ISBN 978-3-86345-187-5
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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V era Sperber Hannover 2013
Evaluation von drei neuen synthetischen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
Tierärztliche Hochschule Hannover
Vera Sperber
Gewebeklebern im Leberteilresektionsmodell
der Ratte
Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-187-5
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Tierärztliche Hochschule Hannover
Evaluation von drei neuen synthetischen Gewebeklebern im Leberteilresektionsmodell
der Ratte
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Vera Sperber
Düren
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung:
Herr Univ.-Prof. Dr. med. vet. Hansjoachim Hackbarth
Institut für Tierschutz und Verhalten der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Herr Univ.-Prof. Dr. med. René H. Tolba
Institut für Versuchstierkunde sowie Zentrallaboratorium für Versuchstiere der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen
1. Gutachter: Prof. Dr. Hansjoachim Hackbarth 2. Gutachter: Prof. Dr. Michael Fehr
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2013
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 4
2.1 Blutungskomplikationen an der Leber ... 4
2.2 Hämostase ... 5
2.3 Bisherige Therapiestrategien ... 8
2.3.1 Lokale Hämostatika ... 9
2.4 Anatomie der Leber ... 18
2.4.1 Makroskopische Anatomie der Rattenleber ... 18
2.4.2 Histologische Anatomie der Leber ... 21
2.5 Leber-Resektionsmodell ... 22
3 Material und Methoden ... 25
3.1 Material ... 25
3.1.1 Versuchstiere ... 25
3.1.2 Klebstoffe ... 25
3.2 Methodik und Modelle ... 26
3.2.1 Versuchsaufbau und -ablauf ... 26
3.2.2 Narkose ... 28
3.2.3 Lagerung und Vorbereitung zur Operation ... 29
3.2.4 Operationsmethoden ... 29
3.2.5 Messungen ... 37
3.2.6 Proben ... 44
3.3 Statistik ... 52
4 Ergebnisse ... 53
4.1 Anzahl der Versuchstiere ... 53
4.2 Überlebensanalyse ... 54
4.3 Blutungszeit ... 56
4.4 Blutungsmenge ... 57
4.4.1 Intraoperative Blutungsmenge ... 57
4.4.2 Letale Blutungsmenge ... 58
4.5 Intraoperative Komplikationen ... 59
4.5.1 Ablösen der Klebeschicht von der Wundfläche ... 59
4.5.2 Nachblutungen ... 60
4.5.3 Nachkleben aufgrund der intraoperativen Komplikationen ... 61
4.6 Kleberabbau makroskopisch ... 62
4.7 Kleberhaftung an die Leberresektionsfläche ... 63
4.7.1 Kleberanhaftung bei verstorbenen Tieren ... 63
4.7.2 Kleberkonsistenz und Anhaftung am Finaltag ... 64
4.8 Intraabdominale Adhäsion ... 66
4.9 Histologie ... 69
4.9.1 Deskriptive histologische Beschreibung mit Bildern ... 69
4.9.2 Kleberreste... 85
4.9.3 Fibrosekapsel... 87
4.9.4 Alte Blutung... 90
4.9.5 Nekrose ... 91
4.10 Micro Computer-Tomographie (µCT) ... 92
4.10.1 Klebervolumen ... 98
4.10.2 Lebervolumen ... 99
4.10.3 Volumen der Gefäße ... 100
4.11 Laborparameter ... 101
4.11.1 Leberenzyme ... 101
4.11.2 Kleines Blutbild ... 107
4.12 Lebergewicht ... 109
4.13 Körpergewicht ... 110
4.14 Leberresektat ... 110
5 Diskussion ... 111
5.1 Methodik ... 111
5.1.1 Leberresektionsmodell ... 111
5.1.2 Auswahl von Fibrinkleber als Kontroll-Hämostatikum ... 112
5.1.3 Messung von Blutungszeit und -menge ... 113
5.1.4 Micro CT ... 115
5.2 Ergebnisse ... 117
5.2.1 Vorbereitung und Handhabung des Klebers ... 117
5.2.2 Überleben ... 117
5.2.3 Hämostase ... 118
5.2.4 Kleberanhaftung ... 122
5.2.5 Laborparameter ... 125
5.2.6 Verträglichkeit und Bioabbaubarkeit des Klebers... 128
5.2.7 Prävention von intraabdominalen Adhäsionen ... 132
5.3 Gesamtbetrachtung ... 135
5.4 Klinische Relevanz und Ausblick ... 136
6 Zusammenfassung ... 139
7 Summary ... 141
8 Verzeichnisse ... 143
8.1 Abbildungsverzeichnis ... 143
8.2 Tabellenverzeichnis ... 149 8.3 Literaturverzeichnis ... 150 9 Danksagung ... 165
1 Einleitung
Trotz modernster chirurgischer Techniken stellt das Management von Blutungen nach Lebertraumata eine große Herausforderung dar (DI SAVERIO et al. 2012;
ORDONEZ et al. 2013). Während größere Gefäße ligiert werden können, besteht das Hauptrisiko in Sickerblutungen aus kleinen Gefäßen, die mittels konventioneller chirurgischer Techniken nicht kontrolliert werden können. Hier besteht der Bedarf an effektiven Hämostatika (griech. haíma = ‚Blut‘ und stasis = ‚Stauung, Stillung‘). Zu diesen blutstillenden Materialien zählen verschiedene Substanzen, die als Kleber, Spray, Schwamm oder Kompresse auf die Wundfläche aufgebracht werden.
Schon frühzeitig wurde auf verschiedene Weise versucht eine Blutung zu stillen. Wie von ACHNECK et al. (2010) beschrieben, verwendeten die Ägypter eine Mixtur aus Wachs, Fett und Gerstenextrakten (SIGERIST 1951), die Griechen der Antike nutzten Heilkräuter mit blutstillender Wirkung zur Versorgung von Kriegsverwundeten (ARIS 2002) und die Ureinwohner Amerikas mischten Tierhautpartikel mit Sand und Adlerdaunen zum einem topischen Hämostatikum (STONE 1932).
Aktuell stellen Fibrinkleber das effektivste Hämostatikum dar und werden als
„Goldstandard“ in einem breiten Spektrum bei chirurgischen Eingriffen angewendet (EMILIA et al. 2011). Nachdem Anfang des 19. Jahrhunderts Fibrin und seine Wirkung entdeckt wurden, war 1940 der erste Fibrinkleber entwickelt worden.
Aufgrund technischer Hindernisse bei der Gewinnung von Fibrinogen wurde er jedoch erst ab 1970 in Europa kommerziell verfügbar. Wegen der Gefahr der Virusübertragung wurde Fibrinkleber erst 1998 von der Food and Drug Administration (FDA) in den USA zugelassen (EMILIA et al. 2011). In der Zwischenzeit wurden verschiedene Hämostatika auf den Markt gebracht und auch heute noch werden immer wieder neue Materialien und Substanzen getestet. Aktuell gibt es neben den aktiven Fibrinklebern biologisch passive Produkte wie Kollagen, Gelatine, regenerierte oxidierte Cellulose, Chitin und Chitosan sowie synthetische Substanzen wie mineralische Zeolite, Cyanoacrylate, Polyethylenglykol Hydrogele oder Kombinationen aus verschiedenen Materialien. Passiv bedeutet, dass nicht wie beim Fibrinkleber die letzten Stufen der Blutgerinnung durchlaufen werden, sondern
dass das Hämostatikum durch Thrombozytenaktivierung und –aggregation oder Polymerisation seine Wirkung entfaltet (EMILIA et al. 2011).
Jedoch erfüllt keines der bisher entwickelten Produkte alle Anforderungen an ein Hämostatikum. Dieses sollte sicher und schnell wirksam sein, gute systemische und lokale Verträglichkeit (KRISHNAN et al. 2004) aufweisen und zudem einfach in der Handhabung, hocheffizient, nicht antigen, voll resorbierbar und günstig sein (ACHNECK et al. 2010).
Eine neue Perspektive stellen vollsynthetische Kleber auf Polyurethanbasis dar. Sie sind kostengünstig herzustellen und bergen aufgrund der synthetischen Eigenschaften gegenüber dem biologischen Fibrinkleber nicht das Risiko einer Virenübertragung oder einer immunologischen Reaktion. Sie zeigten bereits in vorangegangenen in vitro Studien gute Klebeeigenschaften und Bioabbaubarkeit.
Außerdem wurde in Zellkulturen keinerlei toxische Wirkung nachgewiesen (BAYER 2012). Diese Resultate wurden durch eine erste in vivo Studie eines Polyurethanklebers am Leberresektionsmodell der Ratte bestätigt (WOITOK 2013).
In der hier vorliegenden Studie wird der bereits in vivo getestete Polyurethankleber und zwei daraus weiterentwickelte Klebermischungen, die in vitro abbaubar waren, im Leberresektionsmodell der Ratte auf Funktionalität, Verträglichkeit und Bioabbaubarkeit untersucht.
Folgende Fragen sollen dabei beantwortet werden:
Unterscheiden sich die Kleber in der Handhabung?
Lassen sie sich gut auftragen?
Wie schnell und sicher wirken die Kleber, um die Blutung zu stillen?
Wie gut haften die Kleber der Wundfläche an?
Sind die Kleber verträglich oder kommt es zu toxischen Reaktionen lokal oder generalisiert?
