Viele experimentelle in vivo Studien zu topischen Hämostatika sind am Leberresektionsmodell der Ratte durchgeführt worden. Zum einen ist die Ratte vielerorts als Labortier etabliert, zum anderen stellt sich die Größe der Rattenleber als praktikabel zur Testung von hämostatischen Agenzien dar.
Weitere Leberresektionsmodelle zur Testung hämostatischer Agenzien wurden am Kaninchen (DICKNEITE et al. 2003; NUR et al. 2005; ABOUSHWAREB et al. 2009), im Schwein (WALTHER et al. 1999; DAVIDSON et al. 2000; TAKACS et al. 2010) und Hund (PEPER et al. 1986; KRAM et al. 1988; LACAZE et al. 2012) durchgeführt.
Eine Leberverletzung stellt aufgrund der starken Blutungsneigung der Leber einen
„worst case“ dar, so dass hier die Effektivität des Hämostatikums optimal getestet werden kann. Je nach Größe des resezierten Leberstückes kommt es zu einer starken bis letalen Blutung.
Während in Studien zur Leberregeneration ganze Leberlappen anatomisch reseziert werden, erfolgt zur Testung von Hämostatika eine partiale nicht-anatomische Resektion eines Leberlappens, um eine möglichst große Wundfläche zu erzeugen.
Es gibt kein allgemeingültiges standardisiertes Leberresektionsmodell an der Ratte.
Je nach Fragestellung der Studie, ob der Versuch chronisch oder akut verlaufen soll, ob nur die direkten hämostatischen Parameter gemessen werden oder auch Fragen zur Absorption des Hämostatikums beantwortet werden sollen, werden unterschiedliche Teile der Leber reseziert.
MATSUOKA et al. (1995) etablierten ein standardisiertes Leberresektionsmodell mit unkontrollierbarer Blutung für den Akutversuch. Dabei wurden 65 % des medianen und des linken lateralen Leberlappens scharf reseziert.
HOLCOMB et al. (2000) modifizierten für ihre Akut-Studie das Modell nach Matsuoka (MATSUOKA et al. 1995). Dazu wurden mit einem Stift drei Bereiche (lateral, medial und in der Mittellinie) am medianen Leberlappen markiert. Der Bereich des medianen Leberlappens distal der Markierungen wurde scharf reseziert und hatte eine Größe von ca. 30 x 5 mm. Die gleiche modifizierte Technik verwendeten auch KARAKAYA et al. (2009) für einen chronischen Versuch. Dort mussten jedoch 8 von 39 Ratten aus der Studie ausgeschlossen werden, weil das resezierte Stück entweder zu klein oder zu groß war, was in einer zu geringen oder so starken Blutung resultierte, die unmittelbar zum Tod des Tieres führte.
Eine weitere Technik für chronische Studien ist die Keilresektion. Dabei wird im linken Leberlappen ein Dreieck mit der Seitenlänge von 1 cm reseziert, was ca. 4 % des gesamten Lebergewichtes entspricht (TOVAR et al. 1998; DEMIREL et al. 2008;
KALAYCI et al. 2010).
ZOUCAS et al. (1984) resezierten in ihrer Studie ein standardisiertes Stück des linken lateralen Leberlappens, was 2,2 bis 2,7 % des Lebergesamtgewichtes entsprach.
HENDERSON et al. (2010) nutzten eine modifizierte Version von Murakami (MURAKAMI et al. 2008), bei dem ein standardisiertes Stück des linken lateralen Leberlappens reseziert wurde, was 15 – 20 % der gesamten Lebermasse entspricht.
Diese Menge resezierten auch AYSAN et al. (2010) indem sie entlang der längsten transversen Linie des linken Leberlappens 1 bis 2 g abtrennten.
Aufgrund der Erfahrungen vorausgegangener Versuche in unserem Institut und der Anforderung an das Modell, eine schwere Blutung zu induzieren, die das Tier jedoch möglichst überleben sollte, um spätere Aussagen über die Abbaubarkeit des Klebstoffes treffen zu können, wurde in Anlehnung an HENDERSON et al. (2010) und AYSAN et al. (2010) eine 15 % Leberresektion ausgewählt.
