Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Immunreaktion im Kalb auf das rekombinante Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus
als Glutathion-S-Transferase Fusionsprotein
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Christian von Holtum
aus Krefeld
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. T. Blaha
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2006
meiner Familie
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
C. von Holtum, G. von Samson-Himmelstjerna, T. Schnieder (2005)
„Diagnostik der bovinen Dictyokaulose-ELISA auf der Grundlage eines rekombinanten Major Sperm Proteins“
DVG-Tagung Veterinärparasitologie:
Diagnostik, Epidemiologie und Bekämpfung von Parasitosen bei Nutz-, Haus- und Heimtieren
Potsdam, 22.-24.6.2005
T. Schnieder, G. von Samson-Himmelstjerna, C. Strube, C. von Holtum (2005)
„Immunization of cattle with recombinant Major Sperm Protein (MSP) against Dictyocaulus viviparus”
Molecular and cellular biology of helminth parasites Hydra, Griechenland, 6.-11.9.2005
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 11
2 Schrifttum ... 13
2.1 Die Dictyokaulose des Rindes... 13
2.1.1 Erreger ... 13
2.1.2 Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung ... 14
2.1.3 Biologie und Entwicklungszyklus ... 15
2.1.4 Klinik und Pathogenese ... 17
2.1.5 Immunität ... 18
2.1.6 Diagnose... 21
2.1.7 Bekämpfung ... 25
2.1.7.1 Weidetechnik ... 26
2.1.7.2 Biologische Bekämpfung... 26
2.1.7.3 Anthelminthika ... 27
2.1.7.4 Immunisierung... 29
2.2 Immunisierungsversuche gegen Helminthen ... 31
2.2.1 Adjuvantien ... 32
2.2.1.1 partikuläre Adjuvantien ... 32
2.2.1.2 nicht partikuläre Adjuvantien ... 34
2.2.2 Immunisierungsversuche mit nativen/rekombinanten Proteinen... 35
2.2.2.1 Trematoden und Zestoden ... 35
2.2.2.2 Nematoden... 38
2.2.2.3 Dictyocaulus viviparus... 44
2.3 Das Major Sperm Protein (MSP) ... 47
2.3.1 MSP-Domänen Proteine (MDPs) ... 47
2.3.2 Vorkommen... 48
2.3.3 Funktionen... 49
2.3.3.1 Spermienmotilität ... 50
2.3.3.2 Oozytenreifung und Ovulation ... 51
3 Material und Methoden ... 53
3.1 Puffer und Lösungen ... 53
3.2 Medien und Platten... 55
3.3 Reagentien, Enzyme, Reaktionsgefäße, Reaktionskits und Geräte ... 55
3.4 Bakterien und Vektoren ... 60
3.5 Versuchsplan ... 60
3.6 Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) ... 62
3.6.1 Primer ... 62
3.6.2 Reaktionsbedingungen und Reaktionsansätze ... 63
3.6.2.1 PCR-Temperaturprofile ... 63
3.6.2.2 PCR-Ansätze ... 63
3.7 Darstellung von Nukleinsäuren durch Agarosegel-Elektrophorese ... 64
3.8 Klonierung von PCR-Amplifikaten ... 65
3.8.1 Isolierung von PCR-Amplifikaten aus Agarosegelen... 65
3.8.2 Klonierungsvektor ... 65
3.8.3 Ligation ... 65
3.8.4 Transformation ... 66
3.9 Klonierung in Expressionsvektoren ... 66
3.9.1 Expressionsvektoren... 66
3.9.2 Restriktionsenzymverdau ... 68
3.9.3 Ligation ... 69
3.9.4 Transformation ... 70
3.10 Plasmidpräparation und Darstellung der Inserts ... 71
3.10.1 Plasmidpräparation mittels Miniprep ... 71
3.10.2 Plasmidpräparation mittels Midiprep ... 72
3.10.3 Kontrolle und Darstellung der Inserts... 72
3.10.3.1 Restriktionsenzymverdau... 72
3.10.3.2 Polymerase-Kettenreaktion... 73
3.11 Sequenzierung der Inserts und Sequenzidentitätsvergleich... 74
3.12 Proteinexpression ... 75
3.12.1 Small-scale-Expression der rekombinanten Proteine ... 75
3.12.2 Large-scale-Expession der rekombinanten Proteine... 76
3.13 Aufreinigung der rekombinanten Proteine... 76
3.13.1 Lyse der Zellen ... 77
3.13.2 Aufreinigung über MagneGST®-Partikel ... 77
3.13.3 Aufreinigung über Glutathione Sepharose® High Performance ... 78
3.13.4 Schneiden des Fusionsproteins mittels Thrombin ... 79
3.14 Darstellung der Proteine ... 80
3.14.1 SDS-PAGE ... 81
3.14.2 Färbung der Proteine mittels Coomassie Blue... 81
3.14.3 Färbung des Proteins mittels des Lumio® Green Detection Kits ... 81
3.14.4 Western Blot... 82
3.15 Elektro-Elution des geschnittenen MSP... 83
3.16 Identifizierung des rekombinanten Major Sperm Proteins ... 84
3.17 Quantifizierung des Major Sperm Proteins... 85
3.17.1 Messung der Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay ... 85
3.17.2 Messung der Konzentration mittels Agilent Bioanalyzer ... 85
3.18 Immunisierungsversuche... 86
3.18.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ... 86
3.18.2 Impfstoffe ... 87
3.18.3 Lungenwurm-Stammhaltung ... 89
3.18.4 Impfschema und Untersuchungsplan... 89
3.19 Klinische und pathologische Auswertung der Vakzinierungsversuche... 91
3.19.1 Klinische Untersuchungen... 91
3.19.2 Pathologische Untersuchungen... 92
3.20 Labordiagnostische Auswertung der Vakzinierungsversuche ... 92
3.20.1 Differentialblutbild ... 92
3.20.2 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)... 92
3.20.2.1 Vorversuche... 92
3.20.2.2 ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Fusionsproteins... 95
3.20.2.3 ELISA auf der Grundlage des geschnittenen MSP und der GST ... 95
3.20.2.4 Ceditest® Lungworm... 96
3.20.2.5 Western Blot mit nativem Lungenwurmantigen ... 97
3.21 Parasitologische Auswertung der Vakzinierungsversuche... 98
3.21.1 Bestimmung der Larvenzahlen... 98
3.21.2 Bestimmung der Anzahl und des Geschlechts der adulten Würmer... 98
3.21.3 Messung der Wurmlänge und –breite... 99
3.22 Validierung eines ELISAs zur Diagnostik einer Lungenwurminfektion ... 99
3.23 Quantitative Real-time PCR ... 100
3.23.1 Probenmaterial... 101
3.23.1.1 Adulte Lungenwürmer... 101
3.23.1.2 Larvenstadien... 102
3.23.2 Isolierung der Gesamt-RNA... 103
3.23.3 Bestimmung von Quantität und Reinheit der isolierten RNA ... 103
3.23.4 Synthese der Erststrang-cDNA... 104
3.23.5 Quantitative Real-time PCR mittels TaqMan®-Sonden... 105
3.23.5.1 Absolute Quantifizierung... 107
3.23.5.2 Relative Quantifizierung... 107
3.24 Statistische Auswertung ... 108
4 Ergebnisse ... 109
4.1 Amplifikation und Klonierung... 109
4.1.1 Amplifikate aus cDNA und genomischer DNA ... 109
4.1.2 Klonierung in pCR4®-TOPO® (INVITROGEN)... 110
4.1.3 Klonierung in Expressionsvektoren... 111
4.2 Proteinexpression ... 112
4.2.1 Small-scale-Expression ... 112
4.2.1.1 Aufreinigung und Darstellung der GST-Fusionsproteine ... 112
4.2.1.2 Darstellung des Lumio®-Fusionsproteins ... 114
4.2.2 Large-scale-Expression ... 115
4.2.2.1 Aufreinigung... 115
4.2.2.2 Thrombinverdau und Elektro-Elution des geschnittenen MSP... 117
4.2.3 Identifizierung und Quantifizierung des MSP und der GST ... 119
4.3 Immunisierungsversuche... 121
4.3.1 Stammhaltung... 121
4.3.2 Klinik und Pathologie... 123
4.3.3 Labordiagnostische Auswertung ... 127
4.3.3.1 Differentialblutbild ... 127
4.3.3.2 ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Fusionsproteins... 127
4.3.3.3 ELISA auf der Grundlage des MSP und der GST ... 132
4.3.3.4 Ceditest® Lungworm... 135
4.3.3.5 Western Blot mit nativem Lungenwurmantigen ... 135
4.3.4 Parasitologische Auswertung ... 138
4.3.4.1 Larvenausscheidung ... 138
4.3.4.2 Bestimmung der Anzahl und des Geschlechts der adulten Würmer ... 141
