Kultivierung in verschiedenen Zelllinien

C. parvum läßt sich in verschiedenen Zelllinien kultivieren (Tab. 3). Am besten geeignet sind epitheliale Zelllinien, wie humane Kolon-Adenomakarzinomzellen (Caco-2) oder endometriale Karzinomazellen (RL95-2). Galaktose-adaptierte humane Kolon-Adenomakarzinomzellen (HT-29), humane ileozäkale Kolon-Adenomakarzinomzellen (HCT-8) und

Mardin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) können ebenfalls verwendet werden (UPTON 1997). Vergleichende Untersuchungen zwischen der Infektiösität für humane Enterozyten-Zelllinien führten MAILLOT et al. (1997) an Caco-2, HT-29, HCT-8 und den TC7 und PF11 Klonen von Caco-2 Zellen durch und bestätigen, dass alle drei Zelllinien zur in vitro Kultivierung von C. parvum genutzt werden können.

Ein Vergleich zwischen HT-29 (originaler Herkunft von humanen Kolonkarzinomzellen) und differenzierten HT-29 (Ähnlichkeit mit epithelialen Stammzellen, gleiche morphologische und funktionelle Charakteristika) zeigte eine fünffach höhere Infektiösität von C. parvum in den differenzierten HT-29-Zellen (FLANIGAN et al. 1991). Die Infektionssraten schwankten von 3 % bis 50 % in Caco-2-Zellen (BURAUD et al. 1991, GRIFFITH et al. 1994). UPTON et al. (1994 a) konnten klare Unterschiede zwischen der Infektiösität von C. parvum in verschiedenen Zelllinien beobachten. Die Entwicklungsrate von C. parvum in BALB/3T3, HT-29 und RL- Zellen lag 20 % unter der Entwicklung in MDBK-Zellen. Die HCT-8 Zelllinie hatte die höchste Infektionsrate und somit die besten Entwicklungsergebnisse für C. parvum ergeben. Es war unklar, warum diese Zelllinie den anderen Zelllinien überlegen war. Es wurde angenommen, daß unter anderen Umgebungsverhältnissen mit anderen Medien oder Zusätzen eine andere Zelllinie der HCT-8 Zelllinie überlegen sein könnte (UPTON et al. 1994 a).

Teilweise entwickelten sich zwei oder mehr C.-parvum-Stadien in einer Zelle (ROSALES et al. 1983). In einer elektronenmikroskopischen Untersuchung der ultrastrukturellen Entwicklungsvorgänge einer mit C. parvum infizierten HT-29 Zellkultur konnten sechs Stunden nach Inokulation Trophozoiten nachgewiesen werden. Die Entwicklung vom Trophozoiten zum Schizonten vollzog sich innerhalb von 24 Stunden (AJI et al. 1991).

Aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, wie Trophozoiten, Meronten, Mikrogametozyten und Makrogametozyten konnten beobachtet werden (GUT et al. 1991, AJI et al. 1991, SLIFKO et al. 1997 a). In einigen Fällen konnten die Stadien nicht definiert zugeordnet werden (ROSALES et al. 1983).

Tabelle 3: C.-parvum-Infektionen in verschiedenen Zelllinien

Zelllinie Kurzbezeichnung Autor

Mardin-Darby-canine kidney MDCK

ROSALES et al. 1983 GUT et al. 1991

MITSCHLER et al. 1994

Human fetal lung HFL CURRENT u. HAYNES 1984

Primary chicken kidney PCK CURRENT u. HAYNES 1984

Porcine kidney PK CURRENT u. HAYNES 1984

Human colonic

adeno-carcinoma CACO-2 BURAUD et al. 1991

GRIFFITH et al. 1994 Human endometrial

carcinoma RL-95-2 RASMUSSEN et al. 1993

Human colonic carcinoma HT-29 FLANIGAN et al. 1991 AJI et al. 1991 Mardin-Darby-bovine-kidney MDBK UPTON et al. 1994 a BALB/c mouse embryo BALB/3T3 UPTON et al. 1994 a

Die direkten Auswirkungen von C. parvum auf infizierte Zellkulturen waren Monolayerdefekte, vor allem eine Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran und als dessen Folge der epitheliale Zelltod (GRIFFITH et al. 1994).

Neben der Wahl einer bestimmten Zelllinie konnte eine Variation der Infektionsdosis und der Inkubationszeit helfen, die Parasitenentwicklung in vitro zu optimieren (RASMUSSEN et al.