3 Material und Methoden
3.1 Material3.1.1 Versuchstiere
Für alle Versuche wurden männliche Wistarratten Crl:Wi(Han) von Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland) verwendet. Nach Anlieferung hatten die Tiere mindestens 7 Tage bis zum Versuchsbeginn Zeit, um sich einzugewöhnen. Zum Operationszeitpunkt waren die Ratten 7 bis 9 Wochen alt und hatten ein Körpergewicht von 200 g bis 260 g. Die Haltung und alle Versuche erfolgten im Institut für Versuchstierkunde sowie Zentrallaboratorium für Versuchstiere der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen. Die Haltung erfolgte unter SPF (Spezifiziert Pathogen Freien) Bedingungen gemäß den FELASA-Empfehlungen.
Die Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 1°C und einer relativen Luftfeuchte von 55 ± 10%
gehalten.
Dabei waren jeweils fünf Tiere in einem Polysulfon Typ 2000 Käfig der Firma Tecniplast (Hohenpeißenberg, Deutschland), auf Lignocel-Einstreu von J.Rettenmaier & Söhne GmbH (Rosenberg, Deutschland) untergebracht. Die Tiere hatten Zugang zu Wasser und pelletiertem Futter (ssniff Ratte/Maus Standardfutter – H, autoklavierbar, Sniff Spezialitäten GmbH, Soest, Deutschland) ad libitum. Der Lichtzyklus im Tierraum umfasste je eine 12 stündige Hell- und Dunkelphase (7 bis 19 Uhr Hellphase; 19 bis 7 Uhr Dunkelphase).
Alle Versuche wurden nach Genehmigung durch das Landesamt für Natur Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein Westfalen (LANUV) mit dem Aktenzeichen: 84-02.05.20.11.171 durchgeführt.
3.1.2 Klebstoffe
Es gab zwei Arten zu testende Klebstoffe. Zum einen 3 synthetische Klebstoffe (K1,
thermoplastischem Polyurethan, im Zweikomponenten System, das direkt einsatzbereit war und bei 22°C gelagert werden konnte. Auf die Doppelkammerspritze wurde unmittelbar vor Benutzung eine Düse aufgesetzt, die die beiden Substanzen vor dem Auftragen miteinander vermischte.
Zum anderen wurde der biologische Fibrinkleber (Beriplast® P, Combi-Set 1 ml, CSL Behring GmbH, Marburg, Deutschland) auf Fibrinogen- und Thrombinbasis getestet.
Der Fibrinkleber musste bei + 2 bis + 8°C gelagert werden und wurde als Combi-Set in seinen Einzelsubstanzen geliefert. Vor Benutzung musste er auf 22°C erwärmt werden und die Einzelsubstanzen gemäß Gebrauchsinformation im zugehörigen Lösungsmittel gelöst werden. Dies dauerte 5 bis 10 min und es stellte sich je eine klare Lösung dar, die mit der jeweiligen Spritze aufgezogen wurde. Beide Spritzen wurden im beigefügten Applikationsbesteck eingerastet und mit dem Spritzenstempel arretiert, um den gleichen Vorschub beider Substanzen zu gewährleisten. Wie bei den synthetischen Klebern wurde eine Mischdüse aufgesteckt, die Fibrinogen und Thrombin unmittelbar vor dem Auftragen miteinander vermischte.
Bei allen Klebern wurde pro Auftragen eine neue Mischdüse verwendet, da der Kleber darin unmittelbar nach dem Vermischen aushärtete oder gerann.
3.2 Methodik und Modelle 3.2.1 Versuchsaufbau und -ablauf
Die Studie umfasst die unten tabellarisch aufgeführten Versuchsgruppen:
Tabelle 1: Anzahl der operierten Tiere pro Gruppe (n)
Überlebenszeitpunkt
Pro Kleber und Zeitpunkt waren je 10 Ratten genehmigt, außer für die Gruppen des K2-Klebers mit 14 und 21 Tagen Überlebenszeit. Die Anzahl der operierten Tiere wurde so gewählt, dass später pro Gruppe mindestens 6 bis 8 Tiere überlebten und ausgewertet werden konnten. Für die NaCl-Gruppe wurde aus Tierschutzgründen die Anzahl auf 5 auswertbare Tiere pro Zeitpunkt reduziert.
