Vitalität desinfizierter Oozysten

5.4.6.1 Auswirkung der Neopredisankonzentrationen

Durch die Anwendung von Neopredisan^® auf C. parvum sollte die Vitalität der Oozysten vermindert werden, und mit den PCR-Ergebnissen sollte der Vitalitätsverlust der Oozysten abgeschätzt werden. Bei Einsaat von mit Neopredisan^® (1 %, 4 %) behandelten Oozysten (1 x 10⁴) konnten im Gegensatz zu unbehandelten Oozysten keine positiven PCR-Ergebnisse ermittelt werden. Damit kann von einer drastischen Vitalitätsminderung durch Desinfektion ausgegangen werden. Die signifikanten (p < 0,05) Unterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Oozysten bestätigen die Vitalitätsminderung der Oozysten durch das Desinfektionsmittel.

Die folgenden Untersuchungen fanden bei Einsaat von 1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte statt.

Tendenziell nahm der Anteil der positiven Ergebnisse bei Senkung der Neopredisankonzentration zu. Jedoch ergaben nicht alle unbehandelten Oozysten positive PCR-Ergebnisse (siehe Kap. 5.4.1) und selbst mt 4 % Neopredisan^® behandelte Oozysten ergaben nicht ausschließlich negative Ergebnisse. Der Grund, warum es trotz 4 %iger Neopredisanbehandlung einige positive PCR-Ergebnisse gab, ist unklar. Bei Anwendung von 1 % Neopredisan^® waren 4 von 22 Proben positiv und bei 0,25 % waren 3 von 20 Proben positiv. Abbildung 14 zeigt einen direkten Vergleich der Ergebnisse von HCT-8-Zellkulturinfektionen mit behandelten und unbehandelten C.-parvum-Oozysten. Hier wurde bei Einsaat von 1 x 10³ Oozysten/Kalotte oder weniger Oozysten kein PCR-Ergebnis mehr erzielt. In der Regel waren bei höheren Neopredisankonzentrationen keine C.-parvum-spezifischen Banden erkennbar.

Eine mögliche Aussage über die Vitalitätsminderung könnte ein Vergleich nach Kultivierung behandelter und unbehandelter Oozysten ergeben. Wenn bei der Anwendung von 0,0625 % Neopredisan^® eine Bande festgestellt wurde, so müssten mindestens 1000 vitale Oozysten vorgelegen haben, wenn die Grenze für eine sichtbares Signal bei 1 x 10³ Oozysten liegt. Es lag eine Minderung der Oozysten um etwa 99000 Oozysten vor, wenn die behandelten

Zellkulturen (1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte, Behandlung: 4 %, 1 %, 0,25 %) in der PCR kein Signal ergaben. Dies würde einer Inhibition von ca. 99 % entsprechen. Die offensichtliche Störanfälligkeit des Prüfmodells lässt aber keine präzise Aussage bezüglich der Wirkung von Neopredisan^® auf C.-parvum-Oozysten zu. Die Aussagekraft ist auch durch die rein qualitative Bewertung der PCR eingeschränkt. Eine (semi-) quantitative Auswertung zwischen PCR-Banden könnte hilfreich sein (siehe Kap. 5.4.1).

BLACK et al. (1996) verglichen verschiedene Vitalitätsassays im Anschluß an eine chemische Desinfektion von C.-parvum-Oozysten. Sie verwendeten Ozon und Chlor zur Desinfektion.

Die Exzystierungsrate (siehe Kap. 2.1.8.1), die Vitalfarbstoffmethode (siehe Kap. 2.1.7.3) und das Mausmodell (siehe Kap. 2.1.9) dienten als Vitalitätsassays. Die Exzystierungsrate und der Vitalfarbstoffmethode überschätzten die Vitalität. BLACK et al. (1996) sind der Meinung, dass die Exzystierung nach Stimulation noch nicht bedeutet, dass der Parasit einen kompletten Lebenszyklus im Wirt durchlaufen kann. In den vorliegenden Versuchen mussten sich die Oozysten in der Zellkultur weiterentwickeln, um später durch die PCR nachgewiesen zu werden. SLIFKO et al. (1995, 1997 a u. b) infizierten ebenfalls Zellkulturen und entwickelten auf diese Basis die FDM (foci-detection-method). Sie führten parallel die Vitalfarbstoffmethode, Exzystierung und Infektionen an der Maus durch (siehe Kap.

