der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Auswirkungen von verschimmeltem Futter, chronischer Pansenazidose sowie Schwefel- Zulagen auf die Protozoenpopulation im Pansen (in vitro)
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines
D O C T O R M E D I C I N A E V E T E R I N A R I A E durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Andrea Höhling
aus Hamm
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. Scholz
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Scholz 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Coenen
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2000
Meinen Eltern, meinem Bruder sowie Hornisse, Nr. 6 und Nr. 8
gewidmet
1. Einleitung 2. Schrifttum
2.1 Systematische Gliederung der Pansenprotozoen 2.1.1 Unterteilung in Fraktionen nach HARMEYER (1965) 2.1.2 Möglichkeiten zur Differenzierung von Protozoengruppen 2.1.3 Isolierung von Pansenziliaten
2.1.4 Kultivierung der Pansenziliaten
2.1.5 Färbung und Zählung der Pansenziliaten nach DEHORITY (1984)
2.1.6 Konservierung einiger entodiniomorpher Ziliaten
2.1.7 Phylogenetische Sequenzanalysen ribosomaler RNA innerhalb der Familieder Ophryoscolecidae
2.2 Bedeutung der Protozoen für die ruminale Fermentation und das Wirtstier insgesamt
2.2.1 Bedeutung der Protozoen im Stickstoffstoffwechsel 2.2.2 Bedeutung der Protozoen im Kohlenhydratstoffwechsel 2.2.3 Bedeutung der Protozoen im Lipidstoffwechsel
2.2.3.1 Lipidzusammensetzung bei Pansenprotozoen im Vergleich zu Pansenbakterien
2.2.4 Bedeutung der chemischen Zusammensetzung der Protozoen 2.2.5 Bedeutung der Protozoen für die Methanogenese
2.2.6 Bedeutung der Protozoen für Pansenvolumen, Verweildauer von Ingesta, pH-Wert und postruminale Fermentation
2.2.7 Bedeutung der Protozoen für Blutparameter und Milchinhaltsstoffe
2.2.8 Bedeutung der Protozoen für das Wachstum des Wirtstieres 2.2.9 Defaunation
2.3 Entwicklung und Beeinflussung einer Protozoenpopulation im Pansen
2.3.1 Faunation / Infusorien-Inokulation bei jungen Wiederkäuern 2.3.2 Protozoenpopulationsdichte und deren Zählmethoden
2.3.3 Unterschiede innerhalb und zwischen verschiedenen Hauswiederkäuerarten
2.3.3.1 Antagonismus zwischen Protozoenspezies 2.3.3.2 Spezifitäten der Pansenprotozoen
2.3.3.3 Geographische Unterschiede
2.3.4 Populationsgröße und -zusammensetzung beeinflussende Faktoren
2.3.4.1 Futter
2.3.4.2 Diurnale Variationen 2.3.4.3 Saisonale Unterschiede 2.3.5 Wildwiederkäuer
1 2 2 8 8 18 20 21 22 22 24 30 31 35 37 39 39 40 40 41 42 47 47 48 52 52 53 54 56 56 67 68 70
2.4.1 Laktatazidose
2.4.2 Pansentympanie 2.4.3 Detoxifikation
2.4.4 Toxizität von Mineralstoffen und Spurenelementen 2.4.5 Diarrhoe
2.4.6 Erscheinungsbild des Wirtstieres
2.5 Interaktionen zwischen Protozoen, Bakterien und Pilzen 2.5.1 Interaktionen zwischen Protozoen und Bakterien
2.5.2 Interaktionen zwischen Protozoen und Pilze 2.5.3 Interaktionen zwischen Protozoen und Protozoen
2.6 Flagellaten
2.6.1 Beschreibung und Klassifikation
2.6.2 Infektion des Wirtstieres und Populationsdichte 2.6.3 Kultivierung
2.7 Resumée
3. Eigene Untersuchungen
3.1 Versuchsziel
3.2 Material und Methodik
3.2.1 Das Langzeitinkubationssystem RUSITEC 3.2.2 Futterkomponenten
3.2.2.1 Herkunft und Beschaffenheit des Heus
3.2.2.2 Herkunft und Beschaffenheit des autoklavierten Heus
3.2.2.3 Herkunft und Beschaffenheit des Schadgrases sowie von Epicoccum nigrum, Alternaria alternata, Mucor racemosus und Ulocladium chartarum
3.2.2.4 Herkunft und Beschaffenheit der Maisstärke 3.2.2.5 Herkunft und Beschaffenheit des Weizenmehls 3.2.2.6 Vitamin B1-Lösung, Natriumsulfit und Natriumsulfat 3.2.3 Spendertiere
3.2.3.1 Haltung und Fütterung der Spendertiere 3.3 Versuchsdurchführung
3.4 Analytik
3.5 Statistische Berechnungen 4. Ergebnisse
4.1 Auswirkungen von Schadgras (Exp. 1) auf die Protozoenkonzentrationen im Pansen
4.2 Auswirkungen von Schimmelpilzen (Alternaria/Epicoccum, Exp. 2) auf die Protozoenkonzentrationen im Pansen
4.3 Auswirkungen von Schimmelpilzen (Mucor/Ulocladium, Exp.
3) auf die Protozoenkonzentrationen im Pansen
71 71 72 73 74 74 75 75 77 78 79 79 80 80 81 82 82 83 83 83 84 84
84 85 86 86 86 87 87 89 91 92 92 95 98
4.5 Auswirkungen von Schwefel-Verbindungen (Exp.5) auf die Protozoenkonzentrationen im Pansen
4.6 Résumée
4.7 Statistische Analyse der Ergebnisse
4.7.1 t-Test pairs (nach Umrechnung der protozoalen Konzentrationsänderungen in Prozent vom Ausgangswert)
4.7.2 Einfaktorielle Varianzanalyse (nach Umrechnung der protozoalen Konzentrationsänderungen in Prozent vom Ausgangswert)
4.7.3 Résumée 5. Diskussion
5.1 Intention der Arbeit
5.2 Kritische Betrachtung der Versuchsanstellungen
5.2.1 Das RUSITEC-System
5.2.2 Beurteilung der inokulierten Panseninhalte und verwendeten Futtermittel
5.2.3 Protozoenzählung 5.3 Statistik
5.4 Auswirkungen verschiedener Futterzulagen auf die Protozoen- Konzentrationen
5.4.1 Auswirkungen durch Zulage von Schadgras (Exp. 1), durch Verfütterung von mit Epicoccum nigrum, Alternaria alternata (Exp. 2), Mucor racemosus oder Ulocladium chartarum (Exp.
3) verschimmeltem Heu
5.4.2 Auswirkungen chronischer Pansenazidosen (Exp. 4) 5.4.3 Auswirkungen von Schwefel-Verbindungen (Exp. 5) 5.4.4 Auswirkungen durch Thiaminzulagen
5.5 Zusammenfassende Wertung 6. Zusammenfassung
7. Summary
8. Schrifttumsverzeichnis 9. Anhang
A Statistische Daten
B In vitro-Versuch mit Selen als Futterzulage B.1 Untersuchung
B.2 Ergebnisse
C Größenverhältnisse der Protozoen nach DEHORITY (1993)
105 108 111 113
114 121 122 122 122 122 125 126 127 128
128 128 129 131 133 134 135 136 204 204 215 215 216 219
Abb. Abbildung
Alternaria Alternaria alternata (DMS 62006)
AL1 Zulagefermenter 1 mit Zulage von mit Alternaria alternata (DMS 62006) verschimmeltem Heu bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
Aqua dest. Aqua destillata
bzw. beziehungsweise
DAN Desoxyribonukleinsäure DES Diethylstilboestrol
DSS Dioktylnatriumsulfosukzinat
Epicoccum Epicoccum nigrum
EPI2 Zulagefermenter 2 mit Zulage von mit Epicoccum nigrum (DSM 2586) verschimmeltem Heu bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
Exp. Experiment
Fa. Firma
FlFS flüchtige Fettsäuren GIT Gastrointestinaltrakt I.D. innerer Durchmesser IT Intestinaltrakt
Kap. Kapitel
KF Kontrollfermenter bzw. Zustände in den Kontrollfermenter
max maximal
min minimal
Mucor Mucor racemosus (DMS 62760)
MUC1 Zulagefermenter 1 mit Zulage von mit Mucor racemosus (DMS 62760) verschimmeltem Heu bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
n Anzahl
p Differenzsignifikanz
p1 Differenzsignifikanz zwischen Kontrollfermentern und Zulagefermentern I
p2 Differenzsignifikanz zwischen Kontrollfermentern und
Zulagefermentern II
p3 Differenzsignifikanz zwischen Zulagefermentern I und Zulagefermentern II
PAS Pansensaft
PCR Polymerasekettenreaktion
RNA Ribonukleinsäure
RUSITEC Rumen Simulation Technique s Standardabweichung
s. siehe
s. a. siehe auch
Se1 Zulagefermenter 1 mit 0,02625 mg Selen-Zulage bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
SF1 Zulagefermenter 1 mit 100 mg Natriumsulfit-Zulage bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
SF2 Zulagefermenter 2 mit 400 mg Natriumsulfat-Zulage bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
s. o. siehe oben
sp. Species
spp. Subspecies
SSUrRNA small subunit ribisomal ribonucleic acid
Tab. Tabelle
TF Testfermenter bzw. Zustände in den Testfermentern
TM Trockenmasse
Ulocladium Ulocladium chartarum (Preuss) Simmons (DMS 63070)
UL2 Zulagefermenter 2 mit Zulage von mit Ulocladium chartarum (Preuss) Simmons (DMS 63070) verschimmeltem Heu bzw. Zustände in diesen Zulagefermentern
Vk Variationskoeffizient x arithmetisches Mittel
ZF Zulagefermenter
ZF1 Zulagefermenter 1 bzw. für Zustände in den Zulagefermentern 1 ZF2 Zulagefermenter 2 bzw. für Zustände in den Zulagefermentern 2
* schwach signifikant (p1 < 0,05)
** signifikant (p1 < 0,005)
*** hoch signifikant (p1 < 0,001)
° schwach signifikant (p2 < 0,05)
°° signifikant (p2 < 0,005)
°°° hoch signifikant (p2 < 0,001)
1. Einleitung
Der Pansen enthält eine Unzahl von Protozoen, Bakterien und Pilzen. Erstere wurden 1843 von GRUBY und DELAFOND entdeckt und aufgrund ihrer Populationsdichte von bis zu 106 pro ml Pansensaft als essentiell für Metabolismus, Ernährung und Gesundheit des Wirtstieres erachtet. Seit BECKER (1929) jedoch das Überleben defaunierter Wiederkäuer aufzeigen konnte, werden weitaus differenziertere Betrachtungen zu Leistung und Bedeutung von Pansenprotozoen angestellt. Insbesondere die Unterschiede bei heranwachsenden Jungtieren und erwachsenen Wiederkäuern sowie bei unterschiedlichen Fütterungs- und Leistungsregimen finden dabei Beachtung. So steht bis heute hinter allen Untersuchungen die Frage, auf welche Weise Protozoen die Effizienz der Pansenfermentation und damit die Leistungsfähigkeit des Wirtstieres fördern oder beeinträchtigen.
