Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss von endogenen Sexualsteroidhormonen auf die Wachstumshormon-Rezeptor-Signaltransduktion
in der Leber im physiologischen Zyklus bei Färsen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Kirsten Mense
Bielefeld
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Frau JProf. Dr. Marion Piechotta (Tierärztliche Hochschule Hannover,
Klinik für Rinder, Endokrinologisches Labor)
1. Gutachterin: Frau JProf. Dr. Marion Piechotta
2. Gutachter/in: Herr Prof. Dr. Gerhard Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2014
Gefördert durch die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl-Stiftung
Für meine Eltern
Ulrike und Karl-Heinz
Auszüge aus der vorliegenden Arbeit wurden bereits bzw. werden demnächst unter folgendem Titel der Öffentlichkeit vorgestellt:
• “Influence of sexual steroid hormones on the somatotropic axis in dairy heifers” Mense, Meyerholz, Steufmehl, Duevel, Ulbrich, Krickhahn, Baumgarten, Degen, Hoedemaker, Piechotta (46th Annual Conference of Physiologie and Pathology of Reproduction 27.02 – 01.03.2013 in Danzig)
• „Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die somatotrope Achse bei Milchkühen“ Mense, Meyerholz, Steufmehl, Duevel, Ulbrich, Krickhahn, Baumgarten, Degen, Hoedemaker, Piechotta (Tagung des virtuellen Zentrums für Reproduktionsmedizin 17.06.2013 in Hannover)
• „Hepatic SOCS2 expression is increased during estrus in dairy heifers:
possible impact on liver IGF-I production” Mense, Meyerholz, Knaack, Steufmehl, Ulbrich, Hoedemaker, Piechotta (47th Annual Conference of Physiologie and Pathology of Reproduction 27.02 – 28.02.2014 in Gießen)
• „Hepatic SOCS2 expression is influenced by physiological cycle stages in dairy heifers” Mense, Meyerholz, Knaack, Hoedemaker, Piechotta (ICE/Endo Congress, 21.06 – 24.06.2014 in Chicago; angenommen)
• „The hepatic expression of GHR and SOCS2 mRNA is increased before ovulation during the follicular phase in cattle” Mense, Meyerholz, Knaack, Lietzau, Engelke, Hoedemaker, Piechotta (7th International Congress of the GRS and IGF Society, 15.10 - 18.10.2014 in Singapore; angenommen)
I Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literatur ... 3
2.1 Somatotrope Achse ... 3
2.1.1 Wachstumshormon ... 4
2.1.2 Wachstumshormon-Rezeptor und -Bindungsproteine ... 6
2.1.3 Wachstumshormon-Rezeptor-Signaltransduktionsweg ... 7
2.1.4 Insulin-like Growth Factor System ... 10
2.1.5 Die SOCS-Familie als Regulatoren des GH-Signaltranduktionsweges .. 12
2.2 Gonadotrope Achse ... 15
2.2.1 Der Sexualzyklus des Rindes ... 15
2.3.1 Einfluss von Steroidhormonen auf die zentrale GH Sekretion ... 25
2.3.2 Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die Leber ... 28
2.3.2.1 In vivo Studien im physiologischen Zyklus und während iatrogener Verabreichung von Sexualsteroidhormonen ... 29
2.3.2.2 In vivo Studien während der Trächtigkeit ... 32
2.3.2.3 in vitro Studien ... 33
3 Material und Methoden ... 35
3.1 In vivo Versuch ... 35
3.1.1 Tiere ... 35
3.2 In vitro Versuche ... 41
3.2.1 Durchführung der Zellkultur ... 42
3.2.1.1 Kultivierung der Zellen ... 42
3.2.1.2 Zellzählung ... 44
3.2.1.3 Probenentnahme ... 45
3.2.1.4 Vitalitäts-Bestimmung ... 46
3.2.2 Hormonanalysen im Medium vor Versuchsstart ... 46
3.2.3 Charakterisierung HepG2-Zellen ... 46
II
3.2.3.1 Wachstumskurve ... 46
3.2.3.2 Nachweis des GHR auf HepG2-Zellen mittels Durchflusszytometrie47 3.2.3.3 Basale IGF-Sekretion aus HepG2-Zellen ... 47
3.2.4 Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in HepG2-Zellen ... 48
3.2.5 Langzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in HepG2-Zellen ... 50
3.2.6 Isolation primärer Rattenhepatozyten ... 52
3.2.6.1 Nicht-rezirkulierende in situ-Perfusion der Leber ... 52
3.2.6.2 Gewinnung primärer Hepatozyten aus der perfundierten Leber ... 54
3.2.7 Vorversuch ... 56
3.2.9.5 Insulinähnlicher Wachstumsfaktor II ... 64
3.2.10 PCR-Analysen der Leberbiopsien und HepG2-Zellen und primären Rattenzellen ... 65
3.2.10.1 Extraktion der RNA ... 66
3.2.10.2 Messung der Qualität und Konzentration der RNA ... 66
3.2.10.3 Synthese der cDNA ... 67
3.2.10.1.1 SYBR-Green-Assay ... 68
3.2.10.1.2 TaqMan-Assay ... 69
3.2.11 Harnstoffanalyse ... 70
3.3 Statistische Auswertung ... 70
3.3.1 Statistische Auswertung der Ergebnisse des in vivo Versuchs ... 71
3.3.2 Statistische Auswertung der Ergebnisse der in vitro Versuche ... 71
4 Ergebnisse ... 73
4.1.1 Tiere ... 73
4.1.2.1 Östrogene und Progesteron ... 74
4.1.2.2 Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II ... 74
4.1.3 PCR-Analysen der Leberbiopsien ... 73
4.2 In vitro Versuch ... 81
4.2.1 Hormonanalysen im Medium vor Versuchsstart ... 81
III
4.2.1.1 Bovines Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I ... 82
und -II ... 82
4.2.2 Charakterisierung von HepG2-Zellen ... 83
4.2.2.1 Wachstumskurve ... 84
4.2.2.2 Nachweis des GHR auf HepG2-Zellen mittels Durchflusszytometrie84 4.2.2.3 IGF-Konzentration im Medium nach Kultur mit HepG2-Zellen ... 85
4.2.3 Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in HepG2-Zellen ... 87
4.2.4 Langzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf HepG2-Zellen ... 91
4.2.4.1 Hormonanalyse im Medium ... 91
4.2.4.2 PCR-Analyse der Zellen ... 96
4.2.4.3 Harnstoffanalyse im Medium ... 97
4.2.5 Vorversuch an primären Rattenhepatozyten ... 100
4.2.5.1 Hormonanalyse im Medium ... 100
4.2.6 Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf primäre Rattenhepatozyten ... 104
4.2.6.1 Hormonanalyse im Medium ... 104
4.2.6.2 PCR-Analyse der Zellen ... 107
4.2.6.3 Harnstoffanalyse im Medium ... 108
5 Diskussion ... 111
5.1 In vivo Versuche ... 111
5.1.1 Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die hypophysäre GH-Sekretion 115 5.1.2 Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die Leber ... 118
5.1.2.1 IGF-I und-IGF-II ... 118
5.1.2.2 Regulation des hepatischen GHR-Signaltransduktionsweges während des physiologischen Zyklus... 122
5.1.2.3 Vergleich der Regulationsmechanismen der somatotropen Achse im Zyklus und in der späten Trächtigkeit ... 130
GHR ... 131
5.2 In vitro Versuche ... 135
IV
5.2.1 Beurteilung der Versuche an HepG2-Zellen ... 135
5.2.2 Beurteilung der Versuche an primären Rattenzellen ... 140
5.3 Schlussfolgerung ... 145
5.4 Ausblick ... 147
6 Zusammenfassung ... 148
7 Summary ... 148
8 Literaturverzeichnis ... 151
9 Anhang ... 184
9.1 Protokoll ... 184
9.2 Rezepturen ... 186
9.3 Tabellenanhang ... 189
10 Danksagung ... 193
V Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Neben den allgemein üblichen Abkürzungen wurden folgende Kurzformen verwendet:
AUC area under the curve
bGH bovines Wachstumshormon
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure CIS cytokine-inducible SH2 containing protein
Cl Gelbkörper
E Gesamtöstrogene
E1 Östron
E2 17-ß-Östradiol
ERα Östrogen-Rezeptor alpha
FCS fetales Kälberserum
FI Fluoreszenz-Intensität
GAPDH Glyceraldehyde-3-Phospate Dehydrogenase
GH Wachstumshormon
GHBP Wachstumshormon-Bindungsprotein GHIH growth hormone-inhibiting hormone
GHR Wachstumshormon-Rezeptor
GHRH growth hormone-releasing hormone GnRH gonadotropin-releasing hormone HCC hepatozelluläres Karzinom IFNt Interferon tau
IGFBP insulinähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsproteine IGF-I insulinähnlicher Wachstumsfaktor I
IGF-II insulinähnlicher Wachstumsfaktor II
IGF-IIR insulinähnlicher Wachstumsfaktor I-Rezeptor IGF-IR insulinähnlicher Wachstumsfaktor II-Rezeptor
JAK2 Januskinase 2
PBS Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline
VI
PI3 Phosphatidylinositol-3´-kinase
P4 Progesteron
qPCR quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
RA relativ abundence
rGH Wachstumshormon der Ratte
RPMI 1640 Roswell Parker Memorial Institut 1640-Medium RPS9 ribosomales Protein S9
SOCS suppressor of cytokine signaling
STAT signal transductor and activator of transcription
VII Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Wachstumshormon-Rezeptor-
