Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
aus der Abteilung Bakteriologie
(Nationales Referenzzentrum für Systemische Mykosen) des Universitätsklinikums Göttingen
Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Nicole Denikus
aus Horstedt Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung durch die Tierärztliche Hochschule:
Univ.-Prof. Dr. G. F. Gerlach
Wissenschaftliche Betreuung durch das Universitätsklinikum Göttingen:
Priv.-Doz. Dr. U. Reichard
1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. G. F. Gerlach 2. Gutachter/in: Prof. Dr. K. H. Böhm
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2004
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Re 953/3).
Teile dieser Arbeit sind auf folgenden Kongressen vorgestellt worden:
DENIKUS, N., B. RIEMENSCHNEIDER und U. REICHARD (2003)
Identification of antigens of A. fumigatus expressed during invasive mycosis Poster, 6thVAAM-Meeting “Molecular Biology of Fungi”
Göttingen, 03.-05.09.2003
DENIKUS, N., B. RIEMENSCHNEIDER und U. REICHARD (2003)
A rabbit model for identification of Aspergillusantigens expressed during invasive mycosis
Poster, 55. Annual Meeting of the “Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie”
Dresden, 28.09.-01.10.2003
Inhaltsverzeichnis A Einleitung B Schrifttum B.1 Aspergillen B.1.1 Taxonomie B.1.2 A. fumigatus B.1.2.1 Morphologie
B.1.2.2 Vorkommen und Bedeutung
B.1.2.2.1 A. fumigatusund seine Bedeutung in der Veterinärmedizin B.1.2.2.2 A. fumigatusund seine Bedeutung in der Humanmedizin B.1.2.2.2.1 Invasive Aspergillose
B.1.2.2.2.2 Andere durch Aspergillen verursachte Erkrankungen des Menschen
B.1.3 Immunologie
B.1.3.1 Angeborene Immunität B.1.3.2 Erworbene Immunität B.1.3.3 Immunität im Tiermodell
B.1.4 Tiermodelle der invasiven Aspergillose B.1.5 Antigene und Virulenzfaktoren
B.1.6 Diagnostik B.1.7 Genomprojekt C Material
C.1 Geräte
C.2 Verbrauchsmaterial und Chemikalien C.3 Lösungen, Puffer und Nährmedien C.4 A. fumigatusD141
C.5 A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek C.6 Bakterienstämme
C.7 Antikörper C.8 Primer
C.9 Versuchstiere
S. 9 S. 10 S. 10 S. 10 S. 10 S. 11 S. 12 S. 12 S. 18 S. 18 S. 20 S. 21 S. 21 S. 22 S. 23 S. 24 S. 26 S. 30 S. 30 S. 31 S. 31 S. 31 S. 31 S. 31 S. 31 S. 32 S. 32 S. 32 S. 32
D Methoden
D.1 Tierexperimentelle Methoden
D.1.1 Blutentnahmen und Serumgewinnung D.1.2 Immunsuppression
D.1.3 Infektion der Tiere
D.1.3.1 Infektionsbegleitende Kontrollen D.1.3.2 Kontrolle des Infektionserfolges D.1.3.3 Serologische Diagnostik
D.1.4 Tötung der Tiere
D.1.4.1 Sektion und weiterführende Untersuchungen
D.2 Mikrobiologische, proteinchemische und immunologische Methoden
D.2.1 Herstellung von Ausgangsmaterial von A. fumigatusD 141 D.2.1.1 Herstellung der Zellwandfraktion
D.2.1.2 Herstellung der intrazellulären Proteinfraktion D.2.2 Bestimmung des Proteingehalts
D.2.3 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
D.2.3.1 Herstellung der Gele
D.2.3.2 Coomassie-Brillantblau-Färbung D.2.4 Zweidimensionale Gelelektrophorese D.2.4.1 Vorbereitung der Proben
D.2.4.2 Erste Dimension (Isoelektrische Fokussierung) D.2.4.3 Zweite Dimension (Proteinseparation nach dem
Molekulargewicht) D.2.4.3.1 Herstellung der Gele D.2.4.3.2 Gelelektrophorese D.2.4.3.3 Silberfärbung
D.2.4.3.4 Kolloidale Coomassie-Färbung D.2.5 Proteintransfer mittels Westernblot
D.2.6 Immundetektion nach Westerblot (Immunblot)
S. 33 S. 33 S. 33 S. 33 S. 33 S. 34 S. 34 S. 35 S. 35 S. 35
S. 36 S. 36 S. 38 S. 38 S. 39 S. 40 S. 41 S. 42 S. 43 S. 43 S. 44 S. 44 S. 44 S. 45 S. 46 S. 47 S. 48 S. 48
D.3 Molekularbiologische Methoden
D.3.1 Screening einer A. fumigatus-cDNA-Expressionsbank mit Antikörpern (Immunscreening)
D.3.1.1. Vorbereitungen
D.3.1.2 Absorption von Anti-E.coli-Antikörpern durch Pseudoscreening D.3.1.3 Screening der λ-ZAP-cDNA-Phagenbank mit Infektionsseren D.3.1.4 Aufreinigung der isolierten Phagenklone
D.3.1.5 Infektionsspezifität der Klone
D.3.1.6 Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene D.3.2 Umklonierung der cDNA aus λ-ZAP in ein Plasmid D.3.3 Plasmid-Minipräparation
D.3.4 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektroporation D.3.5 Transfektion von Plasmid-DNA in E.coliDH 5α
D.3.6 DNA-Sequenzanalyse D.3.6.1 Sequenzierung
D.3.6.2 Computeranalyse der Sequenzdaten D.3.7 Klonierung von pET-Expressionsplasmiden D.3.7.1 Produktion HIS-getagter pET-Proteine D.3.7.2 Aufarbeitung HIS-getagter pET-Proteine
D.3.7.2.1 Verwendete Puffer, Säulenäquilibrierung und Vorbereitung des Probenmaterials
D.3.7.2.2 Affinitätschromatographie HIS-getagter pET-Proteine E Ergebnisse
E.1 Tierversuch
E.1.1 Anzahl der Tiere und Infektionsdosen E.1.2 Infektionsbegleitende Kontrollen
E.1.2.1 Gewichtsabnahme und Körpertemperatur
E.1.2.1.1 Prozentuale Gewichtsabnahme der Tiere im Verlauf der Infektionen
E.1.2.1.2 Körpertemperaturen der Tiere im Verlauf der Infektionen E.1.2.2 Auswertung der infektionsbegleitenden Kontrollen
E.1.3 Überprüfung und Darstellung des Infektionserfolges E.1.3.1 Auswertung der eindimensionalen Immunblots E.1.3.2 Zweidimensionale Gele und Immunblots
S. 50 S. 50 S. 50 S. 51 S. 52 S. 53 S. 53 S. 54 S. 54 S. 55 S. 56 S. 56 S. 57 S. 57 S. 57 S. 58 S. 58 S. 58 S. 59 S. 60 S. 61 S. 61 S. 61 S. 62 S. 62 S. 73 S. 74 S. 75 S. 75 S. 78 S. 79
E.1.4 PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA E.1.5 Sektionen
E.1.5.1 Sektionsbilder
E.1.6 Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells
E.2 Screening einer A. fumigatus- cDNA- Expressionsbibliothek mit Infektionsseren (Immunscreening)
E.2.1 Screeningzeitpunkt
E.2.2 Gescreente und aufgereinigte Plaques E.2.3 Infektionsspezifität der Antigene
E.2.3.1 Darstellung infektionsspezifischer Antigene
E.2.4 Zusammenfassende Darstellung der durch das Screening der cDNA-Bank isolierten Antigene
E.2.4.1 Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene
E.2.4.2 Darstellung der Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene E.2.5 Einordnung der Antigene
E.2.6 Rekombinante Proteine F Diskussion
F.1 Aspf 16
F.2 Weitere Antigene mit Enzymfunktion F.3 Proteine mit Chaperonfunktion
F.4 Proteine mit bislang unbekannter Funktion F.5 Tiermodell
G Zusammenfassung H Summary
I Literaturverzeichnis J Anhang
J.1 Geräte
J.2 Verbrauchsmaterial J.3 Chemikalien
J.4 Stammlösungen J.5 Nährmedien
J.6 Abbildungsverzeichnis J.7 Tabellenverzeichnis
S. 82 S. 83 S. 84 S. 86
S. 87 S. 97 S. 97 S. 99 S. 99 S. 101 S. 103 S. 104 S. 105 S. 107 S. 108 S. 109 S. 110 S. 111 S. 113 S. 115 S. 118 S. 119 S. 120 S. 158 S. 158 S. 159 S. 160 S. 162 S. 163 S. 164 S. 166
Abkürzungsverzeichnis
A. = Aspergillus
Abb. = Abbildung
A. bidest. = Aqua bidestillata
bspw. = beispielsweise
bzw. = beziehungsweise
ca. = circa
cDNA = copy deoxyribonucleic acid
et al. = et alii
d = Tage
g = Erdbeschleunigungskonstante
ggf. = gegebenenfalls
ggr. = geringgradig
h = Stunde
hgr. = hochgradig
Ig = Immunglobuline
i.v. = intravenös
kDa = Kilodalton
KGW = Körpergewicht
λ = Lambda
M = Molarität (mol/l)
mgr. = mittelgradig
m3 = Kubikmeter
MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex mRNA = messenger ribonucleic acid p. inf. = post infectionem
SDS-PAGE = Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Tab. = Tabelle
U = unit
UV = Ultraviolett
v. a. = vor allem
V = Volt
[v/v] = volume per volume
[w/v] = weight per volume
A Einleitung
Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender Schimmelpilz, der sich asexuell über Konidien fortpflanzt. Die Inhalation der Konidien ist in der Regel für immunkompetente Individuen ohne Folgen, da die angeborene Immunität ein invasives Wachstum des Pilzes verhindert. Bei Immunsupprimierten hingegen verursacht A. fumigatus als opportunistischer Krankheitserreger sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin Erkrankungen mit oftmals letalem Ausgang.
