Vitalität desinfizierter C.-parvum-Oozysten

Wie schon die Focuszählung mit unbehandelten Oozysten infizierter Zellkulturen ergab, kann auch in der Desinfektionsmitteltestung nur ein eingeschränkter Vergleich zu den PCR-Ergebnissen vorgenommen werden. In der PCR wurden positive Ergebnisse nach Einsatz von 0,0625 % Neopredisan^® und 0,25 % Neopredisan^® infizierten Zellkulturen ermittelt. Eine zweite Bande bei Anwendung von 0,0625 % des Präparates war nur sehr schwach ausgeprägt (Abb. 15), ob ihr eine Bedeutung zukommt ist nicht klar. Die Stärke der Banden könnte quantitative Rückschlüsse erlauben, die entsprechende Methodik ist aber noch nicht erarbeitet.

Somit kann nur die Aussage getroffen werden, dass in den Proben, die keine Bande ergaben, in der Regel weniger als 1 x 10² vitale Oozysten vorlagen. Dies ergibt sich aus der

Titrationsreihe, bei der normalerweise erstmals ein DNA-Produkt bei 1 x 10² Oozysten/Kalotte dargestellt war. Allerdings wurden gelegentlich auch bei höheren Infektionsdosen keine PCR-Produkte gefunden, so dass die Reproduzierbarkeit eingeschränkt war. Bei der Focuszählung konnten unabhängig von der Desinfektion Foci gefunden werden.

Die Focianzahl nahm aber bei steigender Neopredisankonzentration ab. Es wurden signifikant (p < 0,05) weniger Foci gefunden, wenn die Oozysten zuvor mit Neopredisan^® (0,0625 %, 1

%, 0,25 %, 4 %) behandelt wurden. Bei Anwendung von 0,0625 % Neopredisan^® und 1 x 10⁵ Oozysten konnten 39 oder 47 Foci ermittelt werden. Dies entspricht der Fokuszahl nach Einsaat von 1 x 10⁵ und 1 x 10⁴ unbehandelten Oozysten. Eine hohe Neopredisankonzentration (4 %, 1 x 10⁵ Oozysten) lieferte durchschnittlich 0,42 Foci. Die Einsaat von 10 Oozysten ergab durchschnittlich 0,05 und die Einsaat von 100 Oozysten ergab durchschnittlich 2,10 Foci. Somit kann davon ausgegangen werden, das sich von den mit 4 % Neopredisan^® behandelten Oozysten zwischen 10 und 100 vitale Oozysten in der Zellkultur entwickeln konnten. Dies entspricht einer Vitalitätsminderung der Oozysten um 99 %. Nach den DVG-Richtlinien sollte die Anwendungskonzentration eines Desinfektionsmittels bei 120 min Einwirkzeit wenigstens 98 % der Parasitenstadien hemmen. Somit ist dieses Ergebnis vielversprechend, jedoch sind zur Weiterentwicklung eines Routineverfahrens weitere Untersuchungen nötig. In der Literatur konnten zur chemischen Desinfektion und anschließenden Anwendung einer Focuszählung keine Ergebnisse gefunden werden.

Durch die mikroskopische Auszählung der Objektträger liefert die Focuszählmethode zwangsläufig ein subjektives Ergebnis. Sie eignet sich zur Beurteilung der Vitalitätsminderung von Oozysten, dennoch ist eine quantitative Aussage nur eingeschränkt möglich, da ein gezählter Fokus einen Parasiten oder mehrere Entwicklungsstadien darstellen kann.

5.6 Infektion von Babymäusen

Die erfolgreiche Infektion der Babymäuse hängt von verschiedenen Faktoren ab (siehe Kap.

2.1.9.). Als Infektionsmaterial dienten gereinigte behandelte oder unbehandelte

C.-parvum-Oozysten. Eine Infektion mit Sporozoiten (RIGGS u. PERRYMAN 1987), Fäzessuspension oder Darmhomogenat (TZIPORI et al. 1980, SHERWOOD et al. 1982) bei Mäusen führt ebenfalls zu einer Replikation des Parasiten. In der vorliegenden Studie wurde die gleiche Infektionsdosis (1 x 10⁵ Oozysten/Maus), wie in der Zellkultur angewendet. Eine wesentlich geringere Oozystenzahl (79 Oozysten/Maus) kann bereits eine Infektionen in der Maus auslösen (FINCH et al. 1993). Eine Vorbehandlung durch kortisonhaltige Präparate (PETRY et al. 1995) ist bei Verwendung von Babymäusen, die noch empfänglich für C.-parvum-Infektionen sind (FAYER 1995), nicht notwendig.

Die Behandlung von C. parvum erfolgte wie im Zellkultursystem durch vorherige Inkubation der Oozysten im Desinfektionsmittel. RIGGS u. PERRYMAN (1987), KORICH et al. (1990) und BLACK et al. (1996) behandelten die Oozysten ebenfalls vor der Inokulation der Mäuse.