Ist der Kleber bioabbaubar? Wie lange dauert es bis zur Resorption?
Können durch den Kleber intraabdominale Adhäsionen verhindert oder vermindert werden?
Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, welcher der drei synthetischen Klebemischungen, im Vergleich zu bereits etabliertem Fibrinkleber, die Anforderungen an ein Hämostatikum am besten erfüllt.
2 Literaturübersicht
2.1 Blutungskomplikationen an der Leber
Blutungen stellen nach Traumata oder chirurgischen Eingriffen an der Leber die größte intra- und postoperative Komplikation dar, wie nachfolgende Studien belegen.
In einer klinischen Studie mit 443 Lebertrauma-Patienten konnte gezeigt werden, dass die meisten Todesfälle (58 %) intraoperativ aufgrund unkontrollierbarer Blutungen und daraus resultierendem Verbluten erfolgen (CARMONA et al. 1982).
Leberrisswunden sind die häufigsten intraabdominalen Verletzungen mit Todesfolge, deren Hauptproblem in der Blutungskontrolle besteht, um die Mortalität zu senken (CARMONA et al. 1984). Je nach Schwere der Verletzungen bestehen Mortalitätsraten von 7 %, 30 % und 66 % bei Klasse III, IV und V-Lebertrauma (COGBILL et al. 1988). Eine weitere klinische retrospektive Studie an einem Level-I- Trauma-Center zeigte, dass bei 1586 Traumapatienten jeglicher Art, von denen 106 (6,6 %) verstarben, Todesursache Nummer eins Verletzungen des zentralen Nervensystems (48,1 %) darstellten, direkt gefolgt von Blutungen in 36,8 % der Todesfälle (SHACKFORD et al. 1989).
An einem anderen Level-I-Trauma-Center konnte bei 23 % der 157 Patienten, die aufgrund von postoperativen Blutungen nachoperiert werden mussten, keine Hämostase gesichert werden, so dass 27 Patienten aufgrund unkontrollierbarer Blutungen verstarben. Die unvollständige Hämostase, die in den meisten Fällen bei Leberverletzungen auftrat, stellte sich als Hauptursache für Blutungen dar (HIRSHBERG et al. 1993).
Besonders bei Patienten mit Leberzirrhose ist eine sichere Blutstillung während chirurgischen Maßnahmen schwer zu gewährleisten (SAKON et al. 1989; TAKACS et al. 2010).
Die starke Blutungsneigung der Leber liegt in ihrem strukturellen Aufbau begründet.
Aufgrund der sinusoidalen Struktur, den spärlich vorhandenen glatten Muskelzellen und nur geringen Anteilen Kollagens am Leberparenchym kann aufgrund fehlender Kontraktion der Muskelzellen nur eine geringe Vasokonstriktion stattfinden (CLARK und LEATHER 1970; TAKACS et al. 2010). Da die meisten Gefäße zu klein sind, um
diese zu ligieren (COGBILL et al. 1988; BEAL 1990; SAIFI et al. 1990; TAKACS et al.
2010) treten besonders Sickerblutungen vom Leberparenchym auf.
Weil die Anzahl der Leberresektionen aufgrund von Metastasenektomien zur effektiven Tumortherapie ansteigt (DODD et al. 2000), vervielfacht sich auch der Bedarf an guten Methoden zur Blutstillung.
Wird bei einer Leberresektion die Blutstillung nicht gesichert, resultiert dies in einem erhöhten perioperativen Blutverlust und führt dadurch zu erhöhter Morbidität und Mortalität (JAMIESON et al. 1992; ROSEN et al. 1992; YAMAMOTO et al. 1994;
BELGHITI et al. 2000; DAVIDSON et al. 2000; IMAMURA et al. 2003; ERDOGAN und VAN GULIK 2008).
Viele postoperative Komplikationen nach Leberresektion aufgrund von Blutungen und Gallenlekage (IWATSUKI et al. 1983; TSUZUKI et al. 1984; NAGORNEY et al.
1989; SCHWARTZ et al. 2004) konnten dank verbesserter chirurgischer Techniken reduziert werden (HOLT et al. 2000), trotzdem bleibt der operative Blutverlust das Hauptproblem (JAMIESON et al. 1992; NAGASUE 1998; BECHSTEIN und NEUHAUS 2000; SCHWARTZ et al. 2004).
2.2 Hämostase
Die Hämostase oder Blutstillung ist ein überlebenswichtiger Prozess, der unmittelbar nach der Verletzung eines Blutgefäßes einsetzt. Sie muss schnell erfolgen und hängt von einer Balance zwischen pro- und antikoagulatorischem System ab.
Nach einer Gefäßläsion kommt es zuerst durch neuronale Reflexe, lokale myogene Spasmen und lokale humorale Faktoren unmittelbar zur Vasokonstriktion.
Danach durchläuft die physiologische Blutgerinnung über die Ausbildung eines Thrombozytenaggregates zum primären Wundverschluss, die Koagulationskaskade, dem Einsetzen von antithrombotischen Prozessen und der Fibrinolyse folgende vier Phasen:
Bildung eines Thrombozytenaggregates zur primären Blutstillung
Wird ein Gefäß verletzt, kommt es zum Endothelschaden und Kollagen, eines der stärksten Thrombozytenstimuli, liegt frei. Dadurch wird der von Willebrand Faktor (vWF) auf der subendothelialen Matrix aktiviert, an den die Thrombozyten dann binden. Thrombozyten zirkulieren unter physiologischen Bedingungen im Blut und können erst nach Aktivierung des vWF adhärieren, so dass eine Thrombusformation im intakten Gefäß verhindert wird. Durch die Bindung werden die Thrombozyten aktiviert, woraufhin sie Botenstoffe freisetzen, die weitere Thrombozyten aktivieren.
Diese bilden dann mit Fibrinogenbrücken ein Netzwerk aus. So entsteht ein Thrombozytenaggregat, das die Gefäßläsion primär und temporär verschließt. Es wird auch als „weißer Abscheidungsthrombus“ bezeichnet, der dann mit Einsetzen der Koagulationskaskade, an deren Ende die Bildung von Fibrin steht, durch die Einlagerung von Erythrozyten zum „roten Abscheidungsthrombus“ ausreift (FURIE und FURIE 2007).
Einsetzen der Koagulationskaskade zur sekundären Blutstillung
Es gibt zwei Gerinnungssysteme: das intrinsische und das extrinsische System.
Beide Wege sind miteinander verknüpft, können jedoch unabhängig voneinander ablaufen, wobei das extrinsische System in vivo die Hauptrolle spielt (DAVIE 2003) und mittlerweile sogar diskutiert wird, ob das intrinsische System in vivo überhaupt eine essentielle Rolle spielt (MCMICHAEL 2012). Beide Systeme haben den gemeinsamen Endschritt, bei dem über Faktor X Fibrinogen im primären Thrombozytenaggregat zu Fibrin konvertiert und somit ein Fibrinnetzwerk zum stabilen Wundverschluss ausgebildet wird.
Das extrinsische Gerinnungssystem, auch als plasmatische Gerinnung bezeichnet, wird erst aktiviert, wenn ein Endothelschaden vorliegt. Alle Gerinnungsfaktoren, die sich entweder auf Zellmembranen befinden oder im Blut zirkulieren, liegen zunächst in der inaktiven Form vor, die durch die Gerinnungskaskade wie bei einem Dominosystem einander aktivieren (a). Durch die Verletzung liegt Faktor III, auch als Tissue Faktor bezeichnet, das von vielen Zellen der subendothelialen Matrix exprimiert wird, frei und Faktor VIIa aus dem Blut kann anbinden. Dadurch wird
wiederum Faktor X aktiviert, der gemeinsam mit Faktor Va zur Konformation von Prothrombin (II) zu Thrombin (IIa) führt. Dieses spaltet an Fibrinogen Peptidreste ab, so dass Bindungsstellen frei werden und eine Polymerisierung der Fibrinmonomere stattfindet. Durch Faktor XIIIa, der ebenfalls von Thrombin aktiviert wurde, findet eine Quervernetzung statt, die zu einem stabilen Wundverschluss führt (DAVIE und RATNOFF 1964).
Das intrinsische System (DAVIE und RATNOFF 1964) wird nicht wie das extrinsische durch einen Gewebsschaden aktiviert, sondern autokatalytisch gestartet. Negativ geladene Oberflächen wie Glas, Kaolin oder Dextrane aktivieren Faktor XII zu XIIa, der dann über die Aktivierung von Faktor XI und IX zur Aktivierung von Faktor X und wie oben bereits beschrieben zur Fibrinbildung führt (DAVIE und RATNOFF 1964). In vivo stellen RNA, Kollagen und Polyphosphate Oberflächen mit negativer Ladung dar (MORRISSEY 2012).
Neben allen erwähnten Gerinnungsfaktoren spielen außerdem Ca2+ - Ionen eine zentrale Rolle in der Hämostase. Da die meisten Gerinnungsfaktoren negativ geladen sind und genau wie die Phospholipidmembranen der Zellen, die an der Gerinnung beteiligt sind wie (sub) endotheliale Zellen und Thrombozyten, ermöglichen sie als Bindeglied erst eine Verbindung zwischen den negativ geladenen Bereichen (DAVIE et al. 1991; MCMICHAEL 2012).