So wird die Zahl der humanen Patienten, die an einer invasiven Aspergillose erkranken, allein in Deutschland auf 5000 pro Jahr geschätzt (MÜLLER 1994). Die Erkrankung verläuft trotz Therapie in ca. 50 bis 60 % der Fälle tödlich und betrifft insbesondere Leukämiepatienten und Empfänger von Organtransplantaten (BODEY et al. 1992; DENNING 1995; 1996; GROLL et al. 1996; DENNING 1998; LATGÉ 1999; LIN et al. 2001).
Obwohl die normale Abwehr von A. fumigatus durch unspezifische angeborene Immunmechanismen (Granulozyten, Makrophagen, Komplement) erfolgt, ist es gelungen, im Tierversuch eine Immunität gegen invasives Wachstum von A.
fumigatus zu erzeugen. Welche Antigene diesen Schutz vermitteln, ist jedoch weitgehend unklar. Bislang ist lediglich ein einziges immunitätsvermittelndes Antigen des Pilzes (Aspf 16) identifiziert worden (BOZZA et al. 2002).
Ziel dieser Arbeit ist es, weitere Antigene von A. fumigatuszu identifizieren und damit einen Beitrag für die mögliche Entwicklung eines Impfstoffes für Risikopatienten zu leisten. Des Weiteren ergibt sich durch die Identifikation von Antigenen die Option, neue auf Antigen-Detektion basierende Tests zu entwickeln, die eine frühzeitige Diagnostik der invasiven Aspergillose ermöglichen könnten.
B Schrifttum
B.1 Aspergillen B.1.1 Taxonomie
Die Gattung Aspergillus ist im Jahre 1729 begründet worden (MICHELI 1729).
Aufgrund der Morphologie der Aspergillen werden diese Schimmelpilze auch als Gießkannenschimmel bezeichnet.
Aspergillen gehören zur Abteilung der höheren Pilze. Ihre taxonomische Zuordnung richtet sich nach Art ihrer Fortpflanzung. So werden Aspergillen, die sich sexuell (teleomorph) fortpflanzen, der Unterabteilung der Ascomycotina (Schlauchpilze) zugeordnet. Hier gehören sie der Ordnung der Eurotiales (KWON-CHUNG u.
BENETT 1992) an. Die teleomorphen Arten der Gattung Aspergillus werden innerhalb dieser Ordnung unter anderen Namen geführt als die Arten, die sich als so genannte imperfekte Pilze durch ihre ungeschlechtliche (anamorphe) Fortpflanzung auszeichnen. Diese sich asexuell reproduzierenden Aspergillen werden zu der Unterabteilung der Deuteromycotina (Fungi imperfecti) gezählt. In dieser Unterabteilung ist eine Vielzahl von Pilzen zusammengefasst, von denen bisher nur die ungeschlechtliche Fortpflanzung und keine sexuelle Vermehrungsform bekannt ist (ROLLE u. MAYR 1993). Bei den imperfekten Pilzen ist die Gattung Aspergillus der Ordnung Moniliales und der Klasse der Fadenpilze (Hyphomyceten) zugehörig (KWON-CHUNG u. BENETT 1992).
Heutzutage sind mehr als 180 Aspergillus-Arten bekannt. Davon sind ungefähr 70 Arten mit teleomorpher Fortpflanzung beschrieben (SAMSON 1999).
B.1.2Aspergillus fumigatus
Das erste Mal wurde die Art A. fumigatus im Jahre 1863 von Fresenius beschrieben.
Dieser berichtete über Aspergillus-Formen, die er in der menschlichen Lunge und in dem Respirationstrakt einer Trappe aufgefunden hatte (SCHMIDT u. SCHMIDT 1999). Da für A. fumigatus bisher nur die asexuelle Fortpflanzung in Form von Konidien bekannt ist, wird er als imperfekter Pilz in die Klasse der Fadenpilze (Hyphomyceten) und der Ordnung der Moniliales gruppiert.
Konidien
Konidiophorvesikel Phialiden
Konidio- phor
Nährmyzel
10 µm Fußzelle
B.1.2.1 Morphologie
Aspergillus fumigatus pflanzt sich asexuell über so genannte Konidiosporen fort.
Diese Konidien werden von ausdifferenzierten Anteilen des Myzels, den Konidiophoren, gebildet und in die Umgebung abgegeben. Die Sporen sind von graugrüner Farbe und 2-3 µm groß (RAPER u. FENELL 1965).
Abb. 1: Morphologie von Aspergillus fumigatus
Auf Sabouraud- und Malzextraktagar wachsen innerhalb von 2-3 Tagen bei 37°C Pilzkolonien von samtiger Textur (KWON-CHUNG u. BENETT 1992). Aspergillus fumigatus ist ein thermophiler Schimmelpilz, dessen Wachstumsoptimum bei 37° bis 42°C liegt. Jedoch ist er in der Lage, selbst bei minimalen Temperaturen von 10°- 12°C und maximalen Gradzahlen von 55°C zu wachsen (REISS 1997).
B.1.2.2 Vorkommen und Bedeutung
Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender, heterotropher Schimmelpilz mit saprophytärer Lebensweise. Er findet sich in Heu, Müll und Blumenerde, sowie in Vogelnestern, Hühnerställen und Tierbauten (REISS 1997). Aufgrund seiner Thermotoleranz konnte er sogar in der oberen Atmosphäre, der Sahara und der Antarktis gefunden werden (BARDANA 1980). Die durchschnittlichen Sporenkonzentrationen in Räumen und der freien Natur liegen bei 2-5 Konidien pro m3. Mensch und Tier atmen daher täglich mehrere hunderte dieser Konidien ein (GOODLEY et al. 1994; HOSPENTHAL et al. 1998). Bedingt durch ihre geringe Größe von lediglich 2-3 µm gelangen sie mit dem Luftstrom bis in die Lungenalveolen eines Individuums (RAPER u. FENELL 1965; SAMSON u. VAN- REENEN-HOEKSTRA 1988). Die Inhalation der Konidien ist in der Regel für immunkompetente Individuen ohne Folgen, da die angeborene Immunität ein invasives Wachstum des fakultativ pathogenen Pilzes verhindert (SCHNEEMANN u.
SCHAFFNER 1999). Bei Immunsupprimierten hingegen verursacht A. fumigatus zunehmend Erkrankungen mit oftmals letalem Ausgang (COHEN et al. 1993;
ROGERS 1995; RUCHLEMER et al. 1996).
Aspergillen sind als opportunistische Infektionserreger sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin bekannt.
B.1.2.2.1 A. fumigatusund seine Bedeutung in der Veterinärmedizin
In der Veterinärmedizin werden Erkrankungen, die durch Aspergillen hervorgerufen werden, in Aspergillosen des Geflügels und Aspergillosen der Säugetiere unterschieden.
Die Aspergillose des Geflügels wird hauptsächlich durch A. fumigatus hervorgerufen.
Vereinzelt kommen auch A. flavus, A. niger, A. nidulans und A. terreus als Krankheitsverursacher in Frage (GEDEK 1989; PAL 1992; HEIDENREICH 1997). Da der besondere Atmungsapparat der Vögel dem Pilz in Bezug auf Temperatur, Feuchtigkeit und Belüftung ideale Wachstumsbedingungen bietet, ist das Geflügel relativ häufig von der Erkrankung betroffen (GEDEK 1989).
Bei der Geflügelaspergillose werden Einzeltiererkrankungen und Enzootien in der Massentierhaltung unterschieden. Bei letzteren kann ein seuchenartiges Auftreten der Erkrankung beispielsweise durch Sägespäneeinstreu begünstigt werden, da dieses Schleimhautläsionen im Atmungstrakt der Tiere hervorruft und somit das Eindringen des ubiquitär vorkommenden Erregers in den Wirt fördert. Die hohe Besatzdichte der Tiere in der Intensivhaltung und die sich daraus entwickelnde Staubentwicklung tragen ihr Übriges zu einer Infektion bei (ROLLE u. MAYR 1993).
Aspergillus fumigatus ist sogar in der Lage, Eier zu infizieren, die gerade bebrütet werden. Der Pilz siedelt sich auf der Oberfläche des Eis an und dringt durch die Poren der Eischale ein. Durch sein Wachstum auf der Schalenhaut tötet er schließlich den Embryo (GEDEK 1989).
Für die Aspergillose des Geflügels sind akute Formen (v. a. bei Küken) durch das Einatmen einer großen Konidienzahl aufgrund mangelnder Stallhygiene ebenso beschrieben, wie chronische Verläufe bei gestressten und immunsupprimierten adulten Tieren. Letztere werden durch eine kontinuierliche Exposition mit dem ubiquitären Pilz hervorgerufen (REDIG 1986; GEDEK 1989; OGLESBEE 1997).
Die akute Erkrankung führt bei Küken zu einer zügigen Kolonisation der Lungen und äußert sich klinisch hauptsächlich als schwere Dyspnoe. Daneben können Apathie, Fieber, Diarrhoe und Krämpfe beobachtet werden. In der Lunge lassen sich massenhaft diffus verstreute stecknadelkopfgroße Pilzgranulome nachweisen (GEDEK 1989; OGLESBEE 1997).
Bei der chronischen Form der Erkrankung werden zunächst die Luftsäcke und der Syrinx befallen. Im Krankheitsverlauf kommt es zu einer Verbreitung des Erregers im gesamten Respirationstrakt (OGLESBEE 1997). Klinisch ist die Erkrankung durch Dyspnoe, akzessorische Atemgeräusche und gestörte Bewegungskoordination gekennzeichnet. Pathologische Veränderungen sind in Form von konzentrischen graugünen Herden in der Lunge, den Bronchien und den Luftsäcken festzustellen.