Für die Gruppen K2 mit 14 und 21 Tagen Überlebenszeit waren keine Tiere genehmigt, da der K2-Klebstoff bereits in den Versuchen mit dem AZ: 8.87-50.10.45.09.184 und AZ: 8.87-50.10.35.08.105 zu diesen Überlebenszeitpunkten erfolgreich getestet worden war. Es wurden jedoch 6 Tiere für die K2 21 Tage Gruppe nachgenehmigt, da für die hier vorliegende Studie Tiere mit dem K2-Kleber bis 21 d post op im µCT untersucht werden sollten. Tiere der K2 90 Tage Gruppe waren noch nicht untersucht worden, so dass im hier vorliegenden Versuchsvorhaben erstmalig das Langzeit-Abbauverhalten in vivo getestet wurde.
Zunächst wurden die Tiere mit 90 Tagen Überlebenszeit operiert. Darauf folgten die Ratten der Gruppen 14 und 21 Tage.
Versuchsablauf
Am Operationstag (d 0) wurde die Ratte narkotisiert (siehe 3.2.2), das Gewicht der Ratte mit der Wage 440-51 N (Kern&Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) bestimmt und die Ratte zur Operation vorbereitet (siehe 3.2.3).
Nach der Laparotomie wurde Blut zur Basiswert-Bestimmung des kleinen Blutbildes und der Leberenzyme aus der Vena cava abdominalis gewonnen. Dann erfolgte die Leberresektion und der zu testende Wundkleber oder NaCl als Kontrolle wurde aufgetragen. Blutungsmenge, Blutungszeit und das Gewicht des resezierten Leberstückes wurden bestimmt.
Je nach Überlebenszeitpunkt wurde die Ratte 14, 21 oder 90 Tage postoperativ euthanasiert (siehe 3.2.4.2). Dazu wurde sie erneut gewogen, narkotisiert und laparotomiert. Es erfolgte wieder eine Blutentnahme aus der Vena cava abdominalis, um ebenfalls ein kleines Blutbild zu erstellen und die Leberenzyme zu messen.
Eventuell vorliegende Adhäsionen zwischen reseziertem Leberlappen und anderen
abdominalen Strukturen wurden beurteilt. Danach wurde die Leber zur weiteren histologischen Untersuchung entnommen.
Zusätzlich wurden jeweils 5 Tiere der Klebergruppe K1, K2, K3 mit 21 Tagen Überlebenszeit 1, 7, 14 und 21 Tage postoperativ im Micro-Computer-Tomographen (µCT) untersucht (siehe 3.2.5.10). Plexiglasbox der Größe 18 x 8,5 x 9,5 cm (Eickemeyer Medizintechnik für Tierärzte KG, Tuttlingen, Deutschland) gesetzt und mit einer Flussrate von 4 l/min und 5 Vol.
% Isofluran (Forene 100%, Abbott, Baar, Schweiz) angeflutet. Nach Verlust der Stellreflexe und des Bewusstseins wurde die Ratte vor eine Inhalationsmaske umgesetzt. Hier erhielt sie zur Aufrechterhaltung der Narkose über das
halbgeschlossene Kreissystem IsoFlo (Eickemeyer, Tuttlingen, Deutschland) ein Isofluran-Sauerstoff-Gemisch (2 Vol. %, 1 l/min). Zur analgetischen Versorgung erhielt die Ratte 0,1 mg/kg KGW Buprenorphin s.c. (Temgesic®, essex pharma GmbH, München, Deutschland). Die Occuli bulbi wurden mit Bepanthen®
Augensalbe (Bayer, Leverkusen, Deutschland) benetzt, um ein Austrocknen der Cornea zu verhindern.
Zur perioperativen Prophylaxe erhielt die Ratte eine s.c Injektion des Breitbandantibiotikums Cefuroxim (Fresenius SE & Co. KGaA, Bad Homburg, Deutschland) in der Dosierung von 16 mg/kg KGW.
3.2.3 Lagerung und Vorbereitung zur Operation
Während des chirurgischen Eingriffes wurde die Ratte auf einer Wärmematte gelagert, damit das Tier anästhesiebedingt nicht auskühlte.
