Zur Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien in bakteriellen bestandsspezifischen Vakzinen für Puten

(1)

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Zur Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien in bakteriellen bestandsspezifischen Vakzinen

für Puten

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

H e i d i v a n d e r V e n

aus Hamburg

Hannover 2002

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. G. Glünder

1. Gutachter: PD Dr. G. Glünder

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach

Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2002

(3)

Diese Arbeit ist in Liebe und Dankbarkeit gewidmet:

meiner Großmutter Herta Köster, die immer für mich da war, meinem Kater Tschurkin stellvertretend für alle Tiere, denen ich ab sofort zur Verfügung stehe, meinen Eltern, die mich so lange unterstützt haben und nicht zuletzt meinem Großvater J.G.N. van der Ven, bei dem alles anfing

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(5)

Abkürzungsverzeichnis IX

1. EINLEITUNG 11

2. LITERATURÜBERSICHT 12

2.1. Adjuvantien 12

2.1.1. Definition und Geschichtliche Entwicklung von Adjuvantien 12 2.1.2. Wirkungsweise einiger Adjuvantien im Allgemeinen 13 2.1.3. Detaillierte Beschreibung klassischer Adjuvantien 17

2.1.3.1. Aluminiumhydroxid 17

2.1.3.2. Öl-Emulsionen 18

2.1.3.2.1. Wasser-in-Öl-Emulsionen 19

2.1.3.2.2. Öl-in-Wasser-Emulsionen 20

2.1.3.2.3. Freund’s inkomplettes Adjuvans (FIA) 20 2.1.3.2.4. Freund’s komplettes Adjuvans (FCA) 21 2.1.4. Übersicht über die Anwendung von Adjuvantien in Geflügel-

impfstoffen und über vergleichende Untersuchungen von Adjuvantien

22

2.1.5. In kommerziellen Vakzinen verwendete Adjuvantien 34

2.2. Antigene 35

2.2.1. Allgemeine Beschreibung 35

2.2.2. Charakterisierung ausgesuchter Antigene 35

2.2.2.1. Bordetella avium 35

2.2.2.1.1. Krankheitsbild durch Bordetella avium bei Puten: Putenschnupfen 37

2.2.2.2. Pasteurella multocida 39

2.2.2.2.1. Krankheitsbild durch Pasteurella multocida bei Puten: Geflügelcholera 40

2.3. Die Pute 43

2.4. Immunreaktion 44

2.4.1. Aspekte zur Entwicklung des Immunsystems beim Geflügel 45 2.4.2. Unterschiede der Humoralen Immunantwort des Geflügels zum

Säugetier

45

2.5. Methoden zur Immunprophylaxe und zur serologischen

Kontrolle 46

2.5.1. Impfung 47

2.5.1.1. Impfstoff 48

2.5.1.1.1. Bestandsspezifische Vakzinen 49

2.5.1.2. Applikationsweisen von Impfstoffen 52

2.5.2. Antikörpernachweis 53

2.5.2.1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 53

2.5.2.2. Immundiffusion 54

(6)

3. MATERIAL UND METHODEN 56

3.1. Versuchstiere 56

3.2. Versuchsablauf 56

3.3. Impfstoffe 58

3.3.1. Bakterielle Antigene 59

3.3.2. Adjuvantien 62

3.3.2.1. Aluminiumhydroxid 62

3.3.2.2. Gerbu Adjuvant 100 62

3.3.2.3. Mineralöl 63

3.3.2.4. Freund’s inkomplettes Adjuvans 64

3.3.2.5. Freund’s komplettes Adjuvans 64

3.3.3. Verwendete Impfstoffe und Kontrollen 64

3.3.3.1. Herstellung der Impfstoffe 64

3.3.3.2. Kommerzieller Impfstoff 66

3.3.3.3. Kontrollen 66

3.4. Impfstoffapplikation und Challenge-Infektion 66

3.5. Klinische Untersuchung 67

3.5.1. Allgemeiner Gesundheitszustand 67

3.5.2. Gewichtsbestimmung 68

3.5.3. Bestimmung der Gewebeschwellung 68

3.5.4. Andere makroskopisch erkennbare Gewebeirritationen 68 3.6. Pathologisch-anatomische Untersuchung 69

3.7. Bakteriologische Untersuchung 69

3.8. Antikörpernachweis 70

3.8.1. ELISA 70

3.8.2. Immundiffusion 71

3.9. Statistische Auswertung 74

4. ERGEBNISSE 75

4.1. Klinische Parameter 75

4.1.1. Allgemeiner Gesundheitszustand nach der Impfung 75

4.1.1.1. Bordetella avium-Impfung 76

4.1.1.2. Pasteurella multocida-Impfung 76

4.1.2. Gewichtsentwicklung nach der Impfung 76

(7)