Fertigstellung des Gerinnungsthrombus durch antithrombotische Prozesse
Ist ein stabiler Gerinnungsthrombus ausgebildet, wird überschüssiges Thrombin, der potenteste Gerinnungsaktivator, von Thrombmodulin auf der Oberfläche von Endothelzellen gebunden und somit seine Fähigkeit zur Fibrinbildung blockiert. Über dadurch aktivierte weitere Rückkopplungsmechanismen des Gefäßendothels wird somit die Gerinnung inhibiert (LANE et al. 2005).
Abbau des Fibringerinnungsthrombus durch Fibrinolyse
Der stabile Fibringerinnungsthrombus wird mit fortschreitender Wundheilung proteolytisch abgebaut. Die zentrale Funktion im Fibrinolysesystem übernimmt Plasmin, das in seiner inaktiven Form als Plasminogen bereits während der
Gerinnung in den Thrombus eingebaut wird. Mit zeitlicher Verzögerung zur Läsion wird Plasminogen durch Kallikrein, das durch Faktor XIIa aktiviert wird, und durch Gewebsaktivatoren aus dem Endothel aktiviert. Das Fibrinnetzwerk wird abgebaut und der Gefäßdefekt schlussendlich mit Bindegewebe verschlossen (COLLEN 1980).
2.3 Bisherige Therapiestrategien
Neben der physiologischen Blutgerinnung gibt es verschiedene Methoden, um eine Blutung zu stillen. Dabei kann zwischen systemischer und lokaler Blutstillung unterschieden werden. Da die in dieser Studie untersuchten Gewebekleber den lokalen Hämostatika zuzuordnen sind, wird auf die systemischen Maßnahmen nur kurz eingegangen.
Bei der systemischen Blutstillung erfolgt durch die Gabe eines Medikamentes ein Eingriff in das Gerinnungssystem. Lysinanaloga wie -Aminokapronsäure oder Tranexamsäure inhibieren die Fibrinolyse. Die gleiche Wirkungsweise zeigt auch Aprotinin, ein unspezifischer Proteaseinhibitor. Zur Prophylaxe von Blutungen bei Patienten mit Gerinnungsstörungen wird außerdem Eptacog α (aktiviert) eingesetzt.
Diese Substanz entspricht dem aktivierten Faktor VII und kann somit bei parenteraler Gabe seine Funktion übernehmen. Die Problematik bei der systemischen Blutstillung liegt darin, dass es gehäuft zu Thrombembolien kommen kann (BECHSTEIN und NEUHAUS 2000).
Zur lokalen Blutstillung können physikalische und mechanische Techniken oder lokale Hämostatika eingesetzt werden. Oft wird auch eine Kombination dieser Möglichkeiten angewendet.
Es gibt viele klassische chirurgische Techniken wie Gefäßligation, Umstechung des blutenden Areals oder Unterbindung (BECHSTEIN und NEUHAUS 2000), Kompression der Wundfläche, Elektrokoagulation, Hitze/Kälteapplikation, Diathermie und Argon Plasma Coagulation, um Blutungen zu kontrollieren. Weiterhin gibt es Maßnahmen wie das Pringle Manöver, um die Blutzufuhr zur Leber während leberchirurgischen Eingriffen zu reduzieren.
Trotz der stetigen Weiterentwicklung dieser Maßnahmen ist ihre Wirkung besonders bei Sickerblutungen an parenchymatösen Organen insuffizient oder kann aufgrund technischer Schwierigkeiten oder adverser Effekte auf das Gewebe nicht angewendet werden. Effektive lokale Hämostatika stellen in solchen Fällen eine ergänzende oder alternative Maßnahme zur Blutstillung dar.
2.3.1 Lokale Hämostatika
Lokale Hämostatika können anhand verschiedener Merkmale unterschieden werden.
Es gibt sie in Form von Kleber, Spray, Puder oder Schwamm. Es gibt biologische und synthetische Produkte. Die meisten Produkte sind biologisch abbaubar, andere hingegen werden nicht oder nur in geringem Maße resorbiert. Manche Produkte sind nur zur äußerlichen Anwendung zum Verschluss von Hautwunden geeignet, andere haben auch ein Anwendungsspektrum an inneren Organen, dem kardiovaskulären System oder in der Neurochirurgie. Einige Produkte werden so produziert, dass sie direkt gebrauchsfertig zur Verfügung stehen (z.B. wirkstoffhaltige Schwämme), andere müssen zur Nutzung erst vorbereitet werden (z.B. Fibrinkleber). Letztlich unterscheiden sich diese Produkte in ihrer Wirkweise. Fibrinkleber wirken aktiv, indem sie die letzten Schritte der Koagulationskaskade nachahmen. Je nach verwendetem Material führen passiv wirkende Substanzen zu einer Thrombozytenaktivierung und –aggregation oder führen über die Polymerisation des Wirkagens zu einem Verschluss der Wundfläche.
Ein weiterer Punkt sind die deutlich unterschiedlichen Kosten, wobei die Fibrinkleber oder Trägermaterialien in Kombination mit gerinnungsaktiven Substanzen die teuersten Produkte darstellen.
Nachfolgend werden verschiedene Hämostatika beschrieben, die bereits zur Blutstillung an der Leber zugelassen sind oder dort experimentell getestet wurden.
2.3.1.1 Gelatine (Gelfoam, Gelfilm, Surgifoam)
Es gibt verschiedene Applikationsmethoden von Gelatine als Hämostatikum. Es ist als Gel, Schwamm und Puder verfügbar. Die Gelatine, aus Tierhaut gewonnen, bildet
eine Matrix, in der Thrombozyten adhärieren, wodurch die intrinsische Gerinnung einleitet wird (PEPER et al. 1986).
Da der pH-Wert neutral ist, kann Gelatine als Trägersubstanz für gerinnungsaktivierende Substanzen wie Thrombin verwendet werden (ACHNECK et al. 2010).
2.3.1.2 Cellulose
Es gibt Produkte aus oxidierter Cellulose und aus oxidierter regenerierter Cellulose.
Beide Formen werden aus Baumwolle gefertigt, wobei die regenerierte Cellulose zu durchgehenden Cellulosefasern verarbeitet wird.
Die oxidierte Cellulose senkt den pH-Wert in der Umgebung, so dass einerseits ein antimikrobieller Effekt angenommen wird, andererseits aber auch mit einem Anstieg der Entzündung des umliegenden Gewebes und daraus folgender verzögerter Wundheilung zu rechnen ist (TOMIZAWA 2005).
2.3.1.3 Microfibrilläres Kollagen (Avitene, Instat)
Microfibrilläres Kollagen wird aus der Lederhaut (Corium) des Rindes gewonnen. Es gibt verschiedene Produkte als Puder, Schwamm und Pad. Die große Oberfläche der Fibrillen lässt Thrombozyten adhärieren, so dass es zur Ausbildung eines Gerinnungsthrombus kommt (MORGENSTERN et al. 1977; WAGNER et al. 1996).
Da der Wirkmechanismus vom Vorhandensein der Thrombozyten abhängt, ist es bei Patienten mit Thrombozytopenie weniger wirksam (ABBOTT und AUSTEN 1975).
2.3.1.4 Mineralische Zeolite (Quick Clot)
Die ersten beiden Generationen von Quick Clot sind Puder, die das Mineral Zeolite enthalten. Dieses aktiviert die Thrombozytenaggregation und absorbiert Wasser, so dass es zu einer Ansammlung von Gerinnungsfaktoren und zur Ausbildung eines Gerinnungsthrombus kommt (ALAM et al. 2004).
Die Weiterentwicklung dieses Präparates ist in der dritten Generation eine Kaolin beschichtete Kompresse. Das inerte Mineral Kaolin ist ein Aluminiumsilikat, das
durch Prehydrierung von Zeolite hergestellt wird. Es wirkt wie Zeolite, allerdings kommt es beim exothermen Prozess der Flüssigkeitsabsorption aus der Blutung, durch die Vorbehandlung, nicht zu so hohen Temperaturen wie bei Zeolite, die gewebsschädigend sind (RHEE et al. 2008).
Bisher wurde Quick Clot besonders von der US-Armee in Kriegseinsätzen zur Versorgung von äußeren Blutungen eingesetzt (ACHNECK et al. 2010).
2.3.1.5 Cyanoacrylate (Dermabond, Histoacryl)
Cyanoacrylate, im normalen häuslichen Gebrauch auch als „Sekundenkleber“
bekannt, bestehen aus flüssigen Monomeren, die in Kontakt mit Wasser vernetzen und sehr schnell eine ausgehärtete Klebeschicht bilden.
Cyanoacrylate werden zum Verschluss von Hautwunden verwendet, wurden jedoch auch schon experimentell an der Leber getestet. Aufgrund der exothermen Reaktion, die zu Zellnekrosen führt, sind sie nur zur Anwendung auf der Haut und zum Verschluss von Ösophagus- und Fundusvarizen zugelassen.
2.3.1.6 Glutaraldehyd (BioGlue, Bio Foam)
BioGlue besteht aus einer Glutaraldehyd-Lösung, die unmittelbar vor dem Auftragen mit der zweiten Substanz aus bovinem Serumalbumin vermischt wird. Beim Vermischen quervernetzt das Glutaraldehyd mit dem Albumin, so dass der Kleber innerhalb von 2 Minuten aushärtet (ACHNECK et al. 2010). Obwohl der Kleber erfolgreich zur Hämostase in der Herzchirurgie eingesetzt wurde (PASSAGE et al.