Signaltransduktionsweges ... 8
Abbildung 2: Inhibition des Signaltransduktionsweges durch suppressor of cytokine signaling-Proteine (SOCS) und cytokine- inducible SH2 containing-Proteine (CIS) 14 Abbildung 3: Schematische Darstellung der Hormon-Konzentrationen und der Follikeldynamik im Sexualzyklus des Rindes, modifiziert nach Forde et al (2011). .. 17
Abbildung 4: vereinfachte Darstellung der Sexualsteroidhormonbiosynthese ... 20
Abbildung 5: schematische Darstellung der verschiedenen Östrogen-Rezeptor (ER)- Signal-Induktions-Wege nach Björnström und Sjöber ... 23
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus der in vivo Untersuchung ... 37
Abbildung 7: Leberbiopsie in Biopsie-Entnahme-System ... 41
Abbildung 8: Lösen der Hepatozyten aus den Kulturgefäßen... 44
Abbildung 9: Zellzählung in der Thomakammer ... 45
Abbildung 10: Versuchesaufbau: „Kurzzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in HepG2-Zellen“ ... 50
Abbildung 11: Versuchesaufbau: „Langzeit-Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in HepG2-Zellen“ ... 50
Abbildung 12: Versuchsaufbau zur Durchführung eine nicht-rezirkulierenden in situ- Perfusion der Leber bei einer Ratte ... 52
Abbildung 13: A. Filtration der Hepatozyten-Suspension, B: Percoll- Dichtegradientenmedium mit Banden der verschiedenen Zellen... 55
Abbildung 14: primäre Rattenhepatozyten ... 55
Abbildung 15: Vorversuches zur Analyse des Kurzzeit-Einflusses von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion in primäre Rattenhepatozyten ... 56
Abbildung 16: Versuchesaufbau: „Kurzzeit-Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die IGF-Produktion von primären Rattenhepatozyten“ ... 58
Abbildung 17: Kollagenbeschichtete 6-Well-Platten mit primären Rattenhepatozyten ... 60
Abbildung 18: ultrasonographische Darstellung der Ovarien ... 73
VIII
Abbildung 19: GH-Konzentration im Plasma in der Luteal- und der Follikelphase .. 75
Abbildung 20: IGF-I-Konzentration um in der Luteal- und der Follikelphase... 76
Abbildung 21: IGF-II-Konzentration im Serum in der Luteal- und der Follikelphase 77 Abbildung 22: Expression des GHR in der Leber,vor und nach der Ovulation und in der Lutealphase ... 79
Abbildung 23: Expression der Suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) vor und nach der Ovulation und in der Lutealphase ... 80
Abbildung 24: IGF-I, –II-Konzentration im 0-Medium nach der Lagerung im Kühlschrank bei 5°C über 6 Tage hinweg ... 83
Abbildung 25: HepG2-Zellen ... 83
Abbildung 26: Wachstumskurve der HepG2-Zellen über zehn Tage ... 84
Abbildung 27: Fluoreszenzprofil der HepG2-Zellen ... 85
Abbildung 28: IGF-I-Konzentration im Zellkulturmedium vor Versuchsstart und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen ... 86
Abbildung 29: IGF-II-Konzentration im Zellkulturmedium vor Versuchsstart und nach viertägiger Kultivierung der HepG2-Zellen ... 86
Abbildung 30: IGF-I-Konzentration pro 1x107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 h und 48h HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von GH ... 87
Abbildung 31: IGF-II-Konzentration pro 1x107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 24 h und 48h HepG2-Zellen-Kultur und Einwirkung von GH ... 89
Abbildung 32: Relative Expression der IGF-II mRNA nach 48 h Kultur der HepG2, mit und ohne GH ... 90
Abbildung 33: IGF-I-Konzentration pro 1x107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 7 und 14 Tagen ... 92
Abbildung 34: IGF-I-Konzentration pro 1x107 Zellen im Medium nach 14 und 21 Tage Zellkultur, abschließende GH-Stimulation ... 93
Abbildung 35: IGF-II-Konzentration pro 1x107 Zellen in den verschiedenen Medien nach 7 und 14 Tagen ... 94
Abbildung 36: IGF-II-Konzentration pro 1x107 Zellen im Medium nach 14 und 21 Tage Zellkultur, abschließende GH-Stimulation ... 95
IX Abbildung 37: Relative Menge der IGF-II mRNA nach 7 und 14 Tagen Kultur der HepG2, mit und ohne GH ... 96 Abbildung 38: Relative Menge der IGF-II mRNA nach 14 und 21 Tagen Kultur der HepG2, mit und ohne GH ... 97 Abbildung 39: Harnstoff- Konzentration in nmol/ml im Medium nach 3 Tagen
Inkubation des Mediums mit den HepG2-Zellen und 7 Tagen Zellkultur, sowie 21 Tagen Zellkultur inklusive 24 h Inkubation mit hGH ... 98 Abbildung 40: IGF-I-Konzentration pro 1x106 Zellen nach 14-17 Stunden Kultur der primären Rattenhepatozyten mit den verschiedenene Medien und erneuter 21-25 stündiger Kultur der Zellen mit und ohne GH ... 101 Abbildung 41: IGF-II-Konzentration pro 1x106 Zellen nach 14-17 h und insgesamt 35-42 h Kultur der primären Rattenhepatozyten in den verschiedenen Medien mit finaler GH-Einwirkung ... 102 Abbildung 42: IGF-I-Konzentration im 0-Medium vor und nach vierstündiger
erschütterungsfreier Kultivierung der primären Rattenhepatozyten ... 104 Abbildung 43: IGF-I-Konzentration in den verschiedenen Medien nach 11-16
Stunden Kultur der primären Rattenzellen, mit und ohne 200ng rodentenem GH .. 105 Abbildung 44: IGF-II-Konzentration im 0-Medium vor und nach vierstündiger
erschütterungsfreier Inkubation der primären Rattenhepatozyten ... 106 Abbildung 45: IGF-II-Konzentration in den verschiedenen Medien nach 11-16
Stunden Kultur der primären Rattenzellen, mit und ohne 200 ng rodenten GH ... 107 Abbildung 46: relative Menge der IGF-I mRNA nach Kurzzeit-Kultur der HepG2, mit und ohne GH ... 108 Abbildung 47: Harnstoff–Konzentration in den verschiedenen Medien nach 11-16 h Inkubation, mit und ohne 200 ng humanem GH mit primären Rattenzellen ... 109 Abbildung 48: Protokollbogen für die Befunde der palpatorischen und
ultrasonoigrafischen Untersuchung von Ovarien und Uterus der Versuchstiere... 184
X
Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1: Zusammensetzung des Hormon-Zellkulturmediums aus RPMI-Medien-
Basis ... 48
Tabelle 2: Zusammensetzung des auf M199-Medien basierenden Zellkulturmediums mit und ohne Zusatz von Sexualsteroidhormonen ... 59
Tabelle 3: Zusammensetzung der Mastermixe für die qPCR... 68
Tabelle 4: Programmablauf der 43 qPCR-Zyklen ... 69
Tabelle 5: Relative mRNA-Expression während der Follikel- und Lutealphase ... 73
Tabelle 6: Konzentration von Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) im RPMI- Medium vor Versuchsstart ... 81
Tabelle 7: Konzentration von Gesamtöstrogenen (E) und Progesteron (P4) im M 199- Medium vor Versuchsstart ... 82
Tabelle 8: Konzentration an bGH, IGF-I und -II im Zellkultur-Medium vor Zellkontakt ... 82
Tabelle 9: Medien für die Durchführung der cDNA-Synthese ... 189
Tabelle 10: Zusammensetzung des Mastermixes für Proben mit (MM+) und ohne (MM-) reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor ... 191
Tabelle 11: Hersteller, der für die PCR verwendeten Reagenzien ... 190
Tabelle 12: Primersequenzen, welche in der PCR-Analyse der Leberbiopsien aus dem in vivo Versuchsteil verwendet wurden ... 192
Tabelle 13: Primersequenzen, die für die PCR-Analyse der HepG2-Zellen verwendet wurden ... 192
Tabelle 14: Primersequenzen, die für die PCR-Analyse der primären Rattenhepatozyten verwendet wurden ... 192
1 1 Einleitung
Die Anpassungsfähigkeit hochleistender Milchkühe an die metabolische Situation nach der Kalbung ist elementar für Gesundheit und Wohlbefinden der Tiere sowie für die Wirtschaftlichkeit der Milchviehbetriebe. Durch das Einsetzen der Laktation post partum müssen diverse Energie- und Nährstoffreserven im Körper mobilisiert werden (Drackley et al. 2001; Ingvartsen & Andersen 2000). Damit die Milchkuh diese metabolische Herausforderung bewältigen kann, bedarf es einer Balance vor allem endokriner Regelmechanismen. Eine bedeutende Rolle spielen dabei das Wachstumshormon (GH) und der insulinähnliche Wachstumsfaktor I (IGF-I) als Komponenten der somatotropen Achse (Lucy et al. 2001a; Breier 1999). Drei Wochen vor und drei Wochen nach der Kalbung, in der sogenannten transition period, sinkt die IGF-I-Konzentration im Blut kontinuierlich ab, obwohl die Konzentration von GH im Blut deutlich erhöht ist (Winkelman et al. 2008; Wook et al.
