Messungen

Nach Abtrennung des zu resezierenden Leberstückes und Auftragen des Klebers wurde die Stoppuhr gestartet. Unmittelbar danach wurde die Stauschlinge gelöst.

War makroskopisch keine Blutung an der Resektionsfläche mehr erkennbar, wurde die Zeit gestoppt und als Blutungszeit definiert. Sickerblutungen, die an der Leberunterseite auftraten, wurden in dieser Messung nicht erfasst. Diese wurden numerisch als intraoperative Nachblutungen erfasst.

3.2.5.2 Blutungsmenge

Zur Bestimmung der Blutungsmenge nach Leberresektion wurden die Tupfer vor Einbringen in das Tier gewogen (Waage PP303-S Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland). Die Gewichtskalkulation wurde nach Entfernen der Kompressen nach Abschluss der Resektion und des Klebens wiederholt. Die Differenz der Gewichte wurde als Blutungsmenge in Gramm angegeben.

3.2.5.3 Gewicht des Leberresektats

Das resezierte Leberstück wurde auf der Waage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) gewogen.

3.2.5.4 Körpergewicht

Am Operationstag und am Finaltag wurde das Gewicht der Ratte mit der Wage 440-51 N, (Kern&Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) bestimmt.

3.2.5.5 Intraoperative Komplikationen

Komplikationen wie das Ablösen der Klebeschicht von der Wundfläche oder eine intraoperative Nachblutung wurden numerisch erfasst. Ebenso wurde bei einer daraus resultierenden erforderlichen Nachklebung vorgegangen.

3.2.5.6 Lebergewicht

Um unterscheiden zu können, ob der Wundkleber Einfluss auf die Leberregeneration nahm, wurde unmittelbar nach Leberentnahme zum finalen Zeitpunkt nach 14, 21 oder 90 Tagen post op das Gewicht der Leber mit der Waage PP303-S (Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) bestimmt.

3.2.5.7 Klebermenge am Finaltag (makroskopisch)

Es erfolgte eine makroskopische Beurteilung, wie viel % der Fläche des aufgetragenen Klebstoffes am Finaltag noch im Abdomen des Tieres auffindbar waren. Hierbei wurden auch von der Resektionsfläche abgelöste Klebstoffstücke berücksichtigt.

3.2.5.8 Kleberanhaftung an die Resektionsfläche

Bei allen verstorbenen Tieren erfolgte eine numerische Erfassung, bei wie vielen Tieren der Kleber von der Resektionsfläche abgelöst war.

Am Finaltag wurde deskriptiv beurteilt, ob die Klebeschicht der Resektionsfläche anhaftete.

3.2.5.9 Intraabdominale Adhäsionen an die Resektionsfläche

Um beurteilen zu können, ob durch den Kleber abdominalen Adhäsionen vorgebeugt wurde, erfolgte die Bewertung auf zwei Weisen. Es wurde dokumentiert, welches Organ oder welche abdominale Struktur adhäsiv war.

Außerdem wurde beurteilt, wie viel % der Resektionsfläche mit einer abdominalen Struktur verwachsen waren.

3.2.5.10 Micro Computer-Tomographie (µCT)

Zur Visualisierung des Kleberabbaus wurden aus jeder Tiergruppe mit synthetischem Kleber und 21 Tagen Überlebenszeit je 5 Tiere im µCT untersucht.

Die Untersuchungszeitpunkte waren 1, 7, 14 und 21 Tage postoperativ. Bis einschließlich 14 Tage postoperativ wurde in vivo gemessen. Zum Zeitpunkt 21 Tage wurde die Leber in vivo mit dem Kontrastmittel Imeron 400 MCT (Bracco Altana Pharma GmbH, Konstanz, Deutschland) perfundiert, entnommen und ex vivo einzeln gemessen, da die Ratten bereits zu groß waren, um eine in vivo Messung durchzuführen.

Auf die Messung der Ratten mit Klebstoff K3 zum Zeitpunkt 14 Tage wurde verzichtet, da der Klebstoff zu diesem Zeitpunkt makroskopisch nicht mehr sichtbar und somit nicht mehr darstellbar war.

Außerdem wurde auf eine Untersuchung der Ratten mit Fibrinkleber verzichtet, da dieser keinen Kontrast zum Leberparenchym darstellt.