2005), wird aufgrund seiner besonders ausgeprägten Zytotoxizität an der Leber dringend vom generellen Einsatz als Hämostatikum abgeraten (FURST und BANERJEE 2005), besonders wenn das geklebte Gewebe die Fähigkeit zur Regeneration beibehalten soll (ACHNECK et al. 2010).
Eine weitere Substanz dieser Kategorie ist BioFoam. Bei diesem Zwei- Komponenten-System basierend auf einer Protein-Lösung aus bovinem Serumalbumin und einer Glutaraldehyd-Lösung, entsteht bei der Vermischung ein Schaum. Dieser dichtet die Wundfläche mechanisch ab und bietet Anbindung für
zelluläre Blutbestandteile, die wiederum die Gerinnung regulieren. Der Schaum resorbiert innerhalb von sechs bis neun Wochen und wurde bisher in einer klinischen Studie an vierzehn Menschen nach partieller Leberresektion untersucht (WÜSTEFELD et al. 2011).
2.3.1.7 Wirkstoffhaltige Schwämme
Um die adhäsiven Eigenschaften eines Schwammes mit den hämostatischen Eigenschaften von Gerinnungsfaktoren wie Fibrin und Thrombin zu kombinieren, wurden Anfang der 90er Jahre wirkstoffhaltige Schwämme entwickelt, indem Kollagenschwämme mit Fibrinogen beschichtet wurden (ERDOGAN und VAN GULIK 2008).
Während die Schwämme anfangs vor Gebrauch manuell beschichtet werden mussten, gibt es mittlerweile fertige „Ready to Use“ Schwämme. Es gibt Kombinationen aus equinem Kollagen (Tachosil), bovinem Kollagen (Sangustop) oder Cellulose (Surgicel) mit Fibrinogen, Thrombin und Antifibrinolytika (TAKACS et al. 2010).
2.3.1.8 Fibrinkleber
Heutzutage ist eine große Anzahl von Fibrinklebern auf dem Markt verfügbar.
Fibrinkleber besteht aus Fibrinogen, Faktor XIII, Thrombin, antifibrinolytischen Agenzien und Calcium Chlorid (DUNN und GOA 1999; JACKSON 2001; KROEZ et al. 2005). Der Fibrinkleber ist immer ein 2-Komponenten-System, bei dem die Substanzen Thrombin und Fibrinogen erst unmittelbar vor dem Auftragen auf die Wundfläche miteinander vermischt werden. Dann findet genau wie in den letzten Stufen der Blutgerinnung folgender Prozess statt: Thrombin setzt das Fibrinogen in Fibrinmonomere um, die sich dann quervernetzen und einen stabilen Gerinnungsthrombus ausbilden (MOSESSON 1990). Hier spielt Faktor XIII eine wichtige Rolle. Auch er wird von Thrombin aktiviert, unterstützt die Quervernetzung der Fibrinmonomere (PISANO et al. 1968) und stimuliert die Adhäsion von Fibroblasten für die vollständige Wundheilung (CORBETT et al. 1997) (Abbildung 1).
Abbildung 1: Wirkungsweise Fibrinkleber aus (ACHNECK et al. 2010) © mit freundlicher Genehmigung von Wolters Kluwer Health
Die Substanz Fibrin und ihre Wirkung wurde im 19. Jahrhundert entdeckt (BERGEL 1909). 1940 wurde der erste biologische Kleber auf Basis von bovinem Thrombin und Plasma-Fibrinogen produziert. Damals waren die Methoden zur Fibrinogen- Isolation noch nicht ausreichend, so dass nur geringe Konzentrationen von Fibrinogen erreicht wurden. Dieser Kleber stellte sich als nicht ausreichend wirksam dar.
In den 70ern wurden die ersten Fibrinkleber in Europa kommerziell erhältlich.
Mittlerweile ist das Verfahren zur Isolation verbessert worden und es gibt Kleber mit ausreichend hoher Fibrinogenkonzentration. In den USA wurde der Klebstoff erst 1998 als Tisseel® auf den Markt gebracht (ERDOGAN und VAN GULIK 2008).
Die größten Unterschiede bei Fibrinklebern entstehen durch die unterschiedliche Herstellung, die Virusinaktivierung (Pasteurisation, Lypophilisierung und Erhitzung, Gewinnung aus Kryoprecipitaten mit anschließender Behandlung mit Lösungsmitteln
(Gehalt von großen glycosilierten Proteinen wie Fibronectin und von Willebrand Faktor) (RADOSEVICH et al. 1997). Außerdem werden teilweise Antifibrinolytika wie Aprotinin und Tranexamsäure zugesetzt. Eine in vitro Studie zeigte, dass die Bindungskraft des Klebers an die Wundfläche von der Fibrinogenkonzentration und der Menge von Faktor XIII abhängt (DICKNEITE et al. 2003).
Anfangs wurde häufig bovines Thrombin für den Kleber verwendet, das jedoch weitestgehend durch humanes Thrombin ersetzt wurde, da es zur Immunreaktion gegen bovines Thrombin kommen kann (ORTEL et al. 1994; LAWSON et al. 2005).
Eine weitere Problematik ist die mögliche Übertragung von Viren (SPOTNITZ 2012) wie HIV, Hepatitis B und C Virus, Parvovirus B19 (HINO et al. 2000; KAWAMURA et al. 2002) oder Prionen, die sich als Creutzfeld-Jacob-Erkrankung im Menschen manifestiert (DANNER 1993; DI MARTINO 1993; HENDERSON et al. 2010). Neuere Studien zeigen jedoch, dass durch stets weiterentwickelte Methoden der Virusinaktivierung die Wahrscheinlichkeit einer Pathogenübertragung als sehr gering einzustufen ist, wobei die größte Übertragungswahrscheinlichkeit bei Parvoviren besteht (HOROWITZ und BUSCH 2008). Um dieses Problem zu umgehen, wurden auch Klebersysteme entwickelt, bei denen körpereigenes Fibrinogen aus einer Eigenblutspende verwendet wird (DAVIDSON et al. 2000).
Fibrin kann als Spray, Kleber oder in Kombination mit einem Kollagen-Patch appliziert werden (NUR et al. 2005).
Fibrinkleber stellt sich wegen seiner Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit innerhalb weniger Wochen als topisches Hämostatikum, als Gewebekleber oder zum Wundverschluss als geeignetes Therapeutikum heraus. Darüber hinaus wird erforscht, inwieweit sich Fibrinkleber als Träger- oder Depotsubstanz für Medikamente (MORTON et al. 2009) oder als Matrix für Zellen im Rahmen des
„Tissue Engineering“ einsetzen lässt (CAKMAK et al. 2013).
2.3.1.9 Keratinkleber
Eine neue Methode, die erstmals in vivo am Leberresektionsmodell im Kaninchen getestet wurde, ist die Isolation von Keratin aus Menschenhaaren, das zu einem Hydrogel verarbeitet wird. Dieses Keratingel kann direkt auf die Wundfläche
aufgetragen werden. Das Gel absorbiert Flüssigkeit, so dass es zu einer Anhäufung von Gerinnungsfaktoren im Wundgebiet kommt, die dann die Gerinnung einleiten (ABOUSHWAREB et al. 2009).
2.3.1.10 Dihydroxyaceton (MPEG)
Als neue synthetische Klebersubstanz wurde ein Polymer aus Polycarbonaten eines Dihydroxyacetons und aus Methoxypolyethylen Glykol (MPEG) entwickelt. Das Polycarbonat ist ein Glucosemetabolit, das aufgrund seiner Unlöslichkeit in organischen Substanzen in MPEG inkorporiert wird, so dass sich bei Wasserkontakt ein Hydrogel ausbildet.
Dieser Kleber wurde bisher nur zur Prävention von postoperativen Serombildungen eingesetzt. Aufgrund seiner guten Verträglichkeit mit Weichteilgeweben wurde er auch in einer in vivo Studie am Leberresektionsmodell der Ratte getestet (HENDERSON et al. 2010).
2.3.1.11 Chitin (RDH) und Chitosan (HemCon)
Chitin und Chitosan, die deacetylierte Form von Chitin, sind Polysaccharide, die bei der Fermentation von Algen entstehen und Bestandteil des Skeletts von Arthropoden sind. Es wird angenommen, dass Chitin eine Vasokonstriktion induziert und Erythrozyten, Thrombozyten sowie Gerinnungsfaktoren mobilisiert (IKEDA et al.
2002).
Chitosan in der Form von HemCon als Kompresse scheint durch den mechanischen Wundverschluss zu wirken (ACHNECK et al. 2010). Außerdem hat Chitosan aufgrund des aziden pH-Wertes eine natürliche antimikrobielle Wirkung (TSAI und SU 1999; RABEA et al. 2003; ACHNECK et al. 2010).
Chitosan wird besonders vom US-Militär in Kriegseinsätzen verwendet, ist jedoch nicht zur Implantation zugelassen (ABOUSHWAREB et al. 2009). Es gibt verschiedene tierexperimentelle Studien an der Milz und an der Leber (ABOUSHWAREB et al. 2009), die jedoch unterschiedliche Ergebnisse liefern (ACHNECK et al. 2010).