4.1.3. Hautschwellung an der Applikationsstelle 77 4.1.3.1. Hautschwellung nach Bordetella avium-Impfung 78 4.1.3.2. Hautschwellung nach Pasteurella multocida-Impfung 79 4.1.4. Andere makroskopisch erkennbare Gewebeirritationen 80 4.1.4.1. Gewebeirritationen nach Bordetella avium-Impfung 81 4.1.4.2. Gewebeirritationen nach Pasteurella multocida-Impfung 83

4.2. Antikörpernachweis 86

4.2.1. ELISA-Antikörpertiter 87

4.2.1.1. ELISA-Antikörpertiter nach Impfung gegen Bordetella avium 87 4.2.1.2. ELISA-Antikörpertiter nach Impfung gegen Pasteurella multocida 89

4.2.2.1. Präzipitierende Antikörper nach Impfung gegen Bordetella avium 92 4.2.2.2. Präzipitierende Antikörper nach Impfung gegen Pasteurella multocida 95 4.3. Pathologisch-anatomische Untersuchung 98 4.4. Klinische und bakteriologische Untersuchung nach

Challenge-Infektion 98

4.4.1. Reisolierung von Bordetella avium nach Challenge-Infektion 99 4.5. Vergleichende Darstellung der Ergebnisse anhand von Rängen 100

5. DISKUSSION 104

5.1. Kritik der Methode 105

5.2. Bewertung der Ergebnisse 109

5.2.1. Gewichte und allgemeiner Gesundheitszustand 109 5.2.2. Gewebeschwellung an der Applikationsstelle 110 5.2.3. Andere makroskopisch erkennbare Gewebeirritationen 110

5.2.4. ELISA-Antikörper 111

5.2.6. Bakteriologische Untersuchung 114

5.3. Schlussfolgerung 115

6. ZUSAMMENFASSUNG 118

7. SUMMARY 121

8. LITERATURVERZEICHNIS 124

(8)

9. ANHANG 139 9.1. Zusammensetzung und Herstellung der verwendeten Medien 139 9.2. Tabellarische Übersicht über den Versuchsablauf 140

9.3. Auflistung der Einzelwerte 143

9.3.1. Gewichte 143

9.3.2. Gewebeschwellung 144

9.3.3. Andere makroskopisch erkennbare Gewebeirritationen 147

9.3.4. ELISA-Titerwerte 151

9.3.6. Bakteriologie 156

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Abkürzungsverzeichnis

Alu Aluminiumhydroxid Bord. av. Bordetella avium

bzw. beziehungsweise CFU Colony Forming Unit entspricht KBE

d.h. das heißt

DNS/ DNA Desoxyribonukleinsäure, kodierte Erbinformation E. coli Escherichia coli

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay evtl. eventuell

FCA Freund's Complete Adjuvant, Freund's komplettes Adjuvans FIA Freund's Incomplete Adjuvant, Freund's inkomplettes Adjuvans g Gramm

g Vielfaches der Erdbeschleunigung Gerbu Gerbu 100, Versuchstieradjuvans

°C Grad Celsius

HSA Humanes Serum Albumin

IF Interferon

Ig Immunoglobulin IL Interleukin i.m. intramuskulär Immundiff. Immundiffusion incl. inklusive

ISCOM Immunostimulating Complex, Immunstimulierender Komplex i.v. intravenös

KBE Kolonie Bildende Einheit entspricht CFU kg Kilogramm

Komm. Vak. Kommerzielle Vakzine

KPL Kirkegaard & Perry Laboratories

LPS Lipopolysaccharid(e) mg Milligramm

MHC Major Histocompatibility Complex min Minute(n) ml Milliliter mm Millimeter µg Mikrogramm µm Mikrometer n Anzahl N normal

NaCl Natriumchlorid, Kochsalz

ND-Virus Newcastle Disease Virus Neg.-Kontr. Negativ-Kontrolle nm Nanometer

o.ä. oder ähnliche(s)

Ohne Adjuv. Ohne Adjuvans, Zubereitung aus Bakterien in Kochsalzlösung P2 Putenfutter für die 2.-5. Woche mit ca. 11,4 MJ ME/kg

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P3 Putenfutter für die 6.-9. Woche mit ca. 11,8 MJ ME/kg Past. mult. Pasteurella multocida

PAT Paraffin, Arlacel, Tween; hier verwendeter Mineralölimpfstoff PVC Poly-Vinyl-Chlorid

% Prozent s.c. subkutan sek Sekunde(n)

SPF spezifisch pathogenfrei

spp. Spezies (Plural)

Tab. Tabelle

TierSG Tierseuchengesetz U Umdrehung(en)

u.ä. und ähnliche(s)

v.a. vor allem

z.B. zum Beispiel

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1. Einleitung

In der Geflügelpraxis sind bei einigen Erkrankungen, insbesondere durch bakterielle Infektionen, keine kommerziellen Impfstoffe verfügbar. Als eine Alternative zur antibiotischen Therapie bietet sich daher die Herstellung stallspezifischer Vakzinen an. Zur Steigerung der Immunantwort benutzt man Adjuvantien, d.h. Stoffe, die dem Impfstoff zugesetzt werden und den Antikörpertiter auf unterschiedliche Art und Weise erhöhen. Die in Deutschland bei lebensmittelliefernden Tieren zugelassenen als Adjuvans geeigneten Stoffe findet man in Anhang I und II der europäischen Verordnung EWG 2377/90.

