Vitalität von unbehandelten C.-parvum-Oozysten

Um einen Vitalitätsassay für C. parvum zu entwickeln, war es zunächst erforderlich, einen Vergleichswert durch die Ermittlung der Vitalität von unbehandelten Oozysten zu ermitteln.

Hierzu wurden die Oozysten zunächst zur Infektion auf 48-Kalotten-Zellkulturtestplatten eingesetzt und dann zur Verkleinerung der Volumina, bzw. zur erleichterten Auswertung in 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten eingesetzt. Nur bei Einsaat von 1 x 10³ Oozysten/Kalotte wurden signifikant (p < 0,05) mehr positive PCR-Ergebnisse in den 96- als in den 48-Kalotten-Zellkulturtestplatten ermittelt, so dass für die folgenden Versuche aus praktischen Erwägungen, die 96 –Kalotten- Zellkulturtestplatten verwendet wurden..

Ein direkter Vergleich zwischen verschiedenen Typen von Zellkulturplatten zur C.-parvum-Kultivierung konnte in der Literatur nicht gefunden werden. LINDSAY et al. (2000) führt die C. parvum Kultivierung ebenfalls wegen der leichteren Auswertung mittels eines Substrat-gekoppelten-Antikörpers in 96-Kalotten-Zellkulturtestplatten durch. Zur Kultivierung von C.

parvum werden auch häufig Lab-tek-chamber-slides (1 cm²/Kalotte) verwendet (FLANIGAN et al. 1991, GUT et al. 1991, WIEST et al. 1993, SLIFKO et al. 1997 a u. b), um anschließend eine direkte mikroskopische Beurteilung der Zellkultur zu erleichtern.

In der vorliegenden Studie erhöhten sich die Anteile positiver PCR-Ergebnisse, sowohl bei der 48- als auch bei der 96-Kalotten-Zellkulturtestplatte, wenn die Anzahl der Oozysten erhöht wurde. Es wurden signifikant (p < 0,05) mehr positive PCR-Ergebnisse bei Einsaat von 1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte als bei Einsaat von 1 x 10³ oder weniger Oozysten/Kalotte ermittelt.

SLIFKO et al. (1997 a u. b) konnten in vitro ebenfalls eine Zunahme der Entwicklungsstadien bei steigender Oozystenanzahl beobachten. Die Auswertung erfolgte durch Zählung der Foci nach Markierung der Entwicklungsstadien mit einem Fluoreszein-gekoppelten-Antikörper.

Während bei 10 eingesäten Oozysten 93 Foci/Kalotte gezählt wurden, betrug die Focianzahl

bei 1000 Oozysten/Kalotte bereits 13839 Foci/Kalotte (SLIFKO et al. 1997 a). In einer weiteren Studie betrug die Focianzahl 9,4 x 10⁴ bei Einsaat von 1 x 10⁴ Oozysten/Kalotte und bei 1 x 10⁶ Oozysten/Kalotte 1,5 x 10⁶ Foci (SLIFKO et al. 1997 b). In der vorliegenden Studie wies die Ausprägung der PCR-Banden deutliche Unterschiede auf. Banden nach Einsaat von 1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte waren wesentlich deutlicher als Banden, bei denen 1 x 10⁴ oder 1 x 10³ Oozysten/Kalotte eingesät wurden. Dieser subjektiv beobachtete Effekt könnte eine (semi-) quantitative Auswertung ermöglichen. Hierzu sind aber weitere Untersuchungen, beispielsweise unter Einsatz von Gelscannern oder bildanalytischer Techniken, nötig.

In den vorliegenden Versuchen konnte mittels PCR C. parvum ab einer Konzentration von 100 eingesäten Oozysten nachgewiesen werden. Allerdings wurde ein spezifisches Signal bei dieser geringen Dosis bei nur 19,4 % der Kulturen ermittelt. Auch bei der Einsaat von höheren Oozystenzahlen (1 x 10³ - 1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte) wurden nicht alle Kulturen in der PCR positiv. Die Nachweisgrenze für C. parvum mittels PCR liegt bei PETRY et al. (1998) bei 140 Oozysten und bei WU et al. (2000) sogar bei einer einzelnen Oozyste, jedoch erfolgte bei diesen Versuchen keine in vitro Kultivierung von C. parvum. WAGNER-WIENING u.

KIMMIG (1995) erklärten falsch negative Ergebnisse durch die Anwesenheit von Enzymen (DNAase), die die Parasiten-DNA zerstören. In ihrer Studie wurden DNAase behandelte exzystierte Sporozoiten benutzt, um einen C. parvum Nachweis mittels PCR durchzuführen.

Dies hat den Nachteil, dass nur Sporozoiten beurteilt wurden und keine Aussage über nicht exzystierte Oozysten getroffen wurde. Ebenso kritisch ist ein Vitalitätsnachweis über die Exzystierungsrate der Oozysten zu betrachten. CAMPBELL et al. (1992) betrachten nur exzystierte Oozysten als vital. KORICH et al. (1990) stellten die Exzystierung unbehandelter der Exzystierungsrate mit Ozon behandelten Oozysten gegenüber. Auch hier wurden nicht exzystierte Oozysten als abgetötet betrachtet. NEUMANN et al. (2000) stellten allerdings durch die Inokulation von nicht exzystierten Oozysten in Mäuse fest, das diese noch infizieren können und somit vital sind. Um auch diese Oozysten zu erfassen, wurde in der vorliegenden Studie eine Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit zuvor nicht exzystierten Oozysten vorgenommen.