Vereinzelt sind plattenförmige, käsige, von Pilzrasen bedeckte Schwielen zu sehen, die das gesamte Lumen der Luftsäcke einnehmen und sekundär verkalken können (GEDEK 1989). Das Erkrankungsrisiko hängt von vielerlei Faktoren wie Stress (z. B.
durch Gefangennahme, Verschiffung), Trauma (z. B. Verletzung, Rauchinhalation), zu hohem Stallbesatz, ungenügender Stallhygiene und Mangelernährung (Hypovitaminose A) ab. Prädisponierend sind besonders bereits bestehende Erkrankungen, die fortwährende Gabe von Antibiotika (Tetrazyklin) oder eine
Therapie mit immunsupprimierenden Kortikosteroiden (AGUILAR u. REDIG 1995;
HEIDENREICH 1997; OGLESBEE 1997; ZIEMER 2001). Die Aspergillose ist die am häufigsten auftretende Endomykose bei frei lebenden, in Gefangenschaft gehaltenen oder domestizierten Spezies (GEDEK 1989).
Für frei lebende Tiere wurden tödliche Krankheitsverläufe bei Kakadus (BURR 1981), Möwen (BRAND et al. 1988), Stockenten (BAIR et al. 1988) und Krähen (ZINKL et al.
1977) beschrieben. Die Erkrankung wird bei frei lebenden Raubvögeln hingegen selten beobachtet (HEIDENREICH 1997), spielt für in Gefangenschaft gehaltene Tiere (z. B. in Zoos) durch die mit dem Arrest verbundene Steigerung des Erkrankungsrisikos jedoch eine Rolle (DYKSTRA et al. 1997; REDIG 1997;
FAUCETTE et al. 1999). Von tödlichen Krankheitsverläufen bei jungen Straußen, die durch eine kontaminierte Umgebung und inadäquate Haltungsbedingungen infiziert wurden, berichteten PERELMAN u. KUTTIN (1992) und YOKOTA et al. (2004).
MARKS et al. (1994) und FITZGERALD u. MOISAN (1995) beobachteten die Erkrankung bei adulten Tieren im Zusammenhang mit lang andauernden Antibiotikatherapien.
Sehr empfänglich für eine Infektion mit A. fumigatus sind auch verschiedene Pinguinarten. In zoologischen Gärten und Aquarien wurden Infektionsausbrüche mit letalem Ausgang bei kurz zuvor importierten Tieren beobachtet (KHAN et al. 1977;
NAKEEB et al. 1981). FLACH et al. (1990) analysierten retrospektiv die Mortalität von Pinguinen eines Zoos und stellten fest, dass die Aspergillose bei den meisten Tieren die Todesursache war. Ebenso waren junge Tiere wesentlich empfänglicher für die Erkrankung als adulte Pinguine. REIDARSON u. MC BAIN (1992) vertreten die Meinung, dass jeder in Gefangenschaft gehaltene Pinguin in gewissem Ausmaß mit Aspergillen infiziert ist, es jedoch nur bei prädisponierten Tieren, bspw. durch Stress oder andere Erkrankungen, zur klinischen Manifestation einer Aspergillose kommt.
Unter den domestizierten Vögeln gelten Graupapageien, Amazonen und Kakadus als besonders anfällig für die Erkrankung (RITCHIE 1990; ZIEMER 2001). Als häufige Ursache für die Aspergillose kommen bei diesen Tieren eine nichtartgerechte Haltung (trockene Heizungsluft, Bewegungsmangel) sowie Mangelernährung (Vitamin-A-Mangel durch ausschließliche Samennahrung, Verfütterung von Nüssen und Samen, die mit Pilzsporen kontaminiert sind) infrage (SIMPSON u. EUDEN 1991; ZIEMER 2001). Prädisponiert sind auch hier Jungtiere, Tiere mit bestehender
chronischer Erkrankung oder Vögel, denen Antibiotika und/ oder Cortison verabreicht wird (MC MILLAN u. PETRAK 1989; VAN DER HEYDEN 1993; ZIEMER 2001).
Die Aspergillose der Säugetiere ist weniger verbreitet als die Aspergillose des Geflügels. Seuchenartige Infektionsausbrüche gibt es bei Säugetieren nicht, die Erkrankung ist stets auf Einzeltiere beschränkt (GEDEK 1989). Bezüglich der Pathogenese gibt es viele Parallelen zu der Erkrankung des Geflügels. So wirken sich bereits bestehende Erkrankungen, die anhaltende Gabe von Antibiotika oder eine Therapie mit immunsupprimierenden Kortikosteroiden auch bei diesen Tieren prädisponierend für eine Aspergillose aus (WEILER et al. 1991; GREENE 1998;
PÉREZ et al. 1998, 1999). Die Erkrankung ist in den meisten Fällen auf den Atmungstrakt der Tiere beschränkt, bei Wiederkäuern sind jedoch auch Mastitiden und daraus resultierende systemische Infektionen beschrieben worden (ROLLE u.
MAYR 1993; PÉREZ et al. 1998, 1999). Klinisch äußern sich Aspergillosen der Lunge durch Husten, Dyspnoe und unspezifische Symptome wie Inappetenz, Fieber und ggf. Durchfall. Im Falle einer Aspergillose des Euters bestimmt eine akute Mastitis mit hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden das klinische Bild (STEPHAN et al. 2000; BLEUL et al. 2002). Außerdem sind Einzelfälle über mykotische Aborte durch A. fumigatus und andere Aspergillen bei Rind und Pferd (ROLLE u. MAYR 1993) als auch beim Schwein (EUSTIS et al. 1981) bekannt. Des Weiteren sind Infektionen mit A. fumigatus bei einem Lama (SEVERO et al. 1989), einem Delphin (REIDARSON et al. 1998) und bei Kamelen (EL-KHOULY et al. 1992) beschrieben worden. Im Folgenden wird auf die Erkrankungen unserer Haussäugetiere näher eingegangen.
Die Luftsackmykose des Pferdes ist eine sporadisch auftretende Einzeltiererkrankung, die durch verschiedene Pilze (Aspergillus ssp., Penicillium ssp., Mucorales) hervorgerufen wird (COOK et al. 1968; GUILLOT et al. 1997;
FREEMAN 1999). Häufig wird A. fumigatus als ursächlicher Erreger angesehen (RIES 1903; DIETZ u. WIESNER 1982; GUILLOT et al. 1997). Die Ätiologie der Luftsackmykose ist noch weitestgehend unklar (GUILLOT et al. 1997). Es wird jedoch angenommen, dass prädisponierende Faktoren eine Rolle spielen. So werden traumatische Ursachen (DIETZ u. WIESNER 1982), pathologisch-anatomische Besonderheiten wie Aneurysmen (COLLES u. COOK 1983; GREET 1987) und der Erkrankung vorangegangene intensive Antibiotika-Therapien (LEEMANN u.
SEIFERLE 1970; WEILER et al. 1991) genauso diskutiert wie eine reduzierte systemische oder lokale Immunabwehr des Tieres (WEILER et al. 1991).
Die Pathogenese dieser im deutschsprachigen Raum eher selten diagnostizierten Erkrankung (GRABNER 1987; WEILER et al. 1991; OHNESORGE et al. 1999) ist bis heute nicht ausreichend geklärt. Die Eintrittspforte für die Pilze in den Luftsack ist die Pharyngealöffnung der Tuba auditiva (DIETZ u. WIESNER 1982). In den Luftsäcken verursachen die Erreger zunächst eine diphteroid-nekrotisierende Schleimhautentzündung, die in der Regel klinisch inapparent verläuft.
Lebensbedrohliche Blutungen kann die Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium hervorrufen, wenn Pilzmyzel große, dem Luftsack anliegende Arterien, arrodiert (HILBERT et al. 1981; DIETZ u. WIESNER 1982). Neurologische Ausfallerscheinungen (bspw. Dysphagie, Hemiplegia laryngis, Fazialisparese) zeigen die Tiere, wenn die Mykoseerreger Nerven in der Umgebung des Luftsacks geschädigt haben (HILBERT et al. 1981; WEILER et al. 1991). MC LAUGHLIN u.
O’BRIEN (1986) und GRABNER (1987) berichten sogar von zentralnervösen Störungen, die durch das Eindringen von Pilzmyzel in das Gehirn verursacht wurden.
Infektionen durch Aspergillen sind auch bei Hunden beschrieben worden (RUDOLPH 1974; SHARP 1998; KOHN et al. 2002). Diese beschränken sich in der Regel auf die Nasen und Nasennebenhöhlen. Nasale Aspergillosen des Hundes werden laut SHARP (1998) am häufigsten durch A. fumigatus verursacht, aber auch A. nidulans, A. niger und A. flavus kommen gelegentlich als Erreger in betracht. Die oftmals sehr spät im Infektionsverlauf diagnostizierte Erkrankung (RUDOLPH 1974; KOHN et al.
2002) ist durch ihr invasives Wachstum häufig mit Destruktion von Turbinalschleimhaut und Knochen vergesellschaftet (SHARP 1998; KOHN et al.
2002). Die Pathogenese der Erkrankung ist auch bei Hunden nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch angenommen, dass die Immunkompetenz des Tieres, die bspw. lokal durch sekretorische IgA-Immundefizienzen vermindert sein kann, genauso eine Rolle spielt wie lange Antibiotikatherapie und bereits bestehende Nasenerkrankungen anderer Genese (GREENE 1998). In den bisher durchgeführten Studien konnte keine prädisponierte Rasse bestimmt werden, es wurde jedoch gezeigt, dass sich nasale Aspergillosen ausschließlich bei dolicho- und mesozephalen Hunderassen manifestieren (RUDOLPH 1974; HARVEY u. O’BRIEN 1983; KOHN et al. 2002).
Aspergillosen bei Wiederkäuern äußern sich vorwiegend als Mastitiden.