In der vorliegenden Arbeit soll daher zunächst eine Übersicht der vorhandenen Literatur über Pansenprotozoen geliefert und darauf der Einfluß unterschiedlicher Futterzulagen auf die Anzahl der großen, mittleren und kleinen Protozoen, sowie deren Verhältnis zueinander, untersucht werden.
Schrifttum
2.1 Systematische Gliederung der Pansenprotozoen
Protozoen sind einzellige tierische Organismen (Eukaryonten) mit einer Größe von 2 - 3000 µm. Insgesamt gibt es ungefähr 65000 verschiedene Arten (WIESNER u. RIBBECK 1991), von denen 223 im Pansen verschiedener Wiederkäuerarten beschrieben worden sind (WILLIAMS u. COLEMAN 1992). Es werden jedoch laufend neue entdeckt (u. a. GÖCMEN u. OKTEM 1996; SELIM et al. 1996; ITO et al. 1997).
Die im Vormagen der Wiederkäuer obligat und fakultativ siedelnden Protozoen gehören den Klassen Litostomatea (früher Ciliata) und Zoomastigophora an, wobei erstere hauptsächlich vertreten ist. Die weitere Einteilung ist sehr schwierig, da den Untersuchern zum Vergleich nur Skizzen und Mikrophotographien zur Verfügung stehen. Viele beschriebene Arten können bisher nicht kultiviert werden und zeigen abhängig von unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (wie z.B. Tierart, geographischer Ort, Futter und Frequenz der Fütterungen) ein verändertes Aussehen. Aus diesen Gründen werden Klassifizierungen immer wieder korrigiert (HONIGBERG et al. 1964; CLARKE 1964, 1977; HUNGATE 1966, 1978; LEVINE et al. 1980; OGIMOTO u. IMAI 1981; LEE et al. 1985; DEHORITY 1993;
WILLIAMS u. COLEMAN 1997).
Seit kurzem wird nun mit Hilfe von Sequenzanalysen der großen und kleinen Untereinheit ribosomaler RNA die Phylogenese u. a. innerhalb der Familie der Ophryoscolecidae untersucht (FLEURY u. EISLER 1995; EMBLEY et al. 1995; WRIGHT u. LYNN 1997).
Korrekturen der Taxonomie sind zu erwarten (näheres s. 2.1.3 u. 2.1.8).
In Abb. 2.1 sind ruminale Protozoen schematisch gegliedert und in den Tab. 2.1 bis 2.4 kurz erläutert.
Da bisher über die Klasse ruminaler Zoomastigophora (Flagellata) nur wenig bekannt ist, wird diese Klasse in Kap. 2.6 gesondert beschrieben.
Unterreich Protozoa
Stamm Ciliophora
Klasse Litostomatea
(Ciliata)
Unterklasse Trichostomatia
(Holotricha)
Ordnung Vestibuliferida Entodiniomorphida
Familie Isotrichidae Paraisotrichidae Blepharocorythidae Buetschliidae Ophryscolecidae
Unterfamilie Entodiniinae Diplodiniinae Ophryoscolecinae
Gattung Isotricha Paraisotricha Charonina Buetschlia Entodinium Diplodinium Epidinium
Dasytricha Blepharoconus Eudiplodinium Epiplastron
Oligoiso- Polymorphella Ostracodinium Opisthotrichon
tricha Parabundleia Metadinium Ophryoscolex
Microcetus Polyplastron Caloscolex
Elytroplastron
Tab. 2.1: Kurzerläuterungen zu Klasse, Unterklasse und Ordnungen nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997)
Unterreich/Stamm Kurzerläuterungen
Protozoa einzellige tierische Organismen (Eukaryoten); Zytoplasma mit Pellicula, Mitochondrien, Zentrosomen, Chromosomenkern, Bewegungs- organellen (Geißeln mit oder ohne undulierender, Membran, Wimpern, Pseudopodien), Nahrungs- und Exkretionsvakuolen, Bildung von Dauerformen durch Enzystierung; eigene Enzymsysteme, Atmung, Aufnahme auch ungelöster Substanzen ins Zellinnere; geschlechtliche und ungeschlechtliche Fortpflanzung; saprophytäre oder parasitäre Lebensweise.
Ciliophora Wimperntierchen; mit wenig veränderlicher Gestalt, mit Zilien bedeckte Körperoberfläche; Makronukleus (Stoffwechselkern) und Mikronukleus (Geschlechtskern).
Tab. 2.2: Kurzerläuterungen zu Klasse, Unterklasse und Ordnungen nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997)
Klasse/Unterklasse/
Ordnung
Kurzerläuterungen Litostomatea
(„Ciliata“)
Wimperntierchen; mit wenig veränderlicher Gestalt, mit Zilien bedeckte Körperoberfläche; Makronukleus (Stoffwechselkern) und Mikronukleus (Geschlechtskern).
Trichostomatia meist vollständig und gleichmäßig bewimpert.
Vestibuliferida („Holotricha“)
Strudler mit speziellen Wimpernreihen, versenktes Zytostom.
Entodiniomorphida („Spirotricha“)
stark reduzierte Bewimperung; Membranellenband in rechtsläufiger Schraube zum Zytostom ziehend.
Tab. 2.3: Kurzerläuterungen zu den einzelnen Familien und Unterfamilien nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997)
Familie/Unterfamilie Kurzerläuterungen
Isotrichidae sehr häufig; ellipsoid; uniforme Bewimperung über die ganze Oberfläche, Zytostom nahe dem apikalen Zellpol.
Paraisotrichidae sehr selten; ellipsoid; lange Wimpern als 8 Spiralreihen um den Körper; kontraktile Vakuole im hinterem Bereich der Zelle; zentraler, ovoider Makronukleus.
Blepharocorythidae Bewimperung am vorderen und hinteren Pol und Vestibulum beschränkt; vorderes Zytostom.
Tab. 2.3: Kurzerläuterungen zu den einzelnen Familien und Unterfamilien nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997); (Fortsetzung) Familie/Unterfamilie Kurzerläuterungen
Buetschliidae ovoid bis ellipsoid; uniforme oder zonuläre Bewimperung; apikales Zytostom; kontraktile und Ausscheidungsvakuole.
Ophryoscolecidae zylindrisch; dorsale Wimpernzone wie ein Gürtel drei Viertel der Zelle umziehend; drei Skelettplatten.
Entodiniinae bei Wiederkäuern weit verbreitet; eine Wimpernzone; kontraktile Vakuole im vorderen Bereich; Makronukleus zwischen Mikronukleus und Zellwand.
Diplodiniinae weit verbreitet; Zellen meist seitlich komprimiert; zwei transversal von rechts nach links verlaufende Wimpernzonen im vorderen Bereich der Zelle; zwei oder mehrere kontraktile Vakuolen;
Mikronukleus zwischen Makronukleus und Zellwand.
Ophryoscolecinae sehr verbreitet; meistens zylindrisch; zwei transversal verlaufende Wimpernzonen; vier bis fünfzehn kontraktile Vakuolen in zwei dorsoventralen Ringen angeordnet; drei Skelettplatten; Mikronukleus zwischen Makronukleus und Zellwand.
Tab. 2.4: Kurzerläuterungen zu den einzelnen Gattungen nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997)
Gatttung Kurzerläuterungen
Isotricha bei Hauswiederkäuern weltweit verbreitet; 65 µm breit und 123 µm lang;
weiteres siehe bei Isotrichidae (Tab. 2.3).
Dasytricha der Gattung Isotricha ähnlich, jedoch kleiner (27 x 58 µm).
Oligoisotricha ovoid; sehr klein (16 x 12 µm); Bewimperung parallel zur Körperachse, am hinteren Pol fehlend; kontraktile Vakuole am hinteren Pol; eliptischer Makronukleus meistens im Endoplasma, kugelförmiger Mikronukleus an dessen vorderen Rand anschließend.
Microcetus ovoid; klein (23 x 12 µm); Wimpernreihen einen Winkel von 20° zur Körperachse bildend und am terminalen oder subterminalen Zytoproktum fehlend; ovoider Makronukleus zentral gelegen; kontraktile Vakuole nahe dem Zytoproktum; zwei charakteristische zytopharyngeale Ruten.
Paraisotricha sehr selten; klein (12 x 19 µm).
Charonina selten; wenn vorhanden, dann sehr zahlreich; relativ klein (35 x 17 µm);
reduzierte Bewimperung bis ganz fehlend; große, kontraktile Vakuole;
runder bis ellipsoider Makronukleus.
Buetschlia meistens ovoid; 29 µm breit und 48 µm lang; uniforme Bewimperung;
kontraktile Vakuole im hinteren Bereich der Zelle, Ausscheidungsvakuole im vorderen.
Tab. 2.4: Kurzerläuterungen zu den einzelnen Gattungen nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997); (Fortsetzung)
Gatttung Kurzerläuterungen
Blepharoconus nur bei brasilianischen Hauswiederkäuern beobachtet; ovoid, am vorderen Ende mit knotenförmigem Fortsatz; 35 µm breit und 46 µm lang; am vorderen Ende der Zelle longitudinale Wimpernreihen aus dünnen Zilien, im mittleren Bereich der Zelle zwei sich gegenüberliegende Wimpernbanden und am hinteren Zellende Wimpernbüschel um das Zytoproktum; konisches Zytostom und Ausscheidungsvakuole am vorderen Ende der Zelle; zwei bis drei kontraktile Vakuolen; diskoidaler Makronukleus.
Polymorphella ovoid bis flaschen-ähnlich; 22 µm breit und 34 µm lang; großes Wimpernbüschel am vorderen flaschen-ähnlichen Zellende, kleines am hinteren nahe des Zytoproktums; kontraktile Vakuole im hinteren Zellbereich, Ausscheidungsvakuole im vorderen nahe der Zellwand.