Die Messung erfolgte im µCT Tomoscope 30s Duo (CT Imaging GmbH, Erlangen, Deutschland). Dieses auf Flat Panel Technologie basierende System enthält zwei Röhren und zwei Detektoren, was eine höhere Geschwindigkeit ermöglicht oder zur Dual Energy Bildgebung verwendet werden kann (GREMSE et al. 2011). Hier wurde ein Protokoll (HQD-6565-90-360) verwendet, welches 720 Projektionen (1032 x 1012 Pixel) in 90 Sekunden während einer vollen Umdrehung aufnimmt und eine Strahlendosis von 421 milli Gray besitzt (KUNJACHAN et al. 2013). Da jeder Subscan 3 cm in der Längsachse abdeckte, wurden mehrere Subscans aufgenommen, um das Rattenabdomen zu erfassen. Es wurde eine Rekonstruktion nach dem Feldkamp Algorithmus mit Voxelgröße 70 x 70 x 70 µm³ erstellt (DOLESCHEL et al. 2012). Die rekonstruierten Subscans wurden zu einem Volumendatensatz zusammengefügt.

Messungsablauf

Zur Messung wurde die Ratte mit Isofluran narkotisiert. Das Vorgehen wurde bereits unter Prämedikation und Narkose (3.2.2) beschrieben. Auf eine Applikation von Buprenorphin wurde verzichtet, da die Ratte lediglich immobilisiert werden musste und kein schmerzhafter Eingriff erfolgte.

Nach Verlust der Stellreflexe wurde die Ratte in ein Rattenbett gelegt und dort mit Klebestreifen fixiert. Die Narkose wurde über eine Inhalationsmaske mit 1,5 - 2 Vol. -

% und 1 l/min Isofluran aufrechterhalten.

Das Rattenbett wurde in die Halterung des µCT Gerätes eingespannt, der Deckel geschlossen und die Ratte in die Messröhre gefahren (Abbildung 9).

Abbildung 9: Narkotisierte Ratte im Rattenbett; Einspannen in Halterung zur Messung

Um die Scanfelder an der richtigen Position zu setzen, wurde als erstes ein Topogramm (Röntgenaufnahme der gesamten Ratte) erstellt. Dann wurden je ein Scanfeld auf der Leber und eines auf dem kranialen Abdomen positioniert, so dass der Kleber mit Leber gemessen wurde. Hatte sich die Klebeschicht abgelöst und war an einer anderen Stelle im Abdomen palpierbar, wurde in dieser Region ebenfalls ein Scanfeld angelegt.

An Tag 21 erfolgte die Messung ex vivo, da die Ratte in vivo für eine Messung im µCT zu groß war. Die entnommene Leber wurde deshalb zusammen mit dem Kleber auf eine Styroporschicht im Rattenbett aufgelegt und gescannt.

Vorversuche

Ziel war es die Bioabbaubarkeit und somit die Reduktion der Klebermenge des synthetischen Klebers mittels Messungen im µCT graphisch darzustellen.

Dazu wurde zunächst folgender Vorversuch durchgeführt: An einer euthanasierten Ratte wurden analog zur Operation der Leberresektion ca. 1,5 g des linken Leberlappens reseziert und die Wundfläche mit dem Kleber K2 benetzt. Nach Aushärten des Klebstoffes wurde das Abdomen der Ratte mittels zweischichtiger Naht verschlossen.

Im Scan stellte sich der Kleber als hypo-radio-dichte Struktur der Leber anliegend dar (Abbildung 10).

Um den Klebstoff in der Messung zu verifizieren, wurde das Abdomen der Ratte erneut eröffnet und auf das Kleberstück eine neue Klebeschicht aufgetragen, in die eine mit Kontrastmittel gefüllte Pipettenspitze eingebettet war. Das Abdomen wurde wieder verschlossen und die Messung wiederholt.

Die kontrastmittelgefüllte Pipettenspitze stellte sich als stark hyper-radio-dichte Struktur in der Klebeschicht dar, so dass die erste Messanalyse verifiziert werden konnte.

Als weiteres Resultat dieser Testmessung ist zu erwähnen, dass die Ratte zum Messzeitpunkt maximal 5 cm Körperdurchmesser erreichen durfte. Andernfalls ragte der Körper aus dem Scanbereich heraus und erzeugte Artefakte. Betraf dies eine Region, die nicht im Scanfeld lag, war dies jedoch zu tolerieren.

