Studien zur Vitalitätsabschätzung von Cryptosporidium parvum
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Ellen Eckert aus Wittingen
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. A. Daugschies
1. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. A. Daugschies
2. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. J. Pohlenz
Tag der mündlichen Prüfung : 1.06.2001
Meinen Eltern
Was wir wissen ist ein Tropfen, was wir nicht wissen ist ein Ozean.
Sir Isaac Newton
INHALTSVERZEICHNIS Seite
1. EINLEITUNG 13
2. LITERATURÜBERSICHT 14
2.1 Cryptosporidium parvum 14
2.1.1 Taxonomie 14
2.1.2 Biologie und Morphologie 17
2.1.2.1 Der Entwicklungszyklus 17
2.1.2.2 Wirtsspektrum 18
2.1.3 Epidemiologie 19
2.1.4 Kryptosporidiose als Zoonose 22
2.1.5 Pathogenese und Pathologie 24
2.1.6 Bekämpfung 26
2.1.6.1 Rehydratation 26
2.1.6.2 Therapie 27
2.1.6.2.1 Halofuginon 27
2.1.6.2.2 Weitere Medikamente 28
2.1.6.3 Antivirale Therapie 29
2.1.6.4 Immunisierung durch Kolostrum und die Wirkung
darmaktiver Substanzen 30
2.1.6.5 Prophylaxe 31
2.1.6.6 Desinfektion 31
2.1.6.6.1 Desinfektionsarten 32
2.1.6.6.2 Chemische Desinfektion 33
2.1.6.6.3 Desinfektionsmittelprüfung 35
2.1.7 Diagnostik 35
2.1.7.1 Nachweis von C.-parvum-Oozysten in Kotproben 35
2.1.7.2 Direkter C.-parvum-Nachweis 36 2.1.7.3 Indirekter C.-parvum-Nachweis 37
2.1.8 C. parvum in der Zellkultur 42
2.1.8.1 Vorbehandlung der Oozysten 42
2.1.8.2 Kultivierung in verschiedenen Zelllinien 42 2.1.8.3 C. parvum in der HCT-8-Zellkultur 45
2.1.8.3.1 C.-parvum-Vitalitätsnachweis in vitro 45
2.1.8.3.2 Inhibition von C. parvum in vitro 47
2.1.9 C. parvum im Tiermodell 48
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 52
3.1 Material und Methoden 52
3.1.1 C.-parvum-Gewinnung 52
3.1.1.1 Parasitenmaterial 52
3.1.1.2 Passagierung im Kalb 53
3.1.1.3 Anreicherung der C.-parvum-Oozysten 56 3.1.1.4 Reinigung der C.-parvum-Oozysten 57 3.1.1.5 Mikroskopischer Nachweis von C.-parvum-Oozysten 61
3.1.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten 63
3.1.3 C. parvum in der Zellkultur 64
3.1.3.1 Anlage einer HCT-8-Zellkultur 64
3.1.3.2 Lagerung der HCT-8-Zellkultur 67
3.1.3.3 Vitalitätsprüfung der HCT-8-Zellkultur 68 3.1.3.4 Infektion der HCT-8-Zellkultur mit C. parvum 69 3.1.3.5 Inhibition von C. parvum in vitro mit Paromomycin 70 3.1.3.6 Ernte der Zellkultur zur mikroskopischen Untersuchung 71
3.1.4 PCR von C. parvum 72
3.1.4.1 Ernte der Zellkultur für die PCR 72
3.1.4.2 Extraktion genomischer C.-parvum-DNA 72
3.1.4.2.1 Ethanolfällung 72
3.1.4.2.2 Extraktion mit Phenol und Chloroform 73
3.1.4.3 Auswahl der Primer 74
3.1.4.4 Herstellung der Mastermixe für die PCR 75
3.1.4.5 Ansetzen der Reaktion 77
3.1.4.6 Nachweis der PCR-Produkte im Agarosegel 78 3.1.4.6.1 Ladung der Elektrophoresekammer 78
3.1.4.6.2 Färbung des Gels 80
3.1.4.6.3 Ablichten des Gels 81
3.1.5 C.-parvum-Nachweis mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern 81
3.1.6 C. parvum-Infektion von BALB/c-Mäusen 83
3.1.6.1 Haltung der BALB/c-Mäuse 83 3.1.6.2 Infektion der Mäuse mit unbehandelten und behandelten
Oozysten 83 3.1.6.3 Gewinnung von Untersuchungsmaterial 85
3.1.7 Statistik 86
4. ERGEBNISSE 87
4.1 C.-parvum-Oozysten-Gewinnung 87
4.1.1 Passagierung im Kalb 87
4.1.2 Anreicherung der C.-parvum-Oozysten 87
4.1.3 Reinigung der C.-parvum-Oozysten 88
4.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten 88
4.3 Zellkultur 89
4.3.1 MTT-Test 89
4.3.2 Zellkulturmedium 91
4.3.2.1 DMEM oder RPMI-1640 91
4.3.2.2 Mediumzusätze 92
4.4 PCR von C. parvum 92
4.4.1 Extraktion genomischer C. parvum-DNA 92
4.5 Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit C.-parvum-Oozysten 94 4.5.1 Vergleich der Vitalität von C. parvum in 48- und
96-Kalotten-Zellkulturtestplatten 94
4.5.2 PCR-Ergebnisse C.-parvum-infizierter Zellkulturen bei Vernach-
lässigung des Plattentyps 97
4.5.3 Inhibition mit Paromomycin 99
4.5.4 Einfluß der Inkubationsdauer auf die In-vitro-Vitalität von C. parvum 101 4.5.5 Auswirkung der Desinfektion auf die Vitalität von C. parvum-
Oozysten in der Zellkultur 103
4.5.6 Auswirkung der Desinfektionsdauer auf die Vitalität von
C.-parvum-Oozysten 106 4.6 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung 107
4.6.1 Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit unterschiedlichen
Oozystendosen 107 4.6.2 Focuszählung nach Einsaat desinfizierter Oozysten 109
4.7 Infektion von Babymäusen 111
5. DISKUSSION 118
5.1 Gewinnung von C. parvum 118
5.1.1 Passagierung im Kalb 118
5.1.2 Anreicherung von C. parvum 119
5.1.3 Reinigung von C. parvum 119
5.2 Desinfektion der C.-parvum-Oozysten 121
5.3 PCR 122
5.3.1 Extraktion genomischer DNA 122
5.4 Zellkultur 123
5.4.1 HCT-8-Zellkultur 123
5.4.2 MTT-Test 123
5.4.3 Zellkulturmedium 124
5.4.4 Vitalität von unbehandelten C. parvum-Oozysten 125
5.4.5 Inhibition mit Paromomycin 127
5.4.6 Vitalität desinfizierter Oozysten 129
5.4.6.1 Auswirkung der Neopredisankonzentrationen 129 5.4.6.2 Auswirkung der Inkubationszeiten 131
5.5 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung 131 5.5.1 Vitalität von unbehandelten C.-parvum-Oozysten 131
5.5.2 Vitalität desinfizierter C.-parvum-Oozysten 133
5.6 Infektion von Babymäusen 134
5.7 Schlußfolgerung 137
6. ZUSAMMENFASSUNG 138
7. SUMMARY 140
8. LITERATURVERZEICHNIS 142
9. ANHANG 170
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
A. dest. Aqua destillata
bp Basenpaare
BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
C. Cryptosporidium
ca. circa
Caco-2 humane Kolon-Adenomakarzinomzellen
Cl Chlor cm Zentimeter
cm2 Quadratzentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
DAPI 4´,6-diamidino-2-phenylinole
DABCO 1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octane dATP desoxy-Adenosintriphosphat dCTP desoxy-Cytosintriphsphat dGTP desoxy-Guanosintriphophat DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP desoxy-Nukleotidtriphosphat dTTP desoxy-Thymidintriphosphat
DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft
EDTA Äthylendiamintetraessigsäure
EIA Enzym-Immun-Assay FDM foci-detection-method
FKS fetales Kälberserum
g Gramm h Stunde(n)
HCO3 Hydrogencarbonat
H2O Wasser
IgA Immunglobulin A
IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
Kap. Kapitel
KCl Kaliumchlorid kg Kilogramm l Liter M molar
MDBK Mardin-Darby-Rindernierenzellen MDCK Mardin-Darby-Hundenierenzellen min Minuten
mg Milligramm
Mg Magnesium
MgCl2 Magnesiumchlorid
ml Milliliter mm Millimeter mM millimolar
MPN most-probable-number assay
MTT Methyl-Thiazolblau n Stichprobenumfang Na Natrium
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
ng Nanogramm
NGA normal goat serum (Ziegenserum)
µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer
OD600 Optische Dichte 600 nm
p Statistische Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS Phosphate buffered saline (phosphat-
gepufferte physiologische Kochsalzlösung)
PCR Polymerasekettenreaktion Pen. Penicillin
pg Pikogramm PI Propidium-Jodid
p.i. post infectionem
pmol Pikomol
p.o. per os
RL95-2 endometriale Karzinomzellen
± s Standardabweichung
s.c. subcutan sek Sekunde spp. Spezies Strept. Streptomycin Tab. Tabelle
TBE Tris/Borat/EDTA
TPP Techno Plastic Products
x arithmetrischer Mittelwert
x g relative Zentrifugalbeschleunigung
1 EINLEITUNG
Die Kryptosporidiose ist eine Kokzidiose, die durch parasitäre Protozoen der Gattung Cryptosporidium verursacht wird. Mittlerweile gilt C. parvum beim Menschen als dritthäufigster Diarrhoeerreger weltweit (GRIFFITH 1998).
Die im Darm lebenden Protozoen kommen vorwiegend bei Kälbern in den ersten Lebenswochen vor. Bei erwachsenen Tieren verläuft die Infektion in der Regel symptomlos.
Die infizierten Kälber erkranken klinisch an starker, wäßriger Diarrhoe und können an den Folgen eines Flüssigkeitsdefizites sterben (FAYER et al. 1997).