Bestandsspezifische Impfstoffe werden wegen der insgesamt geringeren Mengen häufig in kleinen Labors hergestellt, denen Kenntnisse großer Firmen teilweise fehlen. Um einen Einblick in die Eignung verschiedener Adjuvantien bei der Herstellung Stallspezifischer Vakzinen zu gewinnen, wurden entsprechende Untersuchungen mit verschiedenen Adjuvantien und zwei bakteriellen Antigenen an Puten vorgenommen.

Puten als Versuchstiere wurden ausgewählt, da der Konsum von Putenfleisch und damit die Zahl gehaltener Puten stetig zunimmt. Außerdem liegen kaum Untersuchungen über Reaktionen von Puten auf Totimpfstoffe vor, so dass sich aus diesem Grunde anbot, die Anwendung von Impfstoffen bei dieser Geflügelart zu untersuchen.

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2. Literaturübersicht

2.1. Adjuvantien

2.1.1. Definition und Geschichtliche Entwicklung von Adjuvantien

Adjuvantien sind definiert als eine Gruppe strukturell heterogener Bestandteile, die verwendet werden, um die Immunantwort auf ein Antigen zu erreichen oder zu verstärken (GUPTA et al. 1993; SCHIJNS 2000).

Erste Versuche, durch Immunmodulation einen therapeutischen Effekt zu erzielen, gehen bis in die Mitte des letzten Jahrhunderts zurück. Nach THEIN (1988) versuchte LATOUR 1851 durch Applikation lebender Bakterien Tumorkrankheiten zu bekämpfen. Unter Immunmodulation wird dabei allgemein jeder Versuch der Beeinflussung des Immunsystems über die unveränderte Kapazität des Organismus hinaus verstanden, mit spezifischer Immunmodulation ist die Steigerung der Immunreaktionenspezifisch gegenüber einem oder mehreren ausgewählten Antigenen.

Der Begriff „Adjuvans“ wurde das erste Mal von RAMON gebraucht, der 1925 Saponin, Stärke, Lecithin, Tapioka, Öl, Brotkrumen, Aleuronsamen und Agar verwendete, um die Immunantwort gegen eine Diphterie-Vakzine zu erhöhen (VANSELOW 1987; THEIN 1988; ERHARD et al. 1991). Er entdeckte den Zusammenhang zwischen dem lokalen Abszess an der Injektionsstelle und einem hohen Antikörpertiter und definierte ein Adjuvans als „eine Substanz, die - in Kombination mit spezifischen Antigen-Vakzinen eingesetzt - die Intensität der Immunantwort über die hinaus erhöht, die mit der Vakzine allein erreicht würde“.

Zunächst wurden Adjuvantien im onkologischen Gebiet eingesetzt, nachdem entdeckt worden war, dass beispielsweise Ölsäure bei auf Mammatumoren selektierten Mäusen die Inzidenz von Rezidiven reduzierte (MURPHY 1926). Diese Definition wurde 1973 von JOLLÈS und PARAF erweitert auf jede Substanz, die auf

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ein Hapten oder Antigen mit Erhöhung der antigenen Eigenschaften wirkt, oder die Zellen beeinflusst, die in der Immunantwort beteiligt sind (JOLLÈS u. PARAF 1973;

VANSELOW 1987).

In den Jahren 1926 und 1931 verwendeten GLENNY et al. zum ersten Mal zu diesem Zweck Aluminiumhydroxid (ERHARD et al. 1991). Ein großer Erfolg wurde dann mit der Entwicklung der Mineralöle - insbesondere des Freund‘schen Adjuvans - erreicht, welches komplett mit Zusatz von Mykobakterien, inkomplett nur als Öl hergestellt wurde (FREUND u. McDERMOTT 1942; THEIN 1988; ERHARD et al.

1991).

FARTHING und HOLT erkannten 1962, dass die Adjuvans-Aktivität von Lipopolysacchariden auf deren Fähigkeit basierte, eine Hyperplasie der Antikörper- produzierenden Organe zu provozieren; diverse bakterielle Adjuvantien lösen laut UCHITEL und KHASMAN (1964, 1965) Plasmocytose in lymphoiden Organen aus.