REGH et al. (1991 a u. b) hingegen infizierten zuerst die Mäuse und versuchten dann über eine Behandlung der Mäuse über Trinkwasser und Futter eine Inhibition von C. parvum zu erreichen.

Die Auswertung der Spülflüssigkeit aus dem Darm war nicht praktikabel und wurde somit in Versuch 2 nicht angewendet. Die Beurteilung über einen Nativausstrich der Darmmukosa war schneller und einfacher durchzuführen. CURRENT u. REESE (1986) und LIEBLER et al.

(1986) untersuchten über ein Geschabsel verschiedene Darmabschnitte unter einem Interferenzkontrastmikroskop nach Entwicklungsstadien von C. parvum. UPTON u.

GILLOCK (1996) und LINDSAY et al. (2000) werteten die C.-parvum-Infektion von Mäusen nach Homogenisierung des Darmtraktes in 10 ml 2,5 %iger Kaliumchloridlösung durch Zählung der Oozysten im Hämatozytometer aus. Die Homogenisierung von Ileum, Zäkum und Kolon mit einem Mixer wurde von FINCH et al. (1993) um eine anschließende Konzentrierung über einen Zuckergradienten ergänzt. Die elektronenmikroskopische Auswertung (VITOVEC u. KOUDELA 1988) und die Anfertigung histologischer Schnitte vom Darm ermöglicht ebenfalls eine Beurteilung der C.-parvum-Infektion. LIEBLER et al.

(1986), VITOVEC u. KOUDELA (1988) und FAYER (1995) fixierten den Darm zuvor in 10

% Formalin und führten dann eine HE-Färbung (FAYER 1995) oder Giemsa-Färbung (VITOVEC u. KOUDELA 1988) vor der mikroskopischen Auswertung durch.

Im zweiten eigenen Versuch wurde von einigen Mäusedärmen eine histologische Auswertung vorgenommen. FINCH et al. (2000) bewerteten die histologischen Untersuchungen ebenfalls durch Einteilung in positive und negative Ergebnisse. VITOVEC u. KOUDELA (1988) beurteilten die Mäuseinfektion nach verschiedenen Kategorien (moderate, mittlere, mehrere, massive Infektionen), während LINDSAY et al. (2000) eine Zählung der Oozysten und FAYER (1995) eine Zählung der infizierten epithelialen Zellen vornahmen und eine prozentuale Angabe der infizierten Zellen machten. Die Einteilung in positive und negative Ergebnisse ist einfach und schnell durchzuführen, gibt aber keine Auskunft über den Grad der Infektion. Andererseits ist der Infektionsverlauf in der Maus in hohem Maße variabel, so dass quantitatve Bewertungen nicht mit hinreichender Sicherheit möglich sind, bzw. einen sehr eingeschränkten Aussagewert haben.

In Versuch 2 blieben alle nicht infizierten Mäuse negativ und alle Mäuse, die mit unbehandelten Oozysten infiziert worden waren, wurden sowohl im Nativausstrich als auch bei der histologischen Untersuchung positiv. Mit 4 % Neopredisan^® (1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte) desinfizierte Oozysten ergaben ein positives und 4 negative Ergebnisse.

Das positive Ergebnis steht im Widerspruch zur Beobachtung, dass im gleichen Versuch bei geringerer Neopredisankonzentration von 1 % alle 7 Mäuse negativ waren. Es könnte trotz Vorsichtsmaßnahmen zu einer akzidentellen Infektion gekommen sein. Schon eine geringe Oozystendosis von 79 Oozysten kann ausreichend für eine Infektion sein (FINCH et al. 1993).

Bei Verwendung von 0,25 % Neopredisan^® konnten 3 negative und 3 positive Nativausstriche ermittelt werden. In der Zellkultur hingegen waren 85 % der untersuchten Proben bei gleicher Neopredisankonzentration negativ. Die histologischen Ergebnisse entsprechen im allgemeinen den Ergebnissen der Nativausstriche. BLACK et al. (1996) hält eine Infektion im Tiermodell für aussagekräftiger als die Bestimmung der Exzystierungsrate oder die Verwendung der Vitalfarbstoffmethode. Durch die geringe Anzahl von Nativausstrichen ist die Aussagekraft der eigenen Ergebnisse eingeschränkt. Das Mausmodell ist jedoch aus ethischen und methodischen Gründen nicht als ideal zu betrachten, so dass auf eine Ausweitung der tierexperimentellen Studien verzichtet wurde.

Die Infektion von Mäusen wurde vergleichend zu den in vitro Untersuchungen durchgeführt.

Mit der Vitalitätsabschätzung in vitro ergibt sich die Perspektive künftig auf Tierversuche verzichten zu können, allerdings sind noch grundlegende Verbesserungen hinsichtlich der Sensitivität und Reproduzierbarkeit erforderlich.