Bis vor kurzem gab es in Deutschland noch keine spezifischen Therapiemöglichkeiten, um ein an C. parvum erkranktes Kalb zu behandeln. Die symptomatische Therapie beschränkt sich auf eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr per os oder Elektrolyt- und Glukoseinfusionen intravenös oder subkutan. Da Kryptosporidien nicht wirtsspezifisch sind, können sie auch andere Tiere und den Menschen befallen. Kryptosporidien nehmen eine bedeutende Rolle als humanpathogene Erreger bei Menschen mit einem schwachen Immunsystem ein (CASEMORE et al. 1997)
Zahlreiche Autoren beschäftigen sich mit der Wirkung von Medikamenten und Desinfektion auf Kryptosporidien. Die Testung antikryptospordienwirksamer Mittel direkt am Tier oder im Stall bringt viele Nachteile mit sich. Hierbei handelt es sich um Aspekte des Tierschutzes, des ökonomischen Aufwandes sowie der unzureichenden Standardisierungsmöglichkeiten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fähigkeit von Kryptosporidien, vor und nach einer Desinfektion Zellkulturen zu infizieren, getestet. Das Desinfektionsmittel sollte hierbei eine messbare Vitalitätsminderung hervorrufen. Die Vitalität unbehandelter und behandelter Oozysten wurde mittels PCR der infizierten Zellkulturen beurteilt. In weitergehenden Untersuchungen wurden zum Vergleich mikroskopische Nachweisverfahren, monoklonale Antikörper und ein Mausmodell herangezogen.
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Cryptosporidium parvum
2.1.1 Taxonomie
Stamm APICOMPLEXA apikaler Komplex mit Polring, Conoid,
Mikronemen und Rhoptrien; subpelli-
kuläre Tubuli mit Mikroporen
Klasse SPOROZOA geschlechtliche und ungeschlechtliche Vermehrung, Oozystenbildung
Unterklasse COCCIDIA Trophozoiten und sexuelle Stadien intrazellulär
Ordnung EUCOCCIDIIDA Merogonie in Vertebraten
Unterordnung EIMERIIDA Makro- und Mikrogamonten entwickeln
sich getrennt
Familie CRYPTOSPORIDIIDAE Gattung CRYPTOSPORIDIUM
Art CRYPTOSPORIDIUM PARVUM
Die Familie der monoxenen Cryptosporidiidae zeichnet sich durch Merogonie, Gamogonie und Sporogonie im Wirt aus. Kryptosporidien sind einwirtig, die Oozyste enthält eine Sporozyste mit vier Sporozoiten. Die Entwicklung erfolgt intrazellulär und extraplasmatisch.
TYZZER (1907) beschrieb als erster den Entwicklungszyklus von Kryptosporidien in den Magendrüsen und dem Dünndarm einer Labormaus (TYZZER 1907, 1910, 1912). TYZZER benannte die Spezies im Magen Cryptosporidium muris und die im Dünndarm Cryptosporidium parvum. Es wurden noch weitere acht Kryptosporidienarten benannt. Bei einigen dieser Arten hat sich herausgestellt, daß es sich um Fehlklassifizierungen von
Sarcocystis spp. handelte (MORGAN et al. 1999). Die verbliebenen acht Arten, die zur Familie der Cryptosporidiidae gehören, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Derzeit anerkannte Arten der Gattung Cryptosporidium
ART WIRT
Erstmals beschrieben in AUTOR
C. meleagridis Truthühner SALVIN (1955)
C. wrairi Meerschweinchen VETTERLING et al. (1971) C. baileyi Hühnervögel CURRENT et al. (1986)
C. felis Katze ISEKI (1979)
C. nasorum Fisch HOOVER et al. (1981)
C. serpentis Reptilien LEVINE (1980)
C. muris Maus TYZZER (1910)
C. parvum Maus TYZZER (1912)
C. parvum ist für 79 Säugetierspezies einschließlich des Menschen infektiös (O´DONOGHUE 1995). Die allgemeine Einteilung in verschiedene Spezies basiert auf der Wirtsspezifität, der Oozystenmorphologie und dem Infektionsort. C. parvum ist am häufigsten unter den Säugetieren verbreitet und C. muris wurde bei chronisch infizierten Tieren gefunden (FAYER et al. 1997). Eine Kryptosporidiose bei einem Kalb mit chronischer Diarrhoe wurde erstmals von PANCIERA et al. (1971) beschrieben. MEUTIN (1974) und MORIN (1976) beschäftigten sich in den Jahren darauf mit der Kryptosporidiose des neonatalen Kalbes.
Mit Hilfe der Molekularbiologie und der damit verbundenen neuen Techniken, wie zum Beispiel Westernblot, Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR), Random amplified polymorphic DNA (RAPD), etc. sammelten sich immer mehr Daten an, so daß man heute auch noch weitere Differenzierungen vorgenommen hat. C. parvum läßt sich in
verschiedene Subtypen unterteilen, da es Unterschiede in Virulenz, Infektiösität und Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten gibt (MORGAN et al. 1999). Antigene Unterschiede werden im Westernblot von verschiedenen Autoren aufgezeigt, die MORGAN et al. (1999) in ihrer Veröffentlichung zusammengefaßt haben. MORGAN et al. (1999) weisen darauf hin, dass es einen ”Mensch"- und einen ”Rind"- Genotyp von C. parvum gibt, die sich mit Isoenzym-Analyse und RAPD-Analyse unterscheiden lassen. Der Genotyp ”Rind”
kann Kälber, Mäuse und auch Menschen infizieren. Der Genotyp ”Mensch” hingegen löst nur eine Infektion beim Menschen aus (PENG 1997, WIDMER 1998). Mit der Methode der Arbitrary Primed-PCR (AP-PCR) konnten FAITH et al. (1998) diese genotypischen Unterschiede der beiden Isolate bestätigen. Im Gegensatz dazu haben TZIPORI und GRIFFITH (1998) die humanen Isolate von C. parvum eingeteilt in diejenigen, die Mäuse, Kälber und Ferkel infizieren können und diejenigen, die im Tiermodell nur bei Ferkeln Durchfall auslösen.
Weiterhin wurde diskutiert, ob es spezifische C.-parvum-Genotypen der Maus, des Schweines oder des Beuteltieres gibt. Auch Genotypen, die spezifisch für Hunde und Frettchen sind, könnte es möglicherweise geben (MORGAN et al. 1999). Phenotypische und genotypische Unterschiede wurden eingesetzt, um das "Mensch"- vom "Rind"- Isolat zu unterscheiden.
Manche Isolate bevorzugten deutlich einen Wirt, um sich zu reproduzieren (TZIPORI u.
GRIFFITH 1998). Bei Untersuchungen an bestimmten DNA-Sequenzen von C.-parvum- Isolaten waren die Interspezies-Beziehungen signifikant enger als die Intraspezies- Beziehungen (XIAO et al. 1999 a u. b). XIAO et al. (1999 b) stellten dazu einen Stammbaum mit den verschiedenen Verwandtschaftsgraden der einzelnen Isolate auf. Im Stammbaum von TZIPORI und GRIFFITHS (1998) wird bestätigt, dass verschiedene Kryptosporidienarten zum Teil näher miteinander verwandt waren als verschiedene Subtypen. Damit besteht noch erheblicher Klärungsbedarf, um eine allgemeine Taxonomie der Kryptosporidien aufstellen zu können.
2.1.2 Biologie und Morphologie
2.1.2.1 Der Entwicklungszyklus
TYZZER (1910, 1912) beschrieb sehr detailliert den Entwicklungszyklus von C. parvum in der Maus. Die zu den Apicomplexa gehörenden Parasiten haben einen Generationswechsel, den man in drei verschiedene Abschnitte unterteilen kann:
1. Sporogonie: eine Reduktionsteilung, die der Gamogonie folgt 2. Schizogonie: eine ungeschlechtliche Vielteilung
3. Gamogonie: die geschlechtliche Generation
Die Sporogonie erfolgt schon im Gastrointestinaltrakt des Wirtes, der damit voll infektiöse Oozysten mit dem Kot ausscheidet. Werden die Oozysten von einem empfänglichen Wirt aufgenommen, kommt es durch das Zusammenwirken der Körpertemperatur, der Enzyme des Pankreas und der Gallensalze zur Exzystierung der Sporozoiten. Nach der Exzystierung werden von den 5,5 µm großen Oozysten je vier Sporozoiten freigesetzt. Das Vorderende der Sporozoiten heftet sich vorwiegend im hinteren Teil des Jejunums und Ileums an eine Darmepithelzelle in der luminalen Darmschleimhaut und wird von einer von Mikrovilli des Darmepithels gebildeten parasitophoren Vakuole umgeben. Damit liegen die Entwicklungsstadien von C. parvum intrazellulär und extrazytoplasmatisch. Es bildet sich eine Haftzone und eine Stoffwechsellamelle, die aus der Verschmelzung von Mikrovilli und Parasitenpellikula resultieren (ROMMEL 2000).
Die Sporozoiten runden sich ab zu kugelförmigen Trophozoiten. Es erfolgt nun die asexuelle Vermehrung, die Schizogonie, bei der sich die Trophozoiten teilen. C. parvum hat zwei verschiedene Typen von Schizonten, die auch Meronten genannt werden. Der Typ-I-Schizont entwickelt 48 Stunden post infectionem (p.i.) sechs oder acht Kerne, dabei liegt jeder in einem bananenförmigen Tochterindividuum, dem Merozoiten, der strukturell dem Sporozoiten entspricht. Diese Schizogoniestadien treten bis zum 7. Tag p.i. auf. Jeder reife Merozoit kann nach Verlassen des Schizonten eine weitere Epithelzelle infizieren und sich dann zu einem
Typ-I-oder Typ-II-Schizonten entwickeln. Der Typ-II-Schizont bildet vier Merozoiten. Diese können sich weiter differenzieren in männliche Mikrogamonten und weibliche Makrogamonten. Die geschlechtlichen Stadien der Gamogonie treten bereits 72 Stunden p.i.
auf. Jeder Mikrogamont teilt sich mehrfach, so dass bis zu 16 geißellose Mikrogameten entstehen, die funktionell dem Spermium äquivalent sind. Die Makrogamonten teilen sich nicht weiter und stellen das Eizellenäquivalent dar. Werden die Mikrogameten freigesetzt, kann ein Mikrogamet in einen Makrogamonten eindringen und es kommt zur Fusion von Makro- und Mikronuklei, der Syngamie. Nur befruchtete Makrogamonten können sich in eine Oozyste wandeln, die in situ sporuliert und dann wieder vier Sporozoiten enthält. Die Oozysten gelangen in das Darmlumen und werden mit dem Kot ausgeschieden. Nach einer durchstandenen Infektion bildet sich bei einem immunkompetenten Tier eine ausreichende Resistenz gegenüber C. parvum aus, so dass das Tier nicht noch einmal erkrankt (THEODOS 1998).