Euterentzündungen durch fadenförmig wachsende Pilze sind selten, werden jedoch in den meisten Fällen von A. fumigatus verursacht (SCHÄLLIBAUM et al. 1980;
FUCHS 1994). Die klinische Symptomatik einer durch A. fumigatus hervorgerufenen Mastitis reicht von akut verlaufenden Entzündungen bis zu chronischen und latenten Infektionen (WALSER u. KLEINSCHROTH 1979). Da bei einer klinisch manifesten Mastitis pathomorphologisch eitrige Eutergewebseinschmelzungen im Vordergrund stehen, ist die Prognose trotz Therapieversuchen oftmals infaust (FUCHS 1994;
PODSTATZKY et al. 1999; BLEUL et al. 2002). JENSEN et al. (1996) berichten über Milchziegen, die im Puerperium eine nicht therapierbare Euterentzündung entwickelten, welche durch A. fumigatus hervorgerufen wurde. PODSTATZKY et al.
(1999) u. STEPHAN et al. (2000) diagnostizierten durch A. fumigatus verursachte Mastitiden bei Milchkühen.
Dass die Pilzinfektion nicht immer auf das Organ der Primärinfektion und dessen regionäre Lymphknoten beschränkt bleiben muss, zeigt ein Fall einer Kuh, bei der eine chronische, durch A. fumigatus hervorgerufene Mastitis und Bronchopneumonie diagnostiziert wurde (BLEUL et al. 2002). Allerdings konnte nicht geklärt werden, ob die hämatogene oder lymphogene Streuung des Erregers aus der Lunge oder aus dem Euter stattgefunden hat. Eine Verbreitung von A. fumigatus aus der Milchdrüse über das Blut vermuten auch PÉREZ et al. (1998, 1999), die sowohl systemische Aspergillosen als auch auf das Euter beschränkte A. fumigatus-Infektionen bei Milchschafen beschrieben.
Da der Erreger als fakultativ pathogen eingestuft wird, sind viele Autoren der Meinung, dass für die Auslösung einer derartigen Mastitis und der sich daraus ggf.
entstehenden systemischen Infektion, prädisponierende Faktoren vorhanden sein müssen. Übereinstimmend wird der Einsatz von Antibiotika in der Mastitisprophylaxe (Trockenstellen) und Mastitistherapie als ursächlich für eine galaktogene Infektion mit Aspergillus angenommen (JENSEN et al. 1996; PÉREZ et al. 1998, 1999;
PODSTATZKY et al. 1999; STEPHAN et al. 2000). Dazu gehört die iatrogene Übertragung des Erregers durch unsaubere Applikation des Antibiotikums in das Euter genauso wie ein durch die Antibiose begünstigtes Angehen der Pilzinfektion durch Hemmung des bakteriellen Wachstums (PÉREZ et al. 1998; BLEUL et al.
2002).
B.1.2.2.2 A. fumigatusund seine Bedeutung in der Humanmedizin
B.1.2.2.2.1 Invasive Aspergillose
Die bedeutsamste durch Aspergillen verursachte Erkrankung des Menschen ist die invasive Aspergillose (IA). Diese, erstmals 1953 von RANKIN beschriebene Krankheit, betrifft allein in Deutschland ca. 5000 Patienten pro Jahr (MÜLLER 1994).
Ihren Namen verdankt die IA dem unaufhaltsam invasiven Wachstum der Hyphen von Aspergillus durch das Wirtsgewebe (BODEY u. VARTIVARIAN 1989). In den letzten Jahrzehnten verzeichnete die Humanmedizin eine starke Zunahme opportunistischer Infektionen. Dies wird von HENDERSON u. HIRVELA (1996) durch den zunehmend häufigen Einsatz immunsupprimierender Maßnahmen in der modernen Medizin erklärt. Als Erreger dieser Infektionen sind unter den Pilzen die Gattungen Candida und Aspergillus für > 99% der klinischen Fälle verantwortlich (MÜLLER 1994 u. HENNEQUIN 1996). Aspergillus fumigatus ist in 90 % aller durch Aspergillen hervorgerufenen Erkrankungen der herausragende Krankheitsverursacher (DENNING 1998; LATGÉ 1999). Nach DENNING (2000) können jedoch vereinzelt auch andere Arten wie z.B. Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus und Aspergillus nidulansursächlich für Erkrankungen sein.
Eine invasive Aspergillose tritt schätzungsweise im Verlauf von 10 bis 25 % aller Leukämien auf, wobei ihre Letalität trotz Therapie zwischen 50 und 60 % liegt (BODEY et al. 1992; DENNING 1995, 1996; GROLL et al. 1996; DENNING 1998;
LATGÉ 1999; LIN et al. 2001). Somit ist die invasive Aspergillose zu einer der Haupttodesursachen in hämatologischen und Knochenmarkstransplantations- Zentren geworden (SAUGIER-VEBER et al. 1993; JANTUNEN et al. 1997; WALD et al. 1997). Aber auch die Immunsuppression im Rahmen solider Organtransplantationen, insbesondere von Lunge, Leber und Herz, stellt einen Risikofaktor für diese Erkrankung dar. Nach BODEY et al. (1992), PATEL u. PAYA (1997) und WAKAYAMA et al. (2000) gilt die invasive Aspergillose auch bei diesen Patienten als Haupttodesursache unter den infektiösen Erkrankungen.
Die Inzidenz einer invasiven Aspergillose ist außerdem bei Autoimmunerkrankungen, die mit immunsuppressiver Therapie begleitet werden, und bei HIV-Patienten erhöht (DENNING 1998; LATGÉ 1999). Zu Beginn der AIDS-Epidemie spielte die invasive Aspergillose nur eine untergeordnete Rolle. AIDS-Patienten kamen jedoch durch die
stetige Optimierung der Therapie ihrer opportunistischen Infektionen zunehmend in fortgeschrittenere Stadien ihrer Grunderkrankung. Dieses begünstigte eine Zunahme der invasiven Aspergillose (KHOO u. DENNING 1994; GROLL et al. 1996;
MYLONAKIS et al. 1998 und WOITAS et al. 1998).
Die invasive Aspergillose manifestiert sich primär zu ca. 90 % in der Lunge (DENNING 2000). Im Falle eines Versagens der unspezifischen Abwehr werden Konidien von Aspergillus nicht phagozytiert bzw. werden im Phagolysosom der Alveolarmakrophagen nicht abgetötet. Sie können dann innerhalb weniger Stunden auskeimen und als Hyphen invasiv in das Lungengewebe einwachsen. Im Verlauf der Erkrankung ist ein nahezu ungebremstes Wachstum der Aspergillen innerhalb der Lunge typisch. Eine sich entwickelnde, diffuse Pneumonie kennzeichnet die Erkrankung (BODEY u. VARTIVARIAN 1989; KWON-CHUNG u. BENETT 1992;
DENNING 1998; LATGÉ 1999; RÜCHEL u. REICHARD 1999; DENNING 2000).
Häufig kommt es auch zu einer vaskulären Invasion, die mit Obliteration und Infarzierung distaler Gewebeabschnitte vergesellschaftet ist. Im Falle der Zerstörung von Gefäßwänden können massive Hämoptysen beobachtet werden (ALBELDA et al. 1985; BODEY u. VARTIVARIAN 1989; KWON-CHUNG u. BENETT 1992;
PAGANO et al. 1995). Da die A. fumigatus-Hyphen durch ihr invasives Wachstum in der Lage sind, sämtliche bindegewebige Organgrenzen zu durchdringen, kann es zum Einwachsen des Pilzmyzels durch das Diaphragma in den Magen oder die Leber kommen. Auch eine Penetration des Perikards mit daraus resultierender Infektion des Herzens ist möglich (BODEY u. VARTIVARIAN 1989; KWON-CHUNG u. BENETT 1992). Eine hämatogene Disseminierung der Erkrankung wird bei ca.
einem Drittel der Aspergillose-Patienten beobachtet (YOUNG et al. 1970). Wird die Erkrankung nicht therapiert, beträgt die Letalität nahezu 100 % (DENNING 1996), und selbst bei einer systemisch antimykotischen Behandlung versterben die meisten Patienten innerhalb von 10-14 Tagen nach dem Auftreten der ersten klinischen Symptome (DENNING 1998).
Die hohe Mortalität bei Aspergillose-Patienten und die mit der Erkrankung verbundenen erheblichen Behandlungskosten (633 Millionen Dollar in den USA 1996) machen eine Identifikation von Antigenen und die sich daraus ergebende Möglichkeit, eine Vakzine für oben genannte Risikogruppen zu entwickeln, laut STEVENS (2004) dringend erforderlich.
B.1.2.2.2.2 Andere durch Aspergillen verursachte Erkrankungen des Menschen
Hierzu zählen Aspergillosen des immunkompetenten Individuums und allergische Erkrankungen.
Bei den Aspergillosen des Immunkompetenten unterscheidet man saprophytische und invasive Aspergillosen. Erstere werden vor allem durch Aspergillome repräsentiert. Beim Menschen wachsen diese nicht-invasiv in einer Nasennebenhöhle zu einem Tumor heran und werden in den meisten Fällen durch A.
fumigatus und A. flavus hervorgerufen (KWONG-CHUNG u. BENETT 1992;
FERREIRO et al. 1997).
KARAS et al. (1976) und JEWKES et al. (1983) diagnostizierten Aspergillome in präexistierenden Kavitäten der menschlichen Lunge. Diese können beispielsweise nach einer Tuberkulose entstehen. Gelegentlich kommt es hierbei zu Lungenblutungen mit letalem Ausgang, wenn der sonst eher nicht-invasiv wachsende Schimmelpilz größere, pulmonale Arterien arrodiert.
Invasive Aspergillosen kommen bei Immunkompetenten selten vor (KARAM u.