Parabundleia ovoid; 31 µm breit und 43 µm lang; zwei Wimpernzonen im vorderen Bereich der Zelle um die Ausscheidungsvakuole und um das Zytoproktum;
einzelne kontraktile Vakuolen im hinteren Bereich der Zelle; elliptischer Makronukleus meistens zentral gelegen.
Entodinium 40 µm breit und 59 µm lang; einzelne Arten durch charakteristische Lage der kontraktilen Vakuole im Verhältnis zum Makronukleus definiert.
Eudiplodinium 45 µm breit und 152 µm lang; dorsales Wimpernband; zwei kontraktile Vakuolen; ankerförmiger Makronukleus mit Mikronukleus im Auge des Ankers gelegen; schmale Skelettplatte.
Ostracodinium 45 µm breit und 96 µm lang; dorsales Wimpernband; bis zu zwei Lappen am hinteren Pol; zwei bis sechs kontraktile Vakuolen; sehr breite Skelettplatte.
Metadinium 113 µm breit und 199 µm lang; dorsales Wimpernband; zwei kontraktile Vakuolen; angelförmiger Makronukleus mit zwei bis drei Lappen; zwei Skelettplatten.
Polyplastron 111 µm breit und 164 µm lang; dorsales Wimpernband; sieben bis neun kontraktile Vakuolen; angelförmiger Makronukleus zwei schmale Skelettplatten; großes vorspringendes Operkulum.
Elytroplastron 82 µm breit und 135 µm lang; dorsale Wimpernreihe; vier kontraktile Vakuolen; stäbchenförmiger Makronukleus; drei schmale Skelettplatten;
breites Operkulum.
Epidinium 58 µm breit und 128 µm lang; dorsales Wimpernband hinter vorderem Zellende; bis zu fünf kontraktile Vakuolen und Stacheln; stäbchenförmiger Makronukleus; drei Skelettplatten; schmales Operkulum.
Epiplastron 51 µm breit und 115 µm lang; dorsales Wimpernband; zwei kontraktile Vakuolen; stäbchenförmiger Makronukleus; fünf Skelettplatten; breites Operkulum.
Tab. 2.4: Kurzerläuterungen zu den einzelnen Gattungen nach DEHORITY (1993) und WILLIAMS und COLEMAN (1997); (Fortsetzung)
Gatttung Kurzerläuterungen
Ophryoscolex 70 µm breit und 168 µm lang; dorsales Wimpernband; neun bis fünfzehn kontraktile Vakuolen; stäbchenförmiger Makronukleus; drei breite Skelettplatten; breites Operkulum; mehrere Stachelreihen.
Opisthotrichon nur bei Antilopen.
Caloscolex nur bei Antilopen.
2.1.1 Unterteilung in Fraktionen nach HARMEYER (1963, 1964, 1965)
Laut HARMEYER (1963, 1964, 1965) lassen sich aus Panseninhalt, in dem die Ziliatenpopulation nicht durch besondere Fütterung verändert ist, vier Fraktionen der Protozoenfauna isolieren:
1. Gemisch aus Isotricha prostoma und Isotricha intestinalis;
2. Dasytricha ruminantium;
3. Gemisch aller Entodinienarten;
4. Gemisch aller großen Protozoenzellen des Pansens, bestehend aus großen Diplodinienarten und Ophryoscolex caudatus.
Die in diesen vier Fraktionen vorliegenden Arten umfassen zahlenmäßig über 90 % und volumenmäßig 75 – 80 % der gesamten Protozoenpopulation. Mittelgroße Protozoenzellen, zu denen alle Oligotrichenarten mit einer Länge von 75 – 130 µm und einer Breite von 45 – 70 µm zählen, können auf die von HARMEYER (1963, 1964, 1965) beschriebene Weise nicht isoliert werden.
2.1.2 Möglichkeiten zur Differenzierung von Protozoengruppen
1. Nach Körpergröße
Für eine praktikable Klassifizierung werden die Protozoen in große, mittlere und kleine eingeteilt (HARMEYER 1991; MICHALOWSKI 1991). Zu den kleinen sind Entodinium, Diplodinium und Dasytricha (30 - 80 µm), zu den mittleren Isotricha und Epidinium (80 - 120 µm) und zu den großen Eudiplodinium und Ophryoscolex (120 - 250 µm) zu zählen (DEHORITY 1993).
WILLIAMS und COLEMAN (1997) stellen allerdings fest, daß die Größe der einzelnen Protozoenarten sehr variabel und somit für die Taxonomie von geringerem Wert ist.
2. Nach äußerer Gestalt und Bewimperung
Bei Ophryoscolecidae ist der Körper stets symmetrisch und meistens zylindrisch bzw. bei den Gattungen Entodinium und Diplodinium in einer Richtung mehr oder weniger abgeplattet. Der vordere Zellpol ist durch die Mundöffnung (Zytostom) und der hintere durch die Analöffnung (Zytoproktum) gekennzeichnet (DOGIEL 1927; DEHORITY 1993).
Die Familie Buetschliidae fällt durch einen ei- bis ellipsenförmigen Körper auf, dessen somatische Bewimperung uniform oder in einigen Zonen mit Ausscheidungsvakuolen durchsetzt ist (DEHORITY 1993).
Bei Isotrichidae, Paraisotrichidae und Blepharoisotrichidae ist die gesamte Körperoberfläche uniform, nur bei der Gattung Oligoistricha befindet sich auf dem hinteren Sechstel der Körperoberfläche keine somatische Bewimperung (OGIMOTO u. IMAI 1981; DEHORITY 1993).
3. Nach Verhältnis von Körperlänge zu Körperbreite
WILLIAMS und COLEMAN (1997) beschreiben für einige Arten und Gattungen das Verhältnis von Körperlänge zur Körperbreite:
Gattung: Körperlänge/Körperbreite:
Entodinium 1,0 - 2,0
Eodinium 1,5 - 2,0
Diplodinium 1,2 - 2,1
Eremoplastron 1,3 - 2,0
Eudiplodinium 1,3 - 1,7
Ostracodinium 1,6 - 2,3
Polyplastron 1,7
Diploplastron 1,7
Metadinium 1,3 - 1,8
Epidinium 1,6 - 2,9
Enoploplastron 1,6 - 1,9
Ophryoscolex 1,6 - 2,1
Epiplastron 2,55
Elytroplastron 1,4 - 1,8
Caloscolex 2,0
Opisthotrichum 2,2 Parentodinium 1,9
Paraisotricha 1,5 - 1,8
Art: Körperlänge/Körperbreite:
Isotricha prostoma 1,7 - 2,6
Isotricha intestinalis 1,7 - 1,9
Dasytricha ruminantium 1,7 - 2,7
Oligoisotricha bubali 1,5 - 1,8
Buetschlia parva 1,1 - 1,6
Buetschlia neglecta 1,6 - 2,4
Buetschlia lanceolata 2,0
Buetschlia omnivora 2,4
Buetschlia triciliata 1,4 - 1,6
Parabundleia ruminantium 1,3 - 1,5
Polymorphella bovis 1,3 - 1,8
Blepharoconus krugerensis 1,1 - 1,8
Charonina ventriculi 1,9 - 2,4
4. Nach Stellung der Zilien
Bei Isotricha sind längliche Zilienreihen parallel zur Körperachse vorhanden, bei Dasytricha und Paraisotricha dagegen in Spiralen um den Körper laufend. Oligoisotricha hat keine Zilien am hinteren Ende. Blepharoprosthium wird von drei Zilienbanden (vordere, mittlere und hintere), Blepharoconus von vier (vorderer und hinterer Pol sowie zwei kurze Streifen nahe der Mitte auf entgegengesetzten Körperseiten) bedeckt. Bei Ophryoscolex umgürtet die linke Wimpernzone zwischen vorderem Pol und der Medianen drei Viertel des Körperumfangs, bei Caloscolex fast vollständig den Bereich direkt hinter dem vorderen Pol und bei Opisthotrichum vor der Medianen. Charonina ist durch Zilien am vorderem Pol und durch zwei vorstehende Büschel in der Nähe des hinteren Pols gekennzeichnet. Entodinium besitzt eine einzige adorale Wimpernzone (DOGIEL 1927; WILLIAMS u. COLEMAN 1992;
DEHORITY 1993).
5. Nach Stellung der Stacheln und Lappen
Es werden zwei verschiedene Formen von Fortsätzen unterschieden, die zum Teil fließend ineinander übergehen: Stacheln (schmal und spitz) und Lappen (breit und stumpf).
Diese Gebilde sind für die Klassifikation der einzelnen Gattungen und Arten der Familie der Ophryoscolecidae sehr bedeutend. Es lassen sich hier drei verschiedene Kategorien aufstellen:
a) unbewaffnet mit glattem hinteren Körperende;
b) bewaffnet mit Stacheln am hinteren Körperende (mit zahlreichen Vertretern);
c) bewaffnet an beiden Körperenden (nur Amphacanthus ovum-rajae mit je zwei Stacheln an beiden Enden der ventralen und der dorsalen Längskante).
5.1 Stacheln
Die äußere Form der Stacheln kann variieren und reicht von kurzen, kaum angedeuteten Höckern (Caloscolex u. a.) bis hin zu Ausmaßen, die die Länge des Tieres beinahe übertreffen (Epidinium ecaudatum fasciculus). Gegen ihr freies Ende verjüngen sich die Stacheln entweder nur ganz allmählich oder ihr basaler Teil ist etwas aufgetrieben und der distale nadelartig schmal (Epidinium ecaudatum fasciculus).
Die meisten Ophryoscolecidae besitzen einfache Stacheln, bei sämtlichen Arten der Gattung Ophsyoscolex sind sie jedoch gegabelt oder sogar mit fünf bis sechs Zacken oder Zinken versehen (Ophryoscolex caudatus). Derartige Gebilde bestehen aus einer abgeplatteten Basis, aus der fingerartig zwei bis sechs lange Zähne entspringen; sie sind wie auch die folgenden Abarten aus einfachen Stacheln entstanden. Als weitere Varietät gibt es Sägestacheln, bei denen eine ganze Reihe von Stacheln einer gemeinsamen ektoplasmatischen Kante aufsitzen (Diplodinium cristagalli, zweiter Stachelkranz bei Ophryoscolex purkynjei und Ophryoscolex caudatus). Stacheln mit Seitensporen kommen bei 6 % aller Individuen von Anoplodium denticulatum quinquespinosum vor: einer der hinteren ist an seiner Basis mit einem kurzen, aber spitzen Sporn bewaffnet. Schließlich gibt es noch zusammengestzte Stachel. So weist z.