2.1.2.2 Wirtsspektrum
Kryptosporidien sind bei sehr unterschiedlichen Tierarten zu finden. Wie schon in dem Kapitel zur Taxonomie (Kap. 2.1) erwähnt, sind für eine C.-parvum-Infektion 79 Säugetierspezies, wie zum Beispiel Schweine, Pferde, Frettchen, Katzen, Hunde und Hamster, empfänglich (O´DONOGHUE 1995). Potenziell stellt C. parvum also für fast alle Säugetiere ein Gesundheitsrisiko dar, die Kontakt zu C.-parvum-Oozysten haben. Dies stellt ein erhebliches epidemiologisches Problem dar, da sich C. parvum über ein weites Wirtsspektrum vermehren und ausbreiten kann (O´DONOGHUE 1995).
Aus veterinärmedizinischer Sicht ist das Rind der wichtigste Wirt von C. parvum;
insbesondere Kälber erkranken in den ersten Lebenswochen. C. parvum kommt auch in der Ziege (MAJEWSKA et al. 2000) oder dem Schaf vor (ANGUS et al. 1981, TZIPORI et al.
1981, NAGY et al. 1984, TZIPORI 1988), aber die Bedeutung des Parasiten bei diesen Wirten ist nicht genau dokumentiert. Serologische Untersuchungen deuten auf eine weite Verbreitung von C. parvum bei Schweinen hin (TZIPORI u. CAMPBELL 1981, QUILEZ et al. 1996).
Ferkel haben oft noch zusätzliche enteropathogene Erreger, die ebenfalls Durchfälle verursachen, und meist erkranken die Ferkel an C. parvum nur asymptomatisch (SANFORD 1987).
Weiterhin werden Infektionen bei Katzen, Hunden und Pferden beschrieben, die eine potenzielle Quelle für Infektionen des Menschen sein können (TZIPORI und GRIFFITH 1998), doch kryptosporidienbedingte Durchfälle werden bei diesen Tierarten nach TZIPORI (1985) nicht gesehen. Bei diesen drei Spezies stellten TZIPORI und CAMPBELL (1981) allerdings mit serologischen Untersuchungen eine hohe Prävalenz fest. Die Infektion beim Pferd verläuft ebenfalls meist subklinisch (XIAO und HERD 1994). Bei Katzen gibt es nur wenige Dokumentationen über patente Infektionen mit C. parvum (FAYER et al. 1997).
Die diversen Genotypen von C. parvum sind nicht beliebig auf verschiedene Wirtsarten übertragbar (siehe Taxonomie, Kap. 2.1.). Derzeit gelten die domestizierten und wildlebenden Wiederkäuer, besonders die neugeborenen Tiere, als die wichtigste Infektionsquelle für Tier und Mensch (CASEMORE et al. 1997).
Bei der Übertragung von Mensch auf Mensch sind besonders immunsupressive Menschen und Kinder betroffen (CASEMORE 1990, UNGAR 1990, CURRENT 1994). Ein zusammenfassender Rückblick zeigt, dass die Kryptosporidiose in Kindertagesstätten weit verbreitet ist (CORDELL und ADISS 1994). Ferner kommt es in Krankenhäusern zu C.- parvum-Infektionen durch die Übertragung von Patient zu Patient und von Patient zu Personal (KOCH 1985, NAVARRETTE 1991).
2.1.3 Epidemiologie
Die meisten veterinär-epidemiologischen Daten liegen für Rinder vor. Klinische Erkrankungen treten vorwiegend bei jungen Tieren auf, und es werden altersbezogene Empfindlichkeiten gegenüber C. parvum beim Kalb von HARP et al. (1990 a u.1990 b) beschrieben.
In einer in den USA durchgeführten Studie waren 22 % der 7369 untersuchten Kälber mit Kryptosporidien infiziert und insgesamt 59 % der 1103 untersuchten Bestände von C. parvum betroffen. Hierbei waren fast die Hälfte der 7-12 Tage alten Kälber infiziert (GARBER et al.
1994). LORENZO-LORENZO et al. (1993) konnten eine hohe Prävalenz von C. parvum Antikörpern bei erwachsenen Rindern, die asymptomatisch erkrankt waren, feststellen. Im Rahmen von Untersuchungen des Veterinäruntersuchungsamtes Oldenburg wurden in 44 % von 284 untersuchten Kälber bzw. in 42,5 % der untersuchten Betriebe Kryptosporidien nachgewiesen. In den Winter- und Frühjahrsmonaten erfolgte ein Anstieg der positiven Befunde (FIEDLER 1985).
In Dänemark konnten HENRICKSEN und KROGH (1985) nur eine leichte Tendenz zu höheren Infektionsraten im zweiten Quartal des Jahres feststellen und ermittelten die niedrigste Infektionsrate im vierten Quartal des Jahres, was im Gegensatz zu den Untersuchungen des Veterinäramtes Oldenburg steht.
In Großbritannien stellt die Kryptosporidiose ein zunehmendes Problem dar. Der ”U.K.
Veterinary Investigation Service” stellte 1994 2177 C.-parvum-Infektionen fest, im Jahr 1984 waren es nur 216 Fälle. Dabei konnten nicht alle erkrankten Tiere erfaßt werden, da durch die Unterschätzung der C.-parvum-Infektionen nicht alle Rinder auf C. parvum untersucht wurden, obwohl sie möglicherweise infiziert waren. Unveröffentlichte C.-parvum-Infektionen konnten ebenfalls nicht mit erfaßt werden (CASEMORE et al. 1997).
In einer an der Universität Gießen durchgeführten Studie konnten bei 40 % der mit Durchfall eingelieferten Kälber C.-parvum-Oozysten nachgewiesen werden. Der höchste Anteil an Ausscheidern befand sich in der Altersgruppe bis zu 4 Wochen. Bei 45,5 % dieser Kälber konnten keine weiteren enteropathogenen Erreger festgestellt werden. 37 % der Kälber, die keine Durchfallerscheinungen hatten, schieden ebenfalls C. parvum aus (SIEBERT u.
GRÜNDER 1991).
KRULL (2000) wertete die Ergebnisse der Routinediagnostik von fünf staatlichen Untersuchungsämtern in der Bundesrepublik Deutschland aus und stellte einen durchschnittlichen C.-parvum-Befall von 20 –30 % der untersuchten Kälberkotproben und histologisch untersuchten Därme fest.
Bei Kälbern in Schweizer Mutterkuhbetrieben beträgt die durchschnittliche Prävalenz in den ersten drei Lebensmonaten 16,8 %. In Tiefstreulaufställen bestand für C. parvum ein signifikant höheres Infektionsrisiko als in Boxenlaufställen. Dies kann an dem engeren Kontakt zu den Ausscheidungen älterer Tiere liegen. Wenn die Futterration der Mütter zu mehr als 50 % aus Heu bestand, sank das Risiko für eine Ausscheidung von C. parvum (LENTZE et al. 1999).
Subklinisch erkrankte Rinder können bis zu 7 Millionen Oozysten täglich ausscheiden (SCOTT et al. 1994). CASEMORE et al. (1997) stellten die Besonderheiten, die die Epidemiologie von C. parvum ausmachen, zusammen. Dazu zählten die geringe Größe der Oozysten von nur 4-6 µm, die Resistenz gegen Umwelteinflüsse und Desinfektionsmittel und die Ausscheidung sporulierter und damit voll infektiöser Oozysten. C. parvum hat ein großes Reservoir an Wirtstieren einschließlich des Menschen. KLESIUS et al. (1986) haben C.
parvum aus wilden Mäusen isoliert und konnten sie dann erfolgreich auf das Kalb und Labor- Mäuse übertragen. Der Erreger kommt ubiquitär vor und es ist nur eine geringe Infektionsdosis von 10 -100 Oozysten notwendig, um eine Erkrankung auszulösen. Die Reproduktionsrate von C. parvum im erkrankten Wirt ist sehr hoch (>1010).
Bekämpfungsprobleme liegen in der hohen Resistenz gegenüber Desinfektionsmitteln und unzureichenden spezifischen Therapiemöglichkeiten begründet (CASEMORE et al. 1997).
Wegen der Schwere der C.-parvum-Infektionen bei AIDS-Patienten wurden weltweit Daten über Kryptosporidiose in diesem Personenkreis gesammelt. So konnten bei AIDS-Patienten in Mittel- und Südamerika (Brasilien, Kuba, Mexiko und Venezuela), Europa (Frankreich, Dänemark, Italien, etc.) Afrika (Äthiopien) und Asien (Taiwan, Thailand etc.) gehäuft C.- parvum-Infektionen als Durchfallerreger gefunden werden (GRIFFITH 1998). Auch wenn C.
parvum-Infektionen weltweit vorkommen, ist die globale Verteilung von C.-parvum-
Infektionen bei Menschen nicht einheitlich und reicht von einigen Prozent in den entwickelten Ländern der nördlichen Hemisphäre bis hin zu 10 % in wärmeren, weniger entwickelten Ländern (CASEMORE 1990).
2.1.4 Kryptosporidiose als Zoonose
Grundsätzlich ist jedes Tier und jeder Mensch einem Risiko ausgesetzt, eine Kryptosporidiose zu bekommen (KEUSCH et al. 1995). Die enge ökologische Beziehung zwischen Mensch und Rind läßt vermuten, dass viele C.-parvum-Infektionen des Menschen Zoonosen sind. Die Infektion von Mensch zu Mensch ist besonders in überfüllten Wohnvierteln verbreitet. Die zur Infektion erforderliche Menge an Oozysten ist sehr gering und aufgrund der Größe des Parasiten ist es sehr schwer, das Trinkwasser durch Filtration kryptosporidienfrei zu bekommen (FRICKER und CRABB 1998, GRIFFITH 1998). Weiterhin ist es schwierig, einen schnellen C. parvum Nachweis zu führen, da die zu untersuchende Fäzesprobe spezielle Färbungen erfordert. Es wird befürchtet, dass die Häufigkeit humaner Kryptosporidiose in Zukunft zunehmen wird (GRIFFITH 1998).