4.3.4.3 Messung der Würmer ... 143
4.4 Validierung des ELISA... 145
4.5 Quantitative Real-time PCR ... 147
4.5.1 Gesamt-RNA-Isolierung und Synthese der Erststrang-cDNA... 147
4.5.2 Quantitative Real-time PCR mittels TaqMan-Sonden... 147
4.5.2.1 Absolute Quantifizierung... 147
4.5.2.2 Relative Quantifizierung... 148
5 Diskussion ... 156
5.1 Major Sperm Protein... 157
5.2 Immunisierungsversuche... 159
5.2.1 humorale und zelluläre Immunantwort... 159
5.2.2 Einfluss der Adjuvantien auf die Effizienz einer Vakzine... 161
5.2.3 Einfluss des rekombinanten Antigens auf die Effizienz einer Vakzine ... 166
5.2.4 Klinik und Pathologie... 170
5.3 ELISA ... 171
5.4 quantitative Real-time PCR ... 173
5.5 zusammenfassende Beurteilung und Ausblick ... 175
6 Zusammenfassung ... 177
7 Summary ... 179
8 Literaturverzeichnis... 181
9 Anhang ... 206
9.1 Alignment der genomischen DNA ... 206
9.2 Aminosäure-Alignments ... 207
9.2.1 Aminosäure-Alignment der translatierten genomischen DNA-Sequenzen ... 207
9.2.2 Aminosäure-Alignment der translatierten cDNA-Sequenzen... 207
9.3 cDNA-Alignment... 208
9.4 Körpergewichte der Rinder (kg)... 209
9.5 Leukozyten (G/l)... 211
9.6 absolute Anzahl eosinophiler Granulozyten (G/l) ... 213
9.7 relative Anzahl eosinophiler Granulozyten (%)... 215
9.8 Anzahl und Geschlecht der adulten Lungenwürmer, Larven pro weiblichem Wurm und Geschlechtsverhältnis ... 217
9.9 Wurmgrößen ... 218
9.10 positive Seren (Index) ... 219
9.11 negative Seren (Index) ... 220
9.12 potentiell kreuzreaktive Seren (Index) ... 221
9.13 Konzentrationen und Reinheiten der isolierten Gesamt-RNA ... 222
9.14 Abkürzungsverzeichnis ... 224
9.15 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... 226
Einleitung 11
1 Einleitung
Der Lungenwurm Dictyocaulus viviparus ist innerhalb der gemäßigten Klimazonen einer der wirtschaftlich bedeutsamsten Parasiten in der Weidehaltung von Rindern. Als Auslöser der parasitären Bronchopneumonie kann er zu Krankheitserscheinungen unterschiedlichen Grades und in schweren Fällen zum Tod der Tiere führen.
Zur Bekämpfung einer Lungenwurminfektion dienen weidetechnische Maßnahmen und Anthelminthika sowie eine aus röntgenattenuierten Larven bestehende Lebendvakzine, die aber in Deutschland vom Markt genommen worden ist. Mit diesem Impfstoff kann eine belastbare Immunität der Rinder über einige Monate hervorgerufen werden. Allerdings ist diese Form der Vakzinierung mit verschiedenen Nachteilen verbunden, wie den relativ hohen Produktionskosten und einer begrenzten Haltbarkeit. Des Weiteren müssen zur Gewinnung der Larven Spendertiere zur Verfügung stehen. Aufgrund der Möglichkeit, rekombinante Antigene in großer Menge und hoher Reinheit herzustellen, kann der Einsatz dieser biotechnologisch produzierten Proteine als Vakzine bei entsprechender Effizienz an Stelle der bisherigen Immunisierungsmöglichkeit treten.
Die Diagnose einer Dictyocaulus-Infektion erfolgt sowohl parasitologisch mittels Kotuntersuchungen als auch mit Hilfe serologischer Methoden wie dem ELISA.
Kommerzielle Nachweisverfahren in Form von ELISAs dienen besonders zur Herdendiagnostik und beruhen bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt auf nativen Antigenen, die aus Lungenwürmern isoliert werden. Die Verwendung rekombinanter Proteine kann auch in diesem Fall die aufwändige, mit der Haltung und der Sektion von Spendertieren einhergehende Gewinnung von Antigenmaterial ersetzen.
Die geschlechts- und stadienspezifische Expression von Proteinen konnte bei Helminthen mehrfach nachgewiesen werden. Eines dieser Proteine ist das Major Sperm Protein (MSP), dessen mRNA auschließlich in männlichen Nematoden und in schon geschlechtlich differenzierten, männlichen Larvenstadien gefunden werden konnte.
Einleitung 12
Im Rahmen dieser Arbeit wird die Expression, Identifikation und Aufreinigung eines rekombinanten MSP von D. viviparus beschrieben. In anschließenden Immunisierungsversuchen an Rindern wurde das immunogene Potential dieses Proteins in Verbindung mit unterschiedlichen Adjuvantien getestet. Der Einsatz des MSP erfolgte dabei als einzelnes Protein oder aber in Kombination mit anderen rekombinanten Proteinen. Eine Belastungsinfektion der Tiere mit Lungenwurmlarven diente schließlich zur Überprüfung einer eventuellen protektiven Wirkung der Impfstoffe. Ein weiteres Ziel war die Entwicklung und Validierung eines auf dem rekombinanten MSP basierenden ELISA zur Diagnose von Lungenwurminfektionen. Zudem konnten Unterschiede in der Transkription des MSP in verschiedenen Larvenstadien und in männlichen und weiblichen adulten D. viviparus dargestellt werden.
Schrifttum 13
2 Schrifttum
2.1 Die Dictyokaulose des Rindes
2.1.1 ErregerDer 1782 erstmals von Bloch beschriebene große Lungenwurm des Rindes, Dictyocaulus viviparus, ist als Nematode in der Ordnung Rhabditina der Familie Trichostrongylidae mit der Unterfamilie Dictyocaulinae zuzuordnen. Er parasitiert als adulter Wurm in den Bronchien und der Trachea von Rindern und einigen Wildwiederkäuern und ist der Verursacher der parasitären Bronchopneumonie (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969;
PRESIDENTE et al. 1972; PRESIDENTE u. KNAPP 1973; SCHNIEDER 2006).
Neben D. viviparus gehören als weitere Arten D. filaria, D. arnfieldi, D. eckerti und D. capreolus der Unterfamilie Dictyocaulinae an, wobei diese ein jeweils anderes
Wirtsspektrum besitzen. Auf die kleinen Wiederkäuer als Wirte beschränkt ist D. filaria, während D. arnfieldi bei Pferd und Esel beschrieben wurde (GOTHE 1983; GOTHE u.
KANDELS 1984; HASSLINGER 1989). D. eckerti wurde bei einer größeren Anzahl an Wildwiederkäuerarten aufgefunden, demgegenüber konnte D. capreolus erst kürzlich ausschließlich bei Elchen und Rotwild nachgewiesen werden (DIVINA et al. 2002; ENIGK u.
HILDEBRANDT 1969; HÖGLUND et al. 1999; HÖGLUND et al. 2003b). Die Bestätigung der beiden letztgenannten Spezies als eigenständige Arten gelang durch die Etablierung molekularbiologischer Methoden (EPE et al. 1997; GIBBONS u. HÖGLUND 2002;
HÖGLUND et al. 1999; SCHNIEDER et al. 1996a; VON SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. 1997)
Lungenwurmspezies, die bei mehreren Wirtstierarten vorkommen können, zeigen eine unterschiedlich ausgeprägte Anpassungsfähigkeit an ihre Wirte. Die Ausbildung einer patenten Infektion durch D. arnfieldi findet häufiger beim Esel als beim Pferd statt (HASSLINGER 1989; URQUHART et al. 1996), ebenso ist das Rind empfänglicher für D. viviparus als Wildwiederkäuer (KUTZER 1988).
Schrifttum 14
2.1.2 Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung
Dictyocaulus viviparus ist ein weltweit verbreiteter Nematode, der in Regionen mit Rinderhaltung und zumindest periodisch auftretenden gemäßigten Temperaturen von 15-20 °C zu finden ist (SCHNIEDER 2006). In Österreich konnte eine endemische Durchseuchung feuchter Weiden entlang von Flussläufen festgestellt werden. Über 1200 Meter hoch gelegene Weiden dagegen wiesen einen geringen Befall mit Lungenwurmlarven auf (PFEIFFER 1971).