2004, Radcliff et al 2003). Dieses Phänomen wird in der Literatur als „Entkopplung der somatotropen Achse“ beschrieben. In einigen Studien wurde bereits beobachtet, dass niedrige IGF-I Konzentrationen mit dem Auftreten post partaler Erkrankungen sowie einer verminderten Fertilität nach der Abkalbung einhergehen (Piechotta et al.
2013; Grimard et al. 2013; Cummins et al. 2012; Velazquez et al. 2008; Lucy 2001b).
Trotz der bedeutenden Rolle dieses endokrinen Regelmechanismus sind die Ursachen für die „Entkopplung der somatotropen Achse“ rund um die Kalbung noch nicht komplett entschlüsselt. Es wird unter anderem angenommen, dass die über mehrere Wochen erhöhten Östrogen-Konzentrationen vor der Kalbung den GHR- Signaltransduktionsweg in der Leber beeinflussen. Denn es konnte gezeigt werden, dass der hepatische Wachstumshormon-Rezeptor (GHR) post partum vermindert exprimiert wird (Radcliff et al. 2003; Kobayashi et al. 1999) und, dass rund um die Kalbung in der Leber vermehrt suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) exprimiert wird. Die intrazellulären SOCS2 Proteine inhibieren, laut Arbeiten zu dieser Thematik (Winkelman et al. 2008; Du 2003; Davey et al. 1999; Starr et al.
1997), den GHR-Signaltransduktionsweg in der Leber. Da es in der späten Trächtigkeit allerdings zu enormen endokrinen und metabolischen Veränderungen kommt, ist es schwierig in dieser Phase einzelne Hormonsysteme näher zu
2
betrachten. Um dies zu umgehen, könnte die Untersuchung der somatotropen Achse während des physiologischen Sexualzyklus des Rindes eine Möglichkeit bieten, vertiefende Erkenntnisse über die zugrunde liegenden Regelmechanismen der hepatischen Ausschüttung von IGF zu gewinnen und so auch die Interaktion zwischen Stoffwechsel und Fertilität besser zu verstehen. An nicht tragenden, ovarektomierten Kühen konnte beispielsweise bereits gezeigt werden, dass die Injektion von Östradiol zu einer Erhöhung der GHR-Expression in der Leber und einer Erhöhung der IGF-I-Konzentration im Blut führt (Colak et al. 2011). Außerdem zeigten Kawashima et al. (2007) an zyklischen multiparen Kühen, dass die IGF-I- Konzentration im Blut rund um die Ovulation, parallel zu den erhöhten 17-ß-Östradiol (E2)-Konzentrationen im Blut, ansteigt.
Allerdings liegen speziell über den Einfluss von endogenen Sexualsteroidhormonen auf den hepatischen GHR-Signaltransduktionsweg im physiologischen Sexualzyklus des Rindes nach unserem Wissen zum jetzigen Zeitpunkt keine fundierten Studien vor. Das grundlegende Verständnis der Regulationsmechanismen der somatotropen Achse ist jedoch elementar für die Entwicklung von Präventionsmaßnahmen zur Unterstützung von Milchkühen beim Bestehen des metabolischen Balance-Akts in der transition period und ist deshalb ein wichtiger Beitrag zur Steigerung der Tiergesundheit und des nachhaltigen Tierwohlbefindens in Milchviehherden. Aus diesem Grund war es das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit in vivo im physiologischen Zyklus von 30 Färsen nicht nur die Blutparameter der somatotropen Achse sondern auch den hepatischen GHR-Signaltransduktionsweg unter dem Einfluss von endogenen Sexualsteroidhormonen zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Eignung von HepG2-Zellen und primären Rattenhepatozyten als Modell für die hepatische GHR-Signaltransduktion des Rindes untersucht werden, um zukünftig Tierversuche auf das notwendige Mindestmaß beschränken zu können.
3 2 Literatur
2.1 Somatotrope Achse
Die somatotrope Achse wird in der Literatur als ein endokriner Schlüsselweg für Wachstum und Metabolismus während der fetalen und postnatalen Entwicklung beschrieben (Bartke 2005; Frago & Chowen 2005; Zhu et al. 2001). Bei adulten Tieren ist die somatotrope Achse vor allem bedeutend für die Stoffwechseladaptation, Zellintegrität und partiell auch für die Regeneration von Gewebe nach Verletzungen (Frago & Chowen 2005; Renaville et al. 2002).
Als zentrale Komponenten dieser endokrinen Achse werden GH, der GHR, die Wachstumshormon-Bindungsproteine (GHBP), IGF-I, IGF-II und deren Rezeptoren (insulinähnlicher Wachstumsfaktor I, II-Rezeptor; IGF-IR, IGF-IIR) sowie die entsprechenden Bindungsproteine (insulinähnlicher Wachstumsfaktor- Bindungsproteine; IGFBP) beschrieben (Frago & Chowen 2005; Renaville et al.
2002).
Wachstumshormon wird im Hypophysenvorderlappen synthetisiert. Seine Ausschüttung wird von zwei im Hypothalamus gebildeten Neuropeptiden, dem growth hormone-inhibiting hormone (GHIH) und dem growth hormone-releasing hormone (GHRH) reguliert (Tuggle & Trenkle 1996). Nach der Freisetzung von GH aus der Hypophyse ins Blut, bildet es Komplexe mit seinem Bindungsprotein und wird so in das Zielgewebe transportiert, wo es an den Wachstumshormon-Rezeptor bindet (Baumann, 2001). Dieser Rezeptor wird in allen Körperzellen, in höchster Dichte aber in der Leber, exprimiert (Renaville et al. 2002). Nach Bindung von GH an seinen Rezeptor wird ein intrazellulärer Signaltransduktionsweg ausgelöst, der zur Bildung von IGF führt, welche in Folge im Blut ebenfalls mit ihren spezifischen Bindungsproteinen komplexieren (Rajaram et al. 1997; Bichell et al. 1992). Auch für IGF-I und IGF-II sind entsprechende Rezeptoren, welche deren vielseitige Effekte vermitteln, auf den Zielzellen vorhanden (Hwa et al. 1999; Rajaram et al. 1997;
LeRoith et al. 1995).
4
2.1.1 Wachstumshormon
Erstmals wurde das Wachstumshormon von Evans und Long 1921 beschrieben. Die Autoren konnten zeigen, dass intraperitoneal appliziertes Hypophysenextrakt bei Ratten zu einem gesteigertem Körperwachstum führte (Evans & Long 1921). Im Jahre 1944 konnte GH erstmals aus einer Rinderhypophyse extrahiert werden (Li &
Evans 1944).
Die pulsatile Freisetzung von Wachstumshormon (Butler et al. 2003) aus der Hypophyse wird durch zwei hypothalamisch gebildete Neuropeptide, dem GHIH und dem GHRH, reguliert (Tuggle & Trenkle 1996; Jansson et al. 1985). Hierbei hat GHIH eine inhibitorische Wirkung auf die GH-Ausschüttung aus den somatotropen Zellen des Hypohysenvorderlappens. Es wurde erstmals von Brazeau et al. (1973) isoliert und sequenziert und wird besonders in den periventrikulären Neuronen des Hypothalamus gebildet (Ishikawa et al. 1987). Im Gegensatz dazu stimuliert GHRH die Ausschüttung von GH durch Aktivierung eines Adenylatcyclase-Systems in den somatotropen Zellen des Hypohysenvorderlappens (Dana & Karin 1989; Brent et al.
1988). Es wurde erstmals 1982 aufgereinigt und sequenziert (Guillemin et al. 1982) und wenig später im Hypothalamus nachgewiesen (Ling et al. 1984). In Untersuchungen von Bloch et al. (1984) und Sawchenko et al. (1985) konnte nachgewiesen werden, dass GHRH im Nucleus arcuatus und im ventromedianen Hypothalamus gebildet wird.
West et al. (1997) konnten mit Hilfe eines in vitro Perfusionssystems an bovinen Hypothalamus-Gewebeschnitten nachweisen, dass die Perfusion mit GHRH-haltiger Lösung eine vermehrte Ausschüttung von GHIH hervorruft, während sie nach Perfusion mit GHIH-haltiger Lösung eine verminderte Ausschüttung von GHRH nachwiesen. Die Autoren schlussfolgerten demnach, dass sich GHRH und GHIH gegenseitig regulieren.
Des Weiteren wird die Ausschüttung von GHIH und GHRH durch einen negativen Feedbackmechanismus des hypophysär gebildeten GH auf den Hypothalamus reguliert. Bei Ratten konnte gezeigt werden, dass eine hohe GH-Konzentration im Blut während eines GH-Pulses einen supprimierenden Effekt auf die GHRH- ausschüttenden Neuronen und gleichzeitig einen stimulierenden Effekt auf die GHIH-
5 ausschüttenden Neurone hat. In Folge eines GH-Pulses kommt es dadurch zu einer vermehrten Ausschüttung von GHIH und hierdurch zu einer verminderten GH- Ausschüttung. Im Zeitraum zwischen den GH-Pulsen hat die verminderten GH- Konzentration im Blut einen stimulierenden Effekt auf die GHRH-ausschüttenden Neuronen und einen supprimierenden Effekt auf die GHIH-ausschüttenden Neuronen, was erneut zu einer vermehrten Ausschüttung von GHRH und folgend von GH führt (Pellegrini et al. 1996; Yamauchi et al. 1991; Zeitler et al. 1990). Neben Wachstumshormon haben auch Insulin und IGF-I regulierende Wirkung auf die Freisetzung dieser Neuropeptide aus dem Hypothalamus und wirken hierdurch als negativer Feedbackmechanismus (Butler et al. 2003). Ferner wird auch Leptin, Ghrelin und freien Fettsäuren ein direkter Einfluss auf die hypothalamische GHIH und GHRH-Ausschüttung zugeschrieben (Frago & Chowen 2005).