B. der ventrale Stachel von Ophryoscolec purkynjei und Ophryoscolex caudatus an seiner
Basis ein bis drei kurze, starke Seitendornen auf (DOGIEL 1927; OGIMOTO u. IMAI 1981;
WILLIAMS u. COLEMAN 1992; DEHORITY 1993).
5.2 Lappen
Lappen sind in ihrer Form und Anzahl bei weitem nicht so mannigfaltig wie Stacheln. Am häufigsten findet man einen einzigen ventralen Lappen, welcher dorsoventral etwas abgeflacht ist und mit seinem freien Rand dorsal umgebogen erscheint. Bei Ostracodinium gracile nonlobum u. a. entspringt dieser dem Körper asymmetrisch vor der Medianen. In anderen Fällen gesellt sich zum ventralen noch ein dorsaler, der laterolateral abgeplattet ist.
Lediglich bei Ostracodinium dentatum steigt die Zahl der Lappen bis auf drei, von denen sich der eine dorsal, die beiden übrigen ventral rechts und links der Medianebene befinden (DOGIEL 1927).
In Tab. 2.5 werden die Verbreitung der ein- und mehrstacheligen (retrospektive -lappigen) Formen bei verschiedenen Ophryoscolecidae illustriert (DOGIEL 1927).
Tab. 2.5: Verbreitung der ein- und mehrstacheligen (retrospektive -lappigen) Formen bei verschiedenen Ophryoscolecidae (DOGIEL 1927)
Anzahl der Spezies und Subspezies Gattung
unbe- waffnet
ein Stachel
zwei Stacheln
drei Stacheln
vier Stacheln
fünf Stacheln
sechs Stacheln
über sechs Stacheln Entodi-
nium
12 5 12 3 2 - 1 - Diplodi-
nium
32 12 7 3 2 3 3 -
Epidi-
nium
3 4 1 1 1 2 - - Ophryo-
scolex
1 - - - 1 6 Opistho-
trichum
- 1 - - - Calo-
scolex
1 1 1 1 1 1 - -
Cunhaia - 1 - - -
6. Nach Anzahl und Formen der Skelettplatten
Ophryoscolecidae besitzen bis zu fünf, teils sehr charakteristische Skelettplatten:
Diplodinium hat keine, Eudiplodinium eine enge, Ostracodinium eine breite, Opisthotrichum eine, die fast den ganzen Körper umgibt, und Metadinium zwei, die in der hinteren Region verschmelzen können. Epidinium, Caloscolex, Enoploplastron und Ophryoscolex weisen drei, Elytroplastron vier (zwei auf der oberen und zwei auf der unteren Seite) und Epiplastron sogar fünf auf (DOGIEL 1927; s. a. Tab. 2.6).
Tab. 2.6: Klassifizierung der Ophryoscolecidae nach Anzahl ihrer Skelettplatten Gattung Anzahl und Form der Skelettplatten
Diplodinium - Eudiplodinium eine enge
Ostracodinium eine breite
Opisthotrichum eine, die fast den ganzen Körper umgibt
Metadinium zwei, die in der hinteren Region verschmelzen können Epidinium, Ophryoscolex,
Caloscolex, Enoploplastron,
drei
Elytroplastron vier (zwei auf der oberen und zwei auf der unteren Seite) Epiplastron fünf
7. Nach Anzahl kontraktiler Vakuolen
Diplodinium, Eudiplodinium, Metadinium und Enoploplastron haben zwei, Elytroplastron vier, Caloscolex sieben, Polyplastron acht bis neun und Ophryoscolex neun bis fünfzehn kontraktile Vakuolen (DOGIEL 1927; OGIMOTO u. IMAI 1981; WILLIAMS u. COLEMAN 1992; DEHORITY 1993).
8. Durch Anfärbung
Nach Filterierung und Anfärbung von Pansenflüssigkeit können verschiedene Protozoenfamilien, -gattungen und -arten identifiziert werden.
Isotrichidae, Blepharocorythidae, Buetschliidae und Entodiniinae sowie deren Gattungen und Arten können mit Hilfe von Methylenblau-Färbung charakterisiert werden. Gattungen der Unterfamilie Diplodiniinae werden zur Hervorhebung der Skelettplatten nach Färbung mit Jod klassifiziert, deren Arten aber wiederum nach Färbung mit Methylenblau. Innerhalb der Unterfamilie Ophryoscolecinae können Epidinium-Spezies einfach in ungefärbten oder in mit Methylenblau oder Jod gefärbten bzw. Ophryoscolex-Spezies in sowohl mit Methylenblau als auch Jod gefärbten Proben differenziert werden (DEHORITY 1993).
Darüber hinaus liefern (DOGIEL 1927) Eisenhämatotoxylin und Hämalaun zum Anfärben sehr gute und Boraxkarmin, Alaunkarmin, Safranin und Delafield´s Hämatotoxylin gute
Dienste. Auch Doppelfärbungen durch Nachfärben mit Eosin, Lichtgrün oder Pikrinsäure werden mit großem Erfolg angewandt. Spezielle Methoden zur Anfärbung von Skelettplatten werden mittels Jod oder Chlorzinkjod und später mit starker Schwefelsäure durchgeführt.
DOGIEL (1927) entdeckt zufällig, daß das Konservierungsmittel Schaudinn auf Skelettplatten präzipitiert, wenn nicht ausreichend mit Jodtinktur ausgewaschen wird. Mit Hämalaun gefärbt und aufgehellt erscheinen solche Protozoen violettblau mit grünlichgrauen, scharf hervortretenden, undurchsichtigen Skelettplatten; allerdings ist deren Imprägnierung oft nicht ganz vollständig DOGIEL (1927).
9. Durch Anwendung von Isolierungsmethoden
Alle Methoden Pansenziliaten zu isolieren, basieren auf einfachen Filtrations-, Sedimentations- und Zentrifugationstechniken.
So ist es relativ leicht, große oder kleine Protozoen aus einer gemischten Population zu isolieren. Bei Spezies mit variierender Größe sollten jedoch weitere Schritte durchgeführt werden, z. B. unterschiedliche Zentrifugationen (COLEMAN u. SANDFORD 1979a), Dichtegradienten-Zentrifugationen (MANGAN u. WEST 1977), Sedimentation durch einen gepufferten Gradienten (MOULD u. THOMAS 1958) oder mehr spezifisch durch unterschiedliche Filtrationen (NEWBOLD et al. 1987), wie es aus der Abbildung 2.2 zu entnehmen ist.
Bei Zentrifugation (100 g für 10 min) von Pansensaft erhält man hauptsächlich Isotricha und andere große Infusorien als Bodensatz (MAKKAR et al. 1971a; WILLIAMS u. STRACHAN 1984). Wenn man von Pansensaft ausgeht, in dem nur kleine Entodinien und Dasytricha ruminantium vorkommen, kann Dasytricha ruminantium nach der gleichen Methode gewonnen werden. Metadinium medium und Epidinium ecaudatum werden durch Sedimentation und Waschung separiert, während Ophryoscolex und Diplodinium spp. durch Sedimentation in einer Puffersäule von einem Protozoengemisch getrennt werden (WILLIAMS et al. 1961). Entodinium ssp. sind kleiner und sinken deutlich langsamer. Daher sollen sie nach Sedimentation und Zentrifugation aus dem Überstand wie von COLEMAN (1969a) beschrieben gewonnen werden: Proben mit Entodinium ssp. erhält man durch Filtration mit Hilfe von gesintertem Glas (BONHOMME-FLORENTIN 1967) oder mit Hilfe von Textilfiltern mit definierter Porengröße (WILLIAMS et al. 1984). Polyplastron multivesiculatum kann durch einen Polyester-Textilfilter mit einer Porengröße von 100 µm abgesondert werden (WILLIAMS u. ELLIS 1985).
Ebenso werden arteigene Stoffwechseleigenschaften bei Isolierungsversuchen ausgenutzt.
Sollen Entodiniomorphida von holotrichen Arten getrennt werden, kann man dies durch Zugabe von 0,5 %-iger Mannose oder Hexosamine erreichen, welche für holotriche Ciliata toxisch sind und innerhalb von 24 Stunden eine Zell-Lyse bedingen (SUDGEN u. OXFORD 1952). Dagegen bauen Trichostomatia Glukose und einige andere lösliche Zucker schnell zu körpereigenen Speicherpolysacchariden auf (ANNISON u. LEWIS 1959; HARMEYER 1973) und nehmen in dreißig Minuten um 50 % ihres Gewichtes zu. Im Scheidetrichter sedimentieren so behandelte Protozoen rasch und reichern sich im Bodensatz an (HARMEYER 1963, 1965). Isotricha und Dasytricha werden danach durch Sedimentation in einem Puffer (HEALD et al. 1952) oder einem Pansensaftgradienten (GUTIEREZ 1955) oder Glyzerol (MOULD u. THOMAS 1958) getrennt. Eine weitere Aufschlüsselung in Arten wird
durch Adhäsion an Glasoberflächen (GUTIEREZ 1955) und durch Saccharosegradienten- Zentrifugation (MANGAN u. WEST 1977) erreicht.
Bei der Separation holotricher Ciliata werden Antibiotika (Penicillin, Streptomycin, Chloramphenicol, Kanamycin, Spiramycin, Cephaloridin) zugegeben, um die Kontamination mit Bakterien zu reduzieren. Eine zusätzliche Hungerphase von 48 Stunden dient dazu, den Stoffvorrat in den Bakterien zu entleeren (u. a. HEALD u. OXFORD 1953).
Abb. 2.2: Prozeß zur Isolierung einiger Pansenprotozoen mit Hilfe von unterschiedlichen Filtrationen und Sedimentationen
Inkubation eines Protozoengemisches bei 39 °C für eine Stunde
Filtration mit einer Porengröße von 100 µm
Filtrat Rückstand
Filtration mit einer
Porengröße von 80 µm
Polyplastron multivesiculatum
Filtration mit einer Rückstand
Porengröße von 45 µm Isotricha ssp.
Ophryoscolex Filtrat
Filterung mit einer
Porengröße von 30 µm Filtrat
Waschung des Sedimentes Waschsuspension
Sediment Filtration mit einer
Dasytricha ruminantium Porengröße von 20 µm Entodinium spp.
10. Durch Kultur- und Anzüchtungsversuche
Entodiniomorphida, Isotricha spp. und Dasytricha ruminantium lassen sich problemlos in vitro mit standartisierten Techniken kultivieren (WILLIAMS u. COLEMAN 1997; s. 2.1.5).
