Zweidimensionale Gelelektrophorese

In der zweidimensionalen Gelelektrophorese werden Proteine sowohl nach ihrem Molekulargewicht, als auch nach ihrem isoelektrischen Punkt getrennt. Somit ist die 2D-Gelelektrophorese der eindimensionalen SDS-PAGE hinsichtlich der Qualität der Proteinauftrennung weit überlegen.

D.2.4.1 Vorbereitung der Proben

Die gefriergetrockneten Proben (jeweils 200 µg) wurden je in 360 µl Rehydratationspuffer aufgenommen, welcher sich wie folgt zusammensetzte:

12 g Urea 0,5 g Chaps

125 µl IPG-Puffer (0,5%) eine Spur Bromphenolblau 16 ml Aqua bidest.

(Lagerung bei –20°C in 2,5 ml Aliquots, Zugabe von 7 mg DTT (Dithiothreitol) pro Aliquot kurz vor Gebrauch)

Die gelöste Probe wurde über 2 h bei RT unter Schütteln inkubiert und anschließend über 2 Minuten bei 16.000 x g abzentrifugiert. Daraufhin wurde die Probe zwischen die Elektroden der silikonisierten und gereinigten Keramikschiffchen (IPG-Strip-Holder, 18 cm) pipettiert. Auf die im Schiffchen verteilte Probe wurde die Gelseite des IPG-Streifens nach Entfernen der Schutzfolie platziert. Nach Überschichtung des Streifens mit dem Immobiline Drystrip Cover Fluid wurde der Deckel auf das Schiffchen gelegt und der Keramikhalter wurde in der IPGphor-Einheit positioniert.

D.2.4.2 Erste Dimension (Isoelektrische Fokussierung)

Es folgte ein zwölfstündiger Rehydratationsschritt mit anschließender isoelektrischer Fokussierung (IEF) über vier Stufen bei 20°C:

1. 500 V für 2 h

2. 1000 V für 1 h 20 min 3. 8000 V für 13 h 20 min

(>108700 Gesamt-Voltstundenzahl)

4. 30 V für 24 h (Step-n-hold, bis das Programm manuell beendet wird)

Wenn nach erfolgter IEF nicht direkt mit der zweiten Dimension fortgefahren wurde, wurden die fokussierten Streifen bei –80°C in 20 cm langen Plastik-Tubes aufbewahrt.

D.2.4.3 Zweite Dimension (Proteinseparation nach dem Molekulargewicht) D.2.4.3.1 Herstellung der Gele

Für die zweite Dimension wurden 15 bis 18 % -Gradientengele (18 x 20 cm) in einer vertikalen Gelgießkammer (DALT-Gel-Caster) mit Gradientenmischer nach Hoefer gegossen. Dazu wurden für 6 Gele folgende Lösungen angesetzt, welche vor ihrer Verwendung ca. 1 Stunde bei 4°C auf Eis gestellt wurden.

Tab. 5: Lösungen für 2D-Gele

Schwere Lösung (18%) Leichte Lösung (15%) Acrylamid-Bis-Stammlösung

(30% Acrylamid + 0.8%

Bisacrylamid)

249 ml 208 ml

1,5 M TrisHCl pH 8,8 104 ml 104 ml

H₂O 28 ml 95 ml

SDS 10% 4,15 ml 4,15 ml

Glycerol 100% 28 ml 0 ml

Bromphenolblau 1% 0,3 ml 0 ml

APS 10%

(Zugabe kurz vor Gebrauch) 2,08 ml 4,15 ml

TEMED 10%

(Zugabe kurz vor Gebrauch)

0,135 ml 1,02 ml

Nachdem der Caster nach Herstellerangaben beladen und mit dem Gradientenmischer verbunden worden war, wurden die gekühlten, mit APS und TEMED versehenen Lösungen, in den Gradientenmischer gegeben. Sobald beide Lösungen in den Caster eingelaufen waren, wurde die Deplatzierungslösung (0,375 M Tris-HCl, pH 8,8 + 50 % (v/v) Glycerol (100 %) + 0,1% (v/v) einer 1-%-igen Bromphenolblau-Lösung) in die Gelkassette eingeleitet, bis die V-förmige Vertiefung ausgefüllt war. Im direkten Anschluss wurde jedes Gel mit 750 µl wassergesättigtem Butanol überschichtet. Nach der ca. zweieinhalb Stunden dauernden Polymerisation wurden die Gele unter fließendem Wasser von Acrylamid- und Butanolresten befreit und bis zu ihrer Verwendung bei 4°C in Gellagerungspuffer (0,375 M Tris-HCl, pH 8,8 + 0,1% (w/v) SDS) bis zu 2 Wochen aufbewahrt.

