Um sich in einem Wirt invasiv ausbreiten zu können, muss A. fumigatus in der Lage sein, an den Epithelien des Respirationstrakts eines Individuums zu haften und diese zu penetrieren. Ferner muss er die Fähigkeit besitzen, der Abwehr des Wirtes zu entgehen oder diese zu schwächen (LATGÉ et al. 1994a, 1997). Antigene von A.
fumigatus, denen solche Virulenz-vermittelnden Eigenschaften zugesprochen werden, lassen sich in vier Kategorien (Adhesine, Pigmente, toxische Moleküle und Enzyme) einteilen.
Die Adhesine fördern Interaktionen zwischen Wirtszellen und dem Pilz. In diese Gruppe gehören Komplementrezeptoren (STURTEVANT u. LATGÉ 1992), ein von TRONCHIN et al. (1997) beschriebener Lamininrezeptor und Hydrophobine, welche von THAU et al. (1994) identifiziert wurden.
Die Pigmente inhibieren die Phagozytose der Konidien durch die Abwehrreaktion des Wirtes. Dieser Gruppe wird das Dihydroxynaphthalene-Melanin zugeordnet (JAHN et al. 1996; TSAI et al. 1997).
Zu den toxischen Molekülen von A. fumigatusgehören sekundäre Metaboliten wie bspw. das Gliotoxin. Dieses Protein ist ein Metabolit der Epipolythiodioxopiperazin-Familie und zeichnet sich durch seine immunsuppressive Wirkung aus
(MÜLLBACHER u. EICHNER 1984; MÜLLBACHER et al. 1985; EICHNER et al.
1986; SUTTON et al. 1994, 1996).
Das Hämolysin, ein 30 kDa-Protein, bedingt eine Lyse der Erythrozyten und erleichtert möglicherweise aus diesem Grund die Entwicklung einer Aspergillus-Infektion (EBINA et al. 1983; YOKOTA et al. 1985; FUKUCHI et al. 1996).
Die von A. fumigatus sezernierte RNase (18 kDa) (LAMY et al. 1991; LATGÉ et al.
1991) wird aufgrund ihrer Eigenschaft, Wirtszellen abzutöten als Virulenzfaktor ebenfalls in die Gruppe der toxischen Moleküle von A. fumigatuseingeordnet.
Enzyme spielen bei der Invasion des Wirtsgewebes durch einen Pilz eine entscheidende Rolle (ODDS 1991; HOGAN et al. 1996). Da das Lungenbindegewebe primär aus Elastin und Kollagen besteht, wird angenommen, dass Proteasen in der Pathogenese der Aspergillose von Bedeutung sind (MONOD et al. 1995).
Katalasen und Superoxiddismutasen (HOLDOM et al. 1995, 1996; CRAMERI et al.
1996; CALERA et al. 1997) wirken nach der Phagozytose durch Wirtszellen als Antioxidantien.
Phopholipasen wird eine Epithelien-zerstörende Funktion zugeschrieben (BIRCH et al. 1996).
Nach heutigem Wissensstand sind ungefähr 100 (Glyko-)Proteine von A. fumigatus in der Lage, humane Immunglobuline zu binden (LATGÉ 1999). Die meisten dieser Antigene wurden jedoch nicht näher charakterisiert, es wurde lediglich ihr Molekulargewicht im Immunblot bestimmt (LATGÉ 1999).
Bisher sind von den 100 (Glyko-)Proteinen weniger als ein Dutzend Antigene mittels proteinchemischer und molekulargenetischer Methoden, wie z. B. Screening von Expressionsbanken mit Patientenseren, näher charakterisiert worden. Die meisten dieser Antigene können hinsichtlich ihrer mutmaßlichen Virulenz den Kategorien toxische Moleküle und Enzymezugeordnet werden.