GRIFFIN 1986; KARIM et al. 1997; CLANCY u. NGUYEN 1998). Verglichen mit der akuten invasiven Aspergillose des Immunsupprimierten verlaufen diese Erkrankungen chronisch. Die Infektionsabwehr geht mit der Ausbildung von Granulomen einher (DENNING 1998). Eine Sonderform stellt hierbei die von KERN et al. (1998) beschriebene Chronische Systemische Aspergillose dar. Bei dieser kommt es wahrscheinlich in der aplastischen Phase unter einer Chemotherapie zu einer Infektion mit Aspergillen. Klinisch manifestiert sich die Erkrankung jedoch erst einige Zeit später, wenn sich die Abwehr des Patienten bereits regeneriert hat. Daher ist ein granulomatöser Entzündungstyp charakteristisch2.
Zu den durch Aspergillen hervorgerufenen allergischen Erkrankungen zählen die Allergische Bronchopulmonale Aspergillose (ABPA), die Extrinsische Allergische Alveolitis (EAA) und das Aspergillus-Asthma.
Die ABPA ist eine Erkrankung, die häufig im Rahmen eines exogen-allergischen Asthma bronchiale oder einer Zystischen Fibrose auftritt (VAUGHAN 1993;
COCKRILL u. HADES 1999; SALEZ et al. 2000). Die Immunreaktionen gegen
Antigene von Aspergillus sind durch Allergie-Typ I, III und IV repräsentiert (PEPYS 1969). Der Pilz siedelt nicht-invasiv in den Bronchiallumina (VAUGHAN 1993;
COCKRILL u. HADES 1999), wo mit Myzel durchwachsene Schleimpfröpfe entstehen (HEBISAWA et al. 1997). Klinisch imponiert die Erkrankung mit asthmatischen Episoden, flüchtigen pulmonalen Infiltraten sowie kutanen Hypersensitivitätsreaktionen vom Soforttyp (SCHØNHEYDER 1987; KWONG- CHUNG u. BENETT 1992; COCKRILL u. HADES 1999; SALEZ et al. 2000).
Bei der Extrinsischen Allergischen Alveolitis und dem Aspergillus-Asthma werden die allergischen Symptome durch Inhalation der Konidien hervorgerufen. Die EAA ist eine selten auftretende Sonderform der so genannten„Farmer-Lunge“. Dabei kommt es Stunden nach dem Einatmen einer hohen Konidienzahl von A. fumigatuszu einer gewebelokalisierten Immunreaktion vom Typ III (RICHERSON 1983;
SCHØNHEYDER 1987). Bei Patienten mit einem allergischen Asthma bronchiale wurden Schimmelpilze, insbesondere A. fumigatus, als Typ I-Allergene zusammen mit anderen häufigen Allergenen wie bspw. Hausstaubmilben oder Pollen identifiziert HENDRICK et al. 1975; BEAUMONT 1988).
B.1.3 Immunologie
B.1.3.1 Angeborene Immunität
Für die Abwehr der Infektion mit A. fumigatus ist beim Immunkompetenten primär die unspezifische, angeborene Immunität zuständig. Die dabei beteiligten Komponenten setzen sich aus anatomisch-physiologischen Barrieren, humoralen Faktoren und phagozytierenden Zellen zusammen (LATGÉ 1999).
Das Flimmerepithel verkörpert die bedeutendste anatomisch-physiologische Barriere, da es durch den Zilienschlag einen Großteil der eingeatmeten Konidien aus der Lunge hinausbefördert.
Nach KOZEL (1996) ist für die unspezifische humorale Abwehr besonders das Komplementsystem von Bedeutung. Zum einen werden Konidien und Hyphen von A.
fumigatus durch das Komplementsystem direkt geschädigt, zum anderen soll die Anlagerung des Komplements an die Konidien eine Entzündungsreaktion sowie eine Opsonierung für die nachgeschaltete zelluläre Abwehr vermitteln (STURTEVANT u.
LATGÉ 1992). Zudem ist Komplement nicht ausschließlich ein Bestandteil des Blutes, sondern ebenso im Bronchialsekret vorhanden (ROBERTSON et al. 1976;
FICK et al. 1986; VAN DE GRAAF et al. 1992). Daher ist es wahrscheinlich, dass eine Opsonierung bereits in den Alveolen stattfindet. Dort werden die Konidien bei immunkompetenten Individuen von residenten Alveolarmakrophagen phagozytiert (SCHAFFNER et al. 1982). Diese Makrophagen können lediglich kurz vor der Aussprossung stehende, metabolisch aktive Konidien abtöten (SCHAFFNER 1994).
Diese Wachstumsphase wird von den Konidien erst Stunden nach der Inhalation erreicht. Zu diesem Zeitpunkt befinden sie sich entweder noch in den terminalen Luftwegen, oder schon in den Phagosomen der Makrophagen. Da die Abwehr durch das Makrophagensystem aber ausgesprochen wirkungsvoll ist, sind die Konidien nach spätestens ca. 36 Stunden vollständig verdaut (SCHAFFNER 1994).
Auch neutrophile Granulozyten stellen eine Abwehrfront gegen eine Aspergillus- Infektion dar. Diese sind ebenfalls erst in der Lage, Konidien des Pilzes abzutöten, wenn diese die oben beschriebene Wachstumsphase erreicht haben (SCHAFFNER et al. 1982; LEVITZ und DIAMOND 1985). Den Granulozyten ist gegenüber den Makrophagen eine Fähigkeit vorbehalten. Sie können nicht nur phagozytierte Konidien eliminieren, sondern sich sogar an Hyphen anheften, welche aufgrund ihrer Größe nicht durch Makrophagen phagozytiert werden können. Die an die Hyphen gehefteten Granulozyten setzen Defensine und Sauerstoffradikale frei und greifen so die Myzelform des Pilzes an (DIAMOND et al. 1978; SCHAFFNER et al. 1982;
SCHAFFNER et al. 1986).
B.1.3.2 Erworbene Immunität
Erworbene Immunmechanismen scheinen bei der Abwehr einer erstmaligen akuten invasiven Aspergillose nur eine untergeordnete Rolle zu spielen (KWON-CHUNG u.
BENETT 1992; DENNING 1998; LATGÉ 1999; SCHNEEMANN u. SCHAFFNER 1999; DENNING 2000). Es ist hingegen denkbar, dass erworbene Immunität bei chronischen Verlaufsformen der Aspergillose von Bedeutung ist. Die sich bisher mit dieser Thematik befassenden Studien gehen auf Tierversuche mit Mäusen zurück (zur Übersicht s. LATGÉ 1999). Diese ahmen zum einen die ABPA (Allergische Bronchopulmonale Aspergillose) durch Infektion der Tiere mittels Inhalation von
Konidien, zum anderen die invasive Aspergillose, durch intravenöse Injektion der Sporen von Aspergillus, nach.
Die Immunantwort durch TH-1-Lymphozyten ist gekennzeichnet durch einen Anstieg der Interleukine 2 und 12 sowie durch eine Erhöhung des Interferon γ- Wertes (IFN- γ). Diese soll für eine Resistenz gegen eine mykotische Erkrankung verantwortlich sein (LATGÉ 1999). Dem gegenüber steht die Immunantwort der TH-2-Lymphozyten, die sich durch steigende Antikörperspiegel und damit assoziierte Interleukinproduktion (IL-4, IL-5, IL-10) auszeichnet.
Die humorale Immunantwort ist bei der ABPA in Mensch und Maus gleichermaßen assoziiert mit einer Eosinophilie, dem Anstieg von Antikörpern (IgE, IgG1, IgA) und der damit verbundenen Produktion der Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 (KNUTSEN et al.
1994; KURUP et al. 1994a, 1994b; WANG et al. 1994; CHU et al. 1995, 1996;
KURUP et al. 1996; KURUP et al. 1998).
Bei der invasiven Aspergillose reichen die Untersuchungen von der Empfänglichkeit einzelner Mausstämme über unterschiedliche murine Tiermodelle bis hin zu Untersuchungen über Mutanten von A. fumigatus mit verschiedenen Wachstums- und Virulenzcharakteristika. CENCI et al. (1997; 1998) zeigten, dass sowohl bei immunkompetenten als auch bei immunsupprimierten Mäusen eine negative Korrelation zwischen dem Fortschreiten der Erkrankung und der TH-2-Antwort vorlag.
Diese war im Krankheitsverlauf mit einem stetigen Anstieg der Zytokine IL-4 und IL- 10, sowie einem sinkenden IFN-γ-Wert korreliert.
B.1.3.3 Immunität im Tiermodell
LEHMANN u. WHITE zeigten bereits 1976, dass Mäuse, die durch eine erste intravenöse Infektion mit Konidien eine isolierte Nierenmykose entwickelten, gegenüber einer normalerweise unter Cortison systemisch-disseminiert verlaufenden erneuten Infektion immun waren. Die erste, nicht unter Cortison gesetzte Nierenmykose musste also zu einer protektiven, Cortison-unabhängigen Immunantwort geführt haben. CORBEL u. EADES (1977) wiederum stellten fest, dass das Alter der Mäuse hinsichtlich der Infektion ebenfalls eine Rolle spielt. So waren ältere Tiere gegenüber einer Infektion resistenter als jüngere Tiere. Die in den 70er Jahren erworbenen Kenntnisse führten zu verschiedenen Studien über Vakzinierungsversuche. So fanden RICHARD et al. (1982) durch Verimpfung von verschiedenen Wachstumsstadien des Pilzes an Puten heraus, dass eine subkutan
injizierte, inaktivierte Germlingfraktion von A. fumigatus gegenüber einer ansonsten tödlichen Aerosolkonzentration von Konidien 38 % der Tiere vor einer Infektion schützte. DE REPENTIGNY et al. (1993) induzierten in Mäusen eine Immunität, indem sie die Tiere intravenös mit einer subletalen Dosis von Aspergillus infizierten.