2.3.1.12 Ankaferd Blood Stopper (ABS)
ABS ist ein Pflanzenextrakt, das seit Jahrzehnten in der Türkei traditionell zur Blutstillung eingesetzt wird. Es besteht aus getrockneten Blättern der Pflanzen Thymus vulgaris, Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum und aus Wurzeln von Urtica dioica. ABS bildet durch die Aggregation von Erythrozyten und Interaktionen zwischen ABS und Fibrinogen ein Proteinnetzwerk (GOKER et al.
2008) unabhängig von der klassischen Koagulationskaskade zur Hämostase (SATAR et al. 2013).
ABS ist in der Türkei in der Dentalchirurgie und zur Behandlung externer Blutungen zugelassen (KARAKAYA et al. 2009). In weiteren experimentellen Studien wird der Einsatz zur Hämostase von Leberblutungen überprüft (KARAKAYA et al. 2009;
KALAYCI et al. 2010; SATAR et al. 2013).
2.3.1.13 Polyurethan
In der vorliegenden Studie wurden drei Klebstoffe der Firma Bayer MaterialScience AG untersucht. Dies sind hydrophile Polyurethan-Prepolymere, die in Kontakt mit Wasser oder Gewebeflüssigkeit ein Hydrogel bilden. Wie beim Fibrinkleber handelt es sich auch hier um einen 2-Komponenten-Kleber. Komponente A ist ein trifunktionelles Polyetherprepolymer auf Basis von Hexamethylendiisocyanat (HDI), Komponente B besteht aus aminofunktionellen Asparginsäureestern. Die Substanzen sind getrennt voneinander in einem 2-Kammerdosiersystem untergebracht (Abbildung 2) und werden erst unmittelbar vor dem Auftragen auf die Wundfläche miteinander vermischt. Der Klebstoff hat eine klare Farbe und eine honigartige Viskosität.
Abbildung 2: Polyurethankleber
Die NCO-Gruppen des HDI reagieren mit den Aminogruppen der Asparaginsäure, was zu einer Vernetzung und somit zur Aushärtung des Klebstoffes innerhalb von 90 Sekunden führt. Dabei bildet der Klebstoff eine kovalente Bindung zum Gewebe aus.
Die drei synthetischen Kleber unterscheiden sich durch die Konzentration an Lactid- Gruppen im HDI-Prepolymer, deren Gehalt die Bioabbaubarkeit des Klebers beeinflusst.
Die hämostatische Wirkung erfolgt durch das Anhaften von Faktor XII am aufgetragenen Kleber, wodurch Thrombozyten adhärieren sowie aktiviert werden und somit die Koagulationskaskade eingeleitet wird (GORBET und SEFTON 2004;
BROEKEMA et al. 2013). Außerdem bildet der ausgehärtete Kleber einen mechanischen Wundverschluss.
Bisher wurde Polyurethan-Schaum zur Blutstillung nach Zahnextraktionen verwendet
2.4 Anatomie der Leber
2.4.1 Makroskopische Anatomie der Rattenleber
Die Rattenleber ist die größte Drüse des Körpers und liegt im intrathorakalen Abschnitt der Bauchhöhle. Sie ist von Peritoneum überzogen, das von subserösem Bindegewebe, der Glisson-Kapsel, unterlagert wird. In Form von Septen zieht das Bindegewebe ins Leberparenchym ein. Neben ihrer zentralen Rolle bei der gastrointestinalen Verdauung erfüllt sie darüber hinaus weitere Funktionen wie die Entgiftung des Blutes, ist Speicherorgan für Glykogen, Wärmequelle und Ort der Hämatopoese im Jungtier.
Die Leber weist zwei Flächen auf: Die Facies diaphragmatica liegt direkt dem Zwerchfell an, die Facies visceralis ist den Eingeweiden zugewandt. Ebenso lassen sich zwei Leberränder unterscheiden: Der Margo acutus stellt den ventrolateralen Rand, der Margo obtusus die dorsale Begrenzung der Leber dar (KÖNIG und LIEBICH 2002).
Die vorliegende Arbeit folgt der von MARTINS und NEUHAUS (2007) beschriebenen Nomenklatur der Rattenleber. Im Gegensatz zum Menschen, wo die Lebermasse 2,5
% des Körpergewichts beträgt, sind dies bei der Ratte 5 %. Außerdem besitzt die Ratte keine Gallenblase. Die anatomische Gliederung der Rattenleber erfolgt jedoch wie beim Menschen anhand der portalen Aufzweigung (Abbildung 3). Demnach können vier Leberlappen mit unterschiedlichen Volumina benannt werden, die sich teilweise durch Fissuren weiter unterteilen:
1) Lobus medianus (38% der gesamten Lebermasse)
Lobus dexter medianus
Lobus sinister medianus 2) Lobus sinister lateralis (30%) 3) Lobus dexter (22%)
Lobus dexter posterior
Lobus dexter inferior
4) Lobus caudatus (10%)
Processus caudatus
Spiegel Lobus
Lobus caudatus anterior
Lobus caudatus posterior
Leberbänder
Die Leber ist durch fünf Bänder in der Ratte fixiert:
Ligamentum falciforme
Dieses Band stellt sich als Peritonealfalte dar, die das Diaphragma mit dem posterioren Anteil der Leber verbindet.
Ligamentum coronare
Dieses Band ist zweischichtig, mit einem Ursprung ventral und lateral am Austritt der V. cava caudalis. Es zieht ebenfalls zum Zwerchfell.
Ligamentum triangulare dexter und sinister
Das rechte Band zieht vom Lobus superior dexter zum Diaphragma, das linke hingegen vom Lobus sinsister posterior ausgehend.
Ligamentum teres hepatis
Dieses Band führt die obliterierte Umbilicalvene in sich und verbindet den Nabel mit der Facies visceralis der Leber.
Außerdem verbindet das Ligamentum hepatoduodenale den Lobus caudatus mit dem Duodenum sowie das Ligamentum hepatogastricum diesen Lobus mit dem Magen.
Abbildung 3: Gefäß-und Gallengangssystem aus (MARTINS und NEUHAUS 2007) hepatic veins (A), portal vein (B) and biliary system (C) of the rat
mit freundlicher Genehmigung von John Wiley and Sons © 2007
CP, caudate process; AC, anterior caudate lobe: PC, posterior caudate lobe; SRL, superior right lateral lobe;
IRL, inferior right lateral lobe; ML, median lobe; RML, right portion of the medial lobe; LML, left portion of the medial lobe; LLL, left lateral lobe; MF, median fissure; LF, left fissure; RF, right fissure and FL, falciform ligament; PV, portal vein and IVC, inferior vena cava.
Gefäßsystem
Das Gefäßsystem der Leber besteht aus den drei Hauptästen A. hepatica, V. porta und V. cava caudalis. Zuführend bringt die A. hepatica propria als nutritives Gefäß sauerstoffreiches Blut. Diese entspringt in einer Aufgabelung neben der A.
gastroduodenale der A. hepatica communis. Die A. hepatica propria verläuft parallel zur V. porta teilt sich unmittelbar vor dem Leberhilus in einen linken und rechten Gefäßast und tritt dann ins Leberparenchym ein.
Die arteriellen Äste verlaufen zwischen der Vorderseite der V. porta und den Gallengängen. In ihrer weiteren Aufzweigung folgen sie der V. porta in die jeweiligen Lobi. Der dorsomediale Teil des Lobus sinister lateralis kann außerdem zusätzlich von einer akzessorischen A. hepatica sinister, einer Abspaltung der A. gastrica versorgt werden.
Das funktionale Gefäß stellt die V. porta dar, die das Blut der unpaaren Organe aus der Bauchhöhle zuführt. Sie entsteht aus dem Zusammenschluss der V. mesenterica superior, der V. gastrolienale und der V. gastroduodenalis. Nach ihrem Eintritt am Leberhilus verzweigt sie sich in drei Hauptäste, die in ihrer weiteren Unterteilung alle Bezirke versorgen.
Die am Leberhilus eintretenden Gefäße verzweigen sich in die Aa. und Vv.
interlobulares und treten als Kapillare schließlich ins Leberläppchen über. Dort vereinigen sie sich zu Sinuskapillaren und führen ab hier arteriovenöses Mischblut.
Nach dem Fluss an den Leberzellplatten vorbei sammelt sich das Blut in der V.
centralis. Mehrere dieser Äste vereinigen sich im Leberparenchym zu den Vv.
hepaticae und treten vereint in der V. cava caudalis, dem dritten Hauptast des Gefäßsystems, an der Facies diaphragmatica aus der Leber aus.
2.4.2 Histologische Anatomie der Leber
Die Leber ist ein parenchymatöses Bauchorgan, das von der Glisson-Kapsel umhüllt wird. Dieser schließt sich auf der Außenseite das Peritonealepithel an.
Es gibt verschiedene Einteilungen, um den Aufbau der Leber darzustellen. Das klassische Leberläppchen besteht aus den Leberzellbalken, die sich radiär um die V.
centralis anordnen. Zwischen den Balken befinden sich die Sinusoide, die arteriovenöses Mischblut aus den Aa. und Vv. interlobulares der A. hepatica und V.
porta den Hepatozyten zuleiten. Mit ihrem Blutpol grenzen die Hepatozyten an die Sinusoide, mit ihrer anderen Seite, dem Gallenpol, an die Gallekanälchen. Diese führen die Galle in entgegengesetzter Richtung zum Blutstrom über Hering- Kanälchen in die Gallengänge ab.
