Rekombinante Proteine

Im Hinblick auf die Entwicklung eines Impfstoffes wurden bisher 3 der 12 mehrfach isolierten Antigene rekombinant hergestellt und aufgereinigt (s. D.3.7 f.). Die linke SDS-PAGE zeigt beispielhaft den in E. coli exprimierten C-terminalen Teil von HSP 90 vor und nach der Affinitätschromatographie, sowie nach der Einengung mittels Zentrifugalkonzentratoren. Das rechte Bild stellt die aufgearbeiteten rekombinanten Proteine dar. AHP-1 und Enolase liegen vollständig vor, das HSP 90 erreicht hier ein niedrigeres Molekulargewicht, weil nur der C-terminale Teil des Proteins rekombinant hergestellt wurde.

Abb. 25: Darstellung rekombinanter Proteine

P Proteinstandard, Biorad-Marker Low

vA vor Affinitätschromatographie nA nach Affinitätschromatographie nZ nach Zentrifugalkonzentration

K Kontrolle, HSP 90 (M.Monod) kDa

97 66 45

31 21 14

kDa 97 66 45

31

21 14

P vA nA nZ K P AHP-1 Enolase HSP 90

F Diskussion

Aspergillus fumigatus ist ein fakultativ pathogener Schimmelpilz, der sowohl beim stark immunsupprimierten Menschen (insbesondere Leukämiepatienten, Empfänger von Organtransplantaten) als auch beim prädisponierten Tier invasive Mykosen verursachen kann. Die serologische Diagnostik der Erkrankung ist unsicher, Antikörpertests sind bei den oft schwach immunreaktiven Patienten wertlos (YOUNG u. BENETT 1971; RÜCHEL u. REICHARD 1999), der einzige auf dem Markt verfügbare kommerzielle Antigentest (Antigen-Doppel-Sandwich-ELISA) ist hinsichtlich Sensitivität und Spezifität deutlich eingeschränkt (STYNEN et al. 1995;

SULAHIAN et al. 1996; PINEL et al. 2003). Häufig wird die Erkrankung daher erst sehr spät im Infektionsverlauf diagnostiziert und therapeutische Maßnahmen sind deshalb oftmals erfolglos (AISNER et al. 1977). Dementsprechend hoch ist die Letalität bei Patienten mit einer invasiven Aspergillose. Für die Entwicklung alternativer Tests besteht dringender Bedarf, Antigene von A. fumigatus, die während der Infektion exprimiert werden, zu identifizieren. Auch aus einem zweiten Grund sind solche Antigene interessant: Sie könnten als Impfstoff für prädisponierte Patienten dienen (STEVENS 2004), da man im Tierversuch festgestellt hat, dass eine überlebte Infektion bleibende Immunität induziert (LEHMANN u. WHITE 1976; DE REPENTIGNY et al. 1993; CENCI et al. 1999, 2000). Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation solcher infektionsrelevanter Antigene. Als Grundlage diente ein unter kontrollierten Infektionsbedingungen durchgeführtes Tiermodell einer invasiven Aspergillose, wobei Antigene nicht direkt, sondern mittels der gegen sie gerichteten humoralen Immunantwort des Wirtes identifiziert werden sollten. Durch extensives Screening einer Aspergillus-cDNA-Expressionsbank wurden 36 verschiedene Antigene identifiziert. Diese wurden mithilfe neuester Daten aus dem kurz vor dem Abschluss stehenden Aspergillus-Genomprojekt, Genen und Proteinen zugeordnet.

Dies ist ein großer Fortschritt, wenn man bedenkt, dass die meisten bislang identifizierten Antigene von A. fumigatuslediglich anhand ihres Molekulargewichts im Western-Blot beschrieben wurden (LATGÉ 1999).

Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene lassen sich in drei Gruppen, nämlich i) Proteine mit Enzymfunktion, ii) Proteine mit Chaperonfunktion, iii) Proteine mit bislang unbekannter Funktion, einteilen. Ausgewählte Antigene dieser Gruppen werden im Folgenden, besonders unter dem Gesichtspunkt ihrer möglichen Eignung als Vakzinekandidaten, diskutiert. An den Anfang dieser Diskussion, herausgelöst

aus der Gruppe mit Enzymfunktion, wurde das durch das Screening gefundene Aspf 16 gestellt. Unabhängig von dieser Arbeit konnte von BOZZA et al. (2002) kürzlich gezeigt werden, dass eine Verimpfung mit gerade diesem Antigen im Tierversuch tatsächlich Immunität gegen eine invasive Aspergillose vermittelt. Somit ein „proof of principle“ für den gesamten Ansatz dieser Arbeit, der die Bedeutung aller weiteren gefundenen Antigene unterstreicht.

F.1 Aspf 16

Zwei von sechs Kaninchen zeigten Immunreaktionen gegen Aspf 16 (Tier 5 und 10).

Interessanterweise wurde dieses 43 kDa-Antigen durch Screening einer cDNA-Bank mit Allergischen Bronchopulmonalen Aspergillose-Patientenseren isoliert und identifiziert (BANERJEE et al. 2001). Dem Aspf 16 wird eine bedeutsame Rolle sowohl in der humoralen als auch in der zellulären Immunantwort bei ABPA-Patienten zugewiesen. So demonstrierten BANERJEE et al. (2001) Aspf 16-spezifische Antikörper vom IgE-Typ bei ABPA-Patienten als auch eine Stimulation von peripheren mononukleären Blutzellen durch Aspf 16 in vitro. BOZZA et al. (2002) erreichte im Mausmodell durch Verimpfung des Aspf 16 in Kombination mit einem definierten unmethylierten CpG-Oligodeoxynukleotid (ODN), einem Adjuvans, welches durch Stimulierung von Toll-Rezeptor 9 eine zelluläre Immunantwort favorisiert, einen Schutz vor einer systemischen Aspergillose. Aspf 16 ist somit die bislang einzige Monosubstanz von A. fumigatus, mit der eine protektive Immunantwort induziert werden konnte. Bei dem Antigen handelt es sich von seiner biologischen Funktion wahrscheinlich um ein Enzym. Homologienvergleiche mit S.

cerevisiae legen nahe, dass Aspf 16 eine putative GPI-verankerte Glucanase der Zellmembran, möglicherweise auch der Zellwand ist (BANERJEE et al. 2001).

Denkbar ist, dass dieses Enzym aufgrund seiner peripheren Lokalisation ein leicht erreichbares Ziel für Immunantworten darstellt, seine Protektion-induzierenden Eigenschaften also über ein besseres „Erkennen“ der Pilzzelle durch das Immunsystem vermittelt werden. Dieser Mechanismus ließe sich modellhaft z. B. wie folgt erklären: Konidien werden von Alveolarmakrophagen phagozytiert. Sie produzieren nach kurzer Zeit in der fungiphoren Vakuole Aspf 16, was GPI-verankert an der Membran vorhanden ist. Die Pilzzelle transloziert den GPI-Anker in die Zellwand, ein Prozess, der bei Hefen beobachtet wurde (HAMADA et al. 1999).

Diese Translokation könnte durch enzymatische Aktivität der Wirtsvakuole gestört sein, sodass freies Aspf 16 in die Vakuole selbst gelangt und letztlich in Peptide zerlegt an der Oberfläche des Makrophagen über MHC-II-Moleküle präsentiert wird.

Nun könnten bereits durch Immunisierung vorhandene TH-1-Lymphozyten diese Peptide spezifisch erkennen und den Makrophagen über Zytokine (insbesondere IL-2 und INFγ) aktivieren. Der so aktivierte Makrophage wird in die Lage versetzt, die Pilzzelle effizienter und früher abzutöten.

Welche Bedeutung dem Aspf 16, beispielsweise in der Morphogenese des Pilzes zukommt, ist bis dato nicht bekannt. Sollte es eine essenzielle Bedeutung haben, ist es auch vorstellbar, dass durch die gerichtete Immunantwort des Wirtes das Wachstum des Pilzes unterbunden wird. Auch dieser Mechanismus könnte die Protektion-induzierende Wirkung des Antigens erklären.