In Schweden wurde in den Jahren 1997 und 1998 bei einer Untersuchung von 15 ökologisch betriebenen Milchviehbeständen bei 5 bzw. 9 Betrieben serologisch eine Lungenwurminfektion bei mindestens einem Tier der Herde nachgewiesen, wobei nur in zwei Beständen klinische Symptome einer Dictyokaulose beobachtet wurden (HÖGLUND et al.
2001). Nachfolgende serologische Studien in Schweden zeigten eine Prävalenz von ca. 40 % bei erstsömmrigen Rindern, die unabhängig von der geographischen Region und vom Management der Betriebe war. Allerdings wurde hier im Gegensatz zu der 2001 durchgeführten Erhebung bei keinem der untersuchten ökologisch gehaltenen Tiere eine Infektion mit D. viviparus diagnostiziert (HÖGLUND et al. 2004).
In den Niederlanden entsprach die Seroprävalenz bei ein- und zweijährigen Rindern mit etwa 40 % der in Schweden bestimmten (PLOEGER et al. 2000), im Jahr 1992 konnte sogar eine Prävalenz von 77 % ermittelt werden (EYSKER et al. 1994). Bei Untersuchungen an 121 Rindern, die im Verlauf eines Jahres an einem Schlachthof in Belgien durchgeführt wurden, fanden sich bei 7 % der Tiere Antikörper gegen Lungenwürmer (AGNEESSENS et al. 2000).
In Niedersachsen erwiesen sich 103 von 258 beprobten Herden als serologisch positiv, was einer Prävalenz von knapp 40 % entsprach (SCHNIEDER et al. 1993). Der nach der Schlachtung von 15 Bullen eines Betriebes in Schleswig-Holstein vorgenommene Nachweis adulter Helminthen ergab bei 73 % der Tiere eine Infektion mit D. viviparus (REHBEIN et al.
2003).
Aus England und Wales wurde seit 1993 ein vermehrtes Auftreten von Dictyokaulose gemeldet, wobei im Jahr 1997 mit über 500 Fällen einer Herdenerkrankung ein vorläufiger Höhepunkt erreicht wurde. Hierbei waren vorwiegend adulte Kühe und nicht erstsömmrige Rinder betroffen (DAVID 1993; MCKEAND 2000).
Schrifttum 15
Ein Fallbericht aus Australien beschrieb erstmals den Ausbruch von parasitärer Bronchopneumonie in der tropischen Klimazone in Nord-Queensland (TOWNSEND et al.
1992). Hier kam es in einer Herde von über 1200 Rindern innerhalb eines Monats zu 48 Todesfällen infolge einer Lungenwurminfektion. Von den verbliebenen 1190 Tieren zeigten ca. 25 % klinische Symptome.
Der wirtschaftliche Schaden eines Betriebes mit 100 Milchkühen, in welchem eine Dictyokaulose mit mildem Verlauf auftritt, wurde Ende der neunziger Jahre in Großbritannien mit ca. 5000 bis 6000 ₤ angegeben. Bei erschwerten Krankheitssymptomen innerhalb einer Herde steigerte sich der Ausfall nach Hochrechnungen auf ca. 20000 ₤ (WOOLLEY 1997).
2.1.3 Biologie und Entwicklungszyklus
Der Entwicklungszyklus von D. viviparus ist homoxen. Die in den größeren Bronchialgefäßen lebenden adulten Weibchen legen embryonierte Eier ab, die über das Flimmerepithel der Trachea in den Kehlkopfbereich transportiert werden. Während ein kleiner Teil der Eier oder der schon geschlüpften Larven ausgehustet werden kann, wird die größere Menge abgeschluckt. Über die Passage des Magen-Darmtrakts gelangen die dann geschlüpften Larven mit dem Kot der Rinder in die Außenwelt (SCHNIEDER 2006;
TAYLOR 1951; URQUHART et al. 1996). Hier wird die Entwicklung der mit dem Kot ausgeschiedenen ersten Larven (L1) in die dritten, für das Rind infektiösen Larven (L3) vollzogen. Die unbescheideten L1 können sich bei günstigen klimatischen Voraussetzungen innerhalb von fünf Tagen in zweifach bescheidete L3 entwickeln, wobei die Scheiden aus den nicht abgestreiften Kutikula der vorangegangenen Häutungen bestehen (SCHNIEDER 2006;
TAYLOR 1951; URQUHART et al. 1996). Über die gesamte Zeitdauer außerhalb des Wirtstieres wird von den bescheideten Larven keine Nahrung zu sich genommen, der Stoffwechsel wird über die in Granula eingeschlossenen Energiereserven der L1 betrieben (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; TAYLOR 1951; URQUHART et al. 1996).
Da Rinder nicht in unmittelbarer Nähe der Kothaufen weiden, müssen sich die infektiösen L3
von diesen fortbewegen, wobei sie aufgrund ihres mangelnden aktiven Wanderungsvermögens auf passive Translokation angewiesen sind. Diese kann entweder über die Verbreitung des Kotes durch Vögel, Käfer oder Wild erfolgen, oder aber durch koprophile Pilze der Gattung Pilobolus (DONCASTER 1981; JORGENSEN et al. 1982; SCHNIEDER et
Schrifttum 16
al. 1989). Diese keimen erst nach Passage des Darmes von Herbivoren aus. In die sich entwickelnden Sporangien dringen die L3 von basal ein und werden durch das explosive Aufplatzen der reifen Fruchtkörper mehrere Dezimeter vom Kothaufen weggeschleudert (DONCASTER 1981).
Nach oraler Aufnahme der Larven werden diese im Dünndarm der Wirte durch Gallenflüssigkeit aktiviert (JORGENSEN 1973) und dringen unter Verlust der Scheiden durch die Schleimhaut. Über die Lymphe erreichen sie die Mesenteriallymphknoten, in denen sich die L3 durch Häutung in vierte Larven umwandeln (JARRETT et al. 1957; SOLIMAN 1953). Über den Ductus thoracicus und die Vena cava cranialis gelangen die Larven in die rechte Herzkammer, von der sie über die Arteria pulmonalis in die Kapillargebiete der Lunge geschwemmt werden. Nach Überwinden der arterio-alveolären Schranke findet in den Alveolen eine letzte Häutung zu geschlechtlich differenzierten, präadulten fünften Larven statt. Diese sind ungefähr eine Woche post infectionem (p.i.) in den Bronchioli und Bronchien zu finden, in denen sie in den folgenden zwei bis drei Wochen zu geschlechtsreifen Würmern heranreifen (TAYLOR 1951). Diese besitzen als weibliche Würmer eine Länge von bis zu 8 cm, wohingegen männliche Würmer mit 3-5 cm meistens deutlich kleiner sind (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; SCHNIEDER 2006).
Die Präpatenz beträgt 21-25 Tage, während die Patenz eine maximale Dauer von zwei Monaten einnehmen kann (JARRETT et al. 1957; SCHNIEDER 2006; URQUHART et al.
1996).
Werden in der Außenwelt befindliche dritte Larven von D. viviparus Temperaturen unter 8 °C ausgesetzt, wird die Entwicklung zum geschlechtsreifen Wurm im Wirtstier vorübergehend im frühen präadulten Stadium unterbrochen (BARTH u. PRESTON 1987; PFEIFFER 1976).
Dieses auch von anderen Nematoden bekannte Phänomen wird als Hypobiose bezeichnet und dient zur Überwinterung der Larven bzw. Präadulten. Eine weitere Möglichkeit zur Fortsetzung des Infektionsgeschehens über mehrere Jahre besteht in der Überwinterung von Larven auf der Weide, wie sie mehmals unter geeigneten klimatischen Bedingungen nachgewiesen werden konnte (JARRETT et al. 1955; PFEIFFER u. SUPPERER 1980;
SCHNIEDER et al. 1989).
Schrifttum 17
2.1.4 Klinik und Pathogenese
URQUHART et al. (1996) teilen den Krankheitsverlauf der Dictyokaulose in vier Phasen ein.
Diese Gliederung beinhaltet zu Beginn der Erkrankung eine Penetrationsphase, an die sich die Phasen der Präpatenz, Patenz und Postpatenz mit unterschiedlichen klinischen und pathologischen Befunden anschließen.
