D.3 Molekularbiologische Methoden
E.1.6 Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells
Tab. 16: Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells
Tier Gewichtsabnahme
> 5%
Anstieg der Körpertemperatur Immunblot Sektion
1 nein nein Neg. Neg.
2 nein ja Pos. Pos.
3 ja ja Pos. Neg.
4 ja nein Neg. Neg.
5 ja ja Pos.
-6 ja ja Neg.
-7 ja ja Pos. Pos.
8 ja ja Pos.
-9 ja ja Pos. Pos.
10 ja ja Pos. Pos.
Aufgrund der in der Tabelle 16 dargestellten Ergebnisse wurden von den 10 infizierten Kaninchen 7 Tiere als erfolgreich infiziert betrachtet. Bei 4 der 7 Tiere (2,7,9,10) konnte eine invasive Aspergillose durch die Sektionen zweifelsfrei nachgewiesen werden. Ein Tier (3) war in der Sektion ohne pathologische Veränderungen, obwohl klinische Symptomatik und ein positiver Immunblot vorangegangen waren. Zwei der erfolgreich infizierten Tiere (5,8) überlebten die Infektionen.
Für die Identifikation infektionsrelevanter Antigene von A. fumigatusdurch Screening einer -Phagen-cDNA-Expressionsbank wurden Seren der Kaninchen 2,3,5,7,8und 10ausgewählt.
E.2 Screening einer A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek mit Infektionsseren (Immunscreening)
Tab. 17: Übersicht Screening der cDNA-Expressionsbibliothek
Tier 2 Tier 3 Tier 5 Tier 7 Tier 8 Tier 10
Verwendete Infektionsseren 14 d p.
1.inf
Zahl der identifizierten Gene aus den infektionsspezifischen
Plaques 7 2 6 10 5 5 4 3 7
Die Verwendung von Einzelseren ermöglicht eine detaillierte Aussage darüber, welches Tier auf welche Antigene reagiert. Antigene, die durch mehrere verschiedene Infektionsseren isoliert werden, weisen eventuell auf eine besondere Bedeutung im Infektionsgeschehen hin.
d. h. Plaques, die ausschließlich mit dem Infektionsserum reagierten oder eine deutlich stärkere Reaktion mit dem Infektionsserum als mit dem Vorserum aufwiesen
Allen Plaques konnten Gene zugeordnet werden. Die Differenz erklärt sich durch Mehrfachisolierungen ein und derselben cDNA (s. Tabelle 17a)
Tab.17a: Identifizierte Antigene
Tier 2(14 d p. 1.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus
fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004)
6 x Erma
>69.m15029|||reticulocyte binding
protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69
6 x BipA
>57.m05760|||ER chaperone BiP|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5210|57
2 x Myosin 2
>71.m15694|||reticulocyte binding
protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0037b07.p1c|71
1 x RNA-Helicase
>72.m18954|||Cdc28p
protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0346e02.q1ca|72
1 x Coatmer A
>57.m05557|||coatomer protein gamma 2-subunit|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5210|57
1 x Methyltransferase
>89.m01968|||methlytransferase, UbiE/COQ5 family|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5049|89
1 x Translationsinitiationsfaktor >69.m15713|||eif-2b|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69
*= TIGR (The Institute for Genomic Research)
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 3(14 d p. 2.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus
fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004)
6 x Elongationsfaktor 1 >62.m03150|||elongation factor 1-gamma
2|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62
1 x Transketolase >70.m15291|||transketolase|a_fumigatus|
chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 5 (14 d p. 1.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
8 x HSP90 >53.m03692|||heat shock protein 90|a_fumigatus|chr_0|
TIGR.5147|53
7 x AHP1 >62.m03473|||antioxidant, AhpC/Tsa
family|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62
1 x Enolase >69.m14844|||enolase|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69
1 x Histon H3 >70.m15320|||histone H3|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
1 x Erma >69.m15029|||reticulocyte binding
protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69
1 x MCAP >59.m09500|||cytoskeleton assembly control protein homolog
Sla2|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 5 (14 d p. 2.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
15x AHP1 >62.m03473|||antioxidant, AhpC/Tsa
famly|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62
11x HSP90 >53.m03692|||heat shock protein 90|a_fumigatus|chr_0|
TIGR.5147|53
8x Aspf 16 >70.m15565|||allergen|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
6x Enolase >69.m14844|||enolase|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69
2x Phosphoglucomutase >59.m08711|||phosphoglucomutase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
1x Acyl-CoA
>72.m19226|||Acyl CoA binding protein family|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0346e02.q1ca|72
1x Cation-Ex >89.m01969|||cation exchanger,
putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5049|89
1x Nucl-Seggr.