Zwischen den Sinusoiden und den Hepatozyten befindet sich der Disse-Raum. Er enthält Bindegewebe vom Kollagenfaser-Typ-III und dient dem intensiven Stoffaustausch. Außerdem ist hier ein weiterer Zelltyp, die hepatische Sternzelle, auch perisinusoidale Ito-Zelle genannt, zu finden. Diese erfüllt unterschiedliche Funktionen und kann unter pathologischen Bedingungen Kollagen Typ I bilden.
Dadurch wird der Stoffwechsel erschwert und eine Fibrose kann entstehen.
Auch die von Kupffer-Sternzelle ist eine funktionale Zelle, die neben den Endothelzellen die Wand der Sinusoide bildet. Sie gehört zur Gruppe der Makrophagen, nimmt partikuläre Substanzen aus dem Blut auf und baut diese ab.
Eine weitere Baueinheit ist das Periportalfeld. Es ummantelt in lockerem Bindegewebe A. und V. interlobularis, einen Gallengang, ein Lymphgefäß sowie
kleine Stränge sympathischer und parasympathischer Nervenfasern. Ein Periportalfeld liegt in der Mitte von drei aufeinandertreffenden Zentralvenenläppchen.
Daraus ergibt sich die zweite Einteilungsmöglichkeit der Leber in Portalvenenläppchen. Dieses beherbergt in seinem Zentrum das Periportalfeld, seine Außenkanten werden durch die Verbindung der V. centralis der drei angrenzenden Zentralvenenläppchen gebildet.
Die dritte Gliederungsmöglichkeit ist der Leberazinus mit seinen drei Zonen.
Er ist in zwei Zentralvenenläppchen mit zugehörigen Portalfeldern abzugrenzen. Die Außenkanten werden in jedem Zentralvenenläppchen durch die Verbindung der V.
centralis mit den benachbarten Periportalfeldern gebildet. Diese V-Form ergibt mit der des zweiten Läppchens die typische rhomboide Gestalt. Die funktionale Aufteilung in drei Zonen zeigt in der spindelförmigen zentralen Zone einen hohen Sauerstoff- und Nährstoffgehalt an, der über die intermediäre und periphere Zone auf die Werte einer Vene abnimmt (WELSCH 2003).
2.5 Leber-Resektionsmodell
Viele experimentelle in vivo Studien zu topischen Hämostatika sind am Leberresektionsmodell der Ratte durchgeführt worden. Zum einen ist die Ratte vielerorts als Labortier etabliert, zum anderen stellt sich die Größe der Rattenleber als praktikabel zur Testung von hämostatischen Agenzien dar.
Weitere Leberresektionsmodelle zur Testung hämostatischer Agenzien wurden am Kaninchen (DICKNEITE et al. 2003; NUR et al. 2005; ABOUSHWAREB et al. 2009), im Schwein (WALTHER et al. 1999; DAVIDSON et al. 2000; TAKACS et al. 2010) und Hund (PEPER et al. 1986; KRAM et al. 1988; LACAZE et al. 2012) durchgeführt.
Eine Leberverletzung stellt aufgrund der starken Blutungsneigung der Leber einen
„worst case“ dar, so dass hier die Effektivität des Hämostatikums optimal getestet werden kann. Je nach Größe des resezierten Leberstückes kommt es zu einer starken bis letalen Blutung.
Während in Studien zur Leberregeneration ganze Leberlappen anatomisch reseziert werden, erfolgt zur Testung von Hämostatika eine partiale nicht-anatomische Resektion eines Leberlappens, um eine möglichst große Wundfläche zu erzeugen.
Es gibt kein allgemeingültiges standardisiertes Leberresektionsmodell an der Ratte.
Je nach Fragestellung der Studie, ob der Versuch chronisch oder akut verlaufen soll, ob nur die direkten hämostatischen Parameter gemessen werden oder auch Fragen zur Absorption des Hämostatikums beantwortet werden sollen, werden unterschiedliche Teile der Leber reseziert.
MATSUOKA et al. (1995) etablierten ein standardisiertes Leberresektionsmodell mit unkontrollierbarer Blutung für den Akutversuch. Dabei wurden 65 % des medianen und des linken lateralen Leberlappens scharf reseziert.
HOLCOMB et al. (2000) modifizierten für ihre Akut-Studie das Modell nach Matsuoka (MATSUOKA et al. 1995). Dazu wurden mit einem Stift drei Bereiche (lateral, medial und in der Mittellinie) am medianen Leberlappen markiert. Der Bereich des medianen Leberlappens distal der Markierungen wurde scharf reseziert und hatte eine Größe von ca. 30 x 5 mm. Die gleiche modifizierte Technik verwendeten auch KARAKAYA et al. (2009) für einen chronischen Versuch. Dort mussten jedoch 8 von 39 Ratten aus der Studie ausgeschlossen werden, weil das resezierte Stück entweder zu klein oder zu groß war, was in einer zu geringen oder so starken Blutung resultierte, die unmittelbar zum Tod des Tieres führte.
Eine weitere Technik für chronische Studien ist die Keilresektion. Dabei wird im linken Leberlappen ein Dreieck mit der Seitenlänge von 1 cm reseziert, was ca. 4 % des gesamten Lebergewichtes entspricht (TOVAR et al. 1998; DEMIREL et al. 2008;
KALAYCI et al. 2010).
ZOUCAS et al. (1984) resezierten in ihrer Studie ein standardisiertes Stück des linken lateralen Leberlappens, was 2,2 bis 2,7 % des Lebergesamtgewichtes entsprach.
HENDERSON et al. (2010) nutzten eine modifizierte Version von Murakami (MURAKAMI et al. 2008), bei dem ein standardisiertes Stück des linken lateralen Leberlappens reseziert wurde, was 15 – 20 % der gesamten Lebermasse entspricht.
Diese Menge resezierten auch AYSAN et al. (2010) indem sie entlang der längsten transversen Linie des linken Leberlappens 1 bis 2 g abtrennten.
Aufgrund der Erfahrungen vorausgegangener Versuche in unserem Institut und der Anforderung an das Modell, eine schwere Blutung zu induzieren, die das Tier jedoch möglichst überleben sollte, um spätere Aussagen über die Abbaubarkeit des Klebstoffes treffen zu können, wurde in Anlehnung an HENDERSON et al. (2010) und AYSAN et al. (2010) eine 15 % Leberresektion ausgewählt.
3 Material und Methoden
3.1 Material3.1.1 Versuchstiere
Für alle Versuche wurden männliche Wistarratten Crl:Wi(Han) von Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland) verwendet. Nach Anlieferung hatten die Tiere mindestens 7 Tage bis zum Versuchsbeginn Zeit, um sich einzugewöhnen. Zum Operationszeitpunkt waren die Ratten 7 bis 9 Wochen alt und hatten ein Körpergewicht von 200 g bis 260 g. Die Haltung und alle Versuche erfolgten im Institut für Versuchstierkunde sowie Zentrallaboratorium für Versuchstiere der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen. Die Haltung erfolgte unter SPF (Spezifiziert Pathogen Freien) Bedingungen gemäß den FELASA-Empfehlungen.
Die Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 1°C und einer relativen Luftfeuchte von 55 ± 10%
gehalten.
Dabei waren jeweils fünf Tiere in einem Polysulfon Typ 2000 Käfig der Firma Tecniplast (Hohenpeißenberg, Deutschland), auf Lignocel-Einstreu von J.Rettenmaier & Söhne GmbH (Rosenberg, Deutschland) untergebracht. Die Tiere hatten Zugang zu Wasser und pelletiertem Futter (ssniff Ratte/Maus Standardfutter – H, autoklavierbar, Sniff Spezialitäten GmbH, Soest, Deutschland) ad libitum. Der Lichtzyklus im Tierraum umfasste je eine 12 stündige Hell- und Dunkelphase (7 bis 19 Uhr Hellphase; 19 bis 7 Uhr Dunkelphase).
Alle Versuche wurden nach Genehmigung durch das Landesamt für Natur Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein Westfalen (LANUV) mit dem Aktenzeichen: 84- 02.05.20.11.171 durchgeführt.
3.1.2 Klebstoffe
Es gab zwei Arten zu testende Klebstoffe. Zum einen 3 synthetische Klebstoffe (K1,
thermoplastischem Polyurethan, im Zweikomponenten System, das direkt einsatzbereit war und bei 22°C gelagert werden konnte. Auf die Doppelkammerspritze wurde unmittelbar vor Benutzung eine Düse aufgesetzt, die die beiden Substanzen vor dem Auftragen miteinander vermischte.
Zum anderen wurde der biologische Fibrinkleber (Beriplast® P, Combi-Set 1 ml, CSL Behring GmbH, Marburg, Deutschland) auf Fibrinogen- und Thrombinbasis getestet.
