β-1,3-Glucanase (20 U/µl) Bestellnr. QUA 2001
ad 1 Liter H2O, Sterilfiltration, Lagerung bei –20°C)
eigene Herstellung
J.5 Nährmedien Luria-Bertani-(LB)-Agar
10 g NaCl
10 g Bacto®-Tryptone 5 g Bacto®-Yeast Extract 20 g Agar
950 ml H2O
Einstellung des pH-Wertes mit 5 N NaOH auf 7,0; ad 1 Liter H2Oauf 1 Liter;
autoklavieren
Luria-Bertani-(LB)-Medium
10 g Bacto®-Tryptone 5 g Bacto®-Yeast Extract 10 g NaCl
950 ml H2O
Einstellung des pH-Wertes mit NaOH auf 7,0; ad 1 Liter H20, autoklavieren
Luria-Bertani-(LB)-Top-Agarose
10 g NaCl
10 g Bacto®-Tryptone 5 g Bacto®-Yeast Extract 7 g Agarose
950 ml H2O
Einstellung des pH-Wertes mit NaOH auf 7,0; ad 1 Liter H20, autoklavieren
Minimalmedium 10,0 g Glukose
ad 1 Liter H2O, Einstellung des pH-Wertes mit NaOH auf pH 6,8;
Sterilfiltration
Sabouraud-Agar 65 g Sabouraud-4%-Glucose-Agar (Fertigagar Fa. MERCK)
ad 1 Liter H2O, autoklavieren, Zugabe von 1 ml Gentamycin (16 mg/ml) und 1 ml Chloramphenicol (16 mg/ml)
SOC-Medium 5 g Bacto®-Yeast Extract 20 g Bacto®-Tryptone 0,5 g NaCl (MW 58.44) 970 ml H2O
autoklavieren und mit sterilfiltrierten 10 ml 1 M MgCl2+ 10 ml 1 M MgSO4+ 10 ml 2 M Glucose komplementieren
J.6 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Morphologie von Aspergillus fumigatus S. 11
Abb. 2: Infektionsschema nach DE REPENTIGNY et al. (1991) S. 34 Abb. 3: Wachstumsstadien von Aspergillus fumigatusD141 S. 37 Abb. 4: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 1) S. 63
Abb. 5: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 2) S. 64
Abb. 6: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 3) S. 65
Abb. 7: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektion (Tier 4) S. 66
Abb. 8: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 5) S. 67
Abb. 9: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 6) S. 68
Abb. 10: Darstellung des Köpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 7) S. 69
Abb. 11: Darstellung des Köpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 8) S. 70
Abb. 12: Darstellung des Köpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektionen (Tier 9) S. 71
Abb. 13: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur
im Verlauf der Infektion (Tier 10) S. 72
Abb. 14: Darstellung der Immunreaktionen auf zellwandständige und intrazelluläre A. fumigatus-Proteine vor und nach den
Infektionen mittels eindimensionaler Immunblots S. 76
Abb. 15 Silbergefärbte 2D-Gele S. 79
Abb. 16: Darstellung der Immunreaktionen ausgewählter Tiere (5,8) auf intrazelluläre und zellwandständige A.
fumigatus-Proteine vor Infektion, nach der ersten und nach der zweiten
Infektion mittels 2D-Immunblots S. 80
Abb. 17: Darstellung der Organveränderungen und mikroskopische
Bilder S. 84
Abb. 18a, b: Screening der -Phagen–cDNA-Plaques S. 97
Abb. 19a, b: Aufgereinigte Plaques S. 98
Abb. 20: Darstellung infektionsspezifischer Antigene S. 99
Abb. 21: Infektionsspezifischer Phagenklon S. 100
Abb. 22a, b: Unspezifische Phagenklone S. 100
Abb. 23: Immunreaktionen der Tiere auf ERMA S. 104
Abb. 24: Immunreaktionen der Tiere auf Enolase S. 104
Abb. 25: Darstellung rekombinanter Proteine S. 107
J.7 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: verwendete Bakterienstämme S. 32
Tab. 2: verwendete Antikörper S. 32
Tab. 3: verwendete Primer S. 32
Tab. 4: Lösungen und Puffer für die eindimensionale SDS-PAGE S. 40
Tab. 5: Lösungen für 2D-Gele S. 44
Tab. 6: Lösungen für die Silberfärbung S. 46
Tab. 7: Lösungen für die kolloidale Coomassie-Färbung S. 47 Tab. 8: Zusätze zur Bakteriensuspension, Endkonzentrationen und
Verwendungszwecke S. 51
Tab. 9: Übersicht der verwendeten Puffer für die Aufarbeitung
HIS-getagter pET-Proteine S. 59
Tab. 10: Anzahl der Tiere und Infektionsdosen S. 61
Tab. 11: Prozentuale Gewichtsabnahme der Tiere im Verlauf der
einzelnen Infektionen S. 73
Tab. 12: Auswertung der infektionsbegleitenden Kontrollen S. 75
Tab. 13: Auswertung eindimensionaler Immunblots S. 78
Tab. 14: Ergebnisse des PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA S. 82
Tab. 15: Ergebnisse der Sektionen S. 83
Tab. 16: Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells S. 86 Tab. 17: Übersicht Screening der cDNA-Expressionsbibliothek S. 87
Tab. 17a: Identifizierte Antigene S. 88
Tab. 18: Auflistung der isolierten Antigene S. 101
Tab. 19: Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene S. 103 Tab. 20: Antigenfunktion und Anzahl der Tiere mit einer
antigenspezifischen Immunantwort S. 105
Danksagung
Bei Herrn Prof. Dr. G. F. Gerlach möchte ich mich ganz besonders für seine Bereitschaft bedanken, diese Arbeit zu betreuen.
Herrn PD Dr. U. Reichard danke ich herzlichst für die stets engagierte wissenschaftliche Betreuung, für unzählige aufschluss- und lehrreiche Gespräche und Diskussionen sowie für das mir entgegengebrachte Vertrauen.
Herrn Dr. Ortwin Schunck gilt mein besonderer Dank für die „Vermittlung“ dieser Arbeit und für die Hilfe bei dem Tierversuch.
Herrn Prof. Dr. R. Rüchel danke ich für seine uneingeschränkte Hilfsbereitschaft bei der Dokumentation der Sektionsergebnisse, für hilfreiche Korrekturen und seine stets aufmunternden Worte.
Meike, Birgit und Petra danke ich vielmals für die gute und humorvolle Zusammenarbeit im Labor sowie für die jeweilige Unterstützung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. H. Prange danke ich ganz besonders dafür, dass er mir für die Zeit des Zusammenschreibens einen Arbeitsplatz in seinem Institut zur Verfügung gestellt hat.
Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir mein Studium ermöglicht haben und dass sie stets Interesse an meinem Lebensweg zeigen.
Richard und Anne, vielen herzlichen Dank für den seelischen Beistand und die finanzielle Unterstützung in der Endphase meines Studiums.
Tausend Dank an Christian, der zeitgleich die Last seiner Doktorarbeit trug und mir trotzdem mit Ratschlägen, Hilfe mit dem Feind Computer, Korrektur lesen und vor allem Verständnis zur Seite stand.
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation "Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus“ selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation in der Abteilung Bakteriologie (Nationales Referenzzentrum für Systemische Mykosen) des Universitätsklinikums Göttingen durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover, angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
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Nicole Denikus Halle, den 27.07.04