Die Limitation in der Länge lag bei 22 cm. Der Schwanz der Ratte wurde auf die rechte Körperseite der Ratte gelegt. Gegebenenfalls konnten die Hinterbeine zur Messung gebeugt und mit Klebeband fixiert werden.

Aus der 21 d Gruppe wurde zunächst ein Tier pro Kleber gemessen. Die Ratten hatten zum Operationszeitpunkt ein Körpergewicht von ca. 200 - 210 g. Diese Größe stellte sich während der anschließenden Messreihe als praktikabel heraus, um die Ratte möglichst zu allen geplanten Messzeitpunkten scannen zu können. Bis zu einem Körpergewicht von 260 g konnte die Ratte vollständig gescannt werden.

Darüber hinaus war es möglich die Ratte bis 290 g KGW im µCT zu positionieren.

Hierbei konnte es jedoch abhängig von der Füllung des Gastrointestinaltraktes zu Artefakten im kaudalen Abdomen kommen, da dieser Bereich dann aus dem Scanfeld herausragte. Der rippengestützte Teil des Abdomens war jedoch gut darstellbar.

Auswertung

Die µCT Messungen wurden mit der Software Philips Imalytics Preclinical (Philips, Aachen, Deutschland) ausgewertet. Voxelbasierte Regionen können damit interaktiv segmentiert werden, was eine höhere Genauigkeit gewährleistet als die Verwendung von festen, z.B. elliptischen Regionen (GREMSE und SCHULZ 2011).

Dabei war das Vorgehen für die 21 d ex vivo Messung wie folgt:

Die jeweiligen dargestellten Strukturen wie Leber, Gefäße in der Leber und Kleber wurden identifiziert und der jeweilige Bereich einer vorher definierten Gruppe zugewiesen. Dabei wurden in der temporären Gruppe der Leber Strukturen über einem Treshold von 500 als Leber definiert und Strukturen mit einem Treshold über 1200 als Gefäßsystem. Der Kleber berührte bei der Messung die Leber nicht und konnte somit isoliert der Gruppe Kleber zugeordnet werden. Nachdem alle Gruppen zugewiesen worden waren, errechnete das Programm für jede Gruppe das Volumen in mm³.

Die Auswertung der in vivo Messung zu den Zeitpunkten 1, 7 und 14 Tage postoperativ erfolgte wie nachführend beschrieben:

Die einzelnen Schnittbilder wurden ebenfalls zu einem dreidimensionalen Konstrukt zusammengefügt. Pro Messung wurde in 15 Schnittbildern in der transversalen Schnittebene der Kleber mit dem Mauszeiger umfahren und die somit umrandete Fläche als Kleber definiert. Die segmentierten Flächen wurden in kranio-kaudaler Richtung miteinander verbunden, so dass eine dreidimensionale Rekonstruktion des Klebers erfolgte. Auch hier wurde das Volumen in mm³ ausgegeben.

3.2.5.11 Laborparameter Leberenzyme

Die Messung der Leberenzyme ALT (Alanin-Aminotransferase) und AST (Aspartat-Aminotransferase) wurde vorgenommen, um eine Aussage über das Ausmaß der Leberzellschädigung treffen zu können. Die ALT ist ein Enzym, das besonders im Zytosol der Hepatozyten vorkommt. Es kann schon bei leichten Schädigungen der Zellmembran ins Blut übertreten.

Die AST hingegen ist größtenteils in den Mitochondrien lokalisiert und wird somit erst bei massiver Zellverletzung freigesetzt. Zudem ist sie in Herz- und Skelettmuskelzellen zu finden.

Die ALT ist somit ein sensitives und für die Hepatozyten spezifisches Enzym. Die Messung beider Enzyme erfolgte am Vitros 250 (Ortho Clinical Diagnostics GmbH, Neckargemünd, Deutschland) mittels standardisierter photometrischer Tests.

Kleines Blutbild

Zur Überprüfung der Blutzusammensetzung wurde von jedem Tier unmittelbar vor Leberresektion und zum Leberentnahmezeitpunkt ein kleines Blutbild erstellt. Dazu wurden aus 100 µl EDTA-Blut am Messgerät MEK-6450K (Nihon Kohden, Rosbach, Deutschland) folgende Parameter gemessen:

Hätte ein Entzündungsprozess bedingt durch das Einbringen des Wundklebers vorgelegen, wäre dies an einer Leukozytose oder einer anderen Veränderung der Zusammensetzung der zellulären Blutbestandteile zu erkennen.

3.2.6 Proben