2.1.8.3.1.). Die FDM erwies sich hierbei als die sensitivste Methode und lieferte dem Mausmodell vergleichbare Infektionsergebnisse.

Gegenüber der Merontenauszählung (MARSHALL u. FLANIGAN 1992, WIEST et al. 1993) ist das in der vorliegenden Studie durchgeführte Verfahren weniger zeitaufwendig und kann technisch noch vereinfacht werden. Um die Zuverlässigkeit und Sensitivität der Methode zu erhöhen, sind noch mehr Versuche nötig. Im Gegensatz zur Bestimmung der Exzystierungsrate wird in der vorliegenden Studie das Reproduktionsvermögen als Vitalitätsmaß verwendet (siehe Kap. 5.5.1), bei der die Gefahr einer Überschätzung der Vitalität, wie sie bei der Exzystierungsrate und der DAPI/PI Auswertung (siehe Kap. 2.1.7.3) vorkommt, geringer ist (BLACK et al. 1996). Um einen direkten Vergleich zu vitalen Oozysten und einen Ausschluß von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen zu erzielen sollte stets parallel mit unbehandelten Oozysten in einer Titrationsreihe gearbeitet

werden (WAGNER-WIENING u. KIMMIG 1995). WAGNER-WIENING u. KIMMIG (1995) schlagen vor, zwei PCR-Verfahren mit unterschiedlichen Primern gleichzeitig durchzuführen, um zuverlässigere Ergebnisse zu erhalten.

Eine quantitative Aussage zur Vitalitätsminderung der Oozysten ist derzeit nur eingeschränkt möglich, da auch bei Einsaat hoher Anzahlen unbehandelter Oozysten einige negative PCR-Ergebnisse erzielt wurden.

5.4.6.2 Auswirkung der Inkubationszeiten

Die Vitalitätsminderung der Oozysten bei unterschiedlicher Desinfektionsdauer wurde in Analogie zu nach DVG-Richtlinien üblichen Verfahren beurteilt. Inkubationszeiten des Neopredisans (1%) von 180 min, 120 min und 60 min lieferten ausschließlich negative PCR-Ergebnisse. Die 30minütige Anwendung von Neopredisan^® lieferte ein positives und 3 negative Ergebnisse. Die Auswertung der PCR konnte nur qualitativ erfolgen. Weitere Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen und Desinfektionsdauern stehen zwar noch aus, wenn man aber von den Eintragungswerten des Neopredisans in der Desinfektionsmittelliste der DVG von 4 % bei einer Einwirkzeit von 120 min ausgeht, ist doch unter diesen Bedingungen eine Wirksamkeit in der vorliegenden Studie verwendeten C.-parvum-Zellkultur-Modell zu erwarten ist.

5.5 Vitalitätsnachweis durch Focuszählung

5.5.1 Vitalität von unbehandelten C.-parvum-Oozysten

Zum Vitalitätsnachweis durch Focuszählung wurden wie auch für die PCR Zellkulturen angelegt, die mit unbehandelten C.-parvum-Oozysten in einer Titrationsreihe infiziert wurden.

Eine erhöhte Oozystenanzahl führte zu einer signifikant (p < 0,05) höheren Focianzahl. Die