Ihre Anzüchtung aus Protozoengemischen läßt sich dabei durch Zugabe weiterer Stoffe zielgerichtet beeinflussen:
Dasytricha ruminantium wird durch Zusatz von Zellobiose einseitig gefördert (GUTIERREZ 1955), während in der Klasse der holotrichen Ciliata nur Isotricha ssp. die Fähigkeit besitzen, Stärkekörner aufzunehmen und zu verarbeiten (HOWARD 1959a). Suspensionen mit Entodiniomorphida werden von Vestibuliferida getrennt, indem Mannose als einziger Nährstoff hinzugegeben wird (OXFORD u. BAILEY 1958; BAILEY et al. 1962). Für Epidinium ecaudatum hat ein Extrakt aus Rotkleeblättern eine besonders günstige Wirkung (OXFORD u. BAILEY 1958), in einigen Kulturversuchen erwiesen sich die Blätter von weißem Klee sogar als lebensnotwendig für Entodinienarten (KANDATSU u. TAKAHASHI 1955b, c). Unter Zusatz von Zellulosepulver oder Filterpapier gedeihen Diplodinien (MARGOLIN 1930; HUNGATE 1942; GAUMONT u. RAYNAUD 1962), Entodinien sterben dagegen unter diesen Bedingungen ab (SUDGEN 1953). Näheres zu diesem Unterabschnitt s. a. bei HARMEYER (1964).
11. Durch Elektromigration
Eine andere noch zu verbessernde Methode spezifische Gattungen aus einem Ziliatengemisch zu isolieren, wird mittels Elektromigration (MASON et al. 1952; HARMEYER 1964;
WAGENER et al. 1986) durchgeführt. Im elektrischen Feld wandern bei einer Spannung von 10 V und einer Stromstärke von 5 - 25 mA Dasy- und Isotricha, Diplodinium und Epidinium mit abnehmender Geschwindigkeit zur Kathode.
12. Durch Behandlung mit Antibiotika
Durch den Einsatz verschiedener Antibiotika in unterschiedlichen Konzentrationen kann die Zusammensetzung einer Protozoenpopulation beeinflußt werden. Penicillin wird in vitro von Entodinium und Diplodinium bis zu Dosen von 12 µg/ml Suspension, von Epidinium ecaudatum bis 20 µg/ml Suspension und von Entodinium caudatum bis 40 µg/ml Suspension vertragen (GUTIERREZ u. DAVIS 1959, 1962; COLEMAN 1960a). Epidinium ecaudatum und Ophryoscolex caudatus überleben bis zu 3 Tagen die Zugabe von 500 – 1000 µg/ml Suspension (WILLIMAS et al. 1961; GUTIERREZ u. DAVIS 1962). Verabreichungen bis zu 4800 µg/ml Suspension haben auf Holotricha eine fördernde Wirkung (SCHUMACHER 1962). Streptomycin wird von Holotricha bis zu einer Dosis von 1500 µg/ml Suspension überlebt (HEALD et al. 1952; HEALD u. OXFORD 1953; SCHUMACHER 1962), von Entodinium, Ophryoscolex caudatus und Epidinium ecaudatum bis zu einer Dosis von 1000 µg/ml Suspension (OXFORD 1955a; OXFORD u. BAILEY 1958; COLEMAN 1962;
WILLIAMS et al. 1961; GUTIERREZ u. DAVIS 1962). 50 µg/g Panseninhalt Chlortetrazyklin in vivo (HORSTMANN 1956; TURNER u. HODGETTS 1953;
ANDERSSON 1953) bzw. 100 µg/ml Suspension in vitro wirken hemmend auf Holotricha, aber begünstigend auf Oligotricha (SCHUMACHER 1962).
Zu Überlebensversuchen mit Antibiotika sei auf HARMEYER (1964) verwiesen.
13. Durch Verwendung bestimmter Futtermittel
Durch einseitige Fütterung werden unterschiedliche Pansenziliaten in ihrem Wachstum gefördert oder gehemmt.
Bei Stroh- (VAN DER WATH u. MYBURGH 1941) und Raygras-Silageverfütterung (SPISNI 1954) vermehrt sich Diplodinium, bei Fütterung von Rotklee insbesondere Epidinium ecaudatum sehr gut (OXFORD u. BAILEY 1958; WRIGHT 1959). Heugaben erhöhen die Konzentrationen von Isotricha (HEALD u. OXFORD 1953; OXFORD 1955b) und Diplodinien (SPISNI u. CARAVALGIA 1954). Durch Fütterung von Raygras vermehren sich alle Entodinienarten außer Entodinium caudatum (BAILEY u. CLARKE 1963). Nach Fütterung von Baumwollsamen und Soja ist der Gehalt von Ophryoscolex caudatus stark erhöht, während die Konzentration der übrigen großen Protozoen abnimmt (WILLIAMS et al.
1961).
Stärkereiches Futter begünstigt Entodinium, speziell Entodinium caudatum (VAN DER WATH u. MYBURGH 1941; OXFORD 1955b; ANNISON u. LEWIS 1959; ABOU AKKADA et al. 1959; ABOU AKKADA u. HOWARD 1960). In Abwesenheit von Entodinium wird durch stärkereiches Futter eine Zunahme von Ophryoscolex (WILLIAMS et al. 1961) oder Epidinium ecaudatum (BOND et al. 1962; GUTIERREZ u. DAVIS 1962) erreicht. Mit einer Fütterung von Kartoffelstärkekörnern erhöht sich die Anzahl der Infusorienart Ophryoscolex caudatus tricorunatus der Gattung Isotricha prostoma und Isotricha intestinalis, im Gegensatz dazu verringert sich die Anzahl der Diplodinium multivesiculatum und Anaplodinium denticulatum stark (ABOU AKKADA u. HOWARD 1960). Bei Zusatz von 5 % Glukose zum Futter ist im Pansen nach wenigen Tagen nur noch Entodinium nachzuweisen (PURSER u. MOIR 1959). Näheres zu diesem Unterabschnitt s. a.
bei HARMEYER (1964).
14. Mittels phylogenetischer Sequenzanalysen ribosomaler RNA innerhalb der Familie der Ophryoscolecidae
Bei phylogenetischen Sequenzanalysen werden die Länge von Nukleinsäuren und Nukleotidpositionen innerhalb der DNA oder RNA bei verschiedenen Arten verglichen und daraus Rückschlüsse auf deren Verwandschaftsgrad gezogen.
WRIGHT u. LYNN (1997) u. a. bestätigen durch derartige Untersuchungen, daß alle Pansenziliaten der Klasse Litostomatea zuzuordnen sind. Wie bereits zuvor von CRAWLEY (1923), DOGIEL (1925a, 1947) und LUBINSKY (1957a, b) postuliert, ist Entodinium caudatum als die phylogenetisch älteste Art innerhalb der Familie der Ophryoscolecidae anzusehen. Sie repräsentiert die Unterfamilie Entodiniinae. Eine Anerkennung auf der taxonomischen Ebene einer Familie ist von weiteren Untersuchungen abhängig zu machen.
Die beiden Unterfamilien Diplodiniinae (mit Epidinium, Ophryoscolex) und Ophryoscolecinae (mit Diplodinium, Eudiplodinium, Polyplastron) zweigen anschließend
gemeinsam vom Stammbaum ab. Im Gegensatz zu LUBINSKYs Annahme (1957b), die auf rein morphologische Beobachtungen beruht, zeigen molekulargenetische Analysen, daß Eudiplodinium phylogenetisch älter ist als Diplodinium (WRIGHT u. LYNN 1997).
Abb. 2.3: Molekulargenetische Klassifizierung der Famile Ophryoscolecidae
Epidi- Ophryo- Dilplo- Polypla-
nium scolex dinium stron
Eudiplo- dinium
Ophryoscolecinae Diplodiniinae
Entodinium
Entodiniinae
Ophryoscolecidae Litostomatea
Ciliophora Protozoa
2.1.3 Isolierung von Pansenziliaten
Alle Methoden Pansenziliaten zu isolieren basieren auf einfachen Filtrations-, Sedimentations- und Zentrifugationstechniken.
Die Pansensaftprobe wird zunächst durch verschiedene Gaze grob gefiltert, um große pflanzliche Partikel zu entfernen (WILLIAMS u. COLEMAN 1992). Diese werden gründlich mit anaerober Salzlösung [meistens aus NaCl, NaHCO3, CH3COONa, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 x 7H2O und CaCl2 x 2H2O bestehend und einen pH-Bereich von 6,7 - 7,2 erzeugend (COLEMAN 1978a; HEALD et al. 1952; OXFORD 1951; WILLIAMS u. HARFOOT 1976)] gewaschen und dem Filtrat wieder zugeführt (OXFORD 1951). Die gesamte Flüssigkeit wird in einen Scheidetrichter gegeben und 30 - 90 Minuten bei 39°C stehen gelassen (WILLIAMS u. COLEMAN 1992). Die auf den Grund sedimentierenden Protozoen können in frischem Puffer aufgefangen werden. Mikrobielle Fermentation läßt Partikel auftreiben, die als Schaumschicht von der Oberfläche abgesaugt werden können. Kleinere (Entodinium spp.) und sich lebhafter bewegende (Dasytricha und Isotricha spp. u. a.) Protozoen sind noch im Überstand enthalten und können entweder durch Zentrifugation (1000 x g für 10 Minuten) oder durch Filtration mit einer Porengröße von 10 µm gewonnen werden (WILLIAMS u.
STRACHAN 1984). Das so erhaltene Gemisch ist noch mit Bakterien, Sporen von Flagellaten und Pilzen und anderen Partikeln kontaminiert. Pflanzliche Reste werden wiederum durch Flotation in frischem Puffer (bei 39°C für 10 Minuten) und Absaugen beseitigt (WILLIAMS u. COLEMAN 1992). Bakterien und Sporen von Pilzen und Flagellaten werden durch Spülung mit frischem, sterilen, anaeroben Puffer dezimiert. Dies geschieht durch Resuspension und Sedimentation aufgrund von Gravidität oder Zentrifugation bei 200 x g für 30 sec (COLEMAN u. SANDFORD 1979a) oder 150 x g für 3 Minuten durch einen Saccharose-Gradienten (MANGAN u. WEST 1977; OGIMOTO u. IMAI 1981). Bakterien sind im Gegensatz zu Protozoen nicht in der Lage, Saccharose-Schichten zu durchwandern.