PALMER und BIFFIN (1990) untersuchten die klinischen und epidemiologischen Aspekte der Kryptosporidiose bei Kindern in England und Wales und ermittelten, dass C. parvum neben Campylobacter der am häufigsten vorkommende Verursacher von gastrointestinalen Erkrankungen bei ein bis fünf Jahre alten Kindern ist und zweimal häufiger auftritt als Salmonellen.
Sehr selten kommt es zu einer Übertragung der C.-parvum-Oozysten von Haustieren wie Hunden und Katzen auf den Menschen (CASEMORE et al. 1997). CASEMORE et al. (1997) listen die prädisponierenden Faktoren für eine Kryptosporidieninfektion wie folgt auf:
Immundefizienz: AIDS oder andere Immundepression hervorrufende Krankheiten, Unterernährung
Zoonotischer Kontakt: Camping, Rucksacktourismus, Bauernhofbesuch
direkter Kontakt mit infizierten Tieren oder Menschen: Tierärzte, Bauern, Krankenschwestern, Mediziner, Laborangestellte, Erzieherinnen
Kontakt zu kontaminierten Flächen/Material/Wasser
Rohmilch oder nicht pasteurisierte Milch, rohes Fleisch, etc.
Menschen können sich über Tiere an C. parvum infizieren. Über Ausbrüche von C. parvum in der Bevölkerung wird seit den frühen 80er Jahren vermehrt berichtet. Meist wurden nur bestimmte Personengruppen untersucht, wie zum Beispiel Kinder (CRAWFORD u.
VEERMUND 1988; CASEMORE 1990). FAYER u. UNGER (1986) und CURRENT (1986) weisen auf die Gefahr der Übertragung von C. parvum auf den Menschen hin, die unmittelbaren Kontakt mit infizierten Kälbern hatten. Zahlreiche Infektionen am Menschen leiten sich von jungen infizierten Kälbern und Lämmern direkt oder indirekt ab (CURRENT 1986, CASEMORE 1990, DAWSON et al. 1995). DAWSON et al. (1995) zeigten einen unmittelbaren Zusammenhang zwischen Schulbesuchen auf Bauernhöfen und dem Auftreten von Zoonosen einschließlich der Kryptosporidiose. CASEMORE (1990) berichtete Fälle, bei denen erkrankte Personen Kontakt zu Reitställen oder Gartendünger hatten, obwohl in letzterem nur eine geringe Anzahl an Oozysten gefunden werden konnte.
In einer Studie an Freiwilligen konnten DUPONT et al. (1995) zeigen, dass schon eine Dosis von 30 Oozysten ausreichend für eine Infektion ist. In der Epidemiologie von C. parvum ist durch Rinder oder andere Tiere kontaminiertes Wasser ein wichtiger Faktor für eine zoonotische Übertragung. Entwässerungsgräben können Rinderfäzes enthalten und so durch Ablauf andere Gewässer kontaminieren (BRIDGMAN et al. 1995). Zu einem massiven Ausbruch in der Bevölkerung kam es 1993 in Milwaukee (USA). In diesem Zusammenhang konnte eine Zoonose nicht direkt nachgewiesen werden, doch ist das Gebiet um Milwaukee bekannt für seine ausgedehnte Milchviehhaltung. Für eine Übertragung über kontaminiertes Trinkwasser sprechen auch die heftigen Regenfälle, die es vor dem Ausbruch gab und die zu einem vermehrten Eintrag von Oozysten von Weideflächen in Gewässer geführt haben könnten (MACKENZIE et al. 1994).
Kontaminierte Nahrung kann ebenfalls eine Infektionsquelle sein. So erkrankten nach einem Verzehr von handgepresstem Cider auf einer landwirtschaftlichen Ausstellung 54 % von 284 Personen an einer Kryptosporidiose. Nach einer Untersuchung konnte festgestellt werden, dass sowohl der Cider als auch die Kälberfäzes der Bauernhöfe, von denen der Cider stammte, C. parvum enthielten (MILLARD et al. 1994).
2.1.5 Pathogenese und Pathologie
Gewöhnlich kann eine ausgeprägte Kryptosporidiose nur entstehen, wenn die Resistenzlage des Wirtes ungünstig ist. Dies kann bedingt sein durch das Alter, eine fehlende Immunantwort bei einer Erstinfektion, die Ernährung und/oder durch ein geschwächtes Immunsystem (CASEMORE et al. 1997). Nach GREGORY (1990) infiziert ein erfolgreicher Parasit jeden möglichen Wirt und richtet nur minimalen Schaden an, so dass unter natürlichen Bedingungen keine Erkrankungserscheinungen auftreten. Diese Balance zwischen Wirt und Parasit kann durch verschiedene prädisponierende Faktoren (siehe Kap. 2.1.4) gestört sein und es kommt zu einer klinischen Erkrankung. Die Erreger können sich stark vermehren und der Wirt kann der Replikation des Eindringlings nichts entgegensetzen. Schädigungen können von zwei Seiten her entstehen: durch den Parasiten selbst und durch die Wirtsreaktion auf den Parasiten. C. parvum schädigt direkt durch Nährstoffentzug, mechanische Alterationen und toxische oder allergene Ausscheidungs- und Stoffwechselprodukte des Parasiten (GREGORY 1990). Die Kryptosporidien verdrängen den Mikrovillisaum der Epithelzellen und stören somit indirekt die Funktion der Darmmukosa. Durch die kleinere Resorptionsoberfläche kommt es zur Malabsorption. Es tritt ein Verlust von Enzymaktivitäten auf, der wahrscheinlich zu einer unzureichenden Spaltung von Zucker und Eiweiß führt (ROMMEL 2000). Entzündungsreaktionen können unspezifisch das betroffene Wirtsgewebe alterieren (GREGORY 1990).
Klinisch zeigt sich die Kryptosporidiose durch Diarrhoe meist ohne Blutbeimengungen.
Läsionen am Darm entstehen durch primäre Entzündungsprozesse am Darm, epitheliale Hyperplasie und Epithelzellverlust. Histologisch stehen vaskuläre Veränderungen, Zellinfiltrationen und epitheliale Hyperplasien im Vordergrund (GREGORY 1990).
Vaskuläre Veränderungen:
Die generelle Entzündungsreaktion bei einer Kryptosporidiose beruht auf Hyperämie und Ödemen, die aber auch gleichzeitig eine Reaktion auf opportunistische Bakterien oder Rota- und Coronaviren sein können. Mukosale Mastzellprodukte erhöhen die Permeabilität des Endothels und Epithels mit der Folge von Ödemen und Flüssigkeitsverlusten (GREGORY 1990).
Zellinfiltrationen:
In das geschädigte Gewebe treten neutrophile und eosinophile Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen ein. Neutrophile Granulozyten treten vor allem auf, wenn der epitheliale Deckmantel zerstört ist und Sekundärerreger eingedrungen sind (GREGORY 1990).
Epitheliale Hyperplasie:
Die Zerstörung der Epithelzellen hat eine Epithelzellproliferation zur Folge. Intestinale Zellen entstehen vermehrt aus den Stammzellen an der Basis der Lieberkühnschen Krypten. Die erhöhte Proliferation führt zu einer Verlängerung der Krypten, und die Epithelzellzerstörung im Dünndarm führt zu einer Bürstensaumatrophie (GREGORY 1990). Bei einer Monoinfektion mit C. parvum, die HEINE et al. (1984) an keimfrei aufgezogenen Kälbern durchgeführt haben, sind Malabsorption im gesamten Darm und gestörte Verdauung im Dünndarm die Hauptursachen der Diarrhoe. Dies kann zu einem Überwuchern der intestinalen Mikroflora führen, zur Veränderung des osmotischen Druckes entlang der Darmwand und infolge dessen zu einem Verlust von Flüssigkeit in das Darmlumen. Bei AIDS-Patienten ist eine durch C. parvum verursachte sekretorische Diarrhoe auf eine toxinvermittelte Hypersekretion zurückzuführen (CURRENT und BLAGBURN 1990).
VITOVEC und KOUDELA (1988) führten eine experimentelle Studie an Mäusen durch, um die Lokalisation und Pathogenität von C. parvum zu untersuchen. Der Parasit konnte hauptsächlich im hinteren Jejunum und Ileum, Zäkum und vorderen Kolon lokalisiert werden.
Im mittleren Jejunum und hinteren Kolon fand man nur sporadisch Kryptosporidien. Die Mäuse zeigten keine klinische Erkrankung. Histologisch konnten die typischen Merkmale einer Kokzidiose festgestellt werden. TZIPORI et al. (1983) infizierten 21 Kälber mit C.
parvum und untersuchten sie klinisch und pathologisch. Äußerlich zeigten die erkrankten Tiere zunächst Depression und Anorexie, dann Durchfall, der eine weiße oder gelbe Farbe hatte und von pastöser bis wässriger Konsistenz war. Zum Teil befanden sich im Kot Blutbeimengungen, Galle, Mukus und unverdaute Milch. In der Sektion zeigten sich zum Teil gasgefüllte Darmabschnitte mit gelbem Kot, die intestinalen Lymphknoten waren vergrößert und ödematös. Die meisten Oozysten fanden sich im distalen Dünndarmabschnitt. Zäkum, Kolon und Duodenum waren aber auch teilweise mit Kryptosporidien infiltriert. Im Allgemeinen bildet sich eine Immunität aus, bei der IgA-Antikörpern eine besondere Bedeutung zukommt (ROMMEL 2000).