Das in den somatotropen Zellen des Hypohysenvorderlappens gebildete GH gehört zu der Familie der Cytokinpeptide und setzt sich aus 191 Aminosäuren zusammen (Miller & Eberhardt 1983). Nach seiner Ausschüttung zirkuliert GH entweder frei im Blut oder bindet an Wachstumshormon-Bindungsproteine (Baumann et al. 1986), hierzu mehr im nachfolgenden Kapitel (2.1.2). Die Ausschüttung von GH wurde sowohl bei juvenilen, als auch bei adulten Tieren als pulsatil beschrieben, wobei alters- und geschlechtsspezifische Unterschiede im Ausschüttungsmuster nachgewiesen wurden (Mondal et al. 2005; Taylor et al. 2004; McAndrews et al.
1993; Jansson et al. 1985). In einer Studie von Mondal et al. (2005) konnte bei Färsen gezeigt werden, dass die Pulsanzahl und Amplitude nachts und während längerer Phasen ohne Fütterung ansteigt, aber direkt nach der Fütterung und tagsüber abnimmt.
Wachstumshormon vermittelt seine Effekte entweder indirekt über die Bildung der beiden insulinähnlichen Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II oder direkt auf die entsprechenden Zielzellen. Direkte Wirkungen von GH durch Bindung an den entsprechenden Rezeptor sind beispielsweise ein Anstieg der Glukoneogenese und der Proteinsynthese in der Leber, die verminderte Liponeogenese und Insulinsensitivität (Renaville et al. 1996). Außerdem hat GH während der
6
embryonalen Entwicklung einen bedeutenden Einfluss auf das Längenwachstum des Embryos bzw. Fetus (Verhaeghe et al. 1993; Gluckman et al. 1983).
2.1.2 Wachstumshormon-Rezeptor und -Bindungsproteine
Nach der pulsatilen Freisetzung aus der Hypophyse (Butler et al. 2003) zirkuliert das Wachstumshormon frei oder gebunden an Wachstumshormon-Bindungsproteine, (Baumann et al. 1986) im Blut. In Studien von de Vos et al. (1992) und Cunningham et al. (1991) konnte ein membranständiger GHR nachgewiesen werden, über den die Wirkung von GH vermittelt wird.
Der GHR stellt ein transmembranes Glykoprotein dar, welches zur Klasse der Cytokinrezeptoren zählt und aus 620 Aminosäuren besteht (Bazan 1990). Beim Rind wurden bisher die folgenden drei GHR mRNA-Transkripte beschrieben: GHR 1A, 1B und 1C. Diese mRNA Transkripte bilden die Grundlage zur Proteinsynthese des GHR an den Ribosomen (Kobayashi et al. 1999).
Der GHR wird in allen Geweben exprimiert und hat die höchste Dichte in der Leber (Sørensen et al. 1992). In ebenfalls hoher Dichte wurde der GHR allerdings auch im Fettgewebe, in der Muskulatur und der Niere nachgewiesen (Ballesteros et al. 2000).
Durch die Bindung eines einzelnen GH-Moleküls an die extrazellulär gelegene Abschnitte der GHR-Monomere, kommt es zur Dimerisierung dieser beiden Monomere (de Vos et al. 1992; Cunningham et al. 1991). Die Dimerisierung führt dann zu einer Aktivierung einer intrazellulären Signaltransduktionskaskade, die aus einer Reihe von hintereinander ablaufenden Phosporilierungsreaktionen besteht (He et al. 2003), auf welche in dem nach folgenden Abschnitt genauer eingegangen wird (2.1.3).
Die GHBPs sind dem GHR strukturell laut Zhang et al. (2000) sehr ähnlich. Es sind zwei verschiedene GHBPs beschrieben, die sich in ihrer Bindungskapazität unterscheiden (Baumann & Mercado 1993). Die Bildungsmechanismen der GHBPs variieren zwischen den Spezies. Diese Bindungsproteine entstehen speziesabhängig entweder als proteolytisches Spaltprodukt des GHR oder nach Transkription des GHR-Gens durch alternatives RNA-Spleißen. Das GHBP (hohe Affinität) wird, unter anderem beim Menschen, als proteolytisches Spaltprodukt von, an der
7 Zelloberfläche membrangebundenen, GHR gebildet (Zhang et al. 2000). Bei Nagetieren wird GHBP (hohe Affinität) vom selben Gen wie der GHR kodiert und nach der Transkription durch alternierendes RNA-Spleißen gebildet (Baumbach et al.
1989).
Durch die Bindung von GH an GHBP entstehen im Blut Komplexe, die ein Reservoir an GH in der Zirkulation darstellen. Ferner schützt dieser Transport am GHBP das Wachstumshormon vor Abbau und Ausscheidung, verlängert die Halbwertszeit, modelliert die GH-Bindung an Geweberezeptoren und verbessert dadurch die Bioaktivität von Wachstumshormon (Baumann & Mercado 1993).
2.1.3 Wachstumshormon-Rezeptor-Signaltransduktionsweg
Bei dem intrazellulären Signaltransduktionsweg, der sich nach Dimerisierung der beiden Rezeptoranteile des Wachstumshormon-Rezeptors anschließt, handelt es sich um einen Jak-STAT-Signalweg (Herrington & Carter-Su 2001; Abbildung 1).
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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Signaltransduktionsweges, welcher durch Wachstumshormon (GH)-Bindung an den Wachstumshomonrezeptor ausgelöst wird; JAK2:
Januskinase 2; STAT: signal transducers and activator of transcription-Proteine; Gas: gamma- interferon-aktivierte Sequenzen, P: symbolisiert die Phosphorylierung
Das GHR-Dimer selbst hat keine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität (Zhu et al.
2001), jedoch ist an den intrazellulären Anteil des transmembranen GHR ein Enzym mit intrinsischer Tyrosinkinase-Aktivität assoziiert. Dieses Enzym heißt Januskinase 2 (JAK2; He et al. 2003; Frank et al. 1994; VanderKuur et al. 1994; Sotiropoulos et al. 1994; Argetsinger et al. 1993). Nach Bindung von GH an die extrazelluläre Domäne des GHR-Dimers werden zwei JAK2-Proteine autophosphoryliert (Argetsinger & Carter-Su 1996; Zhu et al. 2001), wodurch am GHR mehrere Tyrosinreste phosphoryliert werden (He et al. 2003; Stred et al. 1992).
Der genaue Mechanismus, der dieser Autophosphorylierung zugrunde liegt, ist trotz seiner großen Bedeutung noch nicht komplett entschlüsselt (Frank 2001). Es wird davon ausgegangen, dass die Bindung von GH an zwei GHR-Monomere, die daraufhin dimerisieren, die Affinität des entstandenen GHR-Dimeres für JAK2 stark
9 erhöht. Die Bildung eines GHR-Dimeres bringt zwei JAK2-Proteine räumlich so nah zusammen, dass ein JAK2-Protein ein Tyrosin des anderen JAK2-Proteins phosphoryliert und umgekehrt (Behncken 2000; Abbildung 1).
Die höchste Aktivität der JAK2 konnte an porcinen Hepatozyten in vitro fünf bis 20 Minuten nach Bindung von GH an den GHR nachgewiesen werden (Wang et al.
1996). Nach der Phosphorylierung von JAK2 und dem GHR entstehen Bindungsstellen für weitere intrazelluläre Transduktionsmediatoren. An diesen Bindungsstellen lagern sich unter anderem verschiedene signal transducers and activator of transcription-Proteine (STAT) an. Das Wachstumshormon kann STAT1, STAT3 und STAT5A sowie STAT5B aktivieren (Smit et al. 1996). In der Leber sind STAT5A und STAT5B die am meisten vorkommenden, durch GH aktivierten, Mediatoren (Herrington & Carter-Su 2001; Zhu et al. 2001).
Durch die Phosphorylierung von Tyrosin an der SH2-Domäne von STAT aktiviert JAK2 dieses Protein (Heim et al. 1995). Die Phosphorylierung von STAT führt dazu, dass sich zwei dieser phosphorylierten STAT-Monomere zu einem STAT-Dimer verbinden. Dieses STAT-Dimer translokalisiert in den Zellkern, wo es an spezifische DNA-Sequenzen bindet und dadurch deren Transkription aktiviert (Herrington et al.
2000; Darnell et al. 1994). Bei diesen DNA-Sequenzen handelt es sich um gamma- interferon-aktivierte Sequenzen (GAS), welche sich in den Promotorsequenzen der GH-abhängigen Gene befinden. Zu diesen GH-abhängigen Genen gehören unter anderem auch die IGF-Gene (Hennighausen & Robinson 2008; Lucy et al. 2001a;
Abbildung 1).