Zunächst wurde das Operationsfeld mit dem Schergerät Wahl® Super Trim (Harotec, Berlin, Deutschland) rasiert und mit Betaisodonalösung® (Mundipharma GmbH, Limburg a.d. Lahn, Deutschland) desinfiziert. Nach Verlust des Zwischenzehenreflexes und Erreichen der chirurgischen Toleranz wurde mit der jeweiligen chirurgischen Maßnahme begonnen.
3.2.4 Operationsmethoden 3.2.4.1 Leberresektion
Als erstes erfolgte die Längslaparotomie vom kranialen Beckenrand bis zum Sternum. Dazu wurde mit einer geraden Schere die Haut durchtrennt. Anschließend wurde die abdominale Muskulatur und das Peritoneum eröffnet.
Das Wundgebiet wurde mit 4 Magnetwundhaken (F.S.T.® 18200-12, stainless, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland) offengehalten.
Zunächst wurde der Darmtrakt mit seinen anhaftenden Strukturen mobilisiert und in einer feuchten Mullkompresse (Fuhrmann GmbH, Much, Deutschland) auf die linke Körperseite des Tieres ausgelagert, um die Vena cava abdominalis auf einem Stück von 2 cm interrenal darzustellen.
Mit einer 27 G Kanüle (BD Microlance TM, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland)auf einer 2 ml Spritze (Terumo, Leuven, Belgien) wurde die Vena cava abdominalis punktiert und 1 ml Blut entnommen.
100 µl davon wurden in ein 2 ml EDTA-Röhrchen (Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt zur Bestimmung des kleinen Blutbildes. Das restliche Vollblut wurde in ein 1,5 ml Serumröhrchen (Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.
Nach 30 min Gerinnungszeit wurde das Serum bei 4°C für 10 min bei 7500 U/min in der Zentrifuge Mikro 200R (Hettich GmbH, Mülheim a.d. Ruhr, Deutschland) abzentrifugiert und zur späteren Enzymdiagnostik gewonnen. Die ausgelagerten Teile des Darmtraktes wurden zurückverlagert.
Nun wurde die Leber mobilisiert und die Basis des linken Leberlappens mit einem polyfilen USP3-0 Faden (Dexon 3/0 B. Braun, Spangenberg, Deutschland) umschlungen und komprimiert, um eine zu starke Blutung aus offenen Lebervenen bei der Resektion des Leberlappens zu unterbinden.
Der linke laterale Leberlappen wurde auf eine 10 x 10 cm große Mullkompresse (Fuhrmann GmbH, Much, Deutschland) aufgelagert. Dann wurde eine 5 x 5 cm große Kompresse (Fuhrmann GmbH, Much, Deutschland) kranial zwischen Brustwand, Sternum und Leber eingebracht.
Abbildung 5: Lagerungstechnik aller Tiere mit Finalzeitpunkt 90 d
Um eine direkte Verklebung der Resektionsfläche mit der Kompresse zu vermeiden, wurden zwei Wattestäbchen (NOBA Verbandmittel Danz, Wetter, Deutschland) kranial der Resektionslinie zwischen linken lateralen Leberlappen und die große Mullkompresse gelegt (Abbildung 5). Die bis hier beschriebene Vorgehensweise zur Lagerung der Leber wurde bei allen Tieren mit 90 d Überlebenszeit angewendet.
Da mit dieser Technik der K1 und K3-Kleber oft beim Entfernen der Mullkompressen daran haften blieben und sich von der Resektionsfläche ablösten, wurde die Technik für die Tiere mit 14 und 21 d Überlebenszeit geringgradig modifiziert.
Bei ihnen wurde wie folgt vorgegangen:
Die Leber wurde mobilisiert und das Ligamentum hepatogastricum durchtrennt.
Der in den linken lateralen Leberlappen eintretende Gefäßast wurde mit einem polyfilen USP3-0 Faden umschlungen und komprimiert (Abbildung 6), um eine starke Blutung bei der Resektion des Leberlappens zu unterbinden. Andernfalls würde der Kleber sofort von der Wundfläche weggespült werden.
Abbildung 6: Anlegen der Stauschlinge
Der linke laterale Leberlappen wurde auf eine große Mullkompresse aufgelagert.