>70.m15353|||similar to yeast nuclear segregation protein Bfr1 involved in Mitosis and Vesicular transport,
putative|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
1x Pyruvatdecarboxylase >59.m08784|||pyruvate decarboxylase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
1x Formatdehydrogenase >62.m03114|||NAD-dependent formate
dehydrogenase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 7 (14 d p. 1.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
2 x SMC >69.m14905|||hypothetical
protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGD80TR|69
1 x DNA-Helicase >89.m02073|||reticulocyte binding
protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5049|89
1 x Bromo >58.m07590|||bdf1 protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58
1 x Aldolase >59.m08909|||class II aldolase/adducin domain
protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
1 x N-Acetylglucosamindecacetylase >20078.m00050||AO070241000019|conserved hypothetical protein|a_oryzae|chr_0|Con0241|20078
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 7(14 d p. 2.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
18 x Pyruvatdecarboxylase
>59.m08784|||pyruvate decarboxylase|
a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
9 x hypoth. Membranprotein >59.m08614|||conserved hypothetical
protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
3 x HSP70 >70.m15203|||heat shock protein
Hsp70|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
2 x Coatmer B
>70.m15529|||CG14813-PA|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
1 x DnaJ >66.m04645|||unnamed protein
product|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGUU35TF|66
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 8 (14 d p.1.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
3 x ATPase Myosin
>58.m07519|||related to nonmuscle myosin-II heavy chain, putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58
1 x HSP70
>70.m15203|||heat shock protein
Hsp70|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
1 x HSP 30
>59.m08448|||30 kDa heat shock protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
1 x PEP2 >59.m08754|||cellular aspartic
protease|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
Fortsetzung Tab. 17a
Tier 8 (14 d p. 2.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
27 x Erma >69.m15029|||reticulocyte binding
protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69
2 x ATPase Myosin >58.m07519|||related to nonmuscle myosin-II heavy chain,
putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58
1 x MutL >72.m19437|||PMS1|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0346e02.q1ca|72
Fortsetzung Tab.17a
Tier 10 (14 d p.1.inf) Genverteilung
auf Plaques
in dieser Arbeit verwendete Abkürzung
vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand
05/2004)
5 x Elongationsfaktor 1 >62.m03150|||elongation factor 1-gamma
2|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62
4 x Aspf 16 >70.m15565|||allergen|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70
2 x AHP-1 >62.m03473|||antioxidant, AhpC/Tsa
family|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62
1 x HSP90 >53.m03692|||heat shock protein 90|a_fumigatus|chr_0|
TIGR.5147|53
1 x Cholindehydrogenase >67.m02964|||choline
dehydrogenase|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGFF15TF|67
1 x Phosphoglucomutase >59.m08711|||phosphoglucomutase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59
1 x hyp. Signalprotein >58.m07276|||hypothetical signal peptide protein,
putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58
E.2.1 Screeningzeitpunkt
Für das Screening wurden Seren von 6 Kaninchen (Tier 2,3,5,7,8,10) 14 d p. inf.
verwendet (s. Tab. 17). Dieser Zeitpunkt wurde zum einen gewählt, da protektive Immunantworten bereits früh im Infektionsverlauf auftreten (LEHMANN u. WHITE 1976), zum anderen, weil es vermieden werden sollte, dass überwiegend Abräumprodukte des Pilzes identifiziert werden. Im Folgenden sind beispielhaft die Ergebnisse des Screenings der cDNA-Expressionsbank dargestellt.