Diese konnte durch den Transfer von Serum eines immunen Tieres auf ein naives Tier nicht übertragen werden. Es gelang jedoch, eine Immunität durch den Transfer von Milz-Makrophagen zu erzielen. CENCI et al. (1999, 2000) postulierten darauf, dass die protektiven Immunreaktionen weniger humoralen Ursprungs sind, sondern eher zellulär, also durch TH-1-Lymphozyten und Makrophagen, vermittelt werden. Sie demonstrierten, dass sich durch die Verimpfung von A. fumigatus-Kulturüberstand eine TH-1-Antwort ausbildet, die die Mäuse vor einer erneuten Infektion schützt.
BOZZA et al. (2002) erzielten in Mäusen eine zelluläre Immunität gegen Aspergillus durch die gleichzeitige Verimpfung eines Antigens von A. fumigatus, dem Aspf 16, zusammen mit einem unmethylierten CpG-Oligodeoxynukleotid (ODN) als Adjuvans.
B.1.4 Tiermodelle der invasiven Aspergillose
In der Literatur sind zahlreiche Tiermodelle der invasiven Aspergillose beschrieben.
Ob es zu einer Etablierung der IA kommt, hängt von vielerlei verschiedenen Faktoren, wie Tierart, Infektionsdosis, Virulenz des verwendeten Aspergillus- Stammes, Körpergewicht und Alter der Tiere, Immunkompetenz und Infektionsroute ab.
Verwendung finden Mäuse, Kaninchen, Ratten und Meerschweinchen (SHIBUYA et al. 1999a; SCHMIDT 2002). Obwohl Kaninchen als empfänglichsten für eine Infektion gelten (SCHMIDT 2002), werden am häufigsten Mäuse verwendet, da sie leichter zu handhaben sind. Kaninchenmodelle sind Mausmodellen aber aus dem Grund überlegen, weil diesen Tieren eine wesentlich größere Blutmenge entnommen werden kann (SHIBUYA et al. 1999a). Für ein Mausmodell hingegen spricht eine nahezu beliebig hohe Versuchstierzahl, die im Kaninchenmodell in praxi (Platzbedarf der Tiere) nicht zu realisieren ist.
CORBEL u. EADES (1977) zeigten, dass das Alter der Tiere für eine Etablierung einer Erkrankung ebenfalls von Bedeutung ist, da ältere Mäuse höhere Infektionsdosen benötigten als jüngere Tiere. DIXON et al. (1989) stellten fest, dass
für Tiere mit höheren Körpergewichten größere Infektionsdosen pro kg nötig waren als für leichtere Tiere.
Die Infektionsdosis und –route sowie die Abwehrlage des Versuchstieres ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. So lässt sich beispielsweise in immunkompetenten Mäusen durch eine hoch dosierte intranasale Applikation von A.
fumigatus keine Erkrankung erzeugen, aber durch eine intravenöse Injektion des Erregers (LATGÉ 1999). Einen Zusammenhang zwischen der Infektionsdosis und der Immunkompetenz des Wirtes beschreibt auch DE REPENTIGNY et al. (1991). Er zeigte sowohl bei immunkompetenten als auch bei immunsupprimierten Kaninchen eine inverse Beziehung zwischen Überlebenszeit der Tiere nach der Infektion und der Höhe der Infektionsdosis. Identische Infektionsdosen führten bei immunsupprimierten Kaninchen im Vergleich zu den immunkompetenten Tieren schneller zum Tod.
Da viele Tiermodelle der IA zur Erforschung der Wirkungsweise von Antimykotika oder der Bewertung diagnostischer Tests dienten, wurden in den meisten Kaninchenmodellen immunsupprimierten bzw. Spezifisch-Pathogen-Freien (SPF) Tieren überwiegend letale Infektionsdosen (106 bis 107 Konidien) verabreicht, die innerhalb weniger Tage zum Tod der Tiere führten (DE REPENTIGNY et al. 1987;
NIYO et al. 1988; PATTERSON et al. 1993; VISSIENNON et al. 1997; HURST et al.
2000). Bisher wählten nur DE REPENTIGNY et al. (1991) einen Versuchsansatz, der längere Überlebenszeiten der Tiere und damit verbundene detektierbare Antikörperproduktion gewährleistete. Sie analysierten die serologische Antwort der Tiere auf Antigene von A. fumigatus anhand von Immunblots und stellten fest, dass eine Serokonversion bei Tieren, die mehr als 10 Tage überlebten, zu verzeichnen war. Ebenso bemerkten sie, dass sich Immunreaktionen der Tiere, welche p. inf.
auftraten, bis zum Versuchsende nicht veränderten. Allerdings zeigten nicht alle Tiere dieselben Reaktionen auf die Antigene, was sich DE REPENTIGNY et al.
(1991) damit erklärten, dass genetische Unterschiede zwischen den Kaninchen die Beschränkung der Immunreaktion auf bestimmte Epitope nach sich zieht.
Als Infektionsweg wird oftmals die intranasale Verabreichung von A. fumigatus gewählt, da diese die natürliche Infektionsroute nachahmt (TANG et al. 1993; SMITH et al. 1994). Infolge der Inokulation des Erregers kommt es zunächst zu einer Manifestation der Erkrankung in der Lunge und erst im Anschluss daran zu einer disseminierten Aspergillose (LATGÉ 1999). Durch die Wahl eines intravenösen
Infektionsweges hingegen kann die Ausbildung einer systemischen Aspergillose ohne zeitliche Verzögerung erreicht werden (SHIBUYA et al. 1999a).
Über die klinische Symptomatik einer experimentellen invasiven Aspergillose gibt es kaum Informationen. Vereinzelt wird von Inappetenz bzw. Gewichtsabnahme, Apathie und neurologischen Ausfallerscheinungen berichtet (NIYO et al. 1988;
VISSIENNON et al. 1997). Als entscheidendes Kriterium der Infektion wird die Letalität der Tiere aufgeführt. Übereinstimmend wird von pathologischen Organveränderungen, die häufig in Nieren, Gehirn, Lunge, Leber und Milz auftreten, berichtet (DE REPENTIGNY et al. 1987; NIYO et al. 1988; DE REPENTIGNY et al.
1991; VISSIENNON et al. 1997; LATGÉ 1999).
Unterschiedliche Virulenzen bei Aspergillus-Stämmen beschreibt SCHMIDT (2002), der eine deutlich stärkere Virulenz bei klinischen Isolaten von A. fumigatus als bei bestimmten unpigmentierten Umwelt-Isolaten des Pilzes feststellte.
B.1.5 Antigene und Virulenzfaktoren
Um sich in einem Wirt invasiv ausbreiten zu können, muss A. fumigatus in der Lage sein, an den Epithelien des Respirationstrakts eines Individuums zu haften und diese zu penetrieren. Ferner muss er die Fähigkeit besitzen, der Abwehr des Wirtes zu entgehen oder diese zu schwächen (LATGÉ et al. 1994a, 1997). Antigene von A.
fumigatus, denen solche Virulenz-vermittelnden Eigenschaften zugesprochen werden, lassen sich in vier Kategorien (Adhesine, Pigmente, toxische Moleküle und Enzyme) einteilen.
Die Adhesine fördern Interaktionen zwischen Wirtszellen und dem Pilz. In diese Gruppe gehören Komplementrezeptoren (STURTEVANT u. LATGÉ 1992), ein von TRONCHIN et al. (1997) beschriebener Lamininrezeptor und Hydrophobine, welche von THAU et al. (1994) identifiziert wurden.
Die Pigmente inhibieren die Phagozytose der Konidien durch die Abwehrreaktion des Wirtes. Dieser Gruppe wird das Dihydroxynaphthalene-Melanin zugeordnet (JAHN et al. 1996; TSAI et al. 1997).
Zu den toxischen Molekülen von A. fumigatusgehören sekundäre Metaboliten wie bspw. das Gliotoxin. Dieses Protein ist ein Metabolit der Epipolythiodioxopiperazin- Familie und zeichnet sich durch seine immunsuppressive Wirkung aus
(MÜLLBACHER u. EICHNER 1984; MÜLLBACHER et al. 1985; EICHNER et al.
1986; SUTTON et al. 1994, 1996).
Das Hämolysin, ein 30 kDa-Protein, bedingt eine Lyse der Erythrozyten und erleichtert möglicherweise aus diesem Grund die Entwicklung einer Aspergillus- Infektion (EBINA et al. 1983; YOKOTA et al. 1985; FUKUCHI et al. 1996).
Die von A. fumigatus sezernierte RNase (18 kDa) (LAMY et al. 1991; LATGÉ et al.
1991) wird aufgrund ihrer Eigenschaft, Wirtszellen abzutöten als Virulenzfaktor ebenfalls in die Gruppe der toxischen Moleküle von A. fumigatuseingeordnet.
Enzyme spielen bei der Invasion des Wirtsgewebes durch einen Pilz eine entscheidende Rolle (ODDS 1991; HOGAN et al. 1996). Da das Lungenbindegewebe primär aus Elastin und Kollagen besteht, wird angenommen, dass Proteasen in der Pathogenese der Aspergillose von Bedeutung sind (MONOD et al. 1995).
Katalasen und Superoxiddismutasen (HOLDOM et al. 1995, 1996; CRAMERI et al.
1996; CALERA et al. 1997) wirken nach der Phagozytose durch Wirtszellen als Antioxidantien.
Phopholipasen wird eine Epithelien-zerstörende Funktion zugeschrieben (BIRCH et al. 1996).
Nach heutigem Wissensstand sind ungefähr 100 (Glyko-)Proteine von A. fumigatus in der Lage, humane Immunglobuline zu binden (LATGÉ 1999). Die meisten dieser Antigene wurden jedoch nicht näher charakterisiert, es wurde lediglich ihr Molekulargewicht im Immunblot bestimmt (LATGÉ 1999).