Neben der Aktivierung des STAT-Signaltransduktionsweges löst das GH-JAK2- System wiederum die Phosphorylierung von vielen anderen Proteinen aus Gronowskis & Rotweins 1994; Campbell et al. 1993; Silva et al. 1993). Unter anderem werden der mitogen-activated protein kinase (MAPK) - Signaltransduktionsweg (Anderson 1992; VanderKuur et al. 1994) und der Phosphatidylinositol-3-kinase-Signaltransduktionsweg (PI3) initiiert (Argetsinger et al.
1995).
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2.1.4 Insulin-like Growth Factor System
Der dem GHR nachgeschaltete Signaltransduktionsweg resultiert in der Ausschüttung von IGF-I und wahrscheinlich auch IGF-II aus der Leber (Frago &
Chowen 2005). Die Existenz von IGF wurde erstmals 1957 diskutiert, als Salmon et al. (1957) feststellten, dass GH den Einbau von Sulfat in humanen Knorpel nicht direkt bedingt, sondern diesen Effekt über einen Serumfaktor induziert.
Im Jahre 1978 wurde IGF-I zum ersten Mal durch Rinderknecht und Humbel aufgereinigt und extrahiert (Rinderknecht & Humbel 1978). Der Terminus
„insulinähnlich“ wurde gewählt, da IGF-I und -II beide die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen stimulieren und bis zu 50 % Übereinstimmung in der Struktur zu Insulin aufweisen (Blundell et al. 1983; Rinderknecht & Humbel 1978). Durch diese strukturelle Ähnlichkeit können IGF-I und IGF-II nicht nur an spezifische IGF- Rezeptoren binden sondern auch an den Insulin-Rezeptor. Die Bindungsaffinität ist jedoch im Vergleich zu Insulin eingeschränkt (Steele-Perkins et al. 1988).
In verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten wurde dargestellt, dass IGF-I für Zellwachstum, die intrauterine Entwicklung und besonders für das postnatale Wachstum wichtig ist (Romano et al. 2001; Valentinis & Baserga 2001; Grimberg &
Cohen 2000; Lassarre et al. 1991; Gourmelen et al. 1984). Als eine der wichtigsten Wirkungen von IGF-II wurde in einer Studie von Moses et al. (1980) deren Einfluss auf die embryonale Entwicklung beschrieben. Ferner hat IGF-II Einfluss auf das postnatale Wachstum und wahrscheinlich auch auf metabolische Regulationsmechanismen (A. J. D’Ercole 1996).
Die Produktion von IGF-I und IGF-II beginnt in fetalen Geweben und setzt sich postnatal fort (D’Ercole 1996; Han et al. 1987). Yakar et al. 1999 zeigten, dass die Synthese und Sekretion von IGF-I fetal wie auch postnatal zu 75 % in der Leber stattfindet. Die restlichen 25 % werden unter anderem in der Niere, der Muskulatur und im Fettgewebe gebildet und ins Blut sezerniert (Yakar et al. 1999).
Das im Blut zirkulierende IGF-I und IGF-II wird an spezifischen Bindungsproteinen (IGFBP) transportiert (Hwa et al. 1999; Rajaram et al. 1997). Es sind sechs IGF- Bindungsproteine mit hoher Affinität (IGFBP 1-6; Lucy 2011) sowie drei weitere IGF-
11 Bindungsproteine (IGFBP 7-9) mit geringerer Affinität zu IGF-I und IGF-II beschrieben (Pimentel et al. 2011; Monzavi & Cohen 2002; Kim et al. 1997).
Der größte Anteil an IGF-I und IGF-II bildet einen Komplex mit IGFBP-3 und einem zweiten Protein, der „acid labile subunit“ (ALS) (Spagnoli & Rosenfeld 1996). Als Funktion der Bindung von IGF an IGFBPs wird in der Literatur die Verlängerung der Halbwertszeit durch Schutz des Komplexes vor Proteolyse genannt (Guler et al.
1989), wodurch die BPs eine Schlüsselrolle für den Transport von IGF-I und IGF-II zu den Zielgeweben spielen. Ferner vermindert die Bindung an IGFBP den hypoglykämischen Effekt von freiem IGF-I und IGF-II, der durch die Wirkung von freiem IGF auf Insulinrezeptoren vermittelt wird (Baxter & Daughaday 1991).
In der Literatur werden zwei Rezeptoren für IGF-I und IGF-II beschrieben. Der IGF-IR wird ubiquitär exprimiert (Baserga 2000; Grimberg & Cohen 2000) und nur ausgereifte B-Lymphozyten und Hepatozyten tragen diesen Rezeptor laut Valentinis und Baserga (2001) nicht. Jedoch liegen auch Studien vor, in denen die mRNA des IGF-IR in der Leber von Rinder nachgewiesen werden konnte (Alam et al. 2012;
Colak et al. 2011). Der IGF-IR vermittelt vor allem die wachstumsfördernde Wirkung von IGF-I, aber auch IGF-II kann an diesen Rezeptor bindet (LeRoith et al. 1995;
Ullrich et al. 1986). Der IGF-IR wird im Zytoplasma als einzelnes Protein transkribiert.
Aus diesen Einzelproteinen bilden sich unter Einfluss von spezifischen Proteasen Heterodimere, welche als IGF-IR an der Zelloberfläche gebunden werden. Zwischen dem IGF-IR und dem Insulin-Rezeptor besteht zu etwa 70 % Strukturhomologie, weshalb IGF-I und IGF-II auch an den Insulin-Rezeptor binden können, allerdings mit wesentlich geringerer Affinität als Insulin (Baserga 2000; Grimberg & Cohen 2000;
Valentinis & Baserga 2001).
Neben dem, in der Literatur gut beschriebenen, IGF-IR, gibt es einen als IGF-II- Rezeptor (IGF-IIR) bezeichneten weiteren Rezeptor, welcher ausschließlich IGF-II bindet. Es wird beschrieben, dass der IGF-IIR dem Mannose-6-Phosphat-Rezeptor gleicht, welcher ein Rezeptor für die Phosphatsäure der Mannose ist. Es handelt sich bei dem IGF-IIR um ein einfach transmembranes Glycoprotein (MacDonald et al.
1988), das eine Rolle für den intrazellulären Transport von lysosomalen Enzymen spielt (Kornfeld 1992). Der IGF-IIR bewirkt, dass IGF-II aus dem Blut in die Zelle
12
internalisiert wird und vermittelt dessen Degradation (Ludwig et al. 1996; Gelato et al.
1989).
Die beiden Mediatoren des Wachstumshormons IGF-I und IGF-II können sowohl endo-, para- als auch autokrin wirken (Jones & Clemmons 1995; Rotwein 1991;
D’Ercole et al. 1984). Während der fetalen Entwicklung wird besonders IGF-II im Körper des Fetus gebildet, jedoch ist nach Literaturangaben auch IGF-I für das fetale Wachstum von Bedeutung (Lassarre et al. 1991). Holland et al. (1997) zeigten beim Rind, dass sowohl die IGF-II als auch die IGF-I-Konzentration im Blut der Mutter und des Fetus positiv mit dem fetalen Wachstum korrelieren (Holland et al. 1997).
Zu den vielfältigen Wirkungen von IGF-I gehört zudem auf Zellebene die Beeinflussung des Zellwachstums und der Zellproliferation, der eine Beschleunigung des Zellzyklus, inklusive der Mitose, zugrunde liegt. Bei Kühen wird die IGF-I Konzentration im Blut als ein Indikator für die Energiebilanz beschrieben (Spicer et al. 1990). In einer Studie von Breier (1999) wurde nachgewiesen, dass während einer anabolen Stoffwechsellage die Konzentration von Triglyceriden, freien Fettsäuren (FFS) und Ketonkörpern durch IGF-I gesenkt und die Aufnahme von Aminosäuren in die Muskulatur gesteigert wurde. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass IGF-I die Glukoseaufnahme ins Gewebe erhöht und die GH- und Glukagon-Ausschüttung im Sinne eines negativen Feedbacks hemmt (Heemskerk et al. 1999). Liegt eine katabole Stoowechsellage vor, so kommt es nach Breier (1999) zu einer GH-Resistenz im Gewebe und in Folge zu einer geringeren IGF-I Konzentration im Blut, wodurch z.B. Glukose und FFS für die metabolische Homöostase wie die Laktogenese und nicht für Zellwachstum und Proliferation verwertet werden. Auch im peripartalen Zeitraum wird bei Hochleistungskühen eine verminderte IGF-I Konzentration im Blut nachgewiesen, welche mit einer GH- Resistenz einhergeht (Winkelman et al. 2008).
2.1.5 Die SOCS-Familie als Regulatoren des GH-Signaltransduktionsweges Eine wichtige Gruppe von Proteinen, die für die Regulation des GHR- Signaltransduktionsweges verantwortlich sind, ist die Familie der Zytokin-induzierten Proteine, die als „Suppressor of cytokine signaling“ (SOCS) bezeichnet werden
13 (Krebs & Hilton 2000). Die SOCS-Familie umfasst die Proteine SOCS1 bis 7 und das cytokine-inducible SH2 containing protein (CIS) (Alexander 2002; Hilton et al. 1998;
Starr et al. 1997; Masuhara et al. 1997; Yoshimural et al. 1995). Eine hohe Konzentration von GH kann neben anderen Faktoren, wie z.B.