2.1.6 Bekämpfung
2.1.6.1 Rehydratation
Eine symptomatische Behandlung des Flüssigkeitsverlustes und der Gewichtsabnahme durch Rehydratationsmaßnahmen und Glukoseinfusionen unterstützen den Genesungsprozeß (GRIFFITH 1998). Die orale und parenterale Rehydratation mit Flüssigkeiten und Elektrolyten und chemotherapeutischen Zusätzen (siehe Kap.2.1.6.2.1 Halofuginon), die antikryptosporidielle Wirkung besitzen, werden bei erkrankten Kälbern eingesetzt. Die Rehydratation ist vor allem wichtig bei jungen Tieren und bei Tieren mit einer Sekundärinfektion. Mit einer antibiotischen Therapie können pathogene Bakterien, die eine zusätzliche Belastung darstellen, behandelt werden (BLAGBURN u. SOAVE 1997).
2.1.6.2 Therapie
2.1.6.2.1 Halofuginon
In der Europäischen Union (EU) ist Halofuginon als Medikament beim Kalb zugelassen (ROMMEL 2000). VILLACORTA et al. (1991) untersuchten die Effizienz und Wirksamkeit von Halofuginon bei Kälbern. In der nicht behandelten Kontrollgruppe schieden 93 % der Kälber bis zu 10 Tage C. parvum aus, 62 % von ihnen zeigten Durchfallerscheinungen.
Unmittelbar nach Beginn der Behandlung mit Halofuginon konnte kein kryptosporidienbedingter Durchfall mehr festgestellt werden. Diese Tiere blieben sieben Tage nach Absetzen von Halofuginon C. parvum negativ (VILLACORTA et al. 1991). Die Oozystenausscheidung wurde durch die tägliche Verabreichung von 60 oder 120 µg/kg Lebendgewicht vollständig gehemmt (PEETERS et al. 1993). Geringe Dosen von Halofuginon können eine Infektion nicht komplett unterbrechen. Eine Dosis von 60-125 µg/kg Lebendmasse Halofuginon über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht ist hingegen zur Behandlung von Kälbern geeignet (VILLACORTA et al. 1991).
In einem Feldversuch führte KRULL (2000) an 152 Saugkälbern aus verschiedenen deutschen Betrieben, die Durchfallprobleme mit gleichzeitigem Nachweis von C. parvum hatten, Therapieversuche mit unterschiedlichen Konzentrationen von Halofuginon und Sulfadimidin durch. Behandlungsschema nach KRULL (2000): Die Kälber werden gewichtsabhängig (2 ml pro 10 kg Körpergewicht ) mit je 7 – 9 ml/Tag Halofuginon (0,05 g Halofuginon-Base/100 ml) behandelt (100 µg/kg/Tag). In der Placebo-Gruppe und der Sufadimidin-Gruppe trat Durchfall signifikant häufiger und schwerer auf und diese Kälber wiesen einen schlechteren Allgemeinzustand auf als die der Halofuginon-Gruppe. Das von KRULL (2000) durchgeführte Behandlungsschema ist geeignet zur Behandlung in Problembeständen.
2.1.6.2.2 Weitere Medikamente
Die meisten Studien, die sich mit gegen C. parvum wirksamen Medikamenten beschäftigten, wurden mit Nagetieren, wie Inzucht- und Auszuchtmäusen (siehe Kapitel 2.7) und Ratten, (REHG 1991 a u. b) gemacht. Die Behandlung natürlicher Infektionen sowie die Behandlung von experimentell infizierten Tieren steht dabei im Vordergrund (REHG 1991 a u. b, FAYER u. ELLIS 1993 a u. b, PEETERS et al. 1993, LUGINBÜHL et al. 1996, LINDSAY et al.
2000).
Wirksamkeit von Medikamenten am Kalb
Die getesteten Wirkstoffe Paromomycin, Lasalocid und Halofuginon (siehe oben) sind mehr oder weniger gegen C.-parvum Infektion bei Wiederkäuern wirksam (BLAGBURN u.
SOAVE 1997).
Paromomycin konnte in einer Dosis von 100 mg/kg Lebendgewicht (zweimal täglich für elf Tage) die Oozystenausscheidung und die Häufigkeit des Durchfalls signifikant verringern. Bei einer Dosis von 100 mg/kg Lebendgewicht konnten keine Oozysten in den Fäzes nachgewiesen werden, jedoch schieden die Kälber bei geringeren Dosierungen von 25 bzw.
50 mg/kg Paromomycin nach der ersten Woche der Behandlung wieder Oozysten aus (FAYER u. ELLIS 1993 a).
LUGINBÜHL und PFISTER (1996) empfehlen bei einer klinisch manifesten Kryptosporidiose zweimal täglich 6 mg/kg Lasalocid zu verabreichen. Nach drei Tagen konnte die klinische Abheilung und Hemmung der Oozystenausscheidung festgestellt werden, ohne das Nebenwirkungen (Apathie, Schwäche, Festliegen, Zittern der Kaumuskulatur) festgestellt werden konnten. Eine einmalige Verabreichung von 10 mg/kg zeigte keine Wirkung (LUGINBÜHL und PFISTER 1996). Höhere Dosen (15 mg/kg) zeigten toxische Wirkungen (LUGINBÜHL und PFISTER 1996). GÖBEL (1987) konnte bei der Dosierung von 15 mg/kg/Tag keine Nebenwirkung feststellen.
Wirksamkeit von Medikamenten an Nagetieren
Bei Nagetieren wurden ebenfalls eine Reihe verschiedener Chemotherapeutika auf ihre Wirksamkeit gegen C. parvum überprüft. Hierzu gehören Sulfonamide oder Makrolidantibiotika sowie Antiparasitika wie Decoquinat. Die Sulfonamide Sulfadimethoxin (120 mg/kg/Tag) und Sulfamethazin (175 mg/kg/Tag) waren prophylaktisch und therapeutisch wirksam, wenn der Behandlungsbeginn am Tag 0 p.i. oder am Tag 10 p.i. war. Es konnte eine Wirksamkeit von 76 % (Sufamethoxin) bis zu 83 % (Sufamathazin) erreicht werden. Die Bewertung erfolgte anhand der Zählung der C.-parvum-Entwicklungsstadien im Ileum (REGH 1991 a).
Die Makrolidantibiotika Erythromycin (200 mg/kg/Tag) und Azithromycin (200 mg/kg/Tag) zeigten in einer 11tägigen Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe (17 Kryptosporidien/Ileumzotte, 1,7 Kryptosporidien/100 µm) bei REGH (1991 b) eine Reduzierung der Parasitenstadien im Ileum (0/0,2 Kryptosporidien/Ileumzotte) und im Zäkum (0,5 Kryptosporidien /100 µm Zäkum) der Ratten.
Die Behandlung von Mäusen mit Decoquinat (2,5 und 5 mg/kg) bewirkte keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl vorhandener C.-parvum-Oozysten. Die Oozystenanzahl betrug durchschnittlich ca. 136,5 x 104 bei unbehandelten Mäusen, ca. 144,6 x 104 bei Mäusen, die mit 2,5 mg/kg Decoquinat behandelt wurden und 190,5 x 104 Oozysten bei Mäusen, die mit 5 mg/kg behandelt wurden (LINDSAY et al. 2000).
2.1.6.3 Antivirale Therapie
Die Wirkung von 13 antiviralen Substanzen auf C.-parvum-Entwicklungsstadien in einer HCT-8-Zellkultur wurde mit einem ELISA überprüft und kann möglicherweise zu einer neuen Strategie der Kryptosporidiose-Therapie führen. Sechs Präparate sind Nucleosid-Analoge und weisen eine geringe Wirksamkeit gegen C. parvum auf (GRIFFITH 1998).
Ein intaktes Immunsystem ist auch heute noch der wichtigste Faktor zur Bekämpfung der Erkrankung. Eine symptomatische Behandlung des Flüssigkeitsverlustes und der Gewichtsabnahme durch Rehydratationsmaßnahmen und künstliche Ernährung unterstützen den Genesungsprozeß beim Menschen (GRIFFITH 1998) und beim Tier (BLAGBURN u.
SOAVE 1997).
2.1.6.4 Immunisierung durch Kolostrum und die Wirkung darmaktiver Substanzen
Häufig erkranken Tiere in den ersten Lebenstagen an einer Kryptosporidiose, bevor ihr Immunsystem ausgereift und fähig ist, spezifische Immunantworten zu geben. Eine passive Immunisierung durch maternales Kolostrum könnte möglicherweise einen Schutz gegen C.
parvum aufbauen. Die dreimalige Immunisierung von Schwarzbunten-Kühen mit jeweils 300 µg gereinigtem rekombinanten Protein (rC7) von C. parvum verhindert bei Fütterung des Kolostrums an Kälber und nachfolgender oraler Infektion mit 107 Oozysten Diarrhoe und reduziert signifikant die Oozystenausscheidung (PERRYMAN et al. 1999). Die Verabreichung von hyperimmunem Rinderkolostrum ab der vierten Lebensstunde, das mit Antikörpern gegen C.-parvum-Oozysten versetzt worden ist, führt bei einer C.-parvum- Infektion der Kälber am 4. Lebenstag zu einer verkürzten Patenz, verminderter Oozystenausscheidung und abgeschwächter Diarrhoe im Vergleich zu Kälbern, denen normales Kolostrum verabreicht worden ist (FAYER et al. 1989). Im Gegensatz dazu erwies sich bei HARP et al. (1990a) die Fütterung von Rinderkolostrum, das spezifische C.-parvum- Antikörper enthält, die mit einem ELISA nachgewiesen werden konnten, als wirkungslos gegen eine C.-parvum-Infektion. In dieser Untersuchung wurden die Kühe mit Oozysten immunisiert, waren aber nicht hyperimmun (HARP et al. 1990 a).
Enterocin-C, ein Milchaustauscher mit Allicin, Fruktooligosacchariden und darmaktiven Bakterien, hat keine signifikanten Auswirkungen auf das Ausmaß der Diarrhoe oder die Gewichtszunahmen bei C. parvum infizierten Kälbern (OLSON et al. 1998). Ein Vergleich dreier Versuchsgruppen, die entweder oral mit einer C.-parvum-Vakzine oder mit Laktat-
produzierenden Bakterien behandelt wurden oder unbehandelt blieben, zeigten nach experimenteller Infektion keine Unterschiede im Infektionsverlauf (HARP et al. 1996).
2.1.6.5 Prophylaxe
Ziel der Prophylaxe sollte es sein, durch die Kombination von hygienischen Maßnahmen und gezielter symptomatischer Behandlung erkrankter Tiere, eine Ansteckung anderer Tiere zu verhindern und somit die Ausbreitung der Kryptosporidien einzudämmen (BLAGBURN u.
