C.- parvum-Nachweis mit der Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction: PCR)
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
5.7 Schlußfolgerung
Der in dieser Studie entwickelte Vitalitätsassay für C. parvum-Oozysten bedarf weiterer Untersuchungen. Zwar ist ein Vitalitätsnachweis von C. parvum in vitro durch PCR-Auswertung von infizierten Zellkulturen im Prinzip möglich, aber es besteht nach wie vor Bedarf für erhebliche Verbesserungen, bevor dieses Verfahren z.B. für Desinfektionsmitteltestungen verwendet werden kann. Quantifizierung durch bildanalytische oder andere Verfahren könnte die Aussagekraft verbessern und hin zu einem routinemäßig anwendbaren Modell führen.
Die Markierung infizierter Zellkulturen mit monoklonalen Antikörpern ist schneller durchzuführen als die PCR. Die Fokuszählmethode kann allerdings zu falsch positiven Ergebnissen führen. Das Mausmodell hatte den größten finanziellen Aufwand und ist mit ethischen Problemen belastet. Die Verwendung größerer Probenzahlen ist in vitro einfacher zu realisieren. Damit ist zwar noch kein in der Praxis anwendbares in vitro Modell als Vitalitätsassay verfügbar, die vorliegenden Studien lassen aber erwarten, dass eine Methode auf Basis der Focuszählmethode oder einer PCR etablierbar ist.
6. ZUSAMMENFASSUNG
Zur Vitalitätsprüfung von Cryptosporidium parvum wurden Oozysten dem Desinfektionsmittel Neopredisan® in verschiedenen Konzentrationen (4 %, 1 %, 0,25 %, 0,0625 %, 0 %) und Inkubationszeiten (30, 60, 90, 120 min) ausgesetzt, anschließend vom Desinfektionsmittel befreit und zur Infektion von Zellkulturen und Mäusen verwendet. Die Unschädlichkeit von Desinfektionsmittelresten in Konzentrationen bis zu 0,002 % für HCT-8-Zellen wurde im MTT-Test belegt.
Zur Ermittlung der C.-parvum-Vitalität wurden insgesamt 339 Zellkulturen verwendet, die mit desinfizierten oder nicht desinfizierten C.-parvum-Oozysten infiziert wurden. Die Wirtszell-DNA und Parasiten-DNA wurde gewonnen und mit einem kryptosporidienspezifischen Primer wurde eine PCR durchgeführt. Im Agarosegel wurde eine spezifische Bande bei 649 bp dargestellt. Positive PCR-Ergebnisse wurden ab einer Einsaat von 1 x 102 Oozysten/Kalotte ermittelt. Die Zunahme der Oozystenzahl/Kalotte führte zu einer Zunahme der positiven PCR-Ergebnisse. Bei Einsaat von 1 x 102 Oozysten waren 16 % der Kulturen (n=25) in der PCR positiv, während bei Verwendung von 1 x 105 Oozysten 67,4
% der Kulturen (n=43) PCR-positiv waren.
Die Infektion von HCT-8-Zellkulturen mit desinfizierten Oozysten führte in Abhängigkeit von der Desinfektionsmittelkonzentration zu einer Abnahme des Anteils positiver PCR-Ergebnisse. Bei Anwendung von 4 % Neopredisan® war nur eine von 24 Kulturen positiv, während bei einer geringeren Konzentration von 0,0625 % Neopredisan® 28,6 % der Kulturen positive PCR Ergebnisse lieferten. Von 78 Kontrollkulturen, die nicht desinfizierte Oozysten erhielten, waren 61,5 % positiv. Die PCR-Banden nach Einsaat von mit Neopredisan® behandelten Oozysten waren schwächer ausgeprägt. Bei Inkubationszeiten über 30 min nahm die Zahl positiver PCR-Ergebnisse ab.
Die Anwendung eines Floureszein-gekoppelten monoklonalen Antikörpers bestätigte den Vitalitätsverlust der Oozysten bei Anwendung von 4 % Neopredisan® über 120 min. Es
wurden hierbei durchschnittlich nur 0,42 Foci/105 eingesäten Oozysten gezählt. Im Gegensatz dazu wurden bei Einsaat von 100 unbehandelten Oozysten 45 Foci gezählt. Die Zählung der Foci in der Zellkultur ist nur eingeschränkt quantitativ auswertbar, da ein Focus einen oder mehrere Parasitenstadien darstellen kann.
Durch die Kombination der Infektion von Zellkulturen mit desinfizierten und unbehandelten C.-parvum-Oozysten und anschließende PCR konnte die Vitalität der Oozysten abgeschätzt werden. Allerdings mangelt es der Methode noch an Reproduzierbarkeit und einer (semi-) quantitativen Bewertbarkeit.
7. SUMMARY
E. Eckert (2001)
Studies on the viability assessment of Cryptosporidium parvum.
In order to evaulate the viability of Cryptosporidium parvum, oocysts were treated with the disinfectant Neopredisan® in varying concentrations (4 %, 1 %, 0.25 %, 0.0625 %, 0 %) and incubation times (30, 60, 90, 120 min), after which the disinfectant was removed and cell cultures and mice were infected. The remaining disinfectant was demonstrated not to be noxious for cell cultures in concentrations of 0.002 % or less, as shown in an MTT-assay.
For the determination of C. parvum viability a total of 339 cell cultures were used which were infected with disinfected or untreated oocysts of C. parvum. DNA from host cells and parasites was harvested and PCR was carried out using Cryptosporidium-specific primers. A specific band of 649 bp was demonstrated on an agarose gel. PCR was found to be positive from a concentration of 1 x 102 oocysts/well. Increasing numbers of oocysts/well also increased the numbers of positive PCR results. When 1 x 102 oocysts were seeded 16 % of the cultures (n=25) were positive, while 67.4 % of the cultures with 1 x 105 oocysts (n=43) were positive.
Depending on the concentration of disinfectant the infection of HCT-8 cell cultures with disinfected oocysts lead to a decrease of positive PCR-results. After application of 4 % Neopredisan® only one out of 24 cultures was positive, while at lower concentrations of 0.0625 % Neopredisan® 28.6 % of the cultures were PCR-positive. Of the 78 control cultures seeded with untreated oocysts 61.5 % were positive. The PCR-bands were weaker after seeding of Neopredisan®-treated oocysts. After incubation for 30 min the number of positive PCR results decreased.
Application of a fluorescein-conjugated monoclonal antibody verified the loss of oocyst viability after application of 4 % Neopredisan® for120 min. Per average 0.42 foci/105 seeded oocysts were counted. In contrast, after seeding of 100 untreated oocysts 45 foci were counted.
The quantitiative evaluation of foci counts in cell culture is limited since a single focus can represent one or more parasite stages.
With the combination of infection of cell cultures with disinfected or untreated C. parvum oocysts followed by PCR the oocyst viability could be estimated. However, the method still lacks reproducibility and the possibility of (semi-) quantitative estimation.
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