Der Fibrinkleber musste bei + 2 bis + 8°C gelagert werden und wurde als Combi-Set in seinen Einzelsubstanzen geliefert. Vor Benutzung musste er auf 22°C erwärmt werden und die Einzelsubstanzen gemäß Gebrauchsinformation im zugehörigen Lösungsmittel gelöst werden. Dies dauerte 5 bis 10 min und es stellte sich je eine klare Lösung dar, die mit der jeweiligen Spritze aufgezogen wurde. Beide Spritzen wurden im beigefügten Applikationsbesteck eingerastet und mit dem Spritzenstempel arretiert, um den gleichen Vorschub beider Substanzen zu gewährleisten. Wie bei den synthetischen Klebern wurde eine Mischdüse aufgesteckt, die Fibrinogen und Thrombin unmittelbar vor dem Auftragen miteinander vermischte.
Bei allen Klebern wurde pro Auftragen eine neue Mischdüse verwendet, da der Kleber darin unmittelbar nach dem Vermischen aushärtete oder gerann.
3.2 Methodik und Modelle 3.2.1 Versuchsaufbau und -ablauf
Die Studie umfasst die unten tabellarisch aufgeführten Versuchsgruppen:
Tabelle 1: Anzahl der operierten Tiere pro Gruppe (n)
Überlebenszeitpunkt
Testagens Polyurethankleber
Fibrinkleber NaCl
K1 K2 K3
14 Tage n = 10 n = 0 n = 10 n = 7 n = 7
21 Tage n = 10 n = 6 n = 10 n = 6 n = 7
90 Tage n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 n = 6
gesamt n = 30 n = 16 n = 30 n = 23 n = 20
Pro Kleber und Zeitpunkt waren je 10 Ratten genehmigt, außer für die Gruppen des K2-Klebers mit 14 und 21 Tagen Überlebenszeit. Die Anzahl der operierten Tiere wurde so gewählt, dass später pro Gruppe mindestens 6 bis 8 Tiere überlebten und ausgewertet werden konnten. Für die NaCl-Gruppe wurde aus Tierschutzgründen die Anzahl auf 5 auswertbare Tiere pro Zeitpunkt reduziert.
Für die Gruppen K2 mit 14 und 21 Tagen Überlebenszeit waren keine Tiere genehmigt, da der K2-Klebstoff bereits in den Versuchen mit dem AZ: 8.87- 50.10.45.09.184 und AZ: 8.87-50.10.35.08.105 zu diesen Überlebenszeitpunkten erfolgreich getestet worden war. Es wurden jedoch 6 Tiere für die K2 21 Tage Gruppe nachgenehmigt, da für die hier vorliegende Studie Tiere mit dem K2-Kleber bis 21 d post op im µCT untersucht werden sollten. Tiere der K2 90 Tage Gruppe waren noch nicht untersucht worden, so dass im hier vorliegenden Versuchsvorhaben erstmalig das Langzeit-Abbauverhalten in vivo getestet wurde.
Zunächst wurden die Tiere mit 90 Tagen Überlebenszeit operiert. Darauf folgten die Ratten der Gruppen 14 und 21 Tage.
Versuchsablauf
Am Operationstag (d 0) wurde die Ratte narkotisiert (siehe 3.2.2), das Gewicht der Ratte mit der Wage 440-51 N (Kern&Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) bestimmt und die Ratte zur Operation vorbereitet (siehe 3.2.3).
Nach der Laparotomie wurde Blut zur Basiswert-Bestimmung des kleinen Blutbildes und der Leberenzyme aus der Vena cava abdominalis gewonnen. Dann erfolgte die Leberresektion und der zu testende Wundkleber oder NaCl als Kontrolle wurde aufgetragen. Blutungsmenge, Blutungszeit und das Gewicht des resezierten Leberstückes wurden bestimmt.
Je nach Überlebenszeitpunkt wurde die Ratte 14, 21 oder 90 Tage postoperativ euthanasiert (siehe 3.2.4.2). Dazu wurde sie erneut gewogen, narkotisiert und laparotomiert. Es erfolgte wieder eine Blutentnahme aus der Vena cava abdominalis, um ebenfalls ein kleines Blutbild zu erstellen und die Leberenzyme zu messen.
Eventuell vorliegende Adhäsionen zwischen reseziertem Leberlappen und anderen
abdominalen Strukturen wurden beurteilt. Danach wurde die Leber zur weiteren histologischen Untersuchung entnommen.
Zusätzlich wurden jeweils 5 Tiere der Klebergruppe K1, K2, K3 mit 21 Tagen Überlebenszeit 1, 7, 14 und 21 Tage postoperativ im Micro-Computer-Tomographen (µCT) untersucht (siehe 3.2.5.10).
Klebung mit
• K1
• K2
• K3
• Fibrinkleber
• NaCl
Leberresektion
Finale mit Leberentnahme
14d 21d 90d
Kleberabbau im µCT
• Körpergewicht
• Kleines Blutbild
• Leberenzyme
• Blutungszeit
• Blutungsmenge
• Gewicht Leberresektat
• Körpergewicht
• Kleines Blutbild
• Leberenzyme
• Adhäsionen an Resektionsfläche
• Gewicht Leber
Abbildung 4: Versuchsablauf
3.2.2 Narkose
Zur Einleitung der Narkose wurde die Ratte zunächst in eine durchsichtige Plexiglasbox der Größe 18 x 8,5 x 9,5 cm (Eickemeyer Medizintechnik für Tierärzte KG, Tuttlingen, Deutschland) gesetzt und mit einer Flussrate von 4 l/min und 5 Vol.
% Isofluran (Forene 100%, Abbott, Baar, Schweiz) angeflutet. Nach Verlust der Stellreflexe und des Bewusstseins wurde die Ratte vor eine Inhalationsmaske umgesetzt. Hier erhielt sie zur Aufrechterhaltung der Narkose über das
halbgeschlossene Kreissystem IsoFlo (Eickemeyer, Tuttlingen, Deutschland) ein Isofluran-Sauerstoff-Gemisch (2 Vol. %, 1 l/min). Zur analgetischen Versorgung erhielt die Ratte 0,1 mg/kg KGW Buprenorphin s.c. (Temgesic®, essex pharma GmbH, München, Deutschland). Die Occuli bulbi wurden mit Bepanthen®
Augensalbe (Bayer, Leverkusen, Deutschland) benetzt, um ein Austrocknen der Cornea zu verhindern.
Zur perioperativen Prophylaxe erhielt die Ratte eine s.c Injektion des Breitbandantibiotikums Cefuroxim (Fresenius SE & Co. KGaA, Bad Homburg, Deutschland) in der Dosierung von 16 mg/kg KGW.
3.2.3 Lagerung und Vorbereitung zur Operation
Während des chirurgischen Eingriffes wurde die Ratte auf einer Wärmematte gelagert, damit das Tier anästhesiebedingt nicht auskühlte.
Zunächst wurde das Operationsfeld mit dem Schergerät Wahl® Super Trim (Harotec, Berlin, Deutschland) rasiert und mit Betaisodonalösung® (Mundipharma GmbH, Limburg a.d. Lahn, Deutschland) desinfiziert. Nach Verlust des Zwischenzehenreflexes und Erreichen der chirurgischen Toleranz wurde mit der jeweiligen chirurgischen Maßnahme begonnen.
3.2.4 Operationsmethoden 3.2.4.1 Leberresektion
Als erstes erfolgte die Längslaparotomie vom kranialen Beckenrand bis zum Sternum. Dazu wurde mit einer geraden Schere die Haut durchtrennt. Anschließend wurde die abdominale Muskulatur und das Peritoneum eröffnet.
Das Wundgebiet wurde mit 4 Magnetwundhaken (F.S.T.® 18200-12, stainless, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland) offengehalten.
Zunächst wurde der Darmtrakt mit seinen anhaftenden Strukturen mobilisiert und in einer feuchten Mullkompresse (Fuhrmann GmbH, Much, Deutschland) auf die linke Körperseite des Tieres ausgelagert, um die Vena cava abdominalis auf einem Stück von 2 cm interrenal darzustellen.
Mit einer 27 G Kanüle (BD Microlance TM, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland)auf einer 2 ml Spritze (Terumo, Leuven, Belgien) wurde die Vena cava abdominalis punktiert und 1 ml Blut entnommen.
100 µl davon wurden in ein 2 ml EDTA-Röhrchen (Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt zur Bestimmung des kleinen Blutbildes. Das restliche Vollblut wurde in ein 1,5 ml Serumröhrchen (Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach 30 min Gerinnungszeit wurde das Serum bei 4°C für 10 min bei 7500 U/min in der Zentrifuge Mikro 200R (Hettich GmbH, Mülheim a.d. Ruhr, Deutschland) abzentrifugiert und zur späteren Enzymdiagnostik gewonnen. Die ausgelagerten Teile des Darmtraktes wurden zurückverlagert.
Nun wurde die Leber mobilisiert und die Basis des linken Leberlappens mit einem polyfilen USP3-0 Faden (Dexon 3/0 B. Braun, Spangenberg, Deutschland) umschlungen und komprimiert, um eine zu starke Blutung aus offenen Lebervenen bei der Resektion des Leberlappens zu unterbinden.
Der linke laterale Leberlappen wurde auf eine 10 x 10 cm große Mullkompresse (Fuhrmann GmbH, Much, Deutschland) aufgelagert. Dann wurde eine 5 x 5 cm große Kompresse (Fuhrmann GmbH, Much, Deutschland) kranial zwischen Brustwand, Sternum und Leber eingebracht.