Die auf die orale Aufnahme der Larven folgende Penetrationsphase wird über die Dauer von einer Woche beobachtet. Hier findet die Wanderung der Larven im Körper des Wirtes vom Darm in die Lunge statt. Zu diesem Zeitpunkt zeigen die Tiere keine klinischen Symptome, zudem werden keine pathologischen Veränderungen an den Lungen festgestellt. Die Penetration der Darmschleimhaut durch das Eindringen der Larven äußert sich nur in einer subklinischen, katarrhalischen Enteritis (JARRETT et al. 1957).
Mit dem Beginn der Larvenentwicklung in den Alveoli beginnt die Phase der Präpatenz, die bis ungefähr zum 25. Tag p.i. andauert. Die zu Anfang dieser Phase vorliegende Bronchiolitis wird mit den Wanderungsbewegungen der Präadulten zu einer Bronchitis. Beide Entzündungsreaktionen sind gekennzeichnet durch die Bildung zellulärer Infiltrate von Eosinophilen, Neutrophilen und Makrophagen in der Wand und im Lumen der luftführenden Wege, die später noch zusätzlich durch gebildeten Mukus verlegt werden (JARRETT et al.
1957; URQUHART et al. 1996). Diese Veränderungen verursachen das erste Auftreten klinischer Symptome, die als Tachypnoe, Husten und einzelne Fieberschüben beobachtet werden können (PFEIFFER 1971).
In der Patenz von Tag 26 bis Tag 60 p.i. wird das Krankheitsgeschehen durch die adulten Lungenwürmer beherrscht, die jetzt das Bild der parasitären Bronchopneumonie in voller Ausprägung hervorrufen. Die durch die Anatomie der Rinderlunge vorgegebene Trennung der Lungenläppchen bewirkt eine Beschränkung der entzündeten Bereiche auf die Regionen der Lunge, die mit adulten Würmern besiedelt sind. Dort sind ein hyperplastisches Bronchialepithel mit Verlust des Zilienbesatzes und eine weiterhin starke zelluläre Infiltration festzustellen. Durch den Verlust des Flimmerepithels und die Bildung von undifferenzierten Zellen als Ersatz wird die sogenannte mukoziliäre Clearance als Reinigungsmechanismus der Lunge eingeschränkt, worauf leichter eine Infektion mit bakteriellen Sekundärerregern folgen kann. Eine vermehrte Schleimproduktion durch funktionell veränderte sekretorische Zellen äußert sich klinisch durch Nasenausfluss (SCHNIEDER et al. 1989; SHOO et al. 1990).
Schrifttum 18
Makroskopisch sind diese veränderten, scharf umschriebenen Bezirke als emphysematös, oedematös oder atelektatisch zu beschreiben (JARRETT et al. 1957; MICHEL u. SHAND 1955; URQUHART et al. 1996).
Bei der Untersuchung der erkrankten Rinder kann je nach Krankheitsgrad Husten, Tachypnoe und Fieber festgestellt werden. Auskultatorisch sind Atemgeräusche unterschiedlicher Ausprägung wahrzunehmen (DÜWEL 1971; JARRETT et al. 1957; MICHEL u. SHAND 1955). Die Dyspnoe als prägendes Merkmal der Erkrankung wird auch durch einen Anstieg der alveolo-arteriellen Sauerstoffdifferenz sowie einer verkleinerten Compliance der Lunge charakterisiert. Damit steigt der für die Atmung erforderliche Energieaufwand an, der Erhaltungsbedarf des Tieres ist dem entsprechend trotz einer krankheitsbedingten verminderten Futteraufnahme ebenfalls erhöht. Die Tiere zeigen einen deutlichen Gewichtsverlust, bei Milchkühen tritt eine Verringerung der Milchleistung auf (LEKEUX et al. 1985; MICHEL u. SHAND 1955). Schwer erkrankte Tiere können im Verlauf der Präpatenz oder der Patenz verenden (PFEIFFER 1971; URQUHART et al. 1996).
Der Beginn der Postpatenz ab Tag 61 p.i. ist durch das Absterben der adulten Lungenwürmer gekennzeichnet. In dieser bis Tag 90 p.i. andauernden Phase steht die Regeneration der Lungen und eine Verbesserung des Kranheitsbildes im Vordergrund, wobei bei bis zu 25 % der schwer erkrankten Tiere eine Verschlechterung eintreten kann. Diese wird zum einen auf die als „Epithelialisation“ beschriebene, ätiologisch ungeklärte Proliferation der Typ-II Pneumozyten der Lunge zurückgeführt, die bei einem Teil der Rinder vorliegt. Zum anderen kann eine durch bakterielle Sekundärinfektionen verursachte Bronchopneumonie zu weiteren Komplikationen führen (URQUHART et al. 1996).
2.1.5 Immunität
Die durch Parasiten ausgelösten Immunreaktionen im Wirt umfassen sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten des Abwehrsystems. Die gebildeten Antikörper der Klassen IgM, IgG, IgA und IgE erfüllen dazu unterschiedliche Funktionen, wobei als vorherrschender Mechanismus zum Schutz vor Helminthen die zellvermittelte Zytotoxizität auftritt. Eine Aktivierung des mittels Fc-Rezeptoren an Mastzellen der Schleimhäute gebundenen IgE durch Antigene der Parasiten bewirkt dabei eine Freisetzung von Histamin. Dieses verursacht eine erhöhte Permeabilität der Mukosa, womit die durch gleichzeitig ausgeschüttete
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chemotaktische Mediatoren angelockten Zellen des Immunsystems und Immunglobuline leichter in das Lumen von Atmungs- und Gastro-Intestinaltrakt gelangen können (JARRETT 1973; SOULSBY 1985). Dort greifen dann vorwiegend eosinophile Granulozyten im Rahmen der komplement-abhängigen und der antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität die Parasiten an, in dem sie aus ihren Granula oxidierende Substanzen freisetzen (CALLAHAN et al. 1988; SOULSBY 1985).
Immunreaktionen im Verlauf der Dictyokaulose der Rinder führen nach einer Erstinfektion zu einer protektiven Immunität, wie sie von JARRETT et al. (1957) beschrieben wurde. Daher sind vorwiegend junge, erstsömmrige Tiere von einer Lungenwurminfektion betroffen. Ohne wiederholte, kontinuierliche Reinfektionen mit D. viviparus werden die Tiere nach einiger Zeit allerdings wieder empfänglich, worauf erneut eine patente Erkrankung mit klinischen Symptomen bei den dann adulten Rindern auftreten kann (MICHEL 1958). Verschiedene Abwehrmechanismen und daran beteiligte Bestandteile des Immunsystems wurden bereits bei der durch D. viviparus ausgelösten parasitären Bronchopneumonie beschrieben.
Die Beteiligung von Immunglobulinen an der Abwehr von Lungenwürmern wurde schon im Jahr 1955 von JARRETT et al. vermutet. Spätere Studien zeigten die Präsenz von lokalen und systemischen Antikörpern der Klassen IgA, IgM, IgG und der Subklassen IgG1 und IgG2, die spezifisch für Antigene von D. viviparus waren (COLLIE et al. 2001; MCKEAND et al.
1996; SCOTT et al. 1996). Nach einer ersten Infektion konnte ein starker Anstieg des IgM im Serum der Tiere nachgewiesen werden, welcher im weiteren Verlauf der Krankheit und bei immunen Tieren durch einen erhöhten IgG-Spiegel im Blut ersetzt wurde (MCKEAND et al.
1996). In der Lunge wurden hohe Antikörpertiter der Ig-Isotypen A, M und G sowie der Subklassen G1 und G2 nach einer Infektion festgestellt, wobei nach Reinfektionen die höchsten Werte gefunden wurden (SCOTT et al. 1996). Als antigene Strukturen dienen bei der Lungenwurminfektion stadienspezifisch unterschiedliche Bestandteile der Nematoden.
Bei den dritten Larven konnte eine Bindung der Immunglobuline sowohl an die Scheide als auch an die nach der Entscheidung der Larven vorhandene Kutikula beobachtet werden (GILLEARD et al. 1995; MCKEAND et al. 1996). Die adulten Würmer besitzen zum einen ebenfalls auf ihrer Oberfläche Epitope, zum anderen erweisen sich die von ihnen sezernierten sogenannten exkretorisch-sekretorischen Produkte als stark immunogen (BRITTON et al.
1992a; MCKEAND et al. 1996).
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Bestimmungen des gesamten IgE im Serum infizierter Kälber zeigten eine signifikante Korrelation von hohen Titern dieses Antikörpers zur Protektion gegen D. viviparus. Es konnte allerdings kein Zusammenhang zwischen für Lungenwurmantigene spezifischem IgE und dem Schutz vor Dictyokaulose erstellt werden (KOOYMAN et al. 2002).