Die bereits erwähnte RNase ist ebenfalls unter der Bezeichnung Ag 3 (LONGBOTTOM 1986), Restrictocin (FANDO et al. 1985; LAMY u. DAVIS 1991;
LAMY et al. 1991) und ASPF1 (ARRUDA et al. 1992) bekannt. Ob die RNase eine tragende Rolle im Infektionsgeschehen spielt, ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. So zeigten LATGÉ et al. (1991) dass Versuchstiere, denen das Protein injiziert wurde, keine toxischen Schocks erleiden. Es konnten hinsichtlich des
Wachstums im Wirtsgewebe und der Mortalität im Tierversuch keine Unterschiede zwischen einer ASPF1-Knock-out-Mutante und dem parentalen Wildstamm gefunden werden (PARIS et al. 1993; SMITH et al. 1993). Andere Aspergillen, wie beispielsweise der aus medizinischer Sicht nicht unbedeutende Aspergillus flavus, synthetisieren keine RNase, dafür aber einige apathogene Spezies (LATGÉ 1999).
Ein positiv kumulativer toxischer Effekt konnte bei Lymphozyten beobachtet werden, die sukzessive mit subinhibierenden Dosen von Gliotoxin und ASPF1 behandelt wurden (DEBEAUPUIS et al. 1995). YANG u. KENEALY (1992) stellten fest, dass eine ASPF1-Mutante, die keine RNase-Aktivität zeigte, die Immunantwort in höherem Maße stimulierte, als das native ASPF1. Aus diesen Versuchen folgerte LATGÉ (1999), dass der Effekt eines mutmaßlichen Virulenzfaktors davon abhängig ist, ob er allein oder in Kombination mit anderen Aspergillus-Molekülen wirken kann. Ebenso ist ein und dasselbe Antigen in der Lage, eine Immunantwort zu stimulieren oder supprimierend in diese einzugreifen.
Aus der großen Gruppe von Enzymen, die als mutmaßliche Virulenzfaktoren von A.
fumigatus verstanden werden, konnten mehrere Proteasen (ALP, PEP und MEP) identifiziert werden.
ALP ist eine von Aspergillus sezernierte Serinprotease, die der Subtilisinfamilie angehört (REICHARD et al. 1990; MONOD et al. 1991; JATON-OGAY et al. 1992;
MOUTAOUAKIL et al. 1993; MOSER et al. 1994). Dieses 33 kDa-Protein ist zum Gegenstand intensiver Forschung geworden. Allerdings wurde im Tierversuch gezeigt, dass kein signifikanter Virulenz-Unterschied zwischen ALP-produzierenden Wildtypen von A. fumigatus und ALP-Deletionsmutanten besteht (TANG et al. 1992, 1993; MONOD et al. 1993a; SHIBUYA et al. 1999b). FROSCO et al. (1994) verabreichten in einem Infektionsversuch immunsupprimierten Mäusen gegen ALP gerichtete Antikörper und stellten fest, dass diese die Tiere nicht gegen eine Infektion mit A. fumigatus schützten. Die Anti-ALP-Antikörper bewirkten jedoch bei immunkompetenten Mäusen, welche mit hohen Konidiendosen infiziert wurden, Schutz vor einer Infektion.
IADAROLA et al. (1998) fanden heraus, dass diese Serinprotease sowohl in vitro als auch in vivo in der Lage ist, extrazelluläre Matrixkomponenten der Lunge zu degradieren. Eine signifikante Hemmung der polymorphkernigen Leukozyten bezüglich ihrer Chemotaxis und Hyphenzerstörung konnte ALP genauso
nachgewiesen werden (IKEGAMI et al. 1998; HASEGAWA et al. 1999), wie die morphologische Veränderung bronchialer, epithelialer Zelllinien mit einer dadurch bedingten Ablösung von Plastikoberflächen (TOMEE et al. 1997; KAUFFMAN et al.
2000).
PEP ist eine pepsinähnliche Aspartatprotease mit einem Molekulargewicht von 38 kDa (REICHARD et al. 1994). Auch hier wurde im Tierversuch festgestellt, dass hinsichtlich der Virulenz kein Unterschied zwischen einer PEP-Gendeletionsmutante und eines parentalen PEP-Wildstamms bestand (REICHARD et al. 1997).
MONOD et al. (1993b) isolierten aus einem Kulturüberstand einer ALP-Deletionsmutante eine sezernierte Metalloprotease (MEP) mit einem Molekulargewicht von 40 kDa. Im Tierversuch testeten JATON-OGAY et al. (1994) MEP- und auch ALP-MEP-Doppeldeletionsmutanten hinsichtlich ihrer Virulenz. Es gab wie bei ALP und PEP keine signifikant verminderte Virulenz gegenüber dem Wildstamm.