Das so gewonnene Ziliatengemisch enthält eine vernachlässigbar geringe Kontamination an Bakterien und ist geeignet für biochemische und morphologische Studien.
Inkorporierte Bakterien werden durch eine weitere Behandlung mit Antibiotika reduziert, die entweder in einer postisolatorischen Behandlung für 36 - 48 Stunden zugesetzt werden (HEALD et al. 1952; HEALD u. OXFORD 1953) oder zusätzlich bereits im Spülpuffer enthalten sind (QUIN et al. 1962; JARVIS 1974; HINO u. KAMETAKA 1977; ONODERA et al. 1977c; ONODERA u. HENDERSON 1980; BONHOMME et al. 1982a, b). Regelmäßig angewandte Antibiotika sind Penicillin, Streptomycin-Derivate, Choramphenicol, Kanamycin, Spiramycin und Cephalosporin.
Eine andere noch zu verbessernde Methode Ziliaten zu isolieren, wird mittels Elektromigration durchgeführt (näheres s. 2.1.2).
Abb. 2.4: Isolierungsprozeß von Ziliaten aus Pansensaft Pansensaft
Filtration durch einen groben Filter Filtrat Rückstand
zweifache Verdünnung Waschungen
mit Salzlösung und mit Salzlösung
Kombination mit Rückstands-
waschflüssigkeit Waschflüssigkeit Rückstand bei 39°C für 30 - 90 Minuten
in einem Scheidetricheter stehen lassen
Absaugen der Schaumschicht Protozoengemisch Überstand mit kleinen oder
sich lebhaft bewegenden
Protozoen
Zentrifugation (1000 x g für 10 min) oder Filtrierung
(10 µm)
Zentrifugat Überstand
Protozoenfraktion
Resuspension mit kleinem Puffervolumen für 10 - 15 min bei 39 °C
Absaugen der Schaumschicht Protozoenfraktion
einige Waschungen der Resuspension mit steriler anaerober Salzlösung
(+ Antbiotika) nach Sedimentation oder Zentrifugation (200 x g für 30 sec oder 50 x g für 3 min in 30 %-iger Saccharose) oder nach Filterung (10 µm Porengröße)
verworfene Waschflüssigkeit verworfene Filtrate Protozoengemisch
2.1.4 Kultivierung der Pansenziliaten
Entodiniomorphida, Isotricha ssp. und Dasytricha ruminantium lassen sich mit standartisierten Techniken kultivieren. HUNGATE (1942, 1943) hat als erster Erfolg, Entodiniomorphida anzuzüchten, wohingegen später eine Reihe von Forschern (z. B.
SUDGEN 1953; KANDATSU u. TAKAHASHI 1955a, b, 1956; OXFORD 1958) unerklärlicherweise Schwierigkeiten hat, gleiches zu erzielen. 1958, 1960a und 1978a gelingt es COLEMAN, Entodinium caudatum durch eine zweimal wöchentliche Spülung der Kultur mit frischem Medium bei einer Populationsdichte von 20000 pro ml zu halten. Auch über holotriche Ziliaten wird hauptsächlich in den 1950-er und 1960-er Jahren geforscht. 1930 kann jedoch u. a. MARGOLIN schon Erfolge vorweisen.
Als vorteilhaft hat sich ein Medium mit folgenden Zusätzen erwiesen:
- anaerobe, gepufferte, isotonische Salzlösung mit Pansenflüssigkeit (PURSER u. TOMPKIN 1965);
- Protozoenextrakt (CLARKE u. HUNGATE 1966; KUBO et al. 1980);
- Bakterien (PURSER u. WEISER 1963);
- lösliche Kohlenhydrate (SUDGEN u. OXFORD 1952; GUTIEREZ 1955; BONHOMME- FLORENTIN u. HEMPEL-ZAWITKOWSKA 1977) oder Pflanzenextrakte (GENSKOW et al. 1969).
Anzüchtung holo- und oligotricher Ziliaten ist jedoch nur erfolgreich, wenn die Zahl der intrazellulären Bakterien kontrolliert wird und der Zugang zu löslichen Kohlenhydraten begrenzt ist, da Zellteilungen durch exzessive intrazelluläre Vorräte an Speicherpolysacchariden beinträchtigt werden (CLARKE u. HUNGATE 1966; KUBO et al.
1980). Ziliaten werden mit Hilfe von Antibiotika von Bakterien befreit. Penicillin und Penicillin-Mischungen (COLEMAN 1962; ONODERA et al. 1977c; HINO u.
KAMETAKA1977; JARVIS 1974; BONHOMME et al. 1982b, c) sind inzwischen durch das Breitbandantibiotikum Ampicillin ersetzt worden (COLEMAN 1978c; BONHOMME et al.
1982a).
Die Salzlösung enthält üblicherweise Natriumchlorid, Natriumbicarbonat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulphat und Kalziumchlorid. Desoxygeniert wird durch Einblasen von 95 % N2 + 5 % CO2 oder bei manchen Arten bis 100 % CO2 in die Gasphase.
Als optimale Umweltbedingungen empfehlen QUIN et al. (1962) Temperaturen von 37 - 38 °C, einen pH-Bereich von 6,8 - 7,0, ein Redoxpotential von -200 bis -260 mV und einen osmotischen Druck von 260 mEq pro Liter.
Zur Stimulation des Protozoenwachstums werden folgende Supplemente vorgeschlagen:
- Kobaltsalz oder Vitamin B12 (KANDATSU u. TAKEHASHI 1956; BONHOMME et al.
1982a);
- hitzebehandelte Hefe (ONODERA u. HENDERSON 1950);
- Aktivkohle (ONODERA u. HENDERSON 1950);
- mit β-Sitosterol behandelte Stärke (ONODERA u. HENDERSON 1980);
- Cholin (BROAD u. DAWSON 1976), Tryptophan, Nikotinamid und Harnstoff (SPISNI et al. 1980);
- Stilboestrol (SPISNI et al. 1980), β-Sitosterol und verwandte Sterole (COLEMAN u.
REYNOLDS 1982a);
- Hämin (COLEMAN u. REYNOLDS 1982a).
WILLIAMS und COLEMAN (1997) glauben darüber hinaus, daß β-Sitosterol und verwandte Sterole, die gewöhnlich in Gras gefunden werden, Cholin, das mit Stärkekörnern assoziiert ist, sowie Häm und Vitamin B12 essential für das Wachstum von Pansenziliaten ist.
Die Anzüchtung in einer kontinuierlichen Kultur ist zunächst wenig erfolgreich, weil die Nährstoffe in diesen Systemen für die Ziliaten zu schnell bewegt werden. Bald folgen jedoch Apparate, die einen sich langsam bewegenden, hohlen Kolben besitzen, in dem Nährstoffe wie zerkleinerte Gerste und Heu in einem Nylon-Netzbeutel untergebracht sind (WELLER u.
PILGRIM 1974; NAKAMURA u. KURIHARA 1978; CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977, 1979; ABE u. KURIHARA 1984). TEATHER und SAUER (1988) und FUCHIGAMI et al. (1989) haben inzwischen Fermenter entwickelt, in denen sich der Inhalt wie im Pansen natürlicherweise schichtet. Populationsdichten von 2 x 104 bis 106 pro ml Flüssigkeit können auf diese Weise erreicht werden. HINO et al. (1993) u. a. haben die Technik noch weiter verbessert.
2.1.5 Färbung und Zählung von Pansenziliaten nach DEHORITY (1984)
Eine Pansensaftprobe, die möglichst den gesamten Panseninhalt repräsentiert, wird mittels einer Nasenschlundsonde, einer Pansenfistel oder durch Aufschneiden des Pansens unmittelbar nach Schlachtung gewonnen und folgendermaßen weiter behandelt:
1a. 10 ml Pansensaft, der keine großen Partikel enthält, wird mit einer Pipette (8 mm I.D.) in ein 20 x 150 großes mm Kulturröhrchen überführt. Dazu werden 10 ml 50 %-igen Formalins gegeben.
1b. Pansensaft, der große Partikel enthält, wird gut durchmischt und ein 10 - 50 ml fassendes Gefäß damit bis zum Rand gefüllt. Nach Durchmischung mit der gleichen Menge 50 %-igen Formalins wird diese Probe ebenfalls in einem 20 x 150 mm großen Kulturröhrchen aufgefangen.
2. 1 ml Aliquot der formalisierten Probe wird mittels Pipette mit einer Öffnung von 3 mm in ein 16 x 250 mm großes Kulturröhrchen pipettiert. Wenn diese Probe mit einer 1 : 2 Verdünnung nicht zufriedenstellend pipettiert werden kann, wird eine weitere Verdünnung mit 25 %-igem Formalin (9,25 %-igem Formaldehyd) vorgenommen, wodurch man eine Verdünnungsstufe von 1 : 3, 1 : 4 oder 1 : 5 usw.
erhält.
3. Es werden zwei Tropfen Brilliantgrün hinzugegeben, mit der Probe vermischt und mindestens vier Stunden stehengelassen.
4. 9 ml 30 %-iger Glyzerollösung wird zugegeben, was eine Verdünnungsstufe von 1 : 20 ergibt. Es kann je nach Bedarf weiter verdünnt werden.
5. Die Probe wird mit einer Pipette mit weiter Öffnung in eine Sedgewick-Rafter- Zählkammer gegeben, die ein Volumen von 20 mm x 50 mm x 1mm = 1000 mm³ (≅ 1 ml) faßt.
6. Protozoen werden bei einer Vergrößerung von 100 x gezählt, wobei Zählkästchen mit einer Größe von 5 mm als Hilfe dienen. Es werden zweimal 50 Kästchen ausgezählt und deren Durchschnitt gebildet. Optimal ist ein Ergebnis von 100-150 Zellen pro 50 Kästchen. Ansonsten sollte weiter verdünnt werden.
7. Berechnung:
a) 50 Kästchen x Größe der Kästchen (0,5 mm x 0,5 mm) = 12,5 mm²
b) Dementsprechend ist ein Areal von 1000 / 12,5 ≅ 1 / 80 der Gesamtoberfläche der Zählkammer ausgezählt worden. Also muß die Durchschnittszahl der 50 Kästchen mit 80 multipliziert werden.
c) Die Multiplikation mit der Verdünnung (1 : 20 oder entsprechendes) ergibt die Anzahl der Protozoen pro ml Pansenflüssigkeit.