D.2.4.3.2 Gelelektrophorese

Für die Gelelektrophorese wurde die vertikale DALT-Gelelektrophorese-Anlage nach Hoefer mit Laufpuffer (0,025 M Tris + 0,192 M Glycin + 0,1% (w/v) SDS) gefüllt und mittels der angeschlossenen Kühlung auf 14°C eingestellt. Die elektrofokussierten IPG-Streifen aus der Ersten Dimension wurden auf einem Orbitalschüttler über 15 Minuten in SDS-Äquilibrierungspuffer (0,05 M Tris-HCl pH 8,8 + 6 M Harnstoff + 30%

(v/v) Glycerol + 2% (w/v) SDS + ein paar Körnchen Bromphenolblau + 1% (w/v) DTT (kurz vor Gebrauch)) geschwenkt. Nach der Äquilibrierung wurden die Gelstreifen kurz durch Elektrophoresepuffer gezogen und anschließend jeweils auf den oberen Rand der Gradientengele platziert. Dabei wurde das spitze Ende des IPG-Streifens zur Scharnierseite, das stumpfe Ende zur offenen Seite der Gelkammer gelegt und darauf geachtet, dass die Plastikseite des Strips direkt am Glas anlag, sodass die Geloberfläche nicht mit der ihr gegenüberliegenden Glasplatte in Berührung kam. In einigen Fällen wurde ein auf Papier pipettierter Molekulargewichtsstandard verwendet, welcher am stumpfen Pol des IPG-Streifens platziert wurde. Um sowohl den Markerstreifen, als auch den IPG-Streifen in ihren Positionen zu halten, wurden sie mit Agaroselösung überschichtet. Nachdem die Agarose erkaltet war, wurden die Gelkammern so in den mit Laufpuffer gefüllten Elektrophoresetank eingeschoben, dass sich der stumpfe Pol der eingegossenen IPG-Strips senkrecht in der Kammer am Kathodenende befand. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V und wurde beendet, wenn die Farbfronten am Ende der Gele angekommen waren. Pro

Versuchsansatz wurden jeweils zwei identische Gele produziert. Ein Gel wurde nach der Elektrophorese für den späteren Vergleich mit dem Immunblot gefärbt, das andere Gel wurde geblottet.

D.2.4.3.3 Silberfärbung

Durch die Silberfärbung von Proteinen ist es möglich, Proteinspots ab einer Menge von 1 ng optisch nachzuweisen. Folgende Lösungen wurden für diese Färbung benötigt:

Tab. 6: Lösungen für die Silberfärbung

Fixierlösung 30 % (v/v) Isopropanol (100%) 10 % (v/v) Essigsäure (100%) Nachfixierlösung 0,5 M Natriumacetat

0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat 30 % (v/v) Ethanol (100%) 0,5 % (v/v) Glutaraldehyd Silberlösung 0,1 % (w/v) Silbernitrat

0,02 % (v/v) Formaldehyd (37%) Entwicklerlösung 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat

0,01 % (v/v) Formaldehyd Stopplösung 0,05 M EDTA

Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel für eine Stunde auf einem Orbitalschüttler in der Fixierlösung geschwenkt. Im Anschluss wurde es über Nacht in der Nachfixierlösung belassen. Am nächsten Morgen folgten drei je halbstündige Waschschritte in H2O und daraufhin die Färbung in der Silberlösung für eine Stunde.

Nachdem das Gel für maximal 2 Minuten in H2O geschwenkt wurde, wurde es für ca.

10-20 Minuten in Entwicklerlösung geschüttelt. Sobald sich die Spots darstellten, wurde das Gel für ca. 10 Minuten in die Stopplösung überführt und anschließend kurz mit H2O gewaschen. Für die dauerhafte Aufbewahrung wurden die Gele in einer Trockenapparatur (Hoefer) nach Herstellerangaben getrocknet.

D.2.4.3.4 Kolloidale Coomassie-Färbung

Die kolloidale Coomassie-Färbung zur Darstellung von Proteinen ist in ihrer Sensitivität (ca. 1ng/Proteinspot (Herstellerangabe Fa. Roth)) der konventionellen Coomassie-Färbung überlegen. Durch die kolloidalen Eigenschaften des Farbstoffes bindet dieser spezifisch an die Proteine und nur sehr gering an die Matrix des Gels.

Es wurden folgende Lösungen verwendet:

Tab. 7: Lösungen für die kolloidale Coomassie-Färbung

Fixierlösung 1 % (v/v) o-Phosphorsäure (85%) 20 % (v/v) Methanol (100%)

ad 200 ml H2O Roti^®-Blue

Färbelösung

20 % (v/v) Methanol (100%)

20 % (v/v) Roti^®-Blue (5x konzentriert) ad 200 ml H2O

Waschlösung 25 % (v/v) Methanol (100%) ad 1000 ml H2O

Nach der Elektrophorese wurde das Gel für 60 Minuten in der Fixierlösung geschwenkt und anschließend für 2–15 Stunden in der Roti^®-Blue Lösung gefärbt.

Das Entfärben durch die Waschlösung wurde solange durchgeführt, bis der Gelhintergrund klar war. Die entfärbten Gele wurden in H2O bei 4°C gelagert.