Eine individuelle Antigenerkennung nach Infektion mit Lungenwürmern und eine darauffolgende heterogene Antikörperbildung wurden bei Rindern unter gleichen Versuchsbedingungen aufgefunden. Bei entsprechend durchgeführten Studien an Meerschweinchen konnte eine genetische Kontrolle der Immunreaktionen nachgewiesen werden (BRITTON et al. 1992b).
Die in der Lunge von Rindern nach einer experimentellen Infektion gemessene Expression einiger Zytokine wies an Tag 15 p.i. die höchsten Werte auf und sank bis Tag 42 p.i. wieder auf die Basiswerte nicht infizierter Tiere ab. Der Anstieg der Interleukine -4, -5, -10 und -13 sowie des Interferon γ in Verbindung mit einer negativen Korrelation des IgG1-Titers im Serum deuten nach Ansicht der Autoren auf eine Th2-dominierte Immunantwort bei der Dictyokaulose der Rinder hin (JOHNSON et al. 2005).
Im Verlauf einer Lungenwurminfektion wird bei Rindern in einer frühen Phase der entstehenden Entzündungsreaktionen die Bildung von Proteinen der akuten Phase induziert (GANHEIM et al. 2004). Ein Anstieg von Haptoglobin, Fibrinogen und Serumamyloid A konnte in der Präpatenz ebenso gemessen werden wie eine erhöhte Menge eosinophiler Granulozyten im Serum der Tiere. Diese absolute Eosinophilie zeigte 14 bis 21 Tage p.i. eine signifikante Differenz zum Zeitpunkt vor der Infektion.
Im Anschluss an eine D. viviparus-Infektion entsteht wie bereits geschildert eine belastbare Immunität. Von besonderem Interesse war daher die Frage, ob sich diese Immunität auch unter einer Anthelminthika-Behandlung der erstsömmrigen Rinder bilden konnte. Mit Hilfe verschiedene Studien wurde belegt, dass sowohl nach Verabreichung von makrozyklischen Laktonen als auch nach Gabe von Benzimidazolen eine Immunantwort stimuliert wird, die allerdings teilweise schwächer war oder keine protektive Wirkung zeigte. Dieses konnte zum einen im Anschluss an eine Behandlung mit Boli, die den Wirksoff Ivermectin oder Fenbendazol über die gesamte Weidesaison freisetzten, nachgewiesen werden (SCHNIEDER et al. 1998; SCHNIEDER et al. 1996b). Zum anderen wurde nach einmaliger Therapie mit Doramectin oder Eprinomectin in der frühen patenten Phase der Krankheit eine Stimulierung
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des Abwehrsystems beobachtet (HÖGLUND et al. 2003a; TAYLOR et al. 2000). Es zeigte sich zudem, dass bei einer Behandlung mit Ivermectin drei, acht und 13 Wochen nach Austrieb der Rinder auf eine mit Larven kontaminierte Weide ein ausreichender Schutz vor einer Reinfektion mit klinischen Symptomen entstehen kann (TAYLOR et al. 1988). Auch nach der Eingabe von Oxfendazol- und Ivermectin-Boli vier Wochen nach der letzten Vakzinierung konnte in mit röntgenattenuierten Larven immunisierten Tieren eine protektive Immunität hervorgerufen werden (GRIMSHAW et al. 1996).
Im Rahmen der Parasit-Wirt-Interaktionen konnten verschiedene Schutzmechanismen des Parasiten gegen Immunreaktionen des Wirtes gefunden werden. Um sich gegen die von Zellen des Immunsystems freigesetzten oxidativen Substanzen zur Wehr setzen zu können, entwickelten Nematoden anti-oxidative Enzyme wie die Superoxid Dismutase oder die Glutathion Peroxidase (CALLAHAN et al. 1988). Adulte Lungenwürmer besitzen im Gegensatz zu dritten Larven die Fähigkeit, an ihre Oberfläche gebundene Antikörper zu entfernen (MCKEAND u. KENNEDY 1995). Dabei scheinen exkretorisch-sekretorische Produkte, die über proteolytische Aktivität Immunglobuline spalten können, eine Rolle zu spielen, wie es auch bei anderen Helminthen beschrieben wurde (FAGBEMI u. HILLYER 1991).
2.1.6 Diagnose
Der Nachweis einer Infektion mit D. viviparus kann am lebenden Tier über die Erhebung klinischer Befunde, über die parasitologische Untersuchung des Kotes oder über serologische Verfahren erfolgen.
Treten in einer Herde erstsömmriger Rinder Krankheitssymptome wie Husten oder Tachypnoe mehrere Wochen nach dem Austrieb auf und ist zudem vorberichtlich die Region als ein mit Lungenwürmern befallenes Gebiet bekannt, so kann zumindest die Verdachtsdiagnose Dictyokaulose gestellt werden (JARRETT et al. 1957; PFEIFFER u.
SUPPERER 1980; TAYLOR 1951). Auch wenn diese Beobachtungen nur bei einigen Kälbern der Gruppe gemacht werden können und andere als gesund bzw. nicht infiziert erscheinen, spricht JARRETT et al. (1957) von einem pathognomonischen Krankheitsbild.
Diese Ansicht wird allerdings von SCHNIEDER et al. (1989) nicht geteilt, die die erhobenen Befunde auch mit anderen ätiologischen Faktoren in Zusammenhang bringen.
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Die Bestätigung einer patenten Lungenwurminfektion ist mittels des Auswanderungsverfahrens möglich, bei dem mit dem Kot ausgeschiedene erste Larven nachgewiesen werden können (BAERMANN 1917). Dieser direkte Infektionsnachweis kann nicht in den Phasen der Prä- und Postpatenz durchgeführt werden, da in diesen Zeiträumen keine Larven ausgeschieden werden. Ein weiterer Nachteil der Technik besteht in der geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Wird das Auswanderungsverfahren innerhalb von drei Stunden nach Kotentnahme angesetzt, kann die Präsenz eines einzelnen weiblichen patenten Lungenwurmes 5-7 Wochen p.i. nachgewiesen werden (EYSKER 1997). Eine Lagerung der Proben für 24 Stunden bei 4 °C oder 16 °C bewirkt eine Reduktion der ausgewanderten Larven um 20 %, während eine Aufbewahrung bei 20°C schon in einer um 60 % reduzierten Larvenzahl resultierte (RODE u. JORGENSEN 1989). Wurde die Lagerungsdauer auf zwei Tage erhöht, konnten unabhängig von der Temperatut nur noch 20 % der Larven aufgefunden werden. Auch die Dauer des Auswanderungsverfahrens nimmt Einfluss auf das Ergebnis, da der größte Teil der D. viviparus-Larven erst nach 10 Stunden auswandert und anschließend innerhalb mehrerer Stunden sedimentiert (RODE u.
JORGENSEN 1989). Das Auffinden von Larven im Anschluss an eine schwache Infektion gelingt bei Kälbern zuverlässiger als bei adulten Tieren, da sich die Larven bei diesen in einem größeren Kotvolumen verteilen können (EYSKER 1997). Eine Kontamination mit verschiedenen Stadien von Erdnematoden kann besonders bei vom Boden gewonnenen Kotproben Schwierigkeiten bereiten, da die mikroskopische Differenzierung von Lungenwurmlarven notwendig wird (PFEIFFER u. SUPPERER 1980).
Eine modifizierte Form des Auswanderungsverfahrens wurde von BUCHWALDER (1963) entwickelt, der an Stelle des Trichters Spitzgläser verwendete. In vergleichenden Studien zwischen diesen beiden Techniken konnten mit Hilfe der nach Buchwalder veränderten Methode 137 % mehr Larven von D. viviparus nachgewiesen werden (MCKENNA 1999).
Als serologische Untersuchungsmethoden wurden seit Beginn der fünfziger Jahre eine Komplement-Bindungsreaktion (KBR), ein indirekter Hämagglutinationsassay (IHA) und mehrere Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) routinemäßig in der Diagnostik von Lungenwurminfektionen eingesetzt. Die KBR basierte auf einem Rohantigen, das aus adulten Würmern gewonnen worden war (CORNWELL u. MICHEL 1960). Mit diesem Test gelang die Detektion von komplementbindenden Antikörpern im Rahmen einer natürlichen oder
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experimentellen Infektion ab der fünften Woche p.i.. Die Möglichkeit einer Unterscheidung zwischen vakzinierten und nicht vakzinierten Tieren bestand hier aber nicht, da ebenfalls die im Anschluss an eine Immunisierung mit röntgenattenuierten Larven gebildeten Antikörper detektiert wurden (CORNWELL 1960).