RICHOU und Mitarbeiter zeigten 1964, dass einige Saponine exzellente Adjuvantien sind und effektive, entzündungsinduzierende Fähigkeiten haben. Nachfolgend gelang es RICHOU und Mitarbeitern 1965, die Entzündungsreaktion durch Zugabe von Chymotrypsin komplett zu unterbinden, ohne die Adjuvans-Funktion zu beeinflussen. Auch Nukleinsäuren wurden 1965 von MERRITT und JOHNSON als mögliche Adjuvantien erkannt. Zwei Jahre später wurden von BRAUN und NAKANO die Adjuvans-Eigenschaften von Komplexen polyadenyler, polyuridyler und polycytidiler Säuren entdeckt (JOLLÈS u. PARAF 1973).

Die Nachfrage nach alternativen, nicht-toxischen Adjuvantien führte unter anderem zu der Entdeckung von Lipid A, der biologisch aktiven Gruppe der Lipopolysaccharide der äußeren Zellwand gram-negativer Bakterien wie E. coli und Salmonellen, bekannt als B-Zell Mitogen. Wie durch intensive Tests aufgedeckt wurde, verursachten diese Zellwandfragmente aber doch toxische Reaktionen (SALIMATH et al. 1983; ERHARD et al. 1991).

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2.1.2. Wirkungsweise einiger Adjuvantien im Allgemeinen

Adjuvantien werden in der Veterinärmedizin vor allem Totimpfstoffen und Toxoiden zugesetzt, um die Antikörpertiter zu erhöhen (TIZARD 1981). Es handelt sich bei Adjuvantien um Stoffe, die die normale Immunantwort verstärken können. Dieses geschieht auf verschiedene Wirkungsweisen; z.B. kann die Aufarbeitung des Antigens so beeinflusst werden, dass es in wirksamerer Form präsentiert wird. Das kann über Veränderung der Abbaugeschwindigkeit des Antigens bewirkt werden, indem es so in einen unlöslichen Stoff eingebunden wird, dass ein Depot entsteht, welches nur langsam aufgelöst wird, wie bei Alaun, Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Kaolin, Tapioca und Lanolin. Ferner können Wasser-in-Öl- Emulsionen eine lokale chronische Entzündungsreaktion stimulieren, die eine Ansammlung von Makrophagen und eine verlangsamte Freigabe des Antigens bewirkt. Dadurch kann die Halbwertszeit des Antigens im Körper um ein Vielfaches verlängert und die Immunantwort durch den verlängerten Kontakt verstärkt werden.

Freund’s komplettes Adjuvans hat nicht nur die oben erwähnte Depotwirkung durch das enthaltene Mineralöl, sondern erreicht eine zusätzliche Stimulation der antigenempfänglichen Zellen durch die Zellwandbestandteile der Mykobakterien. In ähnlicher Weise sind auch andere Bakterien (Nocardia spp., Bordetella spp. und Propionobacterium acnes) sowie Zellwandbestandteile gramnegativer Bakterien, wie Lipopolysaccharide (LPS) und Endotoxine in der Lage, verstärkend auf die Immunreaktion einzuwirken (TIZARD 1981; HARLOW u. LANE 1988; HAHN et al.

1994).

Die Einflussnahme durch Adjuvantien geschieht in verschiedenen Systemen. Zum Beispiel kann ein Adjuvans entweder das Antigen-Molekül selber oder den Metabolismus des Antigens verändern, wodurch die antigenen Fähigkeiten verändert werden. Ein Antigen muss nicht nur eine antigene Oberflächenstruktur besitzen, sondern auch die Möglichkeit, diese einer Zelle zu übermitteln. So brauchen komplexe Antigene wie Viren, Bakterien oder Gewebe laut WEBSTER (1965) und DAVENPORT et al. (1968) (JOLLÈS u. PARAF 1973) keine Adjuvantien, um eine

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Immunantwort auszulösen. Die äußere Konformität des Antigens kann durch Adjuvantien verändert werden. RIBI et al. (1964; JOLLÈS u. PARAF 1973) vermuteten eine Beziehung zwischen Adjuvans-Aktivität und Carrier-Effekt von E. coli-Lipopolysacchariden. Ebenso kann ein Wechsel in der elektrischen Netto- Ladung bzw. der Verteilung der Ladung eine verbesserte Antigenität herbeiführen;

um diese Ladungsveränderung in einem Protein herbeizuführen eignen sich besonders Öladjuvantien oder Alkylbasen mit einer großen hydrophoben Molekülmasse (JOLLÈS u. PARAF 1973; VANSELOW 1987). Da eine Immunreaktion eine minimale Molekülmasse des Antigens erfordert, kann Bindung des Antigen-Molelküls an das Adjuvans (Carrierfunktion) eine Änderung der Wirtsreaktion hervorrufen (JOLLÈS u. PARAF 1973; VANSELOW 1987; THEIN 1988).