Theoretisch wäre nur eine sehr geringe Anzahl an Oozysten notwendig, um ein positives PCR Ergebnis zu erlangen, da sich C. parvum in vitro vermehrt. SLIFKO et al. (1997 b) konnten bereits nach 48 h Inkubation der Zellkultur Entwicklungsstadien beobachten, die durch eine Autoinfektion entstanden sind. Weiterhin konnten SLIFKO et al. (1997 b) nach 48 h in der FDM (siehe Kap. 2.1.8.3.1) 380 % mehr Foci finden als nach 24 h Inkubation. Die in vitro Vermehrung von C. parvum hängt neben der Verwendung einer geeigneten epithelialen Zelllinie (UPTON et al. 1994) und dem Kulturmedium (siehe Kap. 2.1.8.2) (UPTON et al.

1995) auch vom Alter der Oozysten ab. In der vorliegenden Studie wurden Oozysten bis zu einem Alter von drei Monaten verwendet. LIEBLER et al. (1986), RIGGS u. PERRYMAN (1987) und ARGENZIO et al. (1990) verwendeten ebenfalls bis zu drei Monate alte Oozysten, FLANIGAN et al. (1991) nutzten Oozysten bis zu einem Alter von zweieinhalb Monaten.

FAYER (1995) hingegen benutzte in seinen Studien die Oozysten nur bis zu einem Alter von einem Monat. UPTON (1997) hält sechs Wochen alte C.-parvum-Oozysten für am besten zur in vitro Kultivierung geeignet. Ansonsten sollte die Exzystierungsrate überprüft werden und diese nach 90 min über 70 % liegen. Eine Passagierung war in der vorliegenden Studie aus Zeit- und Kostengründen nicht alle 6 Wochen möglich. Auch die Bestimmung der Exzystierungsrate war zu aufwendig und störanfällig. Die Verwendung bis zu 3 Monate alter Oozysten erschien aber in Übereinstimmung mit den meisten Literaturangaben als vertretbar.

Grundsätzlich stellt die PCR nach Zellkultur ein vielversprechendes Modell zur Vitalitätsüberprüfung dar. Allerdings muss die Sensitivität und Reproduzierbarkeit noch verbessert werden, und die Störanfälligkeit der Methode erfordert sehr sorgfältiges Arbeiten.

Ein standardisiertes Infektionsmaterial ist unbedingt erforderlich, eine Objektivierung der Signalauswertung wäre in höchstem Maße wünschenswert.

5.4.5 Inhibition mit Paromomycin (Tab. 13 u. 14)

Paromomycin ist laut Literatur ein vielversprechender Wirkstoff im Einsatz gegen C. parvum (MARSHALL u. FLANIGAN 1992, FAYER u. ELLIS 1993 a, THEODES et al. 1998). In Vorversuchen wurde in Anlehnung an die Studie von MARSHALL u. FLANIGAN (1992)

eine Inhibition von C. parvum mit Paromomycin untersucht. Die Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit Paromomycin behandelten C.-parvum-Oozysten ergab in der eigenen Studie nur bei der ersten PCR ein negatives Ergebnis (Paromomycinkonzentration: 0,5 mg/ml), bei den übrigen 4 Ansätzen wurde jeweils eine spezifische Bande dargestellt. Eine ausbleibende Inhibition wurde durch die histologische Präparation in der vorliegenden Studie bestätigt, bei der selbst bei hohen Paromomycinkonzentrationen (5 mg/ml) C. parvum-Entwicklungsstadien zu finden waren. Hier lieferten die Negativkontrollen positive PCR-Ergebnisse. Die positiven Ergebnisse bei Verwendung von 10 Oozysten nach 6 h und nach 48 h Inkubation sind zweifelhaft, da die korrekte Einsaat weniger Oozysten sehr schwierig ist und nicht auszuschliessen ist, dass evtl. keine Oozysten eingesät wurden. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse von MARSHALL u. FLANIGAN (1992). Sie führten die Inhibition von C.

parvum an HT-29 Zellen durch und werteten die Versuche durch Zählung der Schizontenstadien aus. Die Inhibition betrug bei 5 mg/ml 86 %, bei 0,5 mg/ml 35 % und bei 0,005 mg/ml noch 31 %. Der Vergleich ist jedoch nur bedingt möglich, da bei einer C.-parvum-Infektion von HCT-8-Zellen mit einer ca. zehn mal höheren Infektionsrate zu rechnen ist als bei einer Infektion von HT-29-Zellen (UPTON et al. 1994 a). THEODES et al. 1998 konnten in Zellkulturversuchen eine Inhibition von 80 % erreichen, wenn die C.-parvum-Oozysten mit 2 mg/ml Paromomycin behandelt wurden. FAYER u. ELLIS (1993 a) bestätigten ebenfalls die inhibitorische Wirkung von Paromomycin, indem sie Behandlungsversuche an Kälbern mit Paromomycin (25, 50, 100 mg/kg) durchführten und signifikant weniger Oozysten im Kot feststellten.

Die zu dem Paromomycinansatz parallel durchgeführten Versuche, infizierte Zellkulturen unterschiedlichen Inkubationszeiten auszusetzen, zeigten, dass Fehler in der ersten PCR durch Anlegen der Titrationsreihe oder durch Kontamination der Zellkulturen oder der PCR- Gefäße erfolgt sein müssen, da alle Negativkontrollen ein positives PCR-Ergebnisse ergeben haben (siehe Tab. 14).

Eine inhibitorische Wirkung von Paromomycin konnte durch die vorliegenden Versuche nicht gezeigt werden.