Isolation primärer Rattenhepatozyten

3.2.6.1 Nicht-rezirkulierende in situ-Perfusion der Leber

Im Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik wurden, im Rahmen einer Lehrveranstaltung, primäre Rattenhepatozyten von männlichen, postpubertären Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und 320 g isoliert. Bei diesen Tieren konnte im Durchschnitt eine Testosteron-Konzentration im Blut von 2,55 ng/ml festgestellt werden. Zur nicht-rezirkulierenden in situ-Perfusion der Leber wurde der in Abbildung 12 dargestellte Versuchsaufbau verwendet. Die Zusammensetzung aller verwendeten Medien ist in Tabelle 9.2 im Tabellenanhang aufgeführt.

Abbildung 12: Versuchsaufbau zur Durchführung einer nicht-rezirkulierenden in situ-Perfusion der Leber bei einer Ratte, 1. Wasserbad mit EDTA-haltigem Puffer in Laborflaschen, 2. Pumpe, 3.

Carbogenzufuhr, 4. Gaswaschflasche als Überlauf, 5. Zulauf des Puffers, 6. Ablauf für Überschuss an Puffer und Carbogen, 7. Ablauf für H2O, 8. Kugelkühler zum Temperieren und Begasen des Puffers, 9.

Umwälzthermostat, 10. Carbogenzufuhr, 11. Überlauf für Puffer, 12. H2O Zulauf, 13. Präpariertisch mit Auffangbecken für nach Leberperfusion austretenden Puffer, 14. Sammelgefäß für den Überschuss an Puffer

53 Die Tiere wurden in eine Makrolon-Box gesetzt und durch eingeleitetes CO2 betäubt.

Nach Entnahme der Ratte wurde diese durch eine intraperitoneale Injektion von Xylazin (8 mg/kg Körpergewicht; Alfasan, Woerden, Holland) und Ketamin (20 mg/kg Körpergewicht; Alfasan, Woerden, Holland) anästhesiert. Nach dem erfolgreichen Eintritt der tiefen Narkose, die durch das Ausbleiben des Cornealreflexes getestet wurde, konnte die Ratte auf dem Präparationstisch fixiert werden. Danach wurde das Xyphoid ertastet und die Bauchregion mit Ethanol besprüht und das Fell gescheitelt.

Die Haut und das Fell der Ratte wurden durch einen Längs- und einen entgegengesetzten Querschnitt eröffnet und das Abdomen freipräpariert. Das Abdomen wurde durch einen Längsschnitt entlang der Linea alba bis zum Processus xyphoideus eröffnet. Das Darmkonvolut der Ratte wurde verlagert, um den Leberhilus freizulegt. Danach wurde die Vena portae stumpf freipräpariert, hierbei wurden Anteile des Pankreas entfernt. Um die Vena portae wurden im Abstand von ca. 0,5 cm locker zwei Ligaturen aus dem chirurgischen Nahtmaterial Polyester Grün (Andreas Bones GmbH, Straelen-Dam, Deutschland) gelegt, um das Fixieren einer Kanüle im Gefäß zu ermöglichen. Danach wurde mit einer Schere eine kleine Inzision in den sich zwischen den Ligaturen befindlichen Bereich der Vena portae gesetzt. Die Vene wurde kanuliert und die Kanüle durch Zuziehen der Ligaturen fixiert. Direkt nach Beginn der Perfusion wurde der Thorax sowie das Herz durch einen Schnitt eröffnet und das Tier somit in der tiefen Narkose schmerzfrei getötet.

Anschließend wurde die Leber mit auf 37 °C erwärmtem und mit Carbogen äquilibrierten Perfusionspuffer 45 Minuten nicht-rezirkulierend perfundiert. Die Flussgeschwindigkeit des Perfusionspuffers lag bei 20 ml/min. Während der Perfusion mit dem EDTA-haltigen Puffer wurden Kalzium-Ionen komplexiert und dadurch die Desmosomen, welche die Hepatozyten miteinander verbinden aufgelockert, wodurch der Auflösung des Leberzellverbandes möglich war.