Sexualsteroidhormonen, die im Kapiteln 2.3 näher beschrieben werden, die Aktivierung der Transkription von SOCS1, 2, 3 und CIS bewirken (Davey et al. 1999;
Matsumoto et al. 1997; Abbildung 2). Der Signaltransduktionsweg, welcher der Induktion der SOCS-Transkription zugrunde liegt, ist noch nicht vollständig geklärt, steht aber nach Meinung von Naka et al. (1997) in einem direkten Zusammenhang mit der STAT-Aktivierung. Die SOCS-Proteine können die GH-Wirkung in verschiedenen Geweben inhibieren (Du 2003; Morales et al. 2002; Davey et al. 1999;
Hansen et al. 1999; Karlsson et al. 1999; Tollet-Egnell et al. 1999; Adams 1998).
Abbildung 2: Darstellung der möglichen Blockierung des Signaltransduktionsweges von GHR durch die Induktion von Suppressor of cytokine signaling-Proteine (SOCS) und cytokine-inducible SH2 containing-Proteine (CIS); JAK2: Januskinase 2; STAT: signal transducers and activator of transcription-Proteine, P: symbolisiert die Phosphorylisierung
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Der Wirkungsmechanismus der SOCS-Proteine ist bisher nur teilweise aufgeklärt. So weiß man, dass SOCS1- und 3-Proteine an JAK2 binden und dessen Aktivität inhibieren, während CIS mit STAT5 um die Bindungsstelle am GHR-JAK2-Komplex konkurriert (Abbildung 2). Der genaue Mechanismus dieser inhibierenden Wirkung von SOCS2 ist noch fraglich (Krebs & Hilton 2001). Mäuse mit SOCS2 Defizienz zeigen Symptome einer GH-Überexpression (Rico-Bautista et al. 2005). Es wird diskutiert, dass SOCS2 genau wie CIS mit STAT5 um die Bindungsstelle am GHR konkurriert (Smit et al. 1996; Abbildung 2).
In einer Studie von Vesterlund et al. (2011) gibt es Hinweise darauf, dass SOCS2 an den GHR-Komplex bindet und dessen Ubiquitinierung fördert und es dadurch zur proteasomalen Degradation dieses Komplexes kommt. Die Ergebnisse einer anderen Arbeit, bei der an einer humanen Nierenzellenlinie mit SOCS- Überexpression gearbeitet wurde, lassen vermuten, dass ein niedriges SOCS2 Level in der Zelle eine inhibierende Wirkung auf die GH-Signaltransduktion hat, ein hohes dagegen einen steigernden Effekt haben könnte und sogar die inhibierende Wirkung von SOCS1 aufheben kann. Somit wird die Funktion von SOCS2 in der Literatur als dualer Modulator diskutiert (Favre et al.1999).
Beim Rind gibt es bisher nur wenige funktionelle Studien zu einer SOCS-Inhibierung des GHR-Signaltransduktionsweges. Eine Untersuchung zu diesem Thema beim Rind ist die Arbeit von Winkelman et al. (2008), in welcher die SOCS2 Expression in der Leber von multiparen Kühen via PCR nachgewiesen wurde. Die Tiere wurden in zwei Fütterungsgruppen eingeteilt und nahe einer physiologischen Kalbung wurden Leberbiopsien für die Bestimmung der SOCS2 Genexpression entnommen. Die Arbeitsgruppe konnte deutlich zeigen, dass die hepatisches SOCS2 mRNA Expression relativ zur Abkalbung anstieg, wobei dieser Effekt bei ad libitum gefütterten Tieren deutlicher war, als bei restriktiv gefütterten Tieren (Winkelman et al. 2008). Eine weitere Arbeit zu dem Thema ist die Studie von Piechotta et al.
(2013), in der gezeigt werden konnte, dass Kühe, deren IGF-I-Konzentration im Blut schon um Tag 250 post inseminationem gering war, eine in Tendenz niedrigere hepatische SOCS2 mRNA-Expression nach der Kalbung aufwiesen als Tiere, die an Tag 250 post inseminationem, höhere IGF-I-Konzentrationen hatten.
15 2.2 Gonadotrope Achse
Die Fortpflanzung und der Sexualzyklus des Rindes werden durch die Hormone der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse, die man auch als die gonadotrope Achse bezeichnet, reguliert. Die klassischen Komponenten dieser Achse sind das Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), das Follikel-stimulierende Hormon (FSH), das luteinisierende Hormon (LH), Progesteron (P4), 17-ß-Östradiol (E2) sowie Inhibin (Roche, 1996). Weitere Hormone die eine Rolle im Sexualzyklus und / oder der Trächtigkeit spielen sind Östron (E1; Patel et al. 1999; Hoffmann et al. 1997) und Prostaglandin F2α (PGF; Liu et al. 1997; Knickerbocker et al. 1988). Durch ihre Interaktion in einem Netzwerk aus negativen und positiven Feedbackmechanismen wird der Sexualzyklus des Rindes gesteuert (Roche 1996).
2.2.1 Der Sexualzyklus des Rindes
Rinder sind polyöstrische Tiere, das Einsetzen der Pubertät wird beim weiblichen Tier zwischen dem 6. und 12. Lebensmonat und einem Durchschnittsgewicht von 200-259 kg beobachtet und ist durch den Beginn des Sexualzyklus, der zwischen 18 und 24 Tagen dauert, gekennzeichnet (Forde et al. 2011a; Hansel & Convey 1983).
Vor allem in der deutschen Literatur wird der bovine Sexualzyklus oft, basierend auf Verhaltensveränderungen und klinischen Veränderungen, in vier Zyklusstadien unterteilt (Ball & Peters 2004; Grunert & Berchtold 1999). Hierbei unterscheidet man:
Proöstrus: Phase zwischen Beginn einer für den Östrus typischen Verhaltensveränderung (z.B. gesteigerte Nervosität, Aufspringen auf andere Kühe) und dem Einsetzen der Paarungsbereitschaft (Dauer: ca.
zwei Tage)
Östrus: Phase der Paarungsbereitschaft, während der die Kuh deutliche Brunstsymptome (Duldungsreflex, Sekretion von Brunstschleim, gesteigerte Kontraktilität des Uterus) zeigt (Dauer: ca. 18 Stunden) Postöstrus: Phase, in der keine Paarungsbereitschaft mehr besteht und die
Brunstsymptome abnehmen, besonders bei Färsen kommt es in dieser Phase zum Abbluten (Dauer: ca. ein bis vier Tage)
16
Diöstrus: Phase der sexuellen Ruhe (Dauer: ca. 14 Tage)
Da sich diese Arbeit vor allem mit den endokrinologischen Regelprozessen des Zyklus und den dabei gebildeten Steroidhormonen beschäftig, wird im Folgenden der Schwerpunkt auf die Einteilung in die Phasen des ovariellen Zyklus gelegt, welcher die hormonellen Veränderungen deutlich widerspiegelt. Diese Einteilung wird vor allem in der aktuellen englischsprachigen Literatur verwendet, hierbei wird der Zyklus in nur zwei Phasen gegliedert (Ginther et al. 2013a; Forde et al. 2011a; Hansel &
Convey 1983)
Lutealphase: Phase der Gelbkörperanbildung und -blüte, beginnt nach der Ovulation und endet mit der Regression des Gelbkörpers (Corpus luteum, CL), diese Phase beinhaltet den oben beschrieben Postöstrus und Diöstrus (Dauer: ca. 14-18 Tage) Follikelphase: Phase der finalen Reifung und der Ovulation des Follikels,
beginnt nach der Luteolyse und endet mit der Ovulation, diese Phase beinhaltet den oben beschrieben Proöstrus und Östrus (Dauer: ca. vier bis sechs Tage)
Nachfolgend werden die endokrinen Prozesse, die zu den Veränderungen am Ovar wie auch zu Hormonkonzentrationsänderungen im Blut des Rindes führen, beschrieben. In Abbildung 3 sind auf der Grundlage einer Veröffentlichung von Sewer & Li (2008) diese Prozesse vereinfacht dargestellt.
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Abbildung 3: Schematische Darstellung der Konzentrationen von Follikel-stimulierenden Hormon (FSH), luteolytischem Hormon (LH) und Progesteron (P4) im Blut, Follikeldynamik im Sexualzyklus des Rindes modifiziert nach Forde et al (2011a), in der Abbildung wurden die Konzentration von 17-β- Östradiol (E2) im Blut sowie die Zyklusphasen ergänzt.
Zu Beginn der Follikelphase bildet sich der Gelbkörper zurück und der dominante Follikel einer Kohorte von mehreren heranreifenden Follikeln, beginnt zu proliferieren (Hansel & Convey 1983a). In einer Studie von Fortune (1994) konnte gezeigt werden, dass der dominante Follikel während seiner Reifung große Mengen an E2 produziert, die ins Blut abgegeben werden. Durch die Luteolyse sinkt im Blut gleichzeitig die Konzentration von P4, wodurch es zu einer Erhöhung der Pulsfrequenz der GnRH-Freisetzung aus den Neuronen des Hypothalamus kommt (Frandson et al. 2003; Moenter et al. 1992). Moenter et al. wiesen 1992 nach, dass GnRH über das Hypothalamus-Hypophysen-Pfortader-System zum Hypophysen- Vorderlappen gelangt, um dort die gonadotropen Zellen dazu anzuregen, die beiden Glykoproteinhormone (Chappel et al. 1983; Fiddes & Goodman 1981) FSH und LH pulsatil auszuschütten (Kakar et al. 1993; Schally et al. 1971; Sunderland et al.