SOAVE 1997).
Um eine Ausbreitung von C. parvum zu verhindern, sollten die epidemiologischen Aspekte berücksichtigt werden (siehe Kap. 2.1.3 und 2.1.4). Der Kontakt mit C.-parvum-Oozysten sollte gemieden werden. Infizierte Tiere sollten abgesondert in Quarantäne gestellt werden und der Zutritt zu ihnen nur durch ein Desinfektionsbad des Schuhwerks möglich sein. Ställe, die leicht zu reinigen und desinfizieren sind, und regelmäßig gesäubert und desinfiziert werden, beugen ebenfalls einer Ausbreitung der Infektion vor. Die Übertragung über verunreinigtes Futter und Wasser sollte unterbunden werden. Nagetiere und Wildtiere sollten von dem Viehbestand ferngehalten werden. Das Personal sollte Kleidung tragen, die regelmäßig gereinigt wird (BLAGBURN u. SOAVE 1997).
Zahlreiche Medikamente wiesen auch eine prophylaktische Wirkung gegen C. parvum auf (siehe Kap. 2.1.6.2), jedoch ist nur Halofuginon als wirksames Medikament bei lebensmittelliefernden Tieren zugelassen.
2.1.6.6 Desinfektion
Die C.-parvum-Oozysten sind sowohl gegenüber Umwelteinflüssen (siehe Kap. 2.1.4) als auch gegenüber Desinfektionsmitteln sehr widerstandsfähig (EXNER u. GORNIK 1990, FAYER et al. 1997).
2.1.6.6.1 Desinfektionsarten
Eine Desinfektion kann durch physikalische oder chemische Methoden erreicht werden (PETZOLDT u. KIRCHHOFF 1986). Ziel einer Desinfektion ist die Abtötung bzw.
irreversible Inaktivierung von krankheitserregendem Material an oder in kontaminierten Objekten (STEUER et al. 1998). GUNDERMANN et al. (1991) sahen die Aufgabe der Desinfektion in der Reduzierung der Zahl an Infektionserregern auf einer Fläche oder einem Gegenstand, so daß eine Übertragung von Infektionserregern nicht mehr möglich ist.
Es sollte sowohl eine laufende Desinfektion (z.B. regelmäßige Reinigung der Gegenstände, bei denen mit Kontamination zu rechnen ist, Nutzung von Desinfektionswannen für Schuhwerk), die während der Zeit der Erkrankung stattfindet, als auch eine Schlußdesinfektion des Raumes bzw. Stalles vorgenommen werden. Die Desinfektion eines Stalles kann in vier Schritten ablaufen (STEUER et al. 1998):
1. Entfernen des Mistes und Verbrennen 2. Gründliche Reinigung mit viel Wasser 3. Reinigung mit einem eiweißlösenden Mittel 4. Anwendung des Desinfektionsmittels
5. Abwaschen des Desinfektionsmittels, Flächen mit Kalkmilch bestreichen
Vor einer Raumdesinfektion sind alle zu desinfizierenden Einrichtungsgegenstände so aufzustellen, daß das Aerosol (z.B. 5 g Formaldehyd, bzw. 15 g Formalin/1 m3) gut eindringen kann. Die starke Reaktionsfähigkeit vieler Desinfektionsmittel mit Eiweiß erfordert eine gründliche Reinigung der Flächen vor Desinfektionsbeginn (STEUER et al.
1998). Die Desinfektion wird bestimmt durch die Konzentration des Desinfektionsmittels, die Einwirkzeit und die Temperatur (PETZOLDT u. KIRCHHOFF 1986).
2.1.6.6.2 Chemische Desinfektion
Zur chemischen Raum- und Flächendesinfektion können Präparate auf Aldehydbasis (z.B.
Formalin) verwendet werden (STEUER et al. 1998). Weitere Desinfektionsmittelgruppen sind Laugen (Natronlauge, Kalkmilch), Halogene (Chlor und Chlorverbindungen, Jod), Phenole, Phenolderivate (Kresole), Alkohole (Ethanol, Isopropanol) und oberflächenaktive Verbindungen (Amphotenside, quaternäre Ammoniumverbindungen) (PETZOLDT u.
KIRCHHOFF 1986).
Chemische Desinfektionsmittel gegen Bakterien und Viren wurden auf ihre Effektivität gegen C. parvum getestet. Viele Desinfektionsmittel sind auf C. parvum ungenügend wirksam (FAYER et al. 1997) (siehe Tab. 2).
BLEWETT (1989) führte Desinfektionsversuche mit anschließender Bestimmung der Exzystierung von C.-parvum-Oozysten durch. Die Reduktion der Vitalität wurde über die Verminderung der Exzystierungsrate ermittelt. Die Vitalität der Oozysten konnte in Tiermodellen (QUINN u. BETTS 1993, FAYER et al. 1996) oder in vitro in Zellkulturen (siehe Kap. 2.1.8.3.2) untersucht werden (siehe Tab. 2). Mit Desinfektionsmitteln (siehe Tab.2) wurden Reduktionsraten von C. parvum von 19 % bis 99 % erreicht. Die Untersuchung der C.-parvum-Desinfektion mit Gasen (Formaldehyd, Ammoniak, Ethylenoxid, Methylbromid, Kohlenmonoxid) und anschließender Überprüfung an BALB/c Mäusen ergab eine desinfizierende Wirkung von Gasen mit niedrigem Molekulargewicht. Ethylenoxid und Methylbromid haben die größte Effektivität und sind am besten als Desinfektionswirkstoff geeignet. Kohlenmonoxid hingegen zeigt keine Wirkung auf C. parvum (FAYER et al. 1996).
STEIN et al. (1983) testeten vier im Handel befindliche Desinfektionsmittel (Wirkstoffe:
Schwefelkohlenstoff, Phenol, Chloroform, Perchloräthylen und Alkohol).
Kryptosporidienhaltiger Kälberkot, der mit der empfohlenen und der 1,5fachen Konzentration dieser Desinfektionsmittel behandelt wurde, verursacht nach zweistündiger Inkubation eine Infektion von Babymäusen.
Tabelle 2: Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen C. parvum
Desinfektionsmittel Inkubations-
bedingungen Ergebnis Autor
5 mg/l, 2 Std. Oozysten exzystieren Chlor
80 mg/l, 2 Std. 99 % Reduktion* in vivo
QUINN u. BETTS 1993
1 %, 30 min., 22 °C 55 % Reduktion**
Hypochlorit
1 %, 30 min. 37 °C 59 % Reduktion**
BLEWETT 1989 10 %, 30 min., 22 °C 19 % Reduktion**
Jod
10 %, 30 min., 37 °C 53 % Reduktion**
BLEWETT 1989
Ethanol 90 %, 30 min., 22 u.
37 °C keine Reduktion** BLEWETT 1989 Propanol 90 %, 30 min., 22 u.
37 °C keine Reduktion** BLEWETT 1989 Isopropanol 90 %, 30 min., 22 u.
37 °C keine Reduktion** BLEWETT 1989 1 %, 30 min., 22 °C 36 % Reduktion** BLEWETT 1989 1 %, 30 min., 37 °C 67 % Reduktion** BLEWETT 1989 Formaldehyd
100 % Gas, 24 Std. infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Ammoniak 100 % Gas, 24 Std. nicht infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Kohlenmonoxid 100 % Gas, 24 Std. infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Ethylenoxid 100 % Gas, 24 Std. nicht infektiös in vivo FAYER et al. 1996 Methylbromid 100 % Gas, 24 Std. nicht infektiös in vivo FAYER et al. 1996
* Reduktion der Infektiösität im Tiermodell
** Reduktion entspricht der Abnahme der Exzystierungsrate in vitro
2.1.6.6.3 Desinfektionsmittelprüfung
In den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) zur Prüfung von Desinfektionsmitteln an Kokzidienoozysten ist ein Lysistest an sporulierten und unsporulierten Oozysten von Eimeria tenella sowie ein Sporulationshemmtest an unsporulierten Oozysten in vitro vorgesehen. Das Desinfektionsmittel wird dazu vor jedem Versuch in doppelter Anwendungskonzentration mit destilliertem Wasser angesetzt. Die Einwirkzeiten betragen 30, 60, 90, 120 und 180 min. Unter einem Mikroskop wird die Anzahl intakter Oozysten und der Anteil unsporulierter und sporulierter Oozysten bestimmt.
Entscheidend für die Bewertung des Desinfektionserfolges ist aber der Infektivitätsverlust der Oozysten im Infektionstest mit Hühnerküken. Als Testobjekte für die Prüfung von Desinfektionsmitteln an Kokidienoozysten dienen ausschließlich Eimeria-tenella-Oozysten.
Die Aussagekraft zur Wirkung auf C. parvum bleibt durch die höherer Resistenz von C.
parvum (siehe oben u. Kap. 2.1.3 ) eingeschränkt. Es ist kein entsprechendes Verfahren für C.
parvum vorhanden.
2.1.7 Diagnostik
Eine korrekte Diagnose ist die Grundlage einer sinnvollen Bekämpfung der Kryptosporidiose.
So ist es beispielsweise wichtig Eltern, deren Kinder erkrankt sind, vor einem Infektionsrisiko zu warnen um so eine Ansteckung anderer Personen zu verhindern. Zum anderen dient eine Untersuchung des Trinkwasser auf Kontamination mit C.-parvum-Oozysten dem Schutz der öffentlichen Gesundheit (GRIFFITH 1998).
2.1.7.1 Nachweis von C.-parvum-Oozysten in Kotproben
Zur Diagnostik kann es von Vorteil sein, die Oozysten in den Fäzesproben vorher anzureichern, um den Nachweis auch geringer Mengen Oozysten zu ermöglichen.
Eine einfache Sedimentation ohne Zentrifugation ist hierzu oft nicht ausreichend. In einer Untersuchung der Sedimentationsgeschwindigkeit von C. parvum, C. muris und C. baileyi in Abhängigkeit von der Temperatur und dem umgebenen Medium zeigte C. parvum deutlich die geringsten Sedimentationsgeschwindigkeiten, was SRETER und SZELL (1998) auf die geringe Größe (C. parvum: 4,5 µm, C. muris: 6,5 µm, C. baileyi: 7,5 µm) und Dichte der Oozysten zurückgeführt haben. Daher ist für die Anreicherung die Verwendung von Zentrifugen erforderlich (SRETER u. SZELL 1998).