Von BEAUVAIS et al. (1997a; 1997b) wurden zwei Dipeptidylpeptidasen (88 kDa und 94 kDa) beschrieben. Das 88 kDa-Enzym verfügt über ein Signalpeptid.
HEARN et al. (1992), LOPEZ-MEDRANO et al. (1995) und CALERA et al. (1997) beschrieben eine Katalase von A. fumigatus. CALERA et al. (1997) klonierten das zugehörige Gen und fanden anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz heraus, dass die Katalase sowohl über ein Signal- als auch über ein Propeptid verfügte.
Es sind bisher zwei Superoxiddismutasen von A. fumigatus beschrieben worden.
Eine 27 kDa-Superoxiddismutase (CRAMERI et al. 1996, 1998), welche auch von HEMMANN et al. (1998) isoliert werden konnte und eine Superoxiddismutase (67 kDa), die von HAMILTON et al. (1995) und HOLDOM et al. (1995, 1996) charakterisiert wurde.
Es wurden des Weiteren zwei Antigene identifiziert, die jedoch nicht in eine der oben genannten Kategorien einzuordnen sind. So identifizierte bspw. CRAMERI (1998) ein peroxisomales Protein von 19 kDa.
Das erste Antigen von Aspergillus, welches in experimentell infizierten Tieren und in Patienten mit einer invasiven Aspergillose gefunden wurde, war das Galactomannan (GM) (LEHMANN u. REISS 1978; REISS u. LEHMANN 1979; ANDREWS u.
WEINER 1981; DUPONT et al. 1987). Dieses Polysaccharid ist in der Zellwand von
Aspergillen lokalisiert (LATGÉ et al. 1994b). Es ist das einzige Polysaccharid-Antigen von A. fumigatus, welches bislang charakterisiert wurde.
B.1.6 Diagnostik
Die derzeitige Diagnostik der Aspergillose stützt sich auf bildgebende Verfahren, dem direkten Nachweis des Erregers aus Gewebeproben und Sekreten sowie auf die Detektion von A. fumigatus-Molekülen in Körperflüssigkeiten mittels eines Antigen-Sandwich-ELISA´s (zur Übersicht siehe: RÜCHEL u. REICHARD 1999). Letzterer weist oben erwähntes Galactomannan (GM) von Aspergillen in Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin und Bronchiallavagen nach und ist derzeit die labordiagnostische Methode der Wahl (LATGÉ 1999). Jedoch ist der GM-ELISA sowohl in seiner Spezifität als auch in seiner Sensitivität zu bemängeln. Zum einen zeigt er eine hohe Rate an falsch positiven Ergebnissen, zum anderen spricht er oftmals erst sehr spät im Verlauf der invasiven Aspergillose an (STYNEN et al. 1995; SULAHIAN et al.
1996; PINEL et al. 2003).
Diagnostische Tests, die auf spezifische Antikörper reagieren, sind ebenfalls wenig geeignet, da die Antikörperproduktion der zumeist immunsupprimierten Patienten stark eingeschränkt oder verzögert ist (YOUNG u. BENETT 1971; RÜCHEL u.
REICHARD 1999).
B.1.7 Genomprojekt
Um einen besseren Einblick in die Pathogenität von A. fumigatus zu gewinnen, wurde 1998 ein internationales Konsortium gegründet, welches die Sequenzierung des kompletten Genoms von A. fumigatus (~ 30 Mb) anstrebte (DENNING et al.
2002). Mittlerweile ist die Sequenzierung nahezu abgeschlossen, erste Annotierungen sind von dem „Wellcome Trust Sanger Institute“ (GB) und „The Institute for Genomic Research“ (TIGR, USA) ausgeführt worden (MABEY et al.
2004). Die in dieser Arbeit isolierten Antigene wurden mittels Blast-Search-Analyse der hier ansequenzierten cDNAs unter Verwendung der TIGR-Datenbanken identifiziert.
C Material
C.1 Geräte
Die in dieser Arbeit benutzten Geräte sind im Anhang aufgeführt (J.1).