Eine kleine Kompresse wurde zwischen Brustwand und Leber eingebracht. Um ein Zurückrutschen des linken Leberlappens nach Resektion zu verhindern, wurde außerdem ein Zahntupfer (Celluron®, Hartmann, Heidenheim, Deutschland) senkrecht auf der linken Körperseite zwischen Leberbasis und Diaphragma eingebracht.
Als abschließender Schritt wurde eine Schicht Parafilm (Pechiney Plastic Packaging, Menasha, USA) zwischen Mullkompresse und linken Leberlappen gelegt, um das Anhaften des Klebers an den Mullkompressen zu verhindern (Abbildung 7).
Abbildung 7: Lagerungstechnik aller Tiere mit Finalzeitpunkt 14 & 21 d
Der nächste Schritt war die 15 % Leberresektion, die wie alle weiteren nun folgenden Schritte in allen Gruppen gleich war.
Mit einer geraden Schere (Aesculap® BC324R, stainless, Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland) wurde ca. die Hälfte des linken Leberlappens abgetrennt, was einem Resektatgewicht von ca. 1,5 g entsprach. Der Schnitt erfolgte senkrecht zur Facies diaphragmatica und parallel zum Margo inferior. Zur Orientierung der Schnittführung dienten hier die anatomischen Inzisionen im unteren Drittel des Lobus sinister lateralis am Margo lateralis.
Unmittelbar nach der Resektion wurde die Wundfläche mit dem zu testenden Kleber benetzt. Als Klebstoff wurde entweder einer der synthetischen Kleber K1, K2, K3 (Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Deutschland) oder Fibrinkleber (Beriplast®
P, Combi-Set 1 ml, CSL Behring GmbH, Marburg, Deutschland) oder NaCl (B.
Braun, Melsungen, Deutschland) als Kontrollsubstanz verwendet. Direkt danach wurde die Schlinge um die Leberbasis gelöst. Mittels Stoppuhr wurde die Blutungszeit (siehe 3.2.5.1) bestimmt.
Abbildung 8: Zustand 2 min und 10 min nach Klebung
Das Tier wurde 10 min ab Auftragen des Klebers beobachtet. War dann keine Blutung mehr erkennbar, wurden die Kompressen, der Parafilm und die Schlinge vollständig entfernt. Dann wurde das Tier für weitere 20 min nachbeobachtet.
Sollte sich die Klebeschicht bei Entfernen der Kompressen von der Leberwundfläche ablösen, wurde eine neue Klebeschicht aufgetragen, wenn an der Resektionsfläche Nachblutungen erkennbar waren. War der Kleber lediglich abgelöst, lag jedoch ohne Nachblutungen der Resektionsfläche an, wurde der Zustand so belassen.
Nach der Gesamtbeobachtungszeit von 30 min ab erfolgreicher Klebung erfolgte eine Volumensubstitution von 2 ml körperwarmem NaCl (B. Braun, Melsungen, Deutschland) i.p. und der zweischichtige Wundverschluss. Dazu wurde die Peritoneal- und Muskelschicht fortlaufend, die Haut hingegen in Einzelhefttechnik mit resorbierbarem Nahtmaterial Vicryl USP 4-0 (Ethicon, Johnson&Johnson, St.
Stevens, Belgien) verschlossen.
Das resezierte Leberstück wurde auf der Waage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) gewogen. Die Blutungsmenge wurde aus dem aktuellen Gewicht der Kompressen abzüglich des Gewichts der vor der OP gewogenen
Bis zum vollständigen Erwachen wurde die Ratte vor einer Rotlichtlampe (Petra Electric GmbH, Geislingen/Steige, Deutschland) gewärmt. Danach wurde sie in den Käfig zu den anderen Tieren zurückgesetzt.
Das Tier wurde an den drei darauffolgenden Tagen adspeziert und erhielt täglich
Es erfolgte eine Längslaparotomie mit seitlichen Einschnitten kaudal des Rippenbogens.
Zunächst erfolgte die Bewertung wie viel % der Resektionsfläche mit abdominalen Strukturen verwachsen waren. Außerdem wurde erfasst, welche Organe und Strukturen an der Adhäsion beteiligt waren. Desweiteren erfolgte eine prozentuale makroskopische Mengenbeurteilung der gegebenenfalls noch vorhandenen Klebstoffreste.