1994a).
18
Die gesteigerte pulsatile FSH-Freisetzung aus der Hypophyse bewirkt über die FSH- Rezeptoren zelluläres Wachstum der follikulären Granulosazellen (Camp et al. 1991;
Evans & Fortune 1997) und wie von Richards et al. (1998) beschrieben, auch die Proliferation des Follikels. Außerdem stellten Mindnich et al. (2004) und Hillier (1994) dar, dass FSH die Aktivität des Enzyms Aromatase stimuliert, das in den follikulären Granulosazellen Androgene zu Östrogenen umwandelt. Durch diese Aromatase wird die E2- und Inhibin-Konzentration in der Follikelflüssigkeit und im Blut gesteigert (Richards et al. 1998). Dies initiiert schließlich einen negativen Feedbackmechanismus, der laut Ginther et al. (2000) und Sunderland et al. (1994) eine reduzierte FSH-Ausschüttung zur Folge hat.
Ireland und Roche beschrieben jedoch schon 1983, dass der dominante Follikel trotz abnehmender FSH-Konzentration im Blut weiterhin E2 sezerniert und wächst. Xu et al. 1995 zeigten in ihrer Studie den Grund für dieses Phänomen. Der dominante Follikel exprimiert mit zunehmender Größe auch mehr LH-Rezeptoren auf den Granulosa- und Thekazellen. Parallel dazu stimuliert E2 durch einen positiven Feedbackmechanismus die hypothalamische GnRH-Sekrektion (Alilia & Hansel 1984; Diaz et al. 2002; Richards et al. 1998), wodurch die Frequenz der pulsatilen LH-Ausschüttung aus der Hypophyse steigt, während sich die Amplitude der Pulse leicht verringert (Rahe et al. 1980; Walters & Schallenberger 1984; Schallenberger et al. 1985). Da die follikulären Zellen nun einen Wechsel von einer hauptsächlich FSH- gesteuerten Aktivität (Adams et al. 1992) zu einer überwiegenden LH-regulierten Aktivität durchlaufen, werden das Follikelwachstum und die E2-Sekretion nicht unterbrochen (Kulick et al. 1999). Folglich bewirkt LH das Wachstum des Follikels, induziert die Ovulation und bedingt die Luteinisierung der Granulosazellen des Gelbkörpers (Walters & Schallenberger 1984; Ireland & Roche 1983). In der Literatur ist beschrieben, dass, sobald die LH-Pulse kumulieren, ein LH-Peak entsteht, welcher anschließend die Ovulation induziert (Rahe et al. 1980; Walters &
Schallenberger 1984; Schallenberger et al. 1985). Roche schlussfolgerte 1996 aus seinen Untersuchungen, dass es genau dann zur Ovulation kommt, wenn die Konzentration von P4 im Blut auf einem niedrigen Basalniveau verweilt und die LH- Pulse über zwei bis drei Tage hinweg alle 40-70 Minuten auftreten (Roche, 1996). Es
19 wurde weiterhin gezeigt, dass die Ovulation etwa 14 h (Nalbandow & Casida 1942) nach Ende des durch Brunstsymptome gekennzeichneten Östrus stattfindet (Frandson et al. 2003).
Nach der Ovulation beginnt die Lutealphase, welche durch die Anbildung des Gelbkörpers gekennzeichnet ist. Die Granulosa- und Thekazellen luteinisieren und bilden P4 (Diaz et al. 2002; Richards et al. 1998; Alilia & Hansel 1984).
Rahe et al. beschrieben bereits 1980, dass sich die Konzentration von P4 im Blut während der Blüte des Gelbkörpers auf einem konstanten Level befindet. Ferner stellte diese Arbeitsgruppe dar, dass durch niedrig-frequente GnRH-Pulse und die daraus resultierende FSH-Ausschüttung auch in der Lutealphase zwei bis drei Follikelwellen auftreten. Diese Follikel atresieren jedoch und ihre E2- und Inhibin- Produktion nimmt ab (Sunderland et al. 1994), da die hohen P4-Konzentrationen nur wenige LH-Pulse mit hoher Amplitude zulassen, was laut Peters et al. (1994) und Rahe et al. (1980) nicht ausreicht um eine Ovulation auszulösen. Nach dem Abklingen einer Follikelwelle steigt die FSH-Sekretion wieder an, so dass sich laut Sunderland et al. (1994) eine neue Follikelwelle bilden kann. Zum Ende der Lutealphase kommt es zur Rückbildung des Gelbkörpers durch endometrial gebildetes PGF und eine neue Follikelphase beginnt, während die P4-Konzentration im Blut absinkt (Hansel & Convey 1983).
2.2.2 Sexualsteroidhormone
Als Sexualsteroidhormone werden Steroidhormone bezeichnet, die zum Erfolg des Reproduktionsprozesses beitragen und in den Gonaden gebildet werden. Man unterscheidet hier die Östrogene, Progestine und Androgene (Gore-Langton &
Armstrong 1988). Neben diesen Sexualsteroidhormonen gehören auch Glukokortikoide und Mineralokortikoide zu der Gruppe der Steroidhormone, die aus Cholesterol synthetisiert werden (Sewer & Li 2008; Miller 1988). In Abbildung 4 sind die wichtigsten Schritte der Steroidhormonbiosynthese aus Cholesterol dargestellt.
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Abbildung 4: Vereinfachte Darstellung der Sexualsteroidhormonbiosynthese aus dem Vorläufermolekül Cholesterol
2.2.2.1 Östrogene
Während des Sexualzyklus des Rindes ist der Hauptbildungsort für E2 der Follikel, in dem die Eizelle von einer Zellschicht aus Granulosazellen und Thekazellen umgeben ist. In der stark durchbluteten Thekazellschicht wird eine große Menge an P4 und Androgenen gebildet (Mindnich et al. 2004; Luu-The 2001; Roberts & Skinner 1990;
Fortune & Quirk 1988; Dorrington et al. 1975). Diese diffundieren laut Fortune und Quirk (1988) nach ihrer Bildung in der Thekazellschicht in die Granulosazell-Schicht und werden dort durch die Aromatase CYP 19 zu E2 konvertiert (Mindnich et al.
2004; Luu-The 2001; Roberts & Skinner 1990; Fortune & Quirk 1988). Diese Syntheseform bezeichnen Fortune und Quirk (1988) als das „zwei Zellen/zwei Gonadotropin Model“, weil zwei Zellen bzw. Syntheseorte zur Bildung von E2 nötig sind.
In einer Studie von Glencross et al. (1973) beim Rind konnte gezeigt werden, dass die Konzentration von E2 etwa 3,5 Tage vor der Ovulation deutlich anstieg, kurz vorher bis zu 6 pg/ml betrug und zur Ovulation hin wieder abnahm. Während der
21 Lutealphase sank die E2-Konzentration im Blut in dieser Studie basal bis auf 2 pg/ml ab. Die Autoren konnten ferner sechs Tage post ovulationem einen erneuten Anstieg der E2-Konzentration dokumentieren, den sie auf die Anwesenheit von Follikelwellen zurückführten.
In einer weiteren Studie von Ginther et al. (2013b) konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass die E2-Konzentration im Blut vor der Ovulation deutlich anstieg und 29 Stunden vor dem Sprung des Follikels ein Maximum erreichte. Danach sank die E2-Konzentration bis 10 Stunden ante ovulationem, um vor der Ovulation noch einmal leicht anzusteigen. Auch in dieser Untersuchung lag die maximale Konzentration von E2 im Blut bei 6 pg/ml.
Neben der Bildung von E2 im Follikel wird in der Literatur auch die Synthese von Östrogenen in der Plazenta der Mutterkuh während der Trächtigkeit beschrieben (Hoffmann & Schuler 2002; Schuler et al. 2008; Leiser & Kaufmann 1994; Sawada et al. 1988). Zu den plazentär gebildeten Östrogenen gehört unter anderem Östron (E1; Schuler et al. 2008; Sawada et al. 1988). In der Studie von Schallenberger et al (1985) wurde gezeigt, dass die E1-Konzentration im Blut von Mutterkühen zur Kalbung hin anstieg und im neunten Monat der Trächtigkeit die höchste Konzentration vorlag und diese post partum wieder deutlich abfiel (Schallenberger et al. 1985). Vor der Kalbung wird E1 in der Plazenta vermehrt aus Pregnenolon gebildet, welches wiederum auch die Vorstufe für P4 ist (Hoffmann & Schuler 2002).
Ferner wird zum Ende der Trächtigkeit in der Plazenta vermehrt E2 synthetisiert, welches sich in diesem Zeitraum, im Vergleich zum Zyklus, in sehr hohen Konzentrationen im Blut befindet (Winkelman et al. 2008; Schuler et al. 2008;
Hoffmann & Schuler 2002; Leiser & Kaufmann 1994). Nach Untersuchungen an mehrkalbigen Kühen steigt ab circa drei Wochen vor der Geburt die Östradiol- Konzentration im Plasma kontinuierlich an (Patel et al. 1999; Piechotta et al. 2013).