Der Nachweis einer Lungenwurminfektion mittels des IHA auf der Grundlage von Antigen, welches aus adulten Lungenwürmern extrahiert worden war, wurde von BOKHOUT et al.
(1979) eingeführt. Der Test zeigte die Existenz von systemischen Antikörpern ab der sechsten Woche nach dem Austrieb an, wobei auch hier keine Differenzierung zwischen immunisierten und nicht immunisierten Tieren möglich war. Aufgrund fehlender Kreuzreaktionen mit anderen, bei Rindern relevanten Nematoden und wegen der positiven Korrelation zwischen klinischen Symptomen und IHA-Ergebnissen wurde diese Technik nach der Evaluierung im Tiergesundheitsdienst der Niederlande als Routinediagnostik angewendet (CORNELISSEN et al. 1997).
MARIUS et al. (1979) beschrieben erstmals die Verwendung eines ELISA zur Diagnose einer Dictyocaulus-Infektion. Dieser wies die gegen Antigene aus adulten D. viviparus reagierenden Immunglobuline ab der fünften Woche p.i. in Seren, Nasenausfluss oder Lungenspülungen nach. Hierbei wurde ein Anstieg von IgA nur lokal in den Lungenspülproben sowie im Nasenausfluss beobachtet, im Serum dagegen konnte spezifisches IgA nicht gefunden werden.
Ein ebenfalls auf dem Antigen von adulten Lungenwürmern basierender ELISA zeigte einen Titeranstieg von spezifischen, systemischen IgG bei nicht vakzinierten Kälbern ab der vierten Woche p.i. (BOON et al. 1982). Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen Ostertagia spp.und Cooperia spp. wurden auf einem niedrigen Level gefunden. Trotz dieser Tatsache konnte eine für die Herdendiagnostik ausreichende Spezifität und Sensitivität der Methode erreicht werden. Darüberhinaus wurde eine positive Korrelation zwischen den mit diesem Test gewonnenen Ergebnissen und der IHA-Technik, parasitologischen Befunden und klinischen Beobachtungen festgestellt.
Neben dem Antigen aus adulten D. vivparus setzte WASSALL (1991) in vergleichenden ELISA-Untersuchungen auch Antigen aus vierten Larven ein. Mit beiden ELISA war ein Anstieg der Antikörpertiter in natürlich und experimentell infizierten Rindern ab sechs
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Wochen p.i. zu beobachten. Vakzinierte Tiere dagegen zeigten keine bzw. nur eine leichte Erhöhung des Titers bei larvalem respektive adultem Antigen nach Immunisierung.
Ein weiterer ELISA mit somatischem Antigen von adulten Lungenwürmern wurde von TENTER et al. (1993) mit Seren von experimentell und natürlich infizierten Tieren etabliert.
Hier konnten über die Detektion von spezifischem IgG eine Spezifität, Sensitivität sowie positive und negative prediktive Werte von über 90 % zwischen der 13. und 17. Woche nach Austrieb der Rinder auf mit Larven kontaminierte Weiden erreicht werden.
Die Entwicklung eines indirekten ELISA auf der Grundlage eines aus den somatischen Proteinen adulter Lungenwürmer aufgereinigten Proteins wurde von DE LEEUW u.
CORNELISSEN (1991) beschrieben. Diese isolierten ein 17 kDa großes Antigen adulter Würmer, welches nicht mit Immunglobulinen gegen Fasciola hepatica, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora und Ascaris suum kreuzreagierte. Die mit diesem putativen MSP durchgeführten ELISA korrelierten positiv mit den ELISA, die auf der Basis von nicht aufgereinigtem adulten Antigen durchgeführt wurden, wobei diese aber Kreuzreaktionen gegen die oben genannten Nematoden aufwiesen. Ein weiterer Vergleich dieser beiden Methoden mit einem kompetitiven ELISA, dessen Durchführung mit dem isolierten Protein in Kombination mit monoklonalen Antikörpern gegen D. viviparus erfolgte, verdeutlichte die Vorteile des indirekten ELISA unter Verwendung des aufgereinigten Proteins (DE LEEUW u.
CORNELISSEN 1993). Mit diesem konnte sowohl eine Sensitivität als auch eine Spezifität von 97 % erreicht werden. Die erstmalige Detektion der Antikörper im Verlauf einer Infektion war zwischen der vierten und sechsten Woche p.i. möglich. Keines der vakzinierten Kälber wurde als positiv erkannt, so daß nach nachfolgenden umfangreichen Studien und gewissen Modifikationen 1995 der ELISA in der Routinediagnostik der Tiergesundheitsdienste der Niederlande die bis dahin verwendeten IHA und Kotuntersuchungen auf Lungenwürmer ersetzte (CORNELISSEN et al. 1997). Die Diagnose einer Dictyocaulus-Infektion mit dem ELISA erfolgte ab diesem Zeitpunkt über den Nachweis spezifischer IgG1-Antikörper. Dadurch gelang es, die Spezifität des ELISA auf 99,2 % und die Sensitivität auf 100 % zu erhöhen, womit eine signifikante Verbesserung gegenüber dem IHA mit 99,6 % bzw. 78,1 % erzielt werden konnte. Ein zweiter Vorteil im Vergleich des ELISA zum IHA bestand in der fehlenden Erkennung von vakzinierten Tieren.
Zusammen mit der bis zum 168. Tag p.i. anhaltenden Nachweisbarkeit der Infektion im
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ELISA trugen diese Eigenschaften zu dessen Evaluierung als Routinediagnostikum bei.
Zugleich wurde der ELISA als kommerzieller Testkit zur Diagnose einer Lungenwurminfektion auf dem europäischen Markt eingeführt (Ceditest® Lungworm, CEDI- DIAGNOSTICS, Lelystad, Niederlande).
Der erste mittels eines rekombinanten Antigens durchgeführte Nachweis lungenwurmspezifischer Immunglobuline fand zu Beginn der neunziger Jahre statt (SCHNIEDER 1992). Ein ca. 18 kDa großes Protein adulter Lungenwürmer wurde als ein Major Sperm Protein (MSP) von D. viviparus identifiziert und als rekombinantes Glutathion- S-Transferase Fusionsprotein exprimiert (SCHNIEDER 1993b). Im ELISA diente zum einen das Fusionsprotein und zum anderern das mit Thrombin vom GST-Tag geschnittene und anschließend aufgereinigte rekombinante MSP als Antigen. Mit beiden Präparationen lag die Spezifität nach experimentellen Infektionen bei über 99 % und die Sensitivität bei über 90 %. Im Anschluss an eine natürliche Exposition sank die Spezifität des ELISA basierend auf dem Fusionsprotein auf 90 % bei gleichbleibendem Wert für das geschnittene MSP, die Sensitivität betrug 85 % bzw. 70 %. Als weitere Einsatzmöglichkeit des rekombinanten Proteins wurde ein Immunoblot entwickelt, der mit dem puren MSP als Antigen in Form eines Schnelltestes - des Dipstick Immunoassays - eine Spezifität und eine Sensitivität von über 99 % bei experimentell infizierten Tieren aufwies (SCHNIEDER 1993a). Beide Techniken beruhten auf dem Nachweis spezifischer Antikörper des Isotyps G im Serum.
Nach Evaluierung wurde der Immunoblot zur Diagnose von Serokonversionen gegen Lungenwürmer im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesetzt.
2.1.7 Bekämpfung
Die Bekämpfung der Dictyokaulose kann prophylaktisch über weidetechnische Maßnahmen, biologische Kontrolle der Parasiten und Vakzinierung erfolgen. Als Therapie und Metaphylaxe sind Anthelminthika verschiedener Wirkstoffklassen das Mittel der Wahl.
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2.1.7.1 Weidetechnik
Als eine strategische Methode zur Vorbeugung von Lungenwurminfektionen wurden unterschiedliche Weidetechniken mit oder ohne zusätzlicher Anthelminthikabehandlung entwickelt. SELMAN (1984) bewertete die ganzjährige Aufstallung erstsömmriger Rinder als ungeeeignet, da infolge fehlender Exposition der Kälber zu infektiösen Larven keine protektive Immunität ausgebildet wird. Damit sind die Tiere im zweiten Jahr voll empfänglich für eine Infektion mit D. viviparus. Bei regelmäßigem Weideumtrieb gelangen die Rinder nach mehreren Tagen auf eine neue, nicht kontaminierte Fläche (POUPLARD 1968;
ROMMEL u. SCHNIEDER 1989). Gleichzeitig soll ein gemeinsamer Weidegang von jungen und adulten Tieren vermieden werden, da letztere als unerkannte Ausscheider fungieren können (JARRETT et al. 1955; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Aus diesem Grund werden bei dieser Weidetechnik erstsömmrige Kälber auch erst nach Ablauf von einem Jahr auf Weiden getrieben, die vorher von älteren Rindern beweidet worden sind (PFEIFFER u.