Dann wurde der Darmtrakt mit seinen anhaftenden Strukturen mobilisiert und in einer feuchten großen Mullkompresse auf die linke Körperseite ausgelagert. Nun wurde die Vena cava abdominalis auf einem Stück von 2 cm interrenal dargestellt und ein 14 G Katheter (Braunüle®, B. Braun, Melsungen, Deutschland) eingeführt. Hierüber wurden 5 ml Blut entnommen. 100 µl wurden zur Erstellung des kleinen Blutbildes benötigt. Der Rest wurde zur späteren Leberenzymmessung in Serumröhrchen überführt.
Die Leber wurde von adhäsiven Strukturen befreit. Dann wurde eine Klemme (Aesculap® BH109, stainless, Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland) auf die Vena porta gesetzt; distal der Klemme wurde die V. porta durchtrennt. Mittels der Klemme wurde die Leber angehoben und alle weiteren anhaftenden Strukturen wie V. cava abdominalis, Diaphragma und Ösophagus wurden mit einer geraden Schere
durchschnitten und die Leber entnommen. Die Ratte verstarb in Isoflurannarkose durch den starken Blutverlust und die Eröffnung des Diaphragmas.
Zunächst wurde das Gewicht der Leber mit der Wage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) bestimmt. Dann wurde der linke laterale Leberlappen senkrecht zur Resektionsfläche in 4 Segmente aufgeteilt. 2 Segmente wurden für spätere histologische Untersuchungen in 10 % Formaldehyd (Roti®-Histofix 10 %, Roth, Karlsruhe, Deutschland) überführt.
Die anderen 2 Segmente wurden in flüssigem Stickstoff bei -80°C kryokonserviert.
3.2.4.3 Leberperfusion
Zur Darstellung des Gefäßsystems, speziell im linken lateralen Leberlappen nach Resektion, wurde bei den Tieren, die im Verlauf mittels dem µCT Tomoscope 30s Duo (CT Imaging GmbH, Erlangen, Deutschland) untersucht wurden, zusätzlich die Leber vor finaler Entnahme mit dem Kontrastmittel Imeron 400 MCT (Bracco Altana Pharma GmbH, Konstanz, Deutschland) perfundiert.
Dazu wurde das Tier wie bereits oben beschrieben erneut narkotisiert und mit seitlichen Einschnitten laparotomiert. Auch hier wurden Adhäsion und noch vorhandene Kleberreste bewertet.
Der Darmtrakt wurde mit seinen anhaftenden Strukturen mobilisiert und in einer großen feuchten Gaze auf die linke Seite des Tieres ausgelagert.
Nun wurde die Leber von ihren Ligamenten befreit. Als erstes wurde das Ligamentum falciforme durchtrennt. Dann wurde der linke laterale Leberlappen mit einer feuchten Gaze auf die rechte Körperseite geschoben, so dass sich das Ligamentum triangulare sinister spannte, um es anschließend leichter durchschneiden zu können. Das Ligamentum hepatogastricum wurde nach Anheben des linken lateralen Leberlappens ebenso scharf durchtrennt.
Nachfolgend wurde mit einer chirurgischen Pinzette der Magen an der großen Kurvatur gefasst, mit einer geraden Schere das Omentum minus eröffnet und der posteriore Anteil des Lobus caudatus von seinen ligamentösen Strukturen befreit und auf die Facies parietalis des Magens vorgelagert.
Als nächster Schritt erfolgte die Entfernung des Ligamentum triangulare dextrum.
Dazu wurde die Leber mit einer feuchten Gaze auf die linke Körperhälfte gelagert.
Das Band spannte sich auf und konnte durchtrennt werden.
Die Leber verblieb in letztgenannter Position, um mit der ersten Gefäßligatur zu beginnen.
Dazu wurde zunächst die V. adrenalis durch Fassen des supraadrenalen Fettgewebes mit einer Klemme gespannt. Das Gefäß wurde mit Seide USP 4-0 (Resorba, Nürnberg, Deutschland) doppelt ligiert und durchtrennt.