Bisher sind von den 100 (Glyko-)Proteinen weniger als ein Dutzend Antigene mittels proteinchemischer und molekulargenetischer Methoden, wie z. B. Screening von Expressionsbanken mit Patientenseren, näher charakterisiert worden. Die meisten dieser Antigene können hinsichtlich ihrer mutmaßlichen Virulenz den Kategorien toxische Moleküle und Enzymezugeordnet werden.
Die bereits erwähnte RNase ist ebenfalls unter der Bezeichnung Ag 3 (LONGBOTTOM 1986), Restrictocin (FANDO et al. 1985; LAMY u. DAVIS 1991;
LAMY et al. 1991) und ASPF1 (ARRUDA et al. 1992) bekannt. Ob die RNase eine tragende Rolle im Infektionsgeschehen spielt, ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. So zeigten LATGÉ et al. (1991) dass Versuchstiere, denen das Protein injiziert wurde, keine toxischen Schocks erleiden. Es konnten hinsichtlich des
Wachstums im Wirtsgewebe und der Mortalität im Tierversuch keine Unterschiede zwischen einer ASPF1-Knock-out-Mutante und dem parentalen Wildstamm gefunden werden (PARIS et al. 1993; SMITH et al. 1993). Andere Aspergillen, wie beispielsweise der aus medizinischer Sicht nicht unbedeutende Aspergillus flavus, synthetisieren keine RNase, dafür aber einige apathogene Spezies (LATGÉ 1999).
Ein positiv kumulativer toxischer Effekt konnte bei Lymphozyten beobachtet werden, die sukzessive mit subinhibierenden Dosen von Gliotoxin und ASPF1 behandelt wurden (DEBEAUPUIS et al. 1995). YANG u. KENEALY (1992) stellten fest, dass eine ASPF1-Mutante, die keine RNase-Aktivität zeigte, die Immunantwort in höherem Maße stimulierte, als das native ASPF1. Aus diesen Versuchen folgerte LATGÉ (1999), dass der Effekt eines mutmaßlichen Virulenzfaktors davon abhängig ist, ob er allein oder in Kombination mit anderen Aspergillus-Molekülen wirken kann. Ebenso ist ein und dasselbe Antigen in der Lage, eine Immunantwort zu stimulieren oder supprimierend in diese einzugreifen.
Aus der großen Gruppe von Enzymen, die als mutmaßliche Virulenzfaktoren von A.
fumigatus verstanden werden, konnten mehrere Proteasen (ALP, PEP und MEP) identifiziert werden.
ALP ist eine von Aspergillus sezernierte Serinprotease, die der Subtilisinfamilie angehört (REICHARD et al. 1990; MONOD et al. 1991; JATON-OGAY et al. 1992;
MOUTAOUAKIL et al. 1993; MOSER et al. 1994). Dieses 33 kDa-Protein ist zum Gegenstand intensiver Forschung geworden. Allerdings wurde im Tierversuch gezeigt, dass kein signifikanter Virulenz-Unterschied zwischen ALP-produzierenden Wildtypen von A. fumigatus und ALP-Deletionsmutanten besteht (TANG et al. 1992, 1993; MONOD et al. 1993a; SHIBUYA et al. 1999b). FROSCO et al. (1994) verabreichten in einem Infektionsversuch immunsupprimierten Mäusen gegen ALP gerichtete Antikörper und stellten fest, dass diese die Tiere nicht gegen eine Infektion mit A. fumigatus schützten. Die Anti-ALP-Antikörper bewirkten jedoch bei immunkompetenten Mäusen, welche mit hohen Konidiendosen infiziert wurden, Schutz vor einer Infektion.
IADAROLA et al. (1998) fanden heraus, dass diese Serinprotease sowohl in vitro als auch in vivo in der Lage ist, extrazelluläre Matrixkomponenten der Lunge zu degradieren. Eine signifikante Hemmung der polymorphkernigen Leukozyten bezüglich ihrer Chemotaxis und Hyphenzerstörung konnte ALP genauso
nachgewiesen werden (IKEGAMI et al. 1998; HASEGAWA et al. 1999), wie die morphologische Veränderung bronchialer, epithelialer Zelllinien mit einer dadurch bedingten Ablösung von Plastikoberflächen (TOMEE et al. 1997; KAUFFMAN et al.
2000).
PEP ist eine pepsinähnliche Aspartatprotease mit einem Molekulargewicht von 38 kDa (REICHARD et al. 1994). Auch hier wurde im Tierversuch festgestellt, dass hinsichtlich der Virulenz kein Unterschied zwischen einer PEP-Gendeletionsmutante und eines parentalen PEP-Wildstamms bestand (REICHARD et al. 1997).
MONOD et al. (1993b) isolierten aus einem Kulturüberstand einer ALP- Deletionsmutante eine sezernierte Metalloprotease (MEP) mit einem Molekulargewicht von 40 kDa. Im Tierversuch testeten JATON-OGAY et al. (1994) MEP- und auch ALP-MEP-Doppeldeletionsmutanten hinsichtlich ihrer Virulenz. Es gab wie bei ALP und PEP keine signifikant verminderte Virulenz gegenüber dem Wildstamm.
Von BEAUVAIS et al. (1997a; 1997b) wurden zwei Dipeptidylpeptidasen (88 kDa und 94 kDa) beschrieben. Das 88 kDa-Enzym verfügt über ein Signalpeptid.
HEARN et al. (1992), LOPEZ-MEDRANO et al. (1995) und CALERA et al. (1997) beschrieben eine Katalase von A. fumigatus. CALERA et al. (1997) klonierten das zugehörige Gen und fanden anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz heraus, dass die Katalase sowohl über ein Signal- als auch über ein Propeptid verfügte.
Es sind bisher zwei Superoxiddismutasen von A. fumigatus beschrieben worden.
Eine 27 kDa-Superoxiddismutase (CRAMERI et al. 1996, 1998), welche auch von HEMMANN et al. (1998) isoliert werden konnte und eine Superoxiddismutase (67 kDa), die von HAMILTON et al. (1995) und HOLDOM et al. (1995, 1996) charakterisiert wurde.
Es wurden des Weiteren zwei Antigene identifiziert, die jedoch nicht in eine der oben genannten Kategorien einzuordnen sind. So identifizierte bspw. CRAMERI (1998) ein peroxisomales Protein von 19 kDa.
Das erste Antigen von Aspergillus, welches in experimentell infizierten Tieren und in Patienten mit einer invasiven Aspergillose gefunden wurde, war das Galactomannan (GM) (LEHMANN u. REISS 1978; REISS u. LEHMANN 1979; ANDREWS u.
WEINER 1981; DUPONT et al. 1987). Dieses Polysaccharid ist in der Zellwand von
Aspergillen lokalisiert (LATGÉ et al. 1994b). Es ist das einzige Polysaccharid-Antigen von A. fumigatus, welches bislang charakterisiert wurde.
B.1.6 Diagnostik
Die derzeitige Diagnostik der Aspergillose stützt sich auf bildgebende Verfahren, dem direkten Nachweis des Erregers aus Gewebeproben und Sekreten sowie auf die Detektion von A. fumigatus-Molekülen in Körperflüssigkeiten mittels eines Antigen- Sandwich-ELISA´s (zur Übersicht siehe: RÜCHEL u. REICHARD 1999). Letzterer weist oben erwähntes Galactomannan (GM) von Aspergillen in Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin und Bronchiallavagen nach und ist derzeit die labordiagnostische Methode der Wahl (LATGÉ 1999). Jedoch ist der GM-ELISA sowohl in seiner Spezifität als auch in seiner Sensitivität zu bemängeln. Zum einen zeigt er eine hohe Rate an falsch positiven Ergebnissen, zum anderen spricht er oftmals erst sehr spät im Verlauf der invasiven Aspergillose an (STYNEN et al. 1995; SULAHIAN et al.
1996; PINEL et al. 2003).
Diagnostische Tests, die auf spezifische Antikörper reagieren, sind ebenfalls wenig geeignet, da die Antikörperproduktion der zumeist immunsupprimierten Patienten stark eingeschränkt oder verzögert ist (YOUNG u. BENETT 1971; RÜCHEL u.
REICHARD 1999).
B.1.7 Genomprojekt
Um einen besseren Einblick in die Pathogenität von A. fumigatus zu gewinnen, wurde 1998 ein internationales Konsortium gegründet, welches die Sequenzierung des kompletten Genoms von A. fumigatus (~ 30 Mb) anstrebte (DENNING et al.
2002). Mittlerweile ist die Sequenzierung nahezu abgeschlossen, erste Annotierungen sind von dem „Wellcome Trust Sanger Institute“ (GB) und „The Institute for Genomic Research“ (TIGR, USA) ausgeführt worden (MABEY et al.
2004). Die in dieser Arbeit isolierten Antigene wurden mittels Blast-Search-Analyse der hier ansequenzierten cDNAs unter Verwendung der TIGR-Datenbanken identifiziert.
C Material
C.1 Geräte
Die in dieser Arbeit benutzten Geräte sind im Anhang aufgeführt (J.1).
C.2 Verbrauchsmaterial und Chemikalien
Die in dieser Arbeit verwendeten Materialien und Chemikalien sind in einer Auflistung im Anhang zusammengestellt (J.2, J.3).
C.3 Lösungen, Puffer und Nährmedien
Gebrauchslösungen und Puffer sind im Text beschrieben. Stammlösungen und Nährmedien sind im Anhang (J.4, J.5) aufgeführt.
C.4A. fumigatusD 141
Der in dieser Arbeit verwendete Stamm, A. fumigatus D 141, wurde von Prof. Dr. Dr.
F. Staib aus Berlin zur Verfügung gestellt. Er wurde aus dem Sputum eines 45- jährigen Patienten isoliert, welcher auf dem Boden einer kavernösen Lungentuberkulose ein Aspergillom entwickelte und an einer durch den Pilz verursachten Arrosion einer Lungenarterie mit konsekutiver Blutung verstarb (STAIB et al. 1980).