SUPPERER 1980). Trotz dieser Vorsorgemaßnahmen wird aber aufgrund der zahlreichen Eintragungsmöglichkeiten der Lungenwurmlarven nur eine Minimierung der Infektionsdosis erreicht, nicht aber eine völlige Befreiung der Weiden von den infektiösen Stadien (ROMMEL u. SCHNIEDER 1989). Des Weiteren kann dieses Weidemanagement nur bei den Betrieben angewendet werden, die eine ausreichende Anzahl an Ausweichflächen zur Beweidung besitzen. Das „Weybridger Dose and Move System“, bei dem vor dem einmaligem Umtrieb im Sommer eine Anthelminthikabehandlung der Tiere durchgeführt wird, bietet über einen langen Zeitraum der Weidesaison Schutz; allerdings kann es im Spätsommer oder Herbst noch zu vereinzelten Ausbrüchen der Dictyokaulose kommen (ROMMEL u. SCHNIEDER 1989).
2.1.7.2 Biologische Bekämpfung
Um eine Aufnahme infektiöser Larven beim Weiden und deren Ausbreitung auf der beweideten Fläche zu verringern, setzten FERNANDEZ et al. (1999) Isolate des Pilzes Duddingtonia flagrans ein. Dieser im Kot von Wiederkäuern und Pferden nachgewiesene Organismus ist in der Lage, mit Hilfe eines Hyphennetzes Nematodenlarven zu immobilisieren und anschließend zu zerstören. Nach Zusatz von 6250 Chlamydosporen/ g Kot konnte im Labor eine signifikante Reduktion der Larvenzahl im Kot erreicht werden, die in
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Freilandversuchen bestätigt wurde. Eine Supplementierung von Pilzsporen zum Futter soll nach LARSEN (1999) in einer verminderten Larvenexposition auf der Weide resultieren, womit klinische Erkrankungen verhindert werden. Inwieweit sich diese Technik zur Praxisreife entwickelt, bleibt abzuwarten.
Eine Inhibierung der Motilität von ersten und dritten Lungenwurmlarven konnte in vitro durch bestimmte Inhaltsstoffe von Pflanzen erzielt werden (MOLAN et al. 2000). Die in den Versuchen verwendeten Tannine und Lactone entstammen Pflanzen, die weidendem Rotwild als Futter dienen können. Eine bei diesen Tieren beobachtete verminderte Parasitenproblematik wird daher durch die Autoren auf die Aufnahme der anthelminthisch wirksamen Substanzen zurückgeführt.
2.1.7.3 Anthelminthika
Zur Behandlung einer Infektion mit D. viviparus steht ein breites Spektrum an anthelminthisch wirksamen Substanzen zur Verfügung. Neben dem zur Gruppe der Imidazothiazole gehörenden Levamisol werden makrozyklische Laktone und Benzimidazole eingesetzt. Im Rahmen der nachfolgenden Tabelle 1 soll nur auf die in den zurückliegenden 10-15 Jahren neu entwickelten bzw. verwendeten Anthelminthika eingegangen werden.
Bezüglich des davorliegenden Zeitraums soll auf die Arbeit von KOHLER-BELLMER (1991) verwiesen werden.
Eine strategische Bekämpfung der Dictyokaulose ist durch mehrmalige Applikation von Doramectin und Ivermectin im Verlauf der Weidesaison möglich (SCHNIEDER u.
WHEELER 1991; VERCRUYSSE et al. 1998). Das wie diese beiden Wirkstoffe zur Gruppe der Avermectine zugehörige Eprinomectin wird aufgrund einer Wartezeit von null Tagen auf Milch vorwiegend zur Therapie von Helminthosen der Milchkühe genutzt. Ein Einsatz bei der strategischen Kontrolle von Weideparasiten der Rinder zeigte allerdings keinen Erfolg hinsichtlich der Prophylaxe von Lungenwurmerkrankungen (EPE et al. 1999).
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Tabelle 1: Exemplarische Auswahl neuerer Anthelminthika zur Behandlung einer Lungenwurminfektion - : keine Angaben
Referenz
EYSKER et al. (1996) VERCRUYSSE et al. (1997)
HUBERT et al. (1997) RANJAN u. DELAY (2004) VERCRUYSSE et al. (1997)
WILLIAMS et al. (1992)
YAZWINSKI et al. (2006)
YAZWINSKI et al. (1994) EDDI et al. (1993) GOUDIE et al. (1993) WHELAN et al. (1995) WEATHERLEY et al. (1993)
STROMBERG et al. (1999)
STROMBERG et al. (1999)
VON SAMSON- HIMMELSTJERNA et al (2000)
HARDER et al. (2003) Persistenz
der Effizienz
6 Wochen mit
> 90 % 6 Wochen
mit
> 90 % 6 Wochen
mit
> 90 % -
4-7 Wochen
6 Wochen mit
> 80 %
- Adulte
> 99 %
> 99 %
100 %
100 %
> 99,9 %
100 %
100 % Präadulte
> 99 %
> 99 %
> 99 %
-
-
-
- Effizienz gegen Dictyocaulus viviparus Larven
> 99 %
> 99 %
> 99 %
-
> 99,9 %
-
100 % Art der
Applikation
Pour-on
Injektion
Long-acting Injektion
Injektion
Injektion
Pour-on
Oral / Injektion Wirkstoff
Moxidectin
Abamectin
Doramectin
PF1022A / Emodepsid Klasse der
Anthelminthika - Gruppe
Makrozyklische Laktone
- Milbemycine
Makrozyklische Laktone
-Avermectine
Cyclooctadepsipeptide
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2.1.7.4 Immunisierung
Die passive Immunisierung empfänglicher Kälber gelang durch die Übertragung von Hyperimmunseren infizierter Rinder. Hierbei wurde aber ein Schutz vor einer Infektion nur für einen Zeitraum von 8-10 Tagen erreicht. Die Immunität schwankte in ihrer Ausbildung zudem stark mit dem Antikörpertiter des Spendertieres, so dass diese Methode nicht weiter verfolgt wurde (JARRETT et al. 1957; POUPLARD 1968).
Eine aktive Impfung gegen D. viviparus wurde erstmals von JARRETT et al. (1957) vorgestellt. Diese impften Kälber mit lebenden dritten Larven, deren Infektiösität vorher durch eine Röntgenbestrahlung von 400 Gy herabgesetzt worden war. Die sogenannten attenuierten Larven wandern nach peroraler Applikation in die Lunge, wo der überwiegende Teil als immature Stadien abstirbt. Während dieser verkürzten Entwicklung stimulieren die Larven das Immunsystem, so dass bei einem korrekt befolgten Impfschema eine belastbare Resistenz gegenüber Lungenwürmern entsteht (DÜWEL 1963; JARRETT et al. 1958;
PFEIFFER u. SUPPERER 1980; POUPLARD 1968). Dazu sollte vor Beginn der Weideperiode eine zweimalige Immunisierung der erstsömmrigen Rinder mit jeweils 1000 attenuierten Larven in einem Abstand von vier Wochen erfolgen. Nach weiteren zwei bis vier Wochen können die Tiere dann ausgetrieben werden, da sich bis zu diesem Zeitpunkt eine Grundimmunität gebildet hat (DÜWEL 1971; JARRETT et al. 1958; PFEIFFER u.
SUPPERER 1980). Diese muss durch eine bald darauffolgende natürliche Infektion geboostert werden, um auch in stark durchseuchten Beständen wirksam zu sein (DÜWEL 1971; PFEIFFER u. SUPPERER 1980).
Die erzielte Resistenz äußert sich in einem Schutz der Rinder vor klinischer Dictyokaulose.
Eine Larvenausscheidung, die epizootiologisch keine Rolle spielt, kann dagegen nicht bei allen Tieren verhindert werden. Die Ausbildung einer patenten Infektion kann dabei sowohl ohne als auch mit einer natürlichen Boosterung im Anschluss an die Vakzinierung stattfinden (DÜWEL 1971; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Klinisch manifeste Impfdurchbrüche wurden bei gleichzeitigem starkem Befall mit anderen Parasiten beobachtet (DÜWEL 1963).
Die Entwicklung der Immunität wird bei Durchführung des oben beschriebenen Impfschemas nicht durch den Gebrauch von Anthelminthika gefährdet, wenn diese bei Austrieb oder während der Weidesaison appliziert werden. Dieses konnte für Doramectin (JACOBS et al.