Als nächstes wurde eine einfache Ligatur an der V. cava vorgelegt. Die A. hepatica wurde gemeinsam mit dem Gallengang einfach ligiert.
An der V. porta wurden zwei Ligaturschlaufen vorgelegt. Die distale wurde verschlossen, ebenso die bereits vorgelegte Ligatur der V. cava.
Mit einer Microschere wurde die V. porta eröffnet und ein 14 G Venenkatheter (Vygon, Ecouen, Frankreich) eingeführt. Mit der proximalen Ligaturschlaufe wurde der Katheter fixiert.
Nun begann die Perfusion aus 30 cm Höhe zunächst mit 20 ml NaCl. Das Zwerchfell wurde eröffnet und die suprahepatische V. cava durchtrennt. Retrograd wurde ein 14 G Venenkatheter (Braunüle®, B. Braun, Melsungen, Deutschland) in sie eingeführt und ein Schlauch übergestülpt, um das Perfusat abzuleiten und eine spätere Kontamination der Leberoberfläche mit Kontrastmittel zu verhindern.
Im Anschluss an die Spülung mit NaCl erfolgte die Perfusion mit 10 ml PFA 2 %, um dann auf 9,5 ml PFA 10% mit 0,5 ml Imeron gemischt umzustellen.
Nach der Perfusion wurden die offenen Gefäßausgänge mittels Ligatur verschlossen.
Die Gefäße wurden distal der Ligatur durchschnitten und die Leber entnommen.
Auch hier wurde das Lebergewicht bestimmt. Anschließend wurden aus dem Lobus lateralis sinister ausschließlich Proben für histologische Untersuchungen entnommen, da das Gewebe durch PFA Perfusion bereits fixiert war.
3.2.5 Messungen 3.2.5.1 Blutungszeit
Nach Abtrennung des zu resezierenden Leberstückes und Auftragen des Klebers wurde die Stoppuhr gestartet. Unmittelbar danach wurde die Stauschlinge gelöst.
War makroskopisch keine Blutung an der Resektionsfläche mehr erkennbar, wurde die Zeit gestoppt und als Blutungszeit definiert. Sickerblutungen, die an der Leberunterseite auftraten, wurden in dieser Messung nicht erfasst. Diese wurden numerisch als intraoperative Nachblutungen erfasst.
3.2.5.2 Blutungsmenge
Zur Bestimmung der Blutungsmenge nach Leberresektion wurden die Tupfer vor Einbringen in das Tier gewogen (Waage PP303-S Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland). Die Gewichtskalkulation wurde nach Entfernen der Kompressen nach Abschluss der Resektion und des Klebens wiederholt. Die Differenz der Gewichte wurde als Blutungsmenge in Gramm angegeben.
3.2.5.3 Gewicht des Leberresektats
Das resezierte Leberstück wurde auf der Waage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) gewogen.
3.2.5.4 Körpergewicht
Am Operationstag und am Finaltag wurde das Gewicht der Ratte mit der Wage 440-51 N, (Kern&Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) bestimmt.
3.2.5.5 Intraoperative Komplikationen
Komplikationen wie das Ablösen der Klebeschicht von der Wundfläche oder eine intraoperative Nachblutung wurden numerisch erfasst. Ebenso wurde bei einer daraus resultierenden erforderlichen Nachklebung vorgegangen.
3.2.5.6 Lebergewicht
Um unterscheiden zu können, ob der Wundkleber Einfluss auf die Leberregeneration nahm, wurde unmittelbar nach Leberentnahme zum finalen Zeitpunkt nach 14, 21 oder 90 Tagen post op das Gewicht der Leber mit der Waage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) bestimmt.
3.2.5.7 Klebermenge am Finaltag (makroskopisch)
Es erfolgte eine makroskopische Beurteilung, wie viel % der Fläche des aufgetragenen Klebstoffes am Finaltag noch im Abdomen des Tieres auffindbar waren. Hierbei wurden auch von der Resektionsfläche abgelöste Klebstoffstücke
Es erfolgte eine makroskopische Beurteilung, wie viel % der Fläche des aufgetragenen Klebstoffes am Finaltag noch im Abdomen des Tieres auffindbar waren. Hierbei wurden auch von der Resektionsfläche abgelöste Klebstoffstücke