C.5A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek
Die in dieser Arbeit verwendete cDNA-Expressionsbank wurde aus der mRNA des Wachstumsstadiums 3 (auskeimende Konidien) (s. D.2.1) angefertigt. Dazu wurden Sporen von A. fumigatus in Minimalmedium (Schüttelkultur) bei 37°C über 12-14 Stunden inkubiert.
C.6 Bakterienstämme
Tab. 1: verwendete Bakterienstämme
Bakterienstamm Anwendung Herkunft
E. coli
XL1-Blue MRF´
Propagation der λ-ZAP-Phagen der cDNA-Expressionsbank
STRATAGENE,
Amsterdam, Niederlande E. coli
XLOLR
In vivo-Umklonierung von Inserts von A. fumigatus λ-ZAP-Express in Plasmide
STRATAGENE,
Amsterdam, Niederlande
C.7Antikörper
Tab. 2: verwendete Antikörper
Antikörper Anwendung Herkunft
1. Antikörper Screening cDNA-Bank Seren der Versuchstiere 2. Antikörper=monokl. Anti-
Kaninchen-Ig (IgM+IgA+IgG- Schwere Kette)-Ak-Peroxidase- Konjugat von der Maus
Konjugat SIGMA, Steinheim
C.8 Primer
Tab. 3: verwendete Primer
Primer Sequenz Herkunft
T3 5´-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´ SIGMA, Steinheim
T7 5´-GTAATACGACTCACTATAGGG-3´ SIGMA, Steinheim
Anwendung: Der T3 Primer hybridisiert mit dem pBK-CMV Plasmid. Bei Verlängerung seines 3`-Endes durch Taq-Polymerase und teilweise fluoreszenzmarkierten Nukleotiden erfolgt eine Ansequenzierung der im Plasmid einklonierten Aspergillus-cDNA des N-terminal kodierenden Abschnitts. Der T 7 Primer hybridisiert mit dem pBK-CMV-Plasmid in gegenüberliegender Position des cDNA-Inserts. Wird er verwendet, kann der C-terminal kodierende cDNA-Teil inklusive des Poly-A-Schwanzes sequenziert werden (Sequenzierung s. D.3.6.1).
C.9 Versuchstiere
Es wurden insgesamt 10 weibliche New Zealand White Kaninchen verwendet. Die Tiere wurden von der Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, bezogen.
D Methoden
D.1 Tierexperimentelle Methoden
D.1.1 Blutentnahmen und Serumgewinnung
Die Blutentnahmen vor der Infektion erfolgten innerhalb der ersten Woche bzw. an Tag 28 nach Einstallung der 10 Tiere. Nach der Infektion wurde erstmalig 14 d p. inf.
Blut entnommen, daraufhin im wöchentlichen Abstand. Es wurden je ca. 12 ml Blut aus der zentralen Ohrarterie entnommen. Dieses wurde nach Gerinnung in einer Swing-out-Zentrifuge bei Raumtemperatur (RT) über 20 Minuten zentrifugiert (300 x g). Das Serum wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei –20 °C aufbewahrt.
D.1.2 Immunsuppression
Den Kaninchen wurde täglich von Tag –2 bis Tag +3 der Infektion (= Tag 0) Cortisonacetat (10 mg/kg KGW) subkutan injiziert. Zur Vermeidung bakterieller Sekundärinfektionen wurden während dieser Zeit außerdem täglich 200 mg Ceftazidim s.c. verabreicht.
D.1.3 Infektion der Tiere
Die Infektion erfolgte intravenös über die Ohrrandvene mit dem Konidienstadium von A. fumigatus. Dazu wurden die Konidien einer, mit A. fumigatus bewachsenen Sabouraud-Platte mit physiologischer NaCl-Lösung abgeschwemmt und in ein 50-ml- Polystyrolgefäß überführt. Nachdem die Konidiensuspension zur Auflösung größerer Aggregate über mehrere Minuten gevortext worden war, wurde sie in einer Swing- out-Zentrifuge kurz anzentrifugiert. Nach der Zentrifugation zeigte der Überstand eine gleichmässige Suspension und wurde für die Bestimmung der Konidienkonzentration weiterverwendet. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch Auszählen der Konidien mithilfe eines Hämocytometers. Nach Ermittlung der Konidienkonzentrationen wurden die individuellen Infektionsdosen nach einem von DE REPENTIGNY et al. (1991) beschriebenem Schema (Abb. 2) angesetzt.
Erforderliche Verdünnungen der originären Konidiensuspension wurden mit physiologischer NaCl-Lösung vorgenommen.
Original aus : DE REPENTIGNY et al., 1991
Abb. 2 : Infektionsschema nach DE REPENTIGNY et al. (1991)
D.1.3.1 Infektionsbegleitende Kontrollen
Der Gesundheitszustand der Tiere wurde mit Beginn der Immunsuppression täglich beurteilt. Dabei wurde im Rahmen einer Allgemeinuntersuchung besonderes Augenmerk auf die rektale Körpertemperatur (Normalwert 38,5-39,5°C (WIESNER 1988; BERGHOFF 1989)) und auf das Körpergewicht gelegt.
D.1.3.2 Kontrolle des Infektionserfolges
Der Erfolg einer Infektion wurde 14 d p. inf. anhand eines Immunblots auf Aspergillus-Proteine (s. Punkt D.2.6/E.1.3) überprüft. Dabei wurden Immunreaktionen vor der Infektion denen nach der Infektion (14. Tag p. inf.) gegenübergestellt. Im Falle eines positiven Blots wurden die entsprechenden Seren für das Screening der -Phagen-cDNA-Expressionsbank weiterverwendet. Bei einem nicht eindeutigen oder negativen Blotergebnis wurden die Tiere erneut mit einer höheren Infektionsdosis infiziert.
D.1.3.3 Serologische Diagnostik
Derzeit wird in der serologischen Diagnostik von A. fumigatus ein Antigen-Doppel- Sandwich-ELISA verwendet. Dieser weist im Blut zirkulierendes Galactomannan (GM) von A. fumigatus nach. Dieser Test ist z. Zt. trotz deutlicher Einschränkungen hinsichtlich Sensitivität und Spezifität der einzige auf dem Markt verfügbare Antigentest. Daher wurden die Seren einiger Tiere mittels des PLATELIA Aspergillus- Ag-ELISAs überprüft. Der Test wurde nach Herstellerangaben von Frau Meike Schaffrinski bzw. Frau Petra Schobert (Labor Mykologische Diagnostik, Abteilung Bakteriologie des Universitätsklinikums Göttingen) durchgeführt.
D.1.4 Tötung der Tiere
Die Tötung der Tiere erfolgte bei hochgradigen Störungen des Allgemeinbefindens.
Dazu wurden die Kaninchen mit 5 mg/kg KGW Xylazin + 25 mg/kg KGW Ketamin i.m. narkotisiert und anschließend durch Blutentzug über die zentrale Ohrarterie bzw.
Herzpunktion getötet. Das Blut wurde zur Serumgewinnung verwendet.
D.1.4.1 Sektion und weiterführende Untersuchungen
Die Sektion umfasste eine gezielte Untersuchung der Körperhöhlen und ihrer Organe auf pathologische Veränderungen. Wurden hierbei mykotische Herde festgestellt, wurde eine Gewebeprobe des betreffenden Organs entnommen und mit einem optischen Aufheller (Calcofluor-Weiß) vermengt. Unter dem Mikroskop konnten im positiven Fall die Hyphen von A. fumigatus identifiziert werden. Zur Sicherung der Verdachtsdiagnose wurde das pathologisch veränderte Organstück über eine Sabouraud-Agarplatte gestrichen und für 3 Tage bei 37°C zur kulturellen Anzucht des Pilzes bebrütet.
D.2 Mikrobiologische, proteinchemische und immunologische Methoden
D.2.1 Herstellung von Ausgangsmaterial von A. fumigatus D 141
Als Ausgangsmaterial für die Probengewinnung wurden mit A. fumigatus D141 beimpfte Sabouraud-Agarplatten verwendet, auf denen der Pilz 3 Tage bei 37°C inkubiert wurde. Die dicht sporulierten Kulturen wurden unter einem Abzug mit Minimalmedium abgeschwemmt und in 2 Liter-Glasflaschen, welche jeweils 250 ml Minimalmedium enthielten, überführt. Pro zu inkubierender Flasche wurden die Sporen von je einer abgeschwemmten Platte verwendet.
Die Inkubation erfolgte als Schüttelkultur (150 U/min) bei 37°C unter aeroben Bedingungen. Die Dauer der Inkubation war abhängig von dem gewünschten Wachstumsstadium des Pilzes, welches mikroskopisch beurteilt und fotodokumentiert wurde.
Abb. 3: Wachstumsstadien von Aspergillus fumigatusD141
Die Kulturen wurden nach der jeweiligen Inkubation einige Minuten auf Eis gestellt, um fortschreitendes Wachstum zu stoppen und das erreichte Stadium zu sichern.
Anschließend wurden die Kulturen Nr. 1 und 2 jeweils durch einen Bottle-Top-Filter, die Kulturen Nr. 3 bis 5 jeweils durch Filterpapier (Schleicher&Schuell Rundfilter Ø 240 mm) filtriert. Jede zurückbehaltene Konidienmasse bzw. jedes Myzel wurde mehrere Male mit 0,02 M Na-Citratpuffer, pH 5,5, durchspült und nachfolgend auf
Wachstums- stadium/
Kulturnr.
Inkubations- zeit
Erwünschte Mikroskopie bei Stop
Fotodokumentation
1 1 Std. Konidien
2 7,5 Std. aufgeblähte Konidien
3 9-10 Std. auskeimende Konidien
4 15 Std. logarithmische
Wachstumsphase
5 48-72 Std. stationäre Wachstums- phase
5 µm
5 µm
5 µm
5 µm
50 µm ù 2-4µm