2.1.6 Konservierung einiger entodiniomorpher Ziliaten
Entodiniomorphida können in vivo nicht zuverlässig am Leben gehalten, aber nach Behandlung mit 4 %-igem Dimethylsulfoxid in flüssigem Stickstoff gut kryokonserviert werden (GYULAI et al. 1988; MARCIN et al. 1989, 1992; KISIDAYOVA 1995, 1996).
Polyplastron multivesiculatum, Epidinium ecaudatum forma caudatum und Ophryoscolex caudatus forma tricoronatus werden in einem Schritt mit 43, 51 und 80 %-igem Erfolg, Ophryoscolex in zwei Schritten mit 30 %-igem Erfolg tiefgefroren. Eine Abkühlungsgeschwindigkeit von 1 – 3 °C pro Minute ist bis zur Eisbildung einzuhalten.
Länge der Haltephase bei -20 bis –40 °C und Equiliberationszeit und -temperatur für Dimethylsulfoxid sind für gute Ergebnisse von entscheidender Bedeutung. Die beiden letzten Parameter sind dabei für jede einzelne Art zu untersuchen (KISIDAYOVA 1996).
In der folgenden Tabelle sind bisherige Ergebnisse zusammengefaßt:
Parameter Gattung
Equiliberationstemperatur in °C für Dimethylsulfoxid
Equiliberationszeit in min für Dimethylsulfoxid Entodinium caudatum 39 bzw. 25 (bei 1-Schritt- bzw.
2-Schritttiefgefrierverfahren)
20 bzw. 5 (bei 1-Schritt- bzw.
2-Schritttiefgefrierverfahren) Entodinium simplex 39 (bei 1-Schritttiefgefrier-
verfahren)
45 (bei 1-Schritttiefgefrier- verfahren)
Ophryoscolex caudatus forma tricoronatus
30 (bei 2-Schritttiefgefrier- verfahren)
15 (bei 2-Schritttiefgefrier- verfahren)
2.1.7 Phylogenetische Sequenzanalysen ribosomaler RNA innerhalb der Familie der Ophryoscolecidae
Insbesondere für die Familie der Ophryoscolecidae erfolgt zunächst eine Extraktion der Nukleinsäuren durch Methylammoniumbromid nach Methoden von WRIGHT et al. (1997).
Zum Starten der anschließenden Polymerasekettenreaktion (PCR) werden SSUrRNA-Primer (MEDLIN et al. 1988) in einem Perkin-Ellmer 960 - Thermostat zugeführt und SSUrRNA amplifiziert. Die Sequenz wird durch die Kettenabbruchmethode unter Zugabe von Primern, Nukleotiden und markierten Diterminatoren, durch Auftrennung der entstandenen Produkte mittels Elektrophorese und Sichtbarmachung der unterschiedlich weit gewanderten Stoffe
analysiert. Die Länge der RNA und Seqzenzmuster können nun bei verschiedenen Arten verglichen und eine phylogenetische Klassifizierung vorgenommen werden.
Nukleotid-Sequenzen der von WRIGHT et al. (1997) untersuchten Arten können bei GenBank/EMBL eingesehen werden.
2.2 Bedeutung der Protozoen für die ruminale Fermentation und das Wirtstier insgesamt
Die ernährungsphysiologische Bedeutung der Pansenprotozoen für das Wirtstier ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Einerseits sind sie für Wiederkäuer nicht lebensnotwendig, andererseits stellen Infusorien jedoch eine wichtige Nährstoffquelle für den Wirtsorganismus bereit.
Zur Klärung der Bedeutung der Protozoen für die Pansenfunktion und das Tier insgesamt werden Versuche mit defaunierten Tieren durchgeführt. Die folgenden Tabellen (2.7 – 2.10) listen derartige Untersuchungen und deren Ergebnisse auf. Defaunationsmethoden werden in 2.2.9 beschrieben.
Tab. 2.7: Auswirkungen einer Defaunation auf ruminale Parameter Untersuchte
Parameter
Erhöhung kein signifikanter
Effekt
Erniedrigung Verweildauer
der Ingesta im Pansen
FAICHNEY u. GRIFFITHS 1978;
ORPIN u. LETCHER 1983, 1984;
ARGYLE u. FORSTER 1989
LINDSAY u.
HOGAN 1972;
VEIRA et al.
1981, 1983
KAYOULI et al.
1984; USHIDA et al. 1986a; PUNIA et al. 1987
Pansenvolumen FAICHNEY u. GRIFFITHS 1978;
ORPIN u. LETCHER 1984;
ARGYLE u. FORSTER 1989
LINDSAY u.
HOGAN 1972;
VEIRA et al.
1981, 1983; BIRD u. LENG 1983;
MEYER et al.
1986; USHIDA et al. 1986a
KAYOULI et al.
1984; USHIDA et al. 1986a; PUNIA et al. 1987
Bakterien- population (PAS)
BRYANT u. SMALL 1960;
EADIE u. HOBSON 1962;
KLOPFENSTEIN et al. 1966;
KURIHARA et al. 1968, 1978;
EADIE u. GILL 1971; ITABASHI u. KATADA 1976a, b; SINGH u.
MAKKAR 1976; DEMEYER u.
VAN NEVEL 1979; ORPIN u.
LETCHER 1983, 1984; ROWE et al. 1981, 1983, 1985; KAYOULI et al. 1984; NEWBOLD et al.
1986a, 1986b; USHIDA et al.
1989a
ARGYLE u.
FORSTER 1989
Pilzpopulation ORPIN 1977c; SOETANTO et al.
1985; ROMULO et al. 1986, 1989;
USHIDA et al. 1989; NEWBOLD u. HILLMAN 1990
JOAUNY 1989
Tab. 2.7: Auswirkungen einer Defaunation auf ruminale Parameter (Fortsetzung) Untersuchte
Parameter
Erhöhung kein signifikanter Effekt
Erniedrigung ATP-Konzentration
(PAS)
WALLACE u. WEST 1982;
NUTBACK et al. 1983 Ammoniak-
Konzentration (PAS)
KUMAR u.
RAGHAVAN 1978;
ROWE et al. 1985
POUNDEN u. HIBBS 1950;
BRYANT u. SMALL 1960;
EADIE 1962a; ABOU AKKADA u. EL-SHAZLY 1964; ABOU AKKADA 1965;
CHRISTIANSEN et al. 1965;
KLOPFENSTEIN et al. 1966;
BORHAMI et al. 1967;
LUTHER et al. 1966;
CHALMERS et al. 1968;
KURIHARA et al. 1968, 1978;
KAHLON et al. 1970; MALES u. PURSER 1970; EADIE u.
GILL 1971; LINDSAY u.
HOGAN 1972; ITABASHI u.
KATADA 1976a; TAKAHASHI u. TAMETAKA 1976;
DEMEYER u. VAN NEVEL 1979; ITABASHI u.
MATSUKAWA 1979;
ITABASHI et al. 1982, 1984;
DEMEYER et al. 1982b;
JOUANY u. SENAUD 1982, 1983;
FONTY et al. 1983; JOUANY u. THIVEND 1983 KAYOULI et al. 1983, 1984, 1986; ORPIN u. LETCHER 1984;
CHAMBERLAIN et al. 1985;
NEWBOLD et al. 1986b;
VEIRA et al. 1981, 1983; 1984;
VAN NEVEL et al. 1985;
USHIDA et al. 1986a, 1989b;
PUNIA et al. 1987
Tab. 2.7: Auswirkungen einer Defaunation auf ruminale Parameter (Fortsetzung) Untersuchte
Parameter
Erhöhung kein signifikanter
Effekt
Erniedrigung Konzentration an
flüchtigen
Fettsäuren (PAS)
KURIHARA et al.
1968; MALES u.
PURSER 1970;
EADIE u. GILL 1971; WHITELAW et al. 1972; STERN u. HINKSON 1974;
VEIRA et al. 1981, 1983; GRUMMER et al. 1983; VAN NEVEL et al. 1985;
KAYOULI et al.
1986; PUNIA et al.
1987
WILLIAMS u.
DINUSSON 1973b; KUMAR u. RAGHAVAN 1978; ITABASHI et al. 1982;
DEMEYER et al.
1982b; KREUZER u.
KIRCHGESSNER 1986b
ABOU AKKADA u. EL- SHAZLY 1964; ABOU AKKADA 1965;
CHRISTIANSEN et al. 1965;
LUTHER et al. 1966;
BORHAMI et al. 1967;
KURIHARA et al. 1968, 1978; YOUSSEF u. ALLEN 1968; KAHLON et al. 1970;
OSMAN et al. 1970;
SELDLOEV 1970; EADIE u.
GILL 1971; LINDSAY u.
HOGAN 1972;
KATAHASHI u.
KAMETAKA 1976;
ITABASHI u.
MATSUKAWA 1979;
JOUANY et al. 1981b;
FONTY et al. 1983; VEIRA et al. 1983, 1984; KAYOULI et al. 1983, 1984, 1986;
CHAMBERLAIN 1983, 1985; ROWE et al. 1985;
NEWBOLD et al. 1986b;
USHIDA et al. 1986b Essigsäure
(molarer Anteil an den FlFS) (PAS)
ABOU AKKADA u.
EL-SHAZLY 1964;
CHRISTIANSEN et al. 1965; WILLIAMS u. DINUSSON 1973b; ITABASHI et al. 1976a;
KURIHARA et al.
1978; DEMEYER et al. 1982b; JOUANY u. SENAUD 1983;
GRUMMER et al.
1983; VAN NEVEL et al. 1985; ROWE et al. 1985; MATHIEU et al. 1996
JOUANY et al.
1981b;
ITABASHI et al.
1982, 1984;
VEIRA et al.
1983; ROWE et al.
1985; KAYOULI et al. 1986;
USHIDA et al.
1986a;
NEWBOLD et al.
1986b
YOUSSEF u. ALLEN 1968;
MALES u. PURSER 1970;
STERN u. HINKSON 1974;
BIRD u. LENG 1978;
KURIHARA et al. 1978;
DEMEYER u. VAN NEVEL 1979; CHAMBERLAIN et al.
1981, 1983; JOUANY u.
SENAUD 1982; GRUMMER et al. 1983; WHITELAW et al. 1972, 1984; KAYOULI et al. 1984, 1986; USHIDA et al. 1986b
Tab. 2.7: Auswirkungen einer Defaunation auf ruminale Parameter (Fortsetzung) Untersuchte
Parameter
Erhöhung kein signifikanter
Effekt
Erniedrigung Propionsäure
(molarer Anteil an den FlFS) (PAS)
CONRAD et al. 1958;
YOUSSEF et al. 1968;
MALES u. PURSER 1970;
WHITELAW et al. 1972, 1984; STERN u. HINKSON 1974; HINKSON et al. 1976;
KURIHARA et al. 1978;
DEMEYER u. VAN NEVEL 1979; JOUANY et al. 1981b;
JOUANY u. SENAUD 1982; ITABASHI et al.