Ein anderes System stellt die Modifikation des Antigen-"Processing" dar. Ein Antigen, das subkutan injiziert wird, verbreitet sich rasch durch Blut- und Lymphgefäße, induziert nur eine Kurzzeitantwort und wird schnell ausgeschieden, es sei denn, es wird durch Mischung mit einem Adjuvans an der Applikationsstelle gehalten (Depotwirkung) und induziert so eine Langzeitantwort. Antigen, das so mehrere Monate in einem Granulom festgehalten wird, produziert eine kontinuierliche Immunstimulation (JOLLÈS u. PARAF 1973; VANSELOW 1987; THEIN 1988). Wie JOLLÈS und PARAF (1973) berichten, stellte HOLT dagegen 1950 fest, dass der Fluss des Antigens an die regionalen Lymphknoten nach 2 Wochen größtenteils durch fibröse Einkapselung gestoppt wird. Alternativ oder zusätzlich kann ein Adjuvans die Lokalisation des Antigens dahingehend steuern, dass es vor allem in Makrophagen, den medullären Sinus der Lymphknoten oder den Lymphfollikeln angesammelt wird (JOLLÈS u. PARAF 1973). Im Lymphknoten kann die Lymphozyten-Rezirkulation verändert und eine Lymphozytenfixation im Retikulo- Endothelialen System erreicht werden (VANSELOW 1987; THEIN 1988). Auch der Katabolismus des Antigens kann verlangsamt werden.

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Adjuvantien sind in der Lage, die Zellpopulationen zu erhöhen oder zu transformieren, die an der Immunantwort beteiligt sind, vor allem Makrophagen und Lymphozyten (JOLLÈS u. PARAF 1973; VANSELOW 1987; THEIN 1988). So können durch sie auch Immunantworten mit zytotoxischen T-Lymphozyten ausgelöst werden (COX u. COULTER 1997). Adjuvantien haben auch selektive Effekte. Die Phagozytose kann durch sie stark erhöht werden (JOLLÈS u. PARAF 1973; THEIN 1988). Nach JOLLÈS u. PARAF (1973) entdeckten SPITZNAGEL und ALLISON (1970), dass verschiedene Agentien, von denen bekannt ist, dass sie die Membran des Lysosoms angreifen, z.B. Retinol und E. coli-Lipopolysaccharide, Adjuvans- Effekte aufweisen. Der erste Schritt bei der Wirkung des Adjuvans ist es vermutlich, selbst mit der Zellmembran zu reagieren und eine Beeinflussung des Phospholipidmechanismus vorzunehmen (JOLLÈS u. PARAF 1973; VANSELOW 1987; THEIN 1988). Es wurde angenommen, dass Adjuvantien durch Veränderung der Zellmembran Zellen aus Lymphknoten und Milz helfen, die Blutbahn zu erreichen und dadurch die Fähigkeit, das Antigen aufzunehmen, erhöhen. Manche Adjuvantien, v.a. Lektine können entweder T- oder B-Zellen stimulieren, abhängig davon, ob die lösliche oder unlösliche Form gegeben wurde (JOLLÈS u. PARAF 1973; THEIN 1988).

Weiterhin sind Adjuvantien fähig, die Produktion verschiedener Hormone zu stimulieren, z.B. ACTH oder Cortison, welche ihrerseits Einfluss nehmen auf die Protein- und somit Globulin-Synthese (JOLLÈS u. PARAF 1973). Neben den Hormonen können auch Cytokine beeinflusst werden und über Immunmodulation zur generellen Hochregulierung des gesamten Immunsystems führen. Dies kann auch Einfluss nehmen auf Th1- oder Th2-Antwort oder zellvermittelte Immunität (COX u.

COULTER 1997). Außerdem kann die Bildung in Richtung der Klasse und Subklasse der produzierten Antikörper gesteuert werden (VANSELOW 1987).

Das Repräsentieren oder Induzieren von "Danger"-Signalen ist eine weitere mögliche Wirkung von Adjuvantien. Dabei wird die nachfolgende Immunreaktion durch den Gewebeschaden induziert, den das Adjuvans verursacht. Einige der neueren

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Adjuvantien können die Signale eines Gewebeschadens erscheinen lassen, obwohl sie diesen nicht mehr auslösen (SCHIJNS 2000).

Am häufigsten werden in der Veterinärmedizin Mineralgele verwendet wie z.B.

Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder Alaun. Diese bilden eine kolloidale Suspension, an die das Antigen-Material adsorbiert wird und sind gut verträglich. Mit ihnen hergestellte Impfstoffe sind gut lagerfähig und beeinflussen die Schlachtkörperqualität nicht (TIZARD 1981).