Eine vorteilhafte Alternative zur Sedimentation ist die Flotation. Hierzu benötigt man Lösungen (gesättigte Salz- oder Zuckerlösungen) mit einem spezifischen Gewicht über 1,2.
Das originale Sheather´s Flotationsmedium stellt ein Zucker-Wasser-Gemisch mit einem spezifischen Gewicht von 1,2 dar (SHEATHER 1923). Es gibt noch Variationsmöglichkeiten mit unterschiedlichen spezifischen Gewichten und Zusätzen wie Formaldehyd oder Phenol, um das Wachstum von Bakterien und Pilzen zu verhindern (UPTON 1997).
CURRENT (1990) benutzte die Zucker-Flotationstechnik zur Gewinnung von Oozysten.
Diese Technik hat gegenüber anderen Flotationsverfahren den Vorteil, daß die Oozysten reiner sind und eine größere Anzahl Oozysten gewonnen werden kann.
2.1.7.2. Direkter C.-parvum-Nachweis
Post mortem lassen sich C.-parvum-Entwicklungsstadien am sichersten in Tupfpräparaten der Ileumschleimhaut auf Objektträgern nachweisen. Die Präparate werden mit Methanol fixiert und nach Giemsa gefärbt. Als Untersuchungsmaterial eignen sich ebenfalls histologische Schnitte des Darmes und Kotausstriche vom lebenden Tier. Eine schnell anzuwendende Färbung kann die Untersuchung von Kotproben erleichtern. Hierbei werden ein Tropfen Kot mit einem Tropfen Karbolfuchsin auf einem entfetteten Objekträger vermischt und dünn ausgestrichen. Nach der Trocknung wird das Präparat mit Immersionsöl bedeckt und unter maximal möglicher Vergrößerung unter einem Lichtmikroskop untersucht. Die Oozysten stellen sich im Hellfeldmikroskop als 4 - 4,5 µm große lichtbrechende runde Gebilde dar. Mit
Hilfe des Interferenzmikroskopes lassen sich die Oozysten leicht anhand ihrer Morphologie identifizieren (HEINE 1982, ROMMEL 2000).
In einer modifizierten Ziehl-Neelsen-Färbetechnik von HENRIKSEN und POHLENZ (1981) kommt zur Karbolfuchsinfärbung noch eine Gegenfärbung mit Methanolblau hinzu. Dies ist ebenfalls eine schnelle und einfache Färbetechnik, bei der sich die hellroten Oozysten gegenüber einem blaugrünen Hintergrund aus Fäzespartikeln abheben.
Weitere Modifikationen der Ziehl-Neelsen-Technik beschrieben BRONSDON (1984) und POHJOLA et al. (1985) indem sie zusätzlich Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendeten. Bei dieser Technik können andere Parasiten, die bei spezifischen Immunfluoreszenztechniken oder Enzymassays übersehen werden, ebenfalls ermittelt werden (siehe Kap. 2.1.7.3). Die Fluoreszenz-Färbemethode ist sensitiver, aber es kann genau wie bei Hellfeldfärbungen zu falsch positiven Ergebnissen kommen, und Oozysten anderer Kokzidienarten bleiben zum Teil unerkannt (ARROWOOD 1997). Zu den direkten Nachweismöglichkeiten gehören ebenfalls die unter Kap. 2.1.7.1 erläuterten Flotations- und Sedimentationtechniken.
2.1.7.3 Indirekter C.-parvum-Nachweis
Bei dem indirektem Nachweis von C. parvum werden Antikörper, Antigene, genomische DNA oder messengerRNA nachgewiesen.
C.-parvum-Nachweis mit Antikörpern
Serologische Techniken zum Nachweis von Oozysten mit Hilfe von Kaninchenimmunserum beschrieben STRIBBS und ONGERTH (1986). Um die Technik der Immunfloureszenz noch weiter zu spezifizieren, benutzten ARROWOOD und STERLING (1989) monoklonale Antikörper. Mit der Immunfloureszenz-Technik konnten signifikante Erhöhungen in der Sensitivität und der Spezifität gegenüber konventionellen Nachweismethoden, wie z.B. der
Färbetechnik nach HEINE (1982) erzielt werden und so Kryptosporidien-Entwicklungsstadien im infizierten Gewebe gezeigt werden (ARROWOOD und STERLING 1989).
Zuvor mit Natriumhypochlorit oder Natriummetaperiodat behandelte Oozysten büßen zum Teil ihre Fähigkeit ein, von bestimmten Antikörpern erkannt zu werden. Durch die chemische Behandlung sind die Oozysten zwar noch vital, aber die Epitope an der Oberfläche der Oozysten werden zerstört. Somit kann die Wiederfindungsrate aus Wasserproben erniedrigt sein und zu falsch negativen Ergebnissen führen. Dieses Problem kann möglicherweise durch die Verwendung von Antikörpern, die an nicht labile Antigene binden, umgangen werden (MOORE et al. 1998). WOODS et al. (1995) entwickelten mit einen ELISA zum Nachweis von vitalen Oozysten eine in-vitro-Nachweismethode von C. parvum.
Eine C.-parvum-Infektion kann auch durch serologischen Antikörpernachweis diagnostiziert werden. Im Serum treten IgG-Antikörper 6 Tage nach einer Infektion auf. In den Fäzes sind IgG, IgA und IgM 5-6 Tage nach Infektionsbeginn nachweisbar (ROMMEL 2000). Humorale Antworten auf Kryptosporidieninfektionen wurden zuerst mit der indirekten Immunfloureszenz im infiziertem Gewebe dargestellt. Antikryptosporidien-Immunglobuline wurden in 10 Säugetierspezies demonstriert (TZIPORI und CAMPBELL 1981).
C.-parvum-Nachweis mit Vitalfarbstoffen
CAMPBELL et al. (1992) untersuchten die Vitalität von Oozysten anhand einer in vitro Exzystierung mit Ein- oder Ausschluß von fluoreszierenden Vitalfarbstoffen (4´,6-diamidino- 2-phenylinole (DAPI), Propidium-Jodid (PI)). Cervine-ovine Oozystenisolate konnten deutlich mehr DAPI aufnehmen als humane oder bovine Oozystenisolate und waren gegenüber PI negativ. Oozysten mit einer Oozystenwand, die permeabel gegenüber DAPI und nicht permeabel gegenüber PI ist, exzystieren nach zwei Stunden Inkubation. Solche Oozysten werden als vital angesehen. Die hohe Vitalität der cervinen-ovinen Oozysten erklären die Autoren durch eine andere Reinigungsmethode. Die Fäzes wurden für diese Reinigungsmethode mit 1 %igem Natriumdodecylsulfat inkubiert und anschließend sedimentiert.
C.-parvum-Nachweis mit Kits
Die kommerziell erhältlichen Enzym-Immun-Assays (EIA) ”ProSpecT Cryptosporidium Microtiter assay” (Alexon, Inc., Kalifornien, USA) und ”ColorView Cryptosporidium assay”
(Seradyn, Indianapolis, Indiana, USA) haben eine Sensitivität von 94,5 %. Der direkte Immunfluoreszenzassay ”Merifluor Cryptosporidium Kit” (Meridian, Diagnostics, Cincinnati, Ohio, USA) und die ”Acid-fast Kinyounfärbung” Methode weisen eine Sensitivität von 96,4
% auf. Somit ist bei allen Tests mit falsch negativen Ergebnisse zu rechnen. Der Colorview Test und die ProSpect Methode erfordern einen erheblichen technischen Aufwand, insgesamt waren der ProSpect-Test und der Merifluor-Test am leichtesten zu handhaben (KEHL et al.
1994).
C.-parvum-Nachweis mit der Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction: PCR)
Die PCR ist eine molekularbiologische Methode, mit der gezielt spezifische DNA-Sequenzen schnell vervielfältigt und nachgewiesen werden können (SAKI et al. 1985, MULLIS u.
FALOONA 1987). Als Starthilfe wird ein Oligonukleotidprimer verwendet, der aus kurzkettigen einzelsträngigen DNA-Molekülen besteht und sich an den Enden einer definierten Sequenz der DNA-Matrize anheftet. Die DNA-Polymerase verlängert in Gegenwart von Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTP) die Primer und synthetisiert somit neue DNA-Stränge. In einem Zyklus werden zunächst bei ca. 95-100 °C die doppelsträngige DNA geschmolzen (Denaturierung), dann erfolgt die Primeranlagerung bei 37-65 °C und eine Primerverlängerung (Extension) schließt sich bei 72 °C an. Im Verlauf einer PCR wird ein Zyklus mehrmals wiederholt, wobei auch die neu synthetisierten DNA-Stränge als Matrize dienen und es so zu einer exponentiellen Vermehrung des gesuchten DNA-Abschnittes kommt (NEWTON u. GRAHAM 1994).
Die PCR-Produkte (Amplifikate) können mit der Elektrophorese in einem Agarosegel und nachfolgender Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden. Andere Nachweistechniken für PCR-Amplifikate sind Southern-Blot-, Dot-Blot-Hybridisierung oder Elektrochemolumineszenz (NEWTON u. GRAHAM 1994).
Eine PCR kann mit verschiedenen Ausgangangsmaterialien von C. parvum durchgeführt werden:
PCR direkt aus Oozysten
LAXER et al. (1991) konstruierten ein spezifisches und sensitives PCR Verfahren, das sich für Diagnostik, Gewebeuntersuchungen sowie für epidemiologische Untersuchungen eignet.
Als Amplifikationsziel wurde eine 400-Basenpaar (bp)-Region des C.-parvum-Genoms gewählt. WEBSTER et al. (1993) bestätigen die Sensitivität und Spezifität der PCR, verwendeten aber eine Sequenz von 329 bp als Replikationsziel. Ihrer Meinung nach ist diese PCR geeignet für diagnostische Proben und epidemiologische Studien. WAGNER-WIENING et al. (1995) fanden weitere C.-parvum-spezifische DNA-Regionen von 873 bp und 604 bp.