1996; TAYLOR et al. 2000), welches ein- oder zweimalig injiziert wurde, ebenso
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nachgewiesen werden wie für Ivermectin und Oxfendazol, welche einmalig als Boli verabreicht wurden (GRIMSHAW et al. 1996).
Die Applikation der röntgenattenuierten Larven bei tragenden und bei laktierenden Färsen zeigt keine Auswirkungen auf Trächtigkeit oder Milchproduktion (HOLZHAUER et al.
2005). Eine Anwendung bei Färsen vor der Integration in die Gruppe der Milchkühe kann daher mit der gleichen Sicherheit und Wirkung erfolgen wie bei erstsömmrigen Rindern.
Der Erfolg dieser Vakzine äußert sich in der Tatsache, dass sie nach ihrer Markteinführung Anfang der sechziger Jahre für nahezu vierzig Jahre der einzige gegen D. viviparus wirksame kommerzielle Impfstoff blieb. Der Einsatz dieser protektiven Immunisierung ging allerdings mit der Durchführung strategischer Kontrollprogramme gegen Nematoden auf der Basis von Anthelminthika stark zurück (BAIN 1999; MAWHINNEY 1997). Auch in Norddeutschland wurde die Vakzine 1987 nur vereinzelt verwendet, wohingegen Ende der neunziger Jahre in einer Erhebung in der gleichen Region kein Einsatz des Impfstoffes mehr festgestellt werden konnte (SCHNIEDER et al. 1999). In den Niederlanden dagegen nutzten 33,8 % der befragten Betriebe die Möglichkeit einer Vakzinierung der erstsömmrigen Kälber (BORGSTEEDE et al. 1998). In einigen Ländern, inklusive Deutschland, ist die Vakzine zurzeit vom Markt genommen worden (SCHNIEDER 2006).
Mit der erwünschten Wirksamkeit der Impfung waren aber auch verschiedene Nachteile verbunden, wie beispielsweise die Möglichkeit der Larvenausscheidung nach der Immunisierung. Zudem nahm der Impfschutz nach wenigen Monaten wieder ab, so dass auch bei vakzinierten Tieren Erkrankungen auftreten konnten (DÜWEL 1971; PFEIFFER u.
SUPPERER 1980). Ein Auftreten der Dictyokaulose nach einer Challenge-Infektion wurde auch bei Kälbern beobachtet, die in einem Alter von unter zwei Monaten geimpft worden waren (DÜWEL 1971). Die als Impfstoff dienenden attenuierten, lebenden Larven führten zu einer auf eine kurze Zeit begrenzten Haltbarkeit und hohen Kosten der Vakzine. Die Produktion der Larven kann zudem nur mit Hilfe von infizierten Spendertieren geschehen, da eine in vitro-Kultur zur Gewinnung der Larven nicht möglich ist (BAIN 1999; MCKEAND 2000).
Die Verwendung von nativen und rekombinanten Proteinen in Impfversuchen gegen D.
vivparus wird in Kapitel 2.2.2.3 dargestellt.
Schrifttum 31
2.2 Immunisierungsversuche gegen Helminthen
Immunisierungsversuche gegen Parasiten werden seit mehreren Jahrzehnten trotz der erfolgreichen Behandlungsmöglichkeiten mit Antiparasitika durchgeführt. Dieses geschieht aufgrund des Verbraucherbewusstseins, das sich in einer vermehrten Nachfrage nach Lebensmitteln von unbehandelten Tieren und in einer vorbeugenden Erhaltung der Tiergesundheit äußert. Des Weiteren werden im Bereich der Helminthologie verstärkt Resistenzen gegenüber Anthelminthika beobachtet, deren Verbreitung und Neubildung sich durch Vakzinierungen als Prophylaxe verhindern lassen. Hierbei werden bevorzugt Vakzineoptionen entwickelt und getestet, die mittels biotechnologischer Verfahren hergestellt werden (DALTON u. MULCAHY 2001; SMITH 1999). Diese besitzen im Vergleich zu herkömmlichen (Lebend-) Vakzinen den Vorteil, kostengünstiger und stabiler zu sein.
Darüberhinaus werden keine Spendertiere zur Gewinnung der Larven benötigt (MCKEAND 2000). Zur Steigerung der Immunogenität dieser rekombinanten Impfstoffe und zur Immunomodulation müssen allerdings zusätzlich Adjuvantien eingesetzt werden, da Peptide oder Proteine in der Regel nicht ausreichende antigene Eigenschaften entfalten und alleine keine oder nur schwache zelluläre Immunreaktionen hervorrufen können. Aufgrund der nicht stattfindenden Aufnahme von Peptiden in das Zytosol der Zellen und einer damit einhergehenden fehlenden Präsentation der Antigene über MHC-I-Moleküle sind diese Substanzen ineffektiv in der Stimulierung einer Th1-abhängigen Immunantwort (JANEWAY u. TRAVERS 1997; SINGH u. O'HAGAN 2003). Weitere Faktoren, die die immunologischen Aspekte einer Vakzine beeinflussen können, sind die Dosis des Antigens und die Anzahl der Immunisierungen, das ausgewählte Adjuvans und die Applikationsart (DALTON u. MULCAHY 2001). Neben diesen Impfstoffen auf Basis von Proteinen werden verstärkt Glykane als antigen wirksame Strukturen untersucht. Die im Verlauf der posttranslationalen Modifikationen entstehenden Zuckermoleküle konnten dazu schon bei vielen Trematoden, Zestoden und Nematoden nachgewiesen und charakterisiert werden (HEIN u. HARRISON 2005). Bei D. viviparus konnten dabei erstmals bei Nematoden sogenannte Lewisx-Epitope gefunden werden, die von N-Glykanen der adulten Würmer gebildet werden (HASLAM 2000).
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2.2.1 Adjuvantien
Die in der Human- und Veterinärmedizin seit über 60 Jahren meistgenutzten Adjuvantien sind Mineralsalze auf der Basis von Aluminium (LINDBLAD 2004). In kommerziellen Impfstoffen zur Immunisierung von Tieren dienten bzw. dienen zudem das unvollständige Freundsche Adjuvans, welches wegen aufgetretener Nebenwirkungen zunehmend kritisch beurteilt wird, sowie Saponine zur Stimulation der Immunantwort (SINGH u. O'HAGAN 2003). Im Folgenden werden nach Einteilung der Adjuvantien in das Schema von COX u.
COULTER (1997) wichtige Aspekte der einzelnen Substanzen kurz geschildert.
2.2.1.1 partikuläre Adjuvantien
Als wichtigster Vertreter dieser Klasse sind die Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxid oder Kalium-Aluminiumsulfat (Alum) zu nennen. Nach Bindung der Antigene an diese 100-1000 nm großen Partikel werden die Komplexe von antigenpräsentierenden Zellen über Phagozytose aufgenommen, worauf im Anschluss an eine Präsentation über MHC II- Moleküle durch eine vermehrte Produktion von IL-4 eine Aktivierung der humoralen Immunität erfolgt. Die starke Modulation des Immunsystems in Richtung einer Th2-Antwort wird durch eine IL-4 vermittelte Hemmung der Differenzierung von Vorläuferzellen zu Th1- Zellen erzielt. Diese Induktion antikörperbildender Immunmechanismen ist ein Kennzeichen der Aluminiumverbindungen (COX u. COULTER 1997; LINDBLAD 2004; SINGH u.
O'HAGAN 2003). Im Rahmen dieser Abwehrreaktionen wird auch eine Stimulierung der IgE- Produktion durch Aluminiumsalze erreicht, womit diese Adjuvantien interessante Kandidaten für Vakzinen gegen Helminthen sein können. Für alle Impfstoffe mit Aluminiumkomplexen werden eine niedrige Toxizität und damit geringe Nebenwirkungen gefunden (LINDBLAD 2004).
Weitere Adjuvantien dieser Gruppe sind die Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das vollständige oder das unvollständige Freundsche Adjuvans. Auch hier beruht die Wirkung auf einer Komplexbildung und folgender Phagozytose. Wie bei den Aluminiumverbindungen führt eine langsame Freisetzung des Antigens zu einer verzögerten Resorption von der Applikationsstelle, womit sich die Dauer des antigenen Stimulus erhöht. Die dem vollständigem Freundschen Adjuvans zugefügten abgetöteten Mykobakterien (Mycobakterium tuberculosis) aktivieren zusätzlich über ihren Inhaltsstoff Muramyldipeptid