1982, 1984; GRUMMER et al.; KAYOULI et al. 1984, 1986; USHIDA et al. 1986a, b; PUNIA et al. 1987
BIRD u. LENG 1978;
VEIRA et al. 1983;
ROWE et al. 1985;
KAYOULI et al.
1986; NEWBOLD et al. 1986b
ABOU AKKADA u.
EL-SHAZLY 1964;
CHRISTIANSEN et al. 1965; LUTHER et al. 1966; EADIE u.
GILL 1971;
WILLIAMS u.
DINUSSON 1973b;
ITABASHI u.
KATADA 1976a;
KURIHARA et al.
1978; DEMEYER et al. 1982b;
CHAMBERLAIN et al. 1981, 1983, 1985;
JOUANY u.
SENAUD 1983;
ITABASHI et al.
1984; ROWE et al.
1985; VAN NEVEL et al. 1985
Buttersäure (molarer Anteil an den FlFS) (PAS)
ABOU AKKADA u. EL- SHAZLY 1964;
KLOPFENSTEIN et al.
1966; WHITELAW et al.
1972; LINDSAY u. HOGAN 1972; BIRD u. LENG 1978;
KURIHARA et al. 1978;
ROWE et al. 1981;
CHAMBERLAIN et al.
1981, 1983, 1985;
DEMEYER et al. 1982;
JOUANY u. SENAUD 1982; ITABASHI et al.
1984; ROWE et al. 1985;
VAN NEVEL et al. 1985;
MATHIEU et al. 1996
VEIRA et al. 1983 CONRAD et al. 1958;
CHRISTIANSEN et al. 1965; YOUSSEF et al. 1968; MALES u.
PURSER 1970;
HINKSON et al.
1976; DEMEYER u.
VAN NEVEL 1979;
ITABASHI et al.
1982; FONTY et al.
1983; GRUMMER et al. 1983;
WHITELAW et al.
1984; NEWBOLD et al. 1986a; KAYOULI et al. 1986; USHIDA et al. 1986b
Ameisensäure- konzentration (PAS)
ABOU AKKADA u.
EL-SHAZLY 1964
Tab. 2.7: Auswirkungen einer Defaunation auf ruminale Parameter (Fortsetzung) Untersuchte
Parameter
Erhöhung kein signifi-
kanter Effekt
Erniedrigung Milchsäurekonzen-
tration (PAS)
TAKAHASHI u.
KAMETAKA 1976;
JOUANY et al. 1981b;
CHAMBERLAIN et al.
1981, 1983; DEMEYER et al. 1982b; YOSHIDA et al.
1982; KAYOULI et al. 1984;
NAGARAJA et al. 1986;
NEWBOLD et al. 1986b
VAN NEVEL 1985;
KAYOULI 1986
HINKSON et al. 1976;
JOUANY u. SENAUD 1982, 1983
Bikarbonatkonzen- tration (PAS)
ROWE et al. 1985 Intraruminaler pH-
Wert
CHRISTIANSEN et al.
1965; YOUSSEF et al. 1968;
JOUANY u. SENAUD 1982, 1983
CONRAD et al. 1958;
KAHLON et al. 1970;
EADIE u. GILL 1971;
VEIRA et al. 1981;
GRUMMER et al. 1983;
VAN NEVEL et al. 1985
Tab. 2.8: Auswirkungen einer ruminalen Defaunation auf Charakteristika des ruminalen Metabolismus
Untersuchte Parameter
Erhöhung Erniedrigung Verdaulichkeit im
gesamten GIT
JOUANY u. SENAUD 1979b Verdaulichkeit im
IT
KAYOULI et al. 1986;
VEIRA 1986; PUNIA et al. 1987
USHIDA et al. 1989a
Futterverdaulich- keit
LINDSAY u. HOGAN 1972; KAYOULI et al.
1986; KREUZER et al.
1986
ABOU AKKADA u. EL-SHAZLY 1965;
KLOPFENSTEIN et al. 1966; PERKINS u.
LUTHER 1967; LINDSAY u. HOGAN 1972;
JOUANY et al. 1981b; VEIRA et al. 1981, 1983;
DEMEYER et al. 1982b; SZUECS et al. 1982;
KAYOULI et al. 1983, 1986; VEIRA 1986; VAN NEVEL et al. 1985; PUNIA et al. 1987;
DEMEYER 1989, 1989a Methanogenese
(PAS)
MATHIEU et al. 1996 DEMEYER u. VAN NEVEL 1979; ITABASHI et al. 1984; WHITELAW et al. 1984; KREUZER et al. 1986; USHIDA et al. 1986b
Tab. 2.8: Auswirkungen einer ruminalen Defaunation auf Charakteristika des ruminalen Metabolismus (Fortsetzung)
Untersuchte Parameter Erhöhung Erniedrigung Proteolytische
Aktivität (PAS)
STINCHI et al. 1986; USHIDA u. JOUANY 1985, 1986 Harnstoffabbau (PAS) TAKAHASHI u. KAMETAKA
1976 Bakterielle
Proteinsynthese (PAS)
DEMEYER u. VAN NEVEL 1979, 1986; SUTTON et al. 1983; LENG u. NOLAN 1984; KAYOULI et al.
1986; USHIDA et al. 1984, 1986a;
VERITE et al. 1986
Tab. 2.9: Auswirkungen einer ruminalen Defaunation auf die Leistung des Wiederkäuers Untersuchte
Parameter
Erhöhung kein signifi-
kanter Effekt
Erniedrigung Futterverwertung BIRD u. LENG 1978,
1983, 1984; BIRD et al.
1979; DEMEYER et al.
1982b
OSMAN et al. 1970;
RAMPAPRASAD u.
RAGHAVAN 1981 Lebendgewicht BECKER et al. 1929;
BECKER u. EVERETT 1930; BIRD u. LENG 1978, 1983, 1984; BIRD et al. 1978, 1979; DEMEYER et al. 1982b, 1986;
KAYOULI et al. 1982;
VAN NEVEL et al. 1985;
KREUZER u.
KIRCHGESSNER 1987b;
FORSTER u. LENG 1989a, b; HABIB et al.
1989
POUNDEN u.
HIBBS 1950;
BRYANT u.
SMALL 1960;
EADIE 1962a;
CHALMERS et al. 1968;
EADIE u.
GILL 1971;
WILLIAMS u.
DINUSSON 1973b; BIRD u.
LENG 1978
POUNDEN u. HIBBS 1950; BRYANT u.
SMALL 1960; ABOU AKKADA u. EL- SHAZLY 1964; ABOU AKKADA 1965;
CHRISTIANSEN et al.
1965; BORHAMI et al.
1967; OSMAN et al.
1970; ITABASHI u.
MATSUKAWA 1979;
RAMPAPRASAD u.
RAGHAVAN 1981;
IVAN et al. 1986; IVAN 1988
Wollwachstum BIRD et al. 1979; BIRD u.
LENG 1983, 1984;
COTTLE 1988a, b;
FORSTER u. LENG 1989a, b; HABIB et al.
1989
Fett der Karkasse VAN NEVEL
et al. 1985
RAMPRASAD u.
RAGHAVAN 1981
Tab. 2.10: Auswirkungen einer ruminalen Defaunation auf die Gesundheit des Wiederkäuers
Untersuchte Parameter
Verstärkung kein signifikanter Effekt
Erniedrigung Auftreten von
Laktazidose
NEWBOLD et al.
1986a Auftreten von
Kupferintoxikation
KREUZER u.
KIRCHGESSNER 1987b; IVAN 1988 Auftreten von
Diarrhoe
OSMAN et al. 1970 Auftreten von
Pansentympanie
CLARKE et al. 1969;
MOATE 1989
WILLIAMS u.
COLEMAN 1992
2.2.1 Bedeutung der Protozoen im Stickstoffstoffwechsel
Protozoen, Bakterien und Pilze sind alle in unterschiedlicher Art und Weise im Aminosäuren- und Proteinmetabolismus aktiv und beeinflussen entscheidend die Zusammensetzung der Pansenflüssigkeit (NOLAN 1989).
Während Bakterien lösliche Proteine an ihrer Zellwand adsorbieren, diese durch sezernierte Proteasen und Peptidasen hydrolisieren und danach die entstandenen Produkte resorbieren (NUGENT u. MANGAN 1981; BROCK et al. 1982; WALLACE 1985a), erfolgt die Proteinverdauung bei Protozoen intrazellulär. Infusorien - insbesondere Entodiniomorphida - inkorporieren hauptsächlich präformierte Eiweiße, also Bakterien, Futterproteine und teilweise andere Protozoen, und sind demnach für die Verdauung unlöslicher Proteine verantwortlich (COLEMAN 1975b; USHIDA u. JOUANY 1985; HINO u. RUSSEL 1987;
JOUANY 1996). Holotrichida geben darüber hinaus Endo- und Exopeptidasen in die Umgebung ab (UEDA et al. 1975) und können somit lösliche und unlösliche Proteine verwerten (ABOU AKKADA u. HOWARD 1962; ONODERA u. KANDATSU 1970b). Die so entstandenen Peptide werden sowohl von Bakterien als auch von Protozoen aufgenommen.
Nach FORSBERG et al. (1984) können einige (nicht näher beschriebene) Protozoen aber auch einfache Aminosäuren in ihr Zytosol transportieren und desaminieren. AHUJA und SARMAH (1979) vermuten, daß es einen zytosolischen und einen nicht-zytosolischen Aminosäurenpool gibt. Ersterer sei für die Proteinsynthese und letzterer für den Proteinabbau und für die Proteinsekretion wichtig.
Als Endprodukt des Proteinstoffwechsels der Protozoen werden Peptide, Aminosäuren, Harnstoff und Ammoniak ausgeschieden: Substrate, die von Bakterien aufgenommen werden und auf dem Weg der Bakterienphagozytose wieder an die Protozoen zurückgelangen können (Stickstoffkreislauf im Pansen, HARMEYER 1971, 1972, 1973). Frei werdendes Ammoniak erhöht dabei den pH-Wert im Pansen (VEIRA 1986; JOUANY 1989). Seine Entstehung ist durch Hemmung der Dipeptidasen mit Hilfe von Metallionen negativ beeinflußbar (WALLACE et al. 1996).