Östrogene haben laut Niswender et al. (2000) generell einen mitose-fördernden Effekt. In einer Studie von Jensen wurde schon 1962 gezeigt, dass die Wirkung von Östrogenen über spezifische nukleäre Östrogen-Rezeptoren (ER) vermittelt wird.
Jensen (1962) beschrieb in seiner Studie erstmals den ERα. Außerdem wurde 1996 ein weiterer Östrogen-Rezeptor, der ERβ, von Kuiper et al. nachgewiesen.
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Diese ERs gehören laut Nilsson et al. (2001) zu der Familie der zellkernständigen Rezeptoren und wirken als liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren. Als klassischer Wirkungsmechanismus der ERs wird beschrieben, dass lipophiles E2 oder E1 durch die Membran der Zielzelle diffundiert und dort an nukleären Östrogen-Rezeptoren bindet und so die vermehrte Transkription der Zielgene induziert (Jensen et al. 1966;
Tsai & O’Malley 1994). Auch Nilsson et al. (2001) beschrieben, dass nach der Östrogen-Bindung an den Rezeptor die Dimerisierung des Rezeptors initiiert wird, sodass der Komplex aus Rezeptor-Dimer und Ligand an spezifische „estrogen response elements“ der DNA binden kann, welche in der Promoter-Region von verschiedenen Zielgenen lokalisiert sind. Björnstrom und Sjoberg (2005) beschrieben aber, dass neben diesem klassischen Model der Wirkungs-Übermittlung von Östrogenen, wie es unter anderem von Jensen et al. (1966) und Tsai und O’Malley (1994) beschrieben wurde, noch weitere Mechanismen diskutiert werden, über die Östrogene die Expression von Genen beeinflussen können. Diese These belegen die Autoren damit, dass etwa ein Drittel der durch ER regulierten humanen Gene keine
„estrogen response elements“ aufweisen (O’Lone et al. 2004). Göttlicher et al. (1998) stellten dar, dass der ER die Expression von Genen auch ohne Bindung an spezifische DNA-Sequenzen modellieren kann, indem dieser Rezeptor Protein- Protein-Interaktionen im Zellkern induziert. Überdies gibt es laut Lösel und Wehling (2003) Hinweise darauf, dass E2 auch Nicht-Transkriptions-induzierende Wirkungsmechanismen auslösen kann, da einige Effekte von E2 so schnell auftreten, dass sie nicht über RNA-Aktivierung reguliert sein können. Lösel und Wehling (2003) gingen davon aus, dass diese nicht-genbasierten Effekte von E2 über Zellmembran- assoziierte ERs vermittelt werden, welche Protein-Kinase-Kaskaden aktivieren.
Die Abbildung 5 wurde aus dem Review von Björnström & Sjöberg (2005) übernommen und zeigt schematisiert die Wirkungsmechanismen von Östrogenen über den ER.
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Abbildung 5: Schematische Darstellung der verschiedenen Östrogen-Rezeptor (ER)-Signal- Induktionswege nach Björnström und Sjöber (2005); 1: klassischer Weg der ER-Aktivierung, nach der Bindung von Östradiol (E2) an den ER, bindet dieser an die Östrogen-ansprechbaren Elemente (ERE) des Zielgens; 2-4: nicht über RNA-Aktivierung ausgelöste Signal-Induktionsmechanismen von E2, vermittelt durch die Aktivierung von verschiedenen Protein-Kinase-Kaskaden; P: Phosphorylierung, TF: transcription factor complex
Beim Rind zeigte Pfaffl et al. (2001), dass der ERα vor allem im Euter, im Uterus, in der Leber und den Muskeln exprimiert wird, während der ERβ vor allem im Uterus, in der Niere und in der Milz nachweisbar ist. Östrogen nimmt über diesen Rezeptor laut Foryst-Ludwig und Kintscher (2010) sowie Matthews und Gustafsson (2003) unter anderem Einfluss auf die Lipid- und Glukose-Homöostase.
2.2.2.2 Progesteron
Progesteron ist ebenfalls ein Sexualsteroidhormon, welches in den Lutealzellen des CLs, wie in Abbildung 4 dargestellt, aus Cholesterin gebildet wird (Miller & Eberhardt 1983). Generell vermittelt Progesteron die Mehrzahl seiner Effekte über intrazelluläre Rezeptoren, die als Liganden-induzierte Trankriptionsfaktoren wirken und so die
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Transkription von Genen direkt regulieren (Moutsatsou & Sekeris 2003). Progesteron wirkt hierbei vor allem als Gegenspieler von Östrogen, indem dieses Steroidhormon den ER supprimiert und so die mitogene Wirkung von Östrogenen mindert (Evans &
Leavitt 1980)
Der Hauptanteil des P4 wird während der Lutealphase in den großen Lutealzellen produziert, aber auch die kleinen Lutealzellen sind an dessen Biosynthese beteiligt (Diaz et al. 2002). Die Lutealphase dauert beim Rind nach Forde et al. (2011a) insgesamt 14-18 Tage. Peters et al. (1994) und Rathbone et al. (2001) beschrieben, dass die Lutealzellen fünf Tage nach der Gelbkörper-Anbildung eine konstant hohe Menge an P4 sezernieren. Glencross et al. zeigten schon 1973, dass die Progesteron-Konzentration im Blut während der Lutealphase tierindividuell bis zu 10 ng/ml betragen kann, während sie vor der Ovulation unter 1 ng/ml abfällt. Durch die hohen Konzentrationen von P4 im Blut während der Lutealphase wird das Endometrium auf eine bevorstehende Trächtigkeit vorbereitetet (Morris & Diskin 2008, Abbildung 3).
In einer Studie von Cummings und Yochim (1984) wurde Progesteron in diesem Zusammenhang als Differenzierungsfaktor beschrieben. Forde et al. (2013) konnten eine große Anzahl von endometrialer Gene identifizieren, die unter Progesteroneinfluss in der Lutealphase vermehrt exprimiert werden, um das Endometrium auf die Implantation eines Embryos vorzubereiten. Progesteron mindert während der Lutealphase die Mitoseaktivität des Endometriums (Padykula et al. 1989), verhindert die Kontraktion des Uterus (Batra 1986; Parkington 1983), induziert die stromale Differenzierung und stimuliert die glanduläre Sekretion (Maslar et al. 1986)
Bleibt ein Signal des Embryos (Interferon tau) aus (Forde et al. 2011b; Northey &
French 1980), so werden in der späten Lutealphase vermehrt endometriale Oxytocin- Rezeptoren exprimiert (Bazer et al. 1991). Die Lutealzellen des CLs bilden Oxytocin, welches an endometriale Oxytocin-Rezeptoren bindet und dadurch, wie von Lamothe et al. (1977) beschrieben, die Sekretion von PGF in die Venae uterinae stimuliert. In einer Studie von Hixon und Hansel (1974) wurde gezeigt, dass PGF via Gegenstromprinzip in die Arteria ovarica gelangt. Dort löst es laut Kindahl et al.
25 (1976) die Luteolyse des Gelbkörpers aus und infolge sinkt auch die Plasmakonzentration an P4. Clemens und Estergreen (1982) beschrieben, dass die Metabolisierung und der Abbau von Progesteron in der Leber durch Umbau zu Glucuronid-Konjugaten stattfinden.
2.3 Einfluss von Sexualsteroidhormonen auf die somatotrope Achse
Es gibt verschiedene Studien die Hinweise darauf geben, dass Sexualsteroidhormone die somatotrope Achse beeinflussen können. Hierbei werden vor allem Östrogene als Regulatoren dieser Achse diskutiert (Chowen et al. 2004;
Colak et al. 2011; Fernández-Pérez et al. 2013; Kawashima et al. 2007). Im Folgenden wird zusammengefasst, welche Einflüsse auf die verschiedenen Komponenten der somatotropen Achse in der Literatur bereits beschrieben sind.
Hierbei wird der Schwerpunkt auf die im Sexualzyklus getroffenen Beobachtungen gelegt.
2.3.1 Einfluss von Steroidhormonen auf die zentrale GH Sekretion
In mehreren Untersuchungen wird der mögliche Effekt von Sexualsteroidhormonen auf die GHRH- und GHIH-Sekretion thematisiert (Chowen et al. 1993; Argente et al.
1991; Edén 1979, Tannenbaum & Martin 1976;). Es wurden bisher vor allem die Unterschiede zwischen Geschlechtern analysiert. Hierbei konnte unter anderem nachgewiesen werden, dass bei männlichen Ratten ein niedriger basaler GH-Spiegel im Blut vorliegt, welcher von einzelnen GH-Pulsen mit hohen Amplituden ergänzt wird. Tannenbaum und Martin (1976) konnten bei männlichen Ratten durchschnittlich sieben Episoden mit vermehrter GH-Freisetzung in 24 Stunden nachweisen. Im Gegensatz dazu, wurde bei weiblichen Ratten nachgewiesen, dass die GH-Pulse mit geringerer Amplitude auftreten und das Basallevel des GHs höher ist als bei männlichen Tieren (Edén 1979; Tannenbaum & Martin 1976). Argente et al. (1991) diskutieren, dass diese unterschiedlichen GH-Sekretions-Profile durch geschlechtsspezifische Differenzen der GHIH- und GHRH-Sekretion bedingt sind.
Diese in der Literatur beschriebenen Hypothese wird durch Untersuchungen untermauert, bei denen man herausgefunden hat, dass männlichen Ratten im