1993, GRIFFITH et al. 1994). Der Erfolg einer C.-parvum-Kultivierung hängt wesentlich von der Zusammensetzung des Kultivierungsmediums ab (UPTON et al. 1995). Ein Vergleich der

Membranlipidzusammensetzung von C.-parvum-Oozysten und den Wirtszellen könnte zu einem besseren Verständnis des Kokzidienwachstums in der Zellkultur beitragen, so daß die Kulturbedingungen und die Entwicklung der Parasiten in der Zellkultur verbessert werden könnte (MITSCHLER et al. 1994).

2.1.8.3 C. parvum in der HCT-8- Zellkultur

Die meisten in vitro Untersuchungen von C. parvum finden in HCT-8 Zellkulturen statt. Die Inhibition von C. parvum und anschließende Überprüfung der Oozystenvitalität in vitro wurden für die Suche nach einem wirksamen Mittel gegen C. parvum eingesetzt (FAYER et al. 1997).

2.1.8.3.1 C.-parvum-Vitalitätsnachweis in vitro

SLIFKO et al. (1997a) haben sich mit der in vitro Technik zur Ermittlung der Infektiösität von C-parvum-Oozysten in der Zelllinie HCT-8 befaßt. Mit der ”foci-detection-method” (FDM) (eine primäre Antikörper-Kopplung an parasitäre Stadien mit Bindung eines sekundären fluoreszierenden Antikörpers) wurden nach 48 Stunden wesentlich mehr Foci gefunden, als ursprünglich Parasiten inokuliert wurden. Dies war vermutlich durch die Vermehrung der Parasiten in der Kultur zu begründen. Theoretisch müßte, wenn alle für die Infektion vorgesehenen Oozysten vital waren, ein Foci/Oozystenverhältnis von 4:1 vorliegen, tatsächlich stieg das Foci/Oozystenverhältnis innerhalb von 48 Stunden auf 9,3:1 bis zu 29,6:1 an (SLIFKO et al. 1997 a).

SLIFKO et al. (1998) verglichen vier C.-parvum-Vitalitätsassays miteinander:

Πdie Vitalfarbstoffmethode mit DAPI/PI (siehe Kapitel 2.1.7.3.2)

Πdie Exzystierungsmethode

Œ die Zellkulturinfektion und anschließende Markierung der Entwicklungsstadien mit den von SLIFKO et al. (1997 a) benutzten Antikörpern und Auswertung mit Hilfe der FDM

Œ die Infektiösität am Mausmodell

Sämtliche Daten wurden über den ”most-probable number assay” (MPN) ausgewertet. Der FDM-MPN-Nachweis im Anschluß an eine Infektion einer HCT-8 Zellkultur war sensitiv genug, um Oozystenkonzentrationen in Lösungen nachzuweisen, die weniger als eine Oozyste pro Milliliter enthielten. Diese Methode war auch anwendbar, wo andere Vitalitätsassays, wie zum Beispiel die PCR und die in situ Hybridisation noch problematisch in der Anwendung sind (z.B. Turbinenwasserproben). Die FDM-MPN-Methode war sensitiver im Nachweis vitaler Oozysten als die Vitalfärbemethode oder die Exzystierungsmethode, die die aktuelle Oozysteninfektiösität zum Teil überschätzten. Im Vergleich der FDM-MPN-Methode mit einem Tiermodell erfolgte hier eine vergleichbare Bewertung der Inaktivierung, so dass dieses In-vitro-Verfahren möglicherweise eine brauchbare Alternative zum Tierversuch sein könnte (SLIFKO et al. 1998).

Zur Optimierung von Vitaitätsassays zeigte ein Vergleich beim Gebrauch von konventionellen Glasobjektträgern mit sogenannten ”well chamber slides”, dass beide sich gleichermaßen eignen, um Monolayer-Kulturen mit Oozysten zu infizieren und anschließend auszuwerten. Es ergaben sich keine Unterschiede der Infektiösität in der qualitativen Auswertung. Die ”well chamber slides” haben den Vorteil, dass man eine begrenzte infizierte Oberfläche vollständig betrachten kann. Um eine Auswertung auch bei höheren Oozysteninfektionsdosen zu ermöglichen, sollte die Inkubationszeit auf 24 Stunden beschränkt werden, da schon nach 48 Stunden 380 % mehr Infektionsfoci zählbar waren als nach 24 Stunden (SLIFKO et al. 1997 b).