Abbildung 5: Lagerungstechnik aller Tiere mit Finalzeitpunkt 90 d
Um eine direkte Verklebung der Resektionsfläche mit der Kompresse zu vermeiden, wurden zwei Wattestäbchen (NOBA Verbandmittel Danz, Wetter, Deutschland) kranial der Resektionslinie zwischen linken lateralen Leberlappen und die große Mullkompresse gelegt (Abbildung 5). Die bis hier beschriebene Vorgehensweise zur Lagerung der Leber wurde bei allen Tieren mit 90 d Überlebenszeit angewendet.
Da mit dieser Technik der K1 und K3-Kleber oft beim Entfernen der Mullkompressen daran haften blieben und sich von der Resektionsfläche ablösten, wurde die Technik für die Tiere mit 14 und 21 d Überlebenszeit geringgradig modifiziert.
Bei ihnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die Leber wurde mobilisiert und das Ligamentum hepatogastricum durchtrennt.
Der in den linken lateralen Leberlappen eintretende Gefäßast wurde mit einem polyfilen USP3-0 Faden umschlungen und komprimiert (Abbildung 6), um eine starke Blutung bei der Resektion des Leberlappens zu unterbinden. Andernfalls würde der Kleber sofort von der Wundfläche weggespült werden.
Abbildung 6: Anlegen der Stauschlinge
Der linke laterale Leberlappen wurde auf eine große Mullkompresse aufgelagert.
Eine kleine Kompresse wurde zwischen Brustwand und Leber eingebracht. Um ein Zurückrutschen des linken Leberlappens nach Resektion zu verhindern, wurde außerdem ein Zahntupfer (Celluron®, Hartmann, Heidenheim, Deutschland) senkrecht auf der linken Körperseite zwischen Leberbasis und Diaphragma eingebracht.
Als abschließender Schritt wurde eine Schicht Parafilm (Pechiney Plastic Packaging, Menasha, USA) zwischen Mullkompresse und linken Leberlappen gelegt, um das Anhaften des Klebers an den Mullkompressen zu verhindern (Abbildung 7).
Abbildung 7: Lagerungstechnik aller Tiere mit Finalzeitpunkt 14 & 21 d
Der nächste Schritt war die 15 % Leberresektion, die wie alle weiteren nun folgenden Schritte in allen Gruppen gleich war.
Mit einer geraden Schere (Aesculap® BC324R, stainless, Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland) wurde ca. die Hälfte des linken Leberlappens abgetrennt, was einem Resektatgewicht von ca. 1,5 g entsprach. Der Schnitt erfolgte senkrecht zur Facies diaphragmatica und parallel zum Margo inferior. Zur Orientierung der Schnittführung dienten hier die anatomischen Inzisionen im unteren Drittel des Lobus sinister lateralis am Margo lateralis.
Unmittelbar nach der Resektion wurde die Wundfläche mit dem zu testenden Kleber benetzt. Als Klebstoff wurde entweder einer der synthetischen Kleber K1, K2, K3 (Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Deutschland) oder Fibrinkleber (Beriplast®
P, Combi-Set 1 ml, CSL Behring GmbH, Marburg, Deutschland) oder NaCl (B.
Braun, Melsungen, Deutschland) als Kontrollsubstanz verwendet. Direkt danach wurde die Schlinge um die Leberbasis gelöst. Mittels Stoppuhr wurde die Blutungszeit (siehe 3.2.5.1) bestimmt.
Abbildung 8: Zustand 2 min und 10 min nach Klebung
Das Tier wurde 10 min ab Auftragen des Klebers beobachtet. War dann keine Blutung mehr erkennbar, wurden die Kompressen, der Parafilm und die Schlinge vollständig entfernt. Dann wurde das Tier für weitere 20 min nachbeobachtet.
Sollte sich die Klebeschicht bei Entfernen der Kompressen von der Leberwundfläche ablösen, wurde eine neue Klebeschicht aufgetragen, wenn an der Resektionsfläche Nachblutungen erkennbar waren. War der Kleber lediglich abgelöst, lag jedoch ohne Nachblutungen der Resektionsfläche an, wurde der Zustand so belassen.
Nach der Gesamtbeobachtungszeit von 30 min ab erfolgreicher Klebung erfolgte eine Volumensubstitution von 2 ml körperwarmem NaCl (B. Braun, Melsungen, Deutschland) i.p. und der zweischichtige Wundverschluss. Dazu wurde die Peritoneal- und Muskelschicht fortlaufend, die Haut hingegen in Einzelhefttechnik mit resorbierbarem Nahtmaterial Vicryl USP 4-0 (Ethicon, Johnson&Johnson, St.
Stevens, Belgien) verschlossen.
Das resezierte Leberstück wurde auf der Waage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) gewogen. Die Blutungsmenge wurde aus dem aktuellen Gewicht der Kompressen abzüglich des Gewichts der vor der OP gewogenen
Bis zum vollständigen Erwachen wurde die Ratte vor einer Rotlichtlampe (Petra Electric GmbH, Geislingen/Steige, Deutschland) gewärmt. Danach wurde sie in den Käfig zu den anderen Tieren zurückgesetzt.
Das Tier wurde an den drei darauffolgenden Tagen adspeziert und erhielt täglich eine Schmerzmedikation mit 5 mg/kg KGW Carprofen s.c. (Rimadyl®, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, Deutschland).
3.2.4.2 Leberentnahme
Am Finaltag wurde die Ratte wie bereits beschrieben (siehe 3.2.2) erneut narkotisiert.
Es erfolgte eine Längslaparotomie mit seitlichen Einschnitten kaudal des Rippenbogens.
Zunächst erfolgte die Bewertung wie viel % der Resektionsfläche mit abdominalen Strukturen verwachsen waren. Außerdem wurde erfasst, welche Organe und Strukturen an der Adhäsion beteiligt waren. Desweiteren erfolgte eine prozentuale makroskopische Mengenbeurteilung der gegebenenfalls noch vorhandenen Klebstoffreste.
Dann wurde der Darmtrakt mit seinen anhaftenden Strukturen mobilisiert und in einer feuchten großen Mullkompresse auf die linke Körperseite ausgelagert. Nun wurde die Vena cava abdominalis auf einem Stück von 2 cm interrenal dargestellt und ein 14 G Katheter (Braunüle®, B. Braun, Melsungen, Deutschland) eingeführt. Hierüber wurden 5 ml Blut entnommen. 100 µl wurden zur Erstellung des kleinen Blutbildes benötigt. Der Rest wurde zur späteren Leberenzymmessung in Serumröhrchen überführt.
Die Leber wurde von adhäsiven Strukturen befreit. Dann wurde eine Klemme (Aesculap® BH109, stainless, Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland) auf die Vena porta gesetzt; distal der Klemme wurde die V. porta durchtrennt. Mittels der Klemme wurde die Leber angehoben und alle weiteren anhaftenden Strukturen wie V. cava abdominalis, Diaphragma und Ösophagus wurden mit einer geraden Schere
durchschnitten und die Leber entnommen. Die Ratte verstarb in Isoflurannarkose durch den starken Blutverlust und die Eröffnung des Diaphragmas.
Zunächst wurde das Gewicht der Leber mit der Wage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) bestimmt. Dann wurde der linke laterale Leberlappen senkrecht zur Resektionsfläche in 4 Segmente aufgeteilt. 2 Segmente wurden für spätere histologische Untersuchungen in 10 % Formaldehyd (Roti®-Histofix 10 %, Roth, Karlsruhe, Deutschland) überführt.
Die anderen 2 Segmente wurden in flüssigem Stickstoff bei -80°C kryokonserviert.
3.2.4.3 Leberperfusion
Zur Darstellung des Gefäßsystems, speziell im linken lateralen Leberlappen nach Resektion, wurde bei den Tieren, die im Verlauf mittels dem µCT Tomoscope 30s Duo (CT Imaging GmbH, Erlangen, Deutschland) untersucht wurden, zusätzlich die Leber vor finaler Entnahme mit dem Kontrastmittel Imeron 400 MCT (Bracco Altana Pharma GmbH, Konstanz, Deutschland) perfundiert.
Dazu wurde das Tier wie bereits oben beschrieben erneut narkotisiert und mit seitlichen Einschnitten laparotomiert. Auch hier wurden Adhäsion und noch vorhandene Kleberreste bewertet.
Der Darmtrakt wurde mit seinen anhaftenden Strukturen mobilisiert und in einer großen feuchten Gaze auf die linke Seite des Tieres ausgelagert.
Nun wurde die Leber von ihren Ligamenten befreit. Als erstes wurde das Ligamentum falciforme durchtrennt. Dann wurde der linke laterale Leberlappen mit einer feuchten Gaze auf die rechte Körperseite geschoben, so dass sich das Ligamentum triangulare sinister spannte, um es anschließend leichter durchschneiden zu können. Das Ligamentum hepatogastricum wurde nach Anheben des linken lateralen Leberlappens ebenso scharf durchtrennt.
Nachfolgend wurde mit einer chirurgischen Pinzette der Magen an der großen Kurvatur gefasst, mit einer geraden Schere das Omentum minus eröffnet und der posteriore Anteil des Lobus caudatus von seinen ligamentösen Strukturen befreit und auf die Facies parietalis des Magens vorgelagert.