Fokuszählungen korrelieren positv (Korrelationskoeffizient=0,929) mit der Anzahl eingesäter Oozysten. Ein Vergleich mit den PCR-Ergebnissen, die parallel dazu erhoben wurden, ist nur eingeschränkt möglich, da in der PCR die Ergebnisse nicht quantitativ ausgewertet wurden. In der PCR (Abb. 17) lag die Nachweisgrenze bei 1 x 10² eingesäten Oozysten/Kalotte. Bei der Focuszählung wurden durchschnittlich 2,10 Foci bei Einsaat von 1 x 10² Oozysten/Kalotte, bei 10 Oozysten/Kalotte wurden durchschnittlich 0,05 Foci ermittelt. SLIFKO et al. (1997 a) zählten bei Einsaat von 1 x 10³ Oozysten/Kalotte 512 Foci/Kalotte nach 24 h und 13839 Foci nach 48 h Inkubation. Die extreme Erhöhung der Focianzahl begründeten sie durch eine Autoinfektion, bzw. zweite Replikation der Oozysten, die hier bereits nach 12 h erfolgte. In den vorliegenden Versuchen betrug die Focianzahl bei Einsaat von 1 x 10⁵ Oozysten/Kalotte 100,45 Foci und bei 1 x 10⁴ Oozysten/Kalotte 20,13 Foci. Die geringere Focizahl könnte durch die Verwendung eines anderen monoklonalen Antikörpers oder durch die älteren Oozysten begründet sein. Außerdem wurde in den vorliegenden Versuchen nicht die ganze Kalotte ausgezählt. SLIFKO et al. (1997 a) verwendeten einen Antikörper, der an alle Entwicklungsstadien von C. parvum bindet und einen zweiten Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper. Die Oozysten waren in den Versuchen von SLIFKO et al. (1997) nicht älter als einen Monat. Die Standardabweichungen betrugen in diesen Versuchen bis zu ein Drittel (±33,63) des Mittelwertes (100,45). Die Standardabweichung (±3873) bei SLIFKO et al. (1997 a) überschreitet zum Teil den Mittelwert (2960,20), d.h. es lagen erhebliche Schwankungen zwischen den einzelnen Focuszählungen der Kalotten vor. Der Variationskoeffizient lag bei SLIFKO et al (1997) bei 130 %, während in der vorliegenden Studie der Variationskoeffizient 33 % betrug. In der vorliegenden Studie wurden somit einheitlichere Ergebnisse als bei SLIFKO et al (1997) erzielt.

Durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an die Entwicklungsstadien von C. parvum bindet, kann die tatsächliche Vitalität der Oozysten ermittelt werden. Leere Oozysten oder nicht exzystierte Oozysten werden nicht erfaßt. Die teilweise starke Hintergrundlumineszenz wirkte sich störend bei der Zählung der Foci aus, und es musste teils auf andere Flächen in der Kalotte zur Zählung ausgewichen werden.

SLIFKO et al. (1997 b) konnten aufgrund des starken Hintergrundes viele Kalotten nicht auswerten. Da auch schon geringe Oozystenzahlen Ergebnisse in der Focuszählung liefern, ist dieser Test sehr sensitiv und damit anfällig für falsch positive Ergebnisse, die durch geringste Pipettierfehler entstehen können. Dennoch ist im Vergleich zu in vivo Versuchen die Focuszählung kostengünstiger, reproduzierbar, praktikabel und erlaubt eine quantitative Auswertung der Ergebnisse (SLIFKO et al. 1997 a).

Die Fokuszählmethode war in der vorliegenden Studie sensitiv, quantitativ auswertbar und zeigte einen direkten Zusammenhang zwischen eingesäter Oozystenzahl und gezählten Foci.

Trotz möglicherweise gelegentlich falsch positiver Ergebnisse erscheint eine Weiterentwicklung dieser Methode zur Etablierung eines Vitalitätsassays mit Floureszein-markierten Antikörpern möglich zu sein. Im Gegensatz zur Auswertung von infizierten Zellkulturen durch eine PCR war die Focuszählmethode (semi-) quantitativ auswertbar.

Weiterhin war die PCR-Methode arbeitsaufwendiger und die PCR-Ergebnisse waren nicht immer reproduzierbar, so dass aufgrund der eigenen Studien derzeit die Focuszählmethode zur Desinfektionsmitteltestung geeigneter erscheint. Der grundsätzliche Vorteil der PCR ist die Objektivierbarkeit der Beurteilung, so dass weitere Untersuchungen in dieser Hinsicht dennoch vielversprechend sein könnten.