2.1.8.3.2 Inhibition von C. parvum in vitro

Die Wirksamkeit von 101 antimikrobiellen und anderen Substanzen auf C. parvum wurde an infizierten Zellkulturen mit Hilfe von Antikörpern von WOODS et al. (1996) getestet. Die Mehrheit der Substanzen hatte eine erkennbare Wirksamkeit erst in hohen Konzentrationen.

Zu den getesteten antimikrobiellen Substanzen gehören z.B. Antibiotika (Ionophore, Sulfonamide, Aminoglykoside, Makrolidantibiotika und Tetrazykline), Malonat, Sinefungin und Ozon.

Die höchste Inhibitionswirkung hatte die Stoffgruppe der Ionophoren. Alborixin hemmte C.

parvum schon bei einer Konzentration von 12,5 ng/ml zu 97 %. Allerdings können Ionophore in dieser Dosis in vivo wegen ihrer hohen Toxizität nicht eingesetzt werden. Ca. 30 % der getesteten Sulfonamide waren bei hohen Anwendungskonzentrationen wirksam (WOODS et al. 1996). Eine weitere Studie bestätigte, dass die Sulfonamide Sulphadimethoxin und Sulphamethazine gegen C. parvum wirksam waren (REHG 1991 b). WOODS et al. (1996) zeigten, dass Sulphanitran und Trimethoprim effizienter waren als Sulphadimethoxin und Sulphamethazine.

Von den Aminoglykosiden war nur Paromomycin im Mikrogrammbereich (100 µg/ml) mit einer Inhibition von 69 % wirksam (WOODS et al. 1996). Eine andere Studie des Wirkstoffes Paromomycin in Zellkultur belegt ebenfalls die inhibitorische Wirkung gegen C. parvum. Die Wirksamkeit einer Paromomycin-Konzentration von 100 µg/ml lag bei 62 %, von 1 mg/ml bei 95 %. Höhere Konzentrationen (5 mg/ml) erwiesen sich jedoch als weniger inhibitorisch und erreichten eine Wirksamkeit von 86 % (MARSHALL u. FLANIGAN 1992).

Makrolidantibiotika zeigten sowohl in vitro (WOODS et al. 1996) als auch in vivo (REHG 1991 a) eine Antikryptosporidienaktivität. Die stärkste Wirkung der Makrolidantibiotika wiesen Azithromycin und Clindamycin auf. Makrolidantibiotika konnten nicht alle Kryptosporidien vollständig eliminieren, so dass es zu Superinfektionen des Wirtsgewebes kam (WOODS et al. 1996).

Tetracycline, vor allem Doxycyclin, waren in vitro gegen C. parvum aktiv (WOODS et al.

1996) und führten auch in vivo allein oder in Kombination mit Paromomycin zu einer Hemmung von C. parvum (FAYER u. ELLIS 1993 a). Mikrotubuli-Inhibitoren wie der Wirkstoff Colchicin bewirken in C.-parvum-infizierten HT-29-Zellkulturen eine Reduktion der intrazellulären Parasitenstadien um 77 %. Vinblastine, ein weiterer Mikrotubuli-Inhibitor, reduzierte ebenfalls den Parasitenbefall der Wirtszellen (WIEST et al. 1993).

Der Wirkstoff Malonat wies dagegen bei einer niedrigen Konzentration von 0,04 µg/ml eine höhere Inhibition von C. parvum auf als bei höheren Konzentrationen (0,1, 0,3 oder 1,0 mg/ml). Dies wurde über Ausfällungen bei höheren Konzentrationen erklärt, die zur Bildung von Micellen geführt haben können.

Sinefungin zeigte in der Zellkultur eine Inhibitionsrate auf C. parvum von ca. 80 %, wenn man den Wirkstoff zwei Stunden nach Zugabe der Sporozoiten zur Zellkultur dem Nährmedium zusetzte. Gab man Sinefungin und Sporozoiten simultan zur Zellkultur, wurden nur Inhibitionsraten von maximal 50 % erreicht (GARGALA et al. 1999).

Im Vergleich zu Giardia wies C. parvum gegenüber Ozon eine 30mal stärkere Resistenz, und gegenüber Chlordioxin eine 14mal höhere Resistenz auf (KORICH et al. 1990).