Öladjuvantien eignen sich größtenteils schlecht für Schlachttiere, da Rückstände die Qualität des Fleisches verändern können. Ebensowenig eignet sich hier Freund’sches komplettes Adjuvans, da es auch Mineralöl enthält und zudem noch Mykobacterien, die beim lebenden Tier eine positiv ausfallende Tuberkulinprobe zur Folge haben können. Es kann auch karzinogene Wirkung entfalten (TIZARD 1981).

2.1.3. Detaillierte Beschreibung klassischer Adjuvantien

Da im Schrifttum bereits diverse Artikel zu Zusammensetzung und Funktion verschiedener Adjuvantien bestehen, beschränkt sich diese Arbeit auf die Beschreibung der bisher gebräuchlichsten Adjuvantien. Eine tabellarische Übersicht über Beschreibungen von zahlreichen weiteren befindet sich in Kapitel 2.1.4.

2.1.3.1. Aluminiumhydroxid

Adjuvantien aus Aluminiumsalzen wie Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat stellen sich als unlösliches, gelartiges Präzipitat der Salze dar. Sie gehören zu den Adjuvantien mit mikroskopisch kleinen Partikeln von einer Größe von 100 bis 1000 nm. Das Immunogen wird durch elektrostatische Interaktionen im vorgeformten Gel oder während der Gelbildung in situ gebunden (VANSELOW 1987; HARLOW u.

LANE 1988; COX u. COULTER 1997).

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Aluminiumsalze induzieren Hyperzellularität und parakortikale Vergrößerung der Lymphknoten durch einen vergrößerten Influx der Blutlymphozyten in den Lymphknoten, auch Lymphozyten-Trapping genannt (DRESSER et al. 1970; ZATZ u.

LANCE 1971; HUGHES u. BABIUK 1994). Durch die beginnende Freisetzung von Mediatoren kann gewährleistet werden, dass Antigen-erkennende Zellen das gewünschte Antigen in der korrekten Umgebung erkennen (HUGHES u. BABIUK 1994).

Neben lokalen Granulomen, die Antikörper-produzierende Plasmazellen enthalten (EDELMANN 1980), aktivieren Aluminiumbestandteile den alternativen Komplement- Weg, was eine chronische Entzündung an der Applikationsstelle auslöst (RAMANTHAN et al. 1979; VANSELOW 1987).

Nach COX und COULTER (1997) zeichnen sich Aluminiumsalz-Adjuvantien durch exzellente Sicherheit in der Handhabung, starke Th2-Antworten, gute Erfassung des Ziels, wenn das Immunogen adsorbiert ist, einen moderaten Depot-Effekt und nur minimale Induzierung einer zytotoxischen T-Zell-Antwort oder zellvermittelten Immunität aus. Manchmal wird von starken IgE-Antworten berichtet.

Zusammenfassend sind sie preisgünstig, sicher und einfach zu formulieren (COX und COULTER 1997).

2.1.3.2. Öl-Emulsionen

Bei der Verwendung von öligen Substanzen stellte DALE (1961) eine lokale Entzündungsreaktion fest. Dabei kam es zur Proliferation lymphatischer Gefäße, die zur Erhöhung der Immunreaktion dadurch führt, dass das Antigen in den regionalen Lymphknoten festgehalten wird (Antigen-Trapping) (JOLLÈS u. PARAF 1973).

Die Wirkung öliger Adjuvantien beruht vor allem auf der Bildung eines Granuloms mit Depotwirkung (HUGHES u. BABIUK 1994; SCHIJNS 2000). Inflammatorische Agentien wie Mineralöl lösen einen schnellen und bemerkenswerten Influx von

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Makrophagen und polymorphonuklearen Zellen aus. Dies könnte verbunden sein mit der verstärkten Expression von MHC Klasse II-Antigenen, die die Anzahl der dem Immunsystem präsentierten antigenen Epitope erhöhen. Aktivierte Makrophagen rufen zudem Co-Stimulator-Moleküle hervor, die als Zweitsignale für Antigen- verantwortliche T-Lymphozyten wirken und IL-2-Sekretion und klonale Expansion von T- und B-Zellen fördern (WARREN et al. 1986; HUGHES u. BABIUK 1994).

Auf der Suche nach einer guten Komposition einer Mineralöl-Vakzine verwendeten BENNE et al. (1997) eine Wasser-Öl-Emulsion im Verhältnis 30/70 unter dem Namen Montanide ISA 740^®, GOMES u. AUGÈ de MELLO (1978) wandten Montanide 80^® im Gemisch mit Arlacel A^® an. STEINBERG et al. (1970) verwendeten eine Wasser-in-Öl-Emulsion aus Antigen-haltiger wässriger Phase, Mineralöl und Arlacel A^® im Verhältnis 1:3:1. STONE et al. (1978) stellten den Herstellungsgang einer Ölemulsion mit einem Wasser-Öl-Verhältnis von 1:4 dar, wobei die wässrige Phase Tween 80^® und die ölige Arlacel A^® enthält. STONE et al.