Nach der Perfusion wurde die Leber freipräpariert, aus dem Abdomen entnommen und in eine mit Waschpuffer gefüllte Glasschale überführt. Für alle weiteren Arbeitsschritte wurde die perfundierte Rattenleber im Waschpuffer unter eine sterile Sicherheitswerkbank verbracht.

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3.2.6.2 Gewinnung primärer Hepatozyten aus der perfundierten Leber

Unter einer sterilen Werkbank wurden alle Pipettierschritte mit Pipettenspitzen durchgeführt, deren Enden abgeschnitten wurden, um die Scherkräfte zu minimieren, die auf die Zellen einwirken.

Zuerst wurde die Leber in 50 ml frischen Waschpuffer überführt und mit Hilfe einer Pinzette die Leberkapsel entfernt. Danach wurde das Lebergewebe vorsichtig stumpf zerkleinert und im Waschpuffer suspendiert. Diese Zellsuspension wurde anschließend durch Nylon-Gewebe (Porentiefe von 80-100 µm) filtriert um Bindegewebsreste und größere Zellverbände zu entfernen. Danach wurde die Zellsuspension zwei Minuten bei 50 x g zentrifugiert (CS-6KR Zentrifuge, Beckman, Brea, USA), wobei tote Zellen, Zelltrümmer und Nichtparenchym-Zellen im Überstand verblieben. Der Überstand wurde abpipettiert und das Zellsediment in Folge noch zweimal in je 50 ml Waschpuffer resuspendiert und zentrifugiert. Nach der dritten Zentrifugation und Abnahme des Überstandes wurde das verbleibende Zellsediment mit Waschpuffer auf 16 ml aufgefüllt und mit 32 ml Percoll-Dichtegradientenmedium vermischt (Endkonzentration der Percoll-Lösung 58 % v/v).

Anschließend wurde die Suspension 5 Minuten bei 800 x g in der CS-6KR Zentrifuge ohne Bremskraft bei Raumtemperatur zentrifugiert. Während der Zentrifugation verteilten sich die verschiedenen Suspensionskomponenten je nach Dichte in dem Percoll-Dichtegradientenmedium (Abbildung 13). Tote Zellen, Zelltrümmer und Nichtparenchym-Zellen befanden sich in einer Bande des Gradienten und konnten zusammen mit dem überschüssigen Puffer abgesaugt werden.

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Abbildung 13: A. Filtration der Hepatozyten-Suspension um große Zellverbände und Bindegewebe abzutrennen; B: Percoll-Dichtegradientenmedium mit Banden der verschiedenen Zellen

Das Zellsediment wurde anschließend je nach Volumen in 5-20 ml M199-Medium suspendiert. Einige µl dieser Suspension wurden in einem Mischungsverhältnis von 1:4 mit Trypanblau vermengt und die Zellzahl der lebenden und toten Zellen in der Thomakammer bestimmt. Danach wurden jeweils 1 x 10⁶ primäre Rattenhepatozyten in die Vertiefungen einer kollagenbeschichteten 6-Well-Platte ausgesät und mit je 2 ml M199-Medium für vier Stunden erschütterungsfrei inkubiert. Danach wurde die primären Rattenhepatozyten in das Zelllabor der Klinik für Rinder transportiert und das M199 Medium durch das entsprechende Versuchsmedium ersetzt und kultiviert.

Abbildung 14 zeigt die primären Rattenhepatozyten direkt nach der Gewinnung und nach der Adhäsion am Zellkulturgefäß.

Abbildung 14: primäre Rattenhepatozyten; A: direkt nach Gewinnung durch nicht-rezirkulierende in situ-Perfusion; B: nach der Adhäsion, in einer 6-Well-Platte, 4 Stunden nach der Gewinnung

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