Die Spezifität und Sensitivität der Primer war ausreichend, um eine geringe Anzahl an Sporozoiten (Nachweisgrenze 873-bp-Primer: 100 Sporozoiten, 604-bp-Primer: 10 Sporozoiten) nachzuweisen. Zur Überprüfung ihrer Ergebnisse benutzten sie ein Exzystierungsprotokoll, um tote und lebende Oozysten zu unterscheiden.
PCR aus organischem Gewebe
Geringste Mengen (0,8 pg) reiner Parasiten-DNA und weniger als 0,1 ng Parasiten-DNA in der Ileummukosa können durch die PCR nachgewiesen werden. Bei nicht immunsupprimierten Mäusen, in deren Fäzes keine Oozysten nachgewiesen werden können, sind mindestens 25 ng Mukosa-DNA notwendig, um eine stattgefundene Infektion mit der PCR nachzuweisen zu können (PETRY et al. 1998).
PCR aus Zellkulturmaterial
LAXER et al. (1992) konnten den Nachweis von C. parvum in fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten mit der PCR führen. Auch in diesem Fall wurde die Methode als sensitiv und spezifisch für C. parvum angesehen. DENG und CLIVER (1998) wiesen durch die PCR C.-parvum-DNA im Überstand einer mit C. parvum infizierten Zellkultur nach. Die hierbei verwendeten Primer lieferten eine spezifische Bande von 452 bp und amplifizierten keine PCR-Produkte mit DNA von C. muris, Giardia lamblia, E. coli oder den
Zellen der Zellkultur. Ein 280-bp-Fragment, das nicht von den Oozysten oder Sporozoiten stammen kann, war möglicherweise Meronten, Mikrogamonten oder Makrogamonten zuzuweisen (DENG u. CLIVER 1998).
PCR-Nachweis in Wasserproben
Eine sehr sensitive Nachweismethode ist notwendig, um auch geringe Oozystenmengen in der Umwelt, vor allem im Trinkwassersediment, nachzuweisen. FILKORN et al. (1994) optimieren den C.-parvum-Nachweis mittels PCR durch Kombination mit weiteren Arbeitsschritten. Die Zerstörung aller freien DNA im Untersuchungsmaterial, anschließende Exzystierung der vorhandenen Oozysten und die nachfolgende PCR der Sporozoiten-DNA erhöht die Nachweisbarkeit von C. parvum. Es wurde der Vitalitätsnachweis von C. parvum erbracht, da nur die lebensfähigen Sporozoiten mittels einer PCR nachgewiesen werden konnten. JOHNSON et al. (1995) erhöhten die Sensitivität durch eine magnetische Antikörper-Bindung, die der Sensitivität einer Immunfluoreszenz zum Nachweis von C.- parvum-Oozysten im konzentrierten Abwasser entspricht. Dieses Verfahren wurde bei dem großem C.-parvum-Ausbruch in Milwaukee verwendet (siehe Kap. 2.1.3).
PCR und Random Amplified Polymorphic (RAPD) DNA-Methode
Der von ZHILIANG et al. (1995) entwickelte Primer SB50 wurde mit der RAPD-DNA- Methode hergestellt. Er liefert PCR-Signale sowohl von den Fäzes C.-parvum-infizierter Patienten, als auch von natürlich infizierten Kälbern und experimentell infizierten Mäusen.
WU et al. (2000) konnten durch die mit der RAPD-DNA-Methode hergestellten Primer eine Sensitivität erreichen, mit der man eine einzelne C.-parvum-Oozyste (bzw. 0,156 pg Oozystenmaterial) nachweisen kann.
2.1.8 C. parvum in der Zellkultur
Um Vorgänge wie zum Beispiel den Entwicklungszyklus, die Entwicklungsstadien, Reaktion auf chemische oder physikalische Behandlung von C. parvum besser beobachten zu können, ist eine C.-parvum-Infektion in der Zellkultur hilfreich.
2.1.8.1 Vorbehandlung der Oozysten
Bevor C.-parvum-Oozysten in die Zellkultur gebracht werden, wird die Exzystierungsrate bestimmt (WOODMANSEE 1987, FILKORN et al. 1994, MAILLOT et al. 1997, SLIFKO et al. 1998). Die Exzystierungsrate kann dabei von verschiedenen Faktoren abhängen. Hierzu zählen der pH-Wert (FAYER u. LEEK 1984, WOODMANSEE 1987), der Zusatz von Taurogallensäure oder Trypsin (FAYER et al. 1984, WOODMANSEE 1987, UPTON et al.
1994 b) und der CO2-Gehalt sowie die Temperatur während der Exzystierung (FAYER et al.
1984). Aber auch ohne ein spezielles Exzystierungsmedium mit bestimmten Zusätzen können Exzystierungsraten von bis zu 90 % in der Zellkultur beobachtet werden (UPTON et al. 1994 b). Der wichtigste Schritt hierbei ist die Behandlung der Oozysten mit Natriumhypochlorit und die anschließende Inkubation der Oozysten bei 37 °C. Nicht vorbehandelte Oozysten exzystierten sehr schlecht. Werden ausreichende Exzystierungsraten mit dieser Methode erzeugt, können aufwendige Behandlungen der Oozysten, wie die Reinigung der Sporozoiten mit einem Anionen-Austausch-Chromatographen, über Cäsiumchlorid- oder Percoll®- Gradienten wegfallen (TAGHI-KILANI u. SEKLA 1987, UPTON et al. 1994 b).
2.1.8.2 Kultivierung in verschiedenen Zelllinien
C. parvum läßt sich in verschiedenen Zelllinien kultivieren (Tab. 3). Am besten geeignet sind epitheliale Zelllinien, wie humane Kolon-Adenomakarzinomzellen (Caco-2) oder endometriale Karzinomazellen (RL95-2). Galaktose-adaptierte humane Kolon- Adenomakarzinomzellen (HT-29), humane ileozäkale Adenomakarzinomzellen (HCT-8) und
Mardin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) können ebenfalls verwendet werden (UPTON 1997). Vergleichende Untersuchungen zwischen der Infektiösität für humane Enterozyten- Zelllinien führten MAILLOT et al. (1997) an Caco-2, HT-29, HCT-8 und den TC7 und PF11 Klonen von Caco-2 Zellen durch und bestätigen, dass alle drei Zelllinien zur in vitro Kultivierung von C. parvum genutzt werden können.
Ein Vergleich zwischen HT-29 (originaler Herkunft von humanen Kolonkarzinomzellen) und differenzierten HT-29 (Ähnlichkeit mit epithelialen Stammzellen, gleiche morphologische und funktionelle Charakteristika) zeigte eine fünffach höhere Infektiösität von C. parvum in den differenzierten HT-29-Zellen (FLANIGAN et al. 1991). Die Infektionssraten schwankten von 3 % bis 50 % in Caco-2-Zellen (BURAUD et al. 1991, GRIFFITH et al. 1994). UPTON et al. (1994 a) konnten klare Unterschiede zwischen der Infektiösität von C. parvum in verschiedenen Zelllinien beobachten. Die Entwicklungsrate von C. parvum in BALB/3T3, HT-29 und RL- Zellen lag 20 % unter der Entwicklung in MDBK-Zellen. Die HCT-8 Zelllinie hatte die höchste Infektionsrate und somit die besten Entwicklungsergebnisse für C. parvum ergeben. Es war unklar, warum diese Zelllinie den anderen Zelllinien überlegen war. Es wurde angenommen, daß unter anderen Umgebungsverhältnissen mit anderen Medien oder Zusätzen eine andere Zelllinie der HCT-8 Zelllinie überlegen sein könnte (UPTON et al. 1994 a).
Teilweise entwickelten sich zwei oder mehr C.-parvum-Stadien in einer Zelle (ROSALES et al. 1983). In einer elektronenmikroskopischen Untersuchung der ultrastrukturellen Entwicklungsvorgänge einer mit C. parvum infizierten HT-29 Zellkultur konnten sechs Stunden nach Inokulation Trophozoiten nachgewiesen werden. Die Entwicklung vom Trophozoiten zum Schizonten vollzog sich innerhalb von 24 Stunden (AJI et al. 1991).
Aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, wie Trophozoiten, Meronten, Mikrogametozyten und Makrogametozyten konnten beobachtet werden (GUT et al. 1991, AJI et al. 1991, SLIFKO et al. 1997 a). In einigen Fällen konnten die Stadien nicht definiert zugeordnet werden (ROSALES et al. 1983).
Tabelle 3: C.-parvum-Infektionen in verschiedenen Zelllinien
Zelllinie Kurzbezeichnung Autor
Mardin-Darby-canine kidney MDCK
ROSALES et al. 1983 GUT et al. 1991
MITSCHLER et al. 1994
Human fetal lung HFL CURRENT u. HAYNES 1984
Primary chicken kidney PCK CURRENT u. HAYNES 1984
Porcine kidney PK CURRENT u. HAYNES 1984
Human colonic adeno-
carcinoma CACO-2 BURAUD et al. 1991
GRIFFITH et al. 1994 Human endometrial
carcinoma RL-95-2 RASMUSSEN et al. 1993
Human colonic carcinoma HT-29 FLANIGAN et al. 1991 AJI et al. 1991
Human ileocaecal adeno-
carcinoma HCT-8
UPTON et al. 1994 a u. b SLIFKO et al. 1997 a u. b SLIFKO et al. 1998 Mardin-Darby-bovine-kidney MDBK UPTON et al. 1994 a BALB/c mouse embryo BALB/3T3 UPTON et al. 1994 a
Die direkten Auswirkungen von C. parvum auf infizierte Zellkulturen waren Monolayerdefekte, vor allem eine Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran und als dessen Folge der epitheliale Zelltod (GRIFFITH et al. 1994).
Neben der Wahl einer bestimmten Zelllinie konnte eine Variation der Infektionsdosis und der Inkubationszeit helfen, die Parasitenentwicklung in vitro zu optimieren (RASMUSSEN et al.
1993, GRIFFITH et al. 1994). Der Erfolg einer C.-parvum-Kultivierung hängt wesentlich von der Zusammensetzung des Kultivierungsmediums ab (UPTON et al. 1995). Ein Vergleich der