(1981 und 1983) testeten verschiedene Konzentrationen der oben genannten Komponenten; STONE (1987) und STONE u. XIE (1990) stellen ihre guten Erfahrungen bei der Verwendung oben genannter Adjuvansmischung dar.

2.1.3.2.1. Wasser-in-Öl-Emulsionen

Wasser-in-Öl-Emulsionen bestehen aus Mikrotropfen von Wasser, die in einer kontinuierlichen Ölphase durch einen Oberflächen-aktiven Stoff, meistens Mannit- Monooleat, stabilisiert werden. Bei der Ölphase handelt es sich typischerweise um Mineralöl, Squalen oder Squalan. Dazu gehört auch Freund’s inkomplettes Adjuvans.

Emulsionen, die auf metabolisierbaren Ölen beruhen, haben ein sehr hohes Sicherheitsprofil bezogen auf die Handhabung. Sie bewirken - abgesehen von dem lokal irritierenden Effekt - zwar kaum Immunmodulation, bilden aber gute Kurzzeitdepots, sind preisgünstig, relativ einfach herzustellen und induzieren besonders für hydrophile Antigene eine gute Immunantwort; in die Formulierung

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können zusätzliche lösliche Immunmodulatoren eingearbeitet werden, jedoch besteht die Gefahr, dass die Emulsion unstabil wird (COX u. COULTER 1997). Durch Re- Emulgieren der Wasser-in-Öl-Emulsion mit Hilfe einer Oberflächen-aktiven Substanz kann man eine sogenannte Doppelemulsion herstellen (HERBERT 1978).

2.1.3.2.2. Öl-in-Wasser-Emulsionen

Die Öl-in-Wasser-Emulsionen bestehen im Gegensatz zu Wasser-in-Öl-Emulsionen aus Mikrotropfen Öl, typischerweise Squalen oder Squalan in der Größe von ca.

200 nm, die in einer kontinuierlichen Wasserphase durch oberflächenaktive Stoffe wie Tween 80^® oder/und Span 85^® stabilisiert werden. Sie werden oft zusammen mit löslichen Immunmodulatoren wie Muramyldipeptid-Derivaten oder Block- Copolymeren verwendet. Zusammenfassend sind sie sicher, preisgünstig und sehr gut geeignet für amphipathische Moleküle, wobei es wichtig ist, das Immunogen in die Ölphase zu inkorporieren (COX u. COULTER 1997).

2.1.3.2.3. Freund’s inkomplettes Adjuvans (FIA)

Nach JOLLÈS u. PARAF (1973) sind SHAW et al. (1964) der Meinung, dass bei den Adjuvantien vom Freund’schen Typ vor allem die Balance zwischen hydrophilen und hydrophoben Anteilen eine prominente Rolle in der Aktivität spielt. Durch das Halten des Antigens an der Applikationsstelle wird der Antigenkatabolismus verlangsamt.

Auch das Eindringen in Immunzellen ist möglich und verändert so die Verteilung des Antigens im Körper. Freund’sche Adjuvantien führen zu extensiver Zellmultiplikation von Histiozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen (JOLLÈS u. PARAF 1973). Freund’sches inkomplettes Adjuvans induziert in erster Linie die humorale Immunantwort (HAHN et al. 1994).

Das ölige Medium von Freund’schem kompletten Adjuvans alleine hat eine geringere Wirkung als das komplette Adjuvans und ist unter dem Namen „Freund’s inkomplettes Adjuvans“ bekannt. Es besteht in der Regel aus Mineralölen einer

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geringen spezifischen Gravidität und geringer Viskosität mit einem Emulgator (VANSELOW 1987). Es agiert als repositorisches Adjuvans, welches die Absorbtion des Antigens verzögert und mononukleäre Zellen zur Antikörperproduktion lokal und distal stimuliert (EDELMANN 1980; VANSELOW 1987).

Das Antigen muß in der Tropfenphase gefangen werden, um eine humorale und eine schwache zelluläre Immunantwort auszulösen. Das Adjuvans wird üblicherweise rasch von den Makrophagen aufgenommen, kann aber auch eine andere Verteilung im Lymphknoten oder eine Interaktion mit Makrophagen und den dendritischen Zellen des Lymphfollikels erhalten.

Freund’sches inkomplettes Adjuvans wurde viel in der Human- und Tiermedizin in Impfstoffen eingesetzt, zeigte aber eine geringe Inzidenz zu Nebenreaktionen (COX u. COULTER 1997).

Mögliche Nebeneffekte des öligen Adjuvans können ungewollte lokale oder systemische Reaktionen, Langzeitpersistenz von Mineralölbestandteilen im Gewebe und Kontamination mit karzinogenen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen sein (VANSELOW 1987).

2.1.3.2.4. Freund’s komplettes Adjuvans (FCA)

Freund’s komplettes Adjuvans ist die am besten bekannte Adjuvans-Kombination, bei der die immunmodulierenden Fähigkeiten von Mycobacterium tuberculosis mit dem Kurzzeitdepot-Effekt von Wasser-in-Öl-Emulsionen verbunden wurde (COX u.

COULTER 1997). Die Wasserphase enthält dabei in der Regel das Antigen, die Ölphase die Mykobakterien, die normalerweise hitzeinaktiviert sind, aber auch lebend verwendet werden können (VANSELOW 1987).

Es handelt sich bei Freund’s komplettem Adjuvans um das potenteste käuflich erwerbbare Adjuvans, das humorale und zelluläre Immunität stimuliert (McCARTHY

(22)

et al. 1977; EDELMANN 1980; VANSELOW 1987; HAHN et al. 1994). Nach nur einer subkutanen oder intramuskulären Injektion können Antikörper nach 4 - 5 Tagen nachgewiesen werden und persistieren 8 – 9 Monate (VANSELOW 1987).

Es löst sehr starke Th1- und Th2-Antworten aus und ist besonders gut geeignet für hydrophile Immunogene (COX u. COULTER 1997). Negativ zu beurteilen sind die weite Verbreitung der Emulsionstropfen vom Applikationsort und die bei allen Tierarten intensive, chronische Entzündungsreaktion rund um die Injektionsstelle und die gebildeten Metastasen. Zusätzlich verursachen die enthaltenen Mykobakterien einen positiven Ausfall der Tuberkulinreaktion. Aus diesen Gründen ist Freund’sches komplettes Adjuvans für den Menschen nicht zugelassen und bleibt sein Gebrauch auf Versuchstiere beschränkt (VANSELOW 1987; HAHN et al. 1994)

2.1.4. Übersicht über die Anwendung von Adjuvantien in Geflügelimpfstoffen und über vergleichende Untersuchungen von Adjuvantien

In der Literatur gibt es zahlreiche Beschreibungen über die Verwendung verschiedenster Adjuvantien in Kombination mit unterschiedlichen Antigenen, daher folgt hier eine Übersicht in Tabellenform. In Tabelle 1 sind Beschreibungen einzelner Adjuvantien erfasst, während in Tabelle 2 Beschreibungen von Untersuchungen mit Adjuvansgemischen dargestellt werden.

Tabelle 1: Literaturübersicht über bei Geflügelimpfstoffen verwendete Adjuvantien.

Adjuvans Tot-Antigen Versuchs-

tierart Autoren HSA

(humanes Serumalbumin)

Hühner STEINBERG et al. 1970

ND-Virus Puten AITKEN u. SURVASHE 1974

Ölemulsion (als Öl in Wasser oder Wasser in Öl – meist nicht genau beschrieben)

ND-Virus Hühner BENNEJEAN et al. 1978

(23)

Fortsetzung Tabelle 1

Adjuvans Tot-Antigen Versuchs- tierart

Autoren Pasteurella

multocida

Puten DUA u. MAHESWARAN 1978

ND-Virus Hühner BRUGH et al. 1983 Pasteurella

multocida Hühner SOLANO et al. 1983 ND-Virus Hühner RWEYEMAMU et al. 1986 ND-Virus Hühner van ECK 1987

Haemophilus

paragallinarum Hühner REID u. BLACKALL 1987

E. coli; ND-Virus Hühner FRANCHINI et al. 1991 Pasteurella

multocida

Hühner McCLIMON et al. 1994 Pasteurella

multocida

Hühner PATELl u. JAISWAL 1994

Salmonella

enteritidis Hühner TIMMS et al. 1994 Pasteurella

multocida Hühner PATEL et al. 1995 Ölemulsion

(als Öl in Wasser oder Wasser in Öl – meist nicht genau beschrieben)

ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998

HSA Hühner FRENCH et al. 1970

ND-Virus Hühner GOUGH u. ALLAN 1974 ND-Virus;

Influenza A Puten GOUGH et al. 1975 ND-Virus Hühner YAMANAKA et al. 1993 Pasteurella

multocida

Hühner McCLIMON et al. 1994 HSA und ein

Hapten über Diazoverbindungen

kombiniert

Hühner;

*(Mäuse)

ERHARD et al. 1997 (a, e*)

FIA (Freund’s Incomplete Adjuvant)

Lactovac^ (Coronavirus, Rotavirus und E.coli K99 Pili)

Hühner ERHARD et al. 1997 (a)

HSA Hühner FRENCH et al. 1970

FCA

(Freund’s Complete

Adjuvant) HSA Hühner STEINBERG et al. 1970

(24)

Autoren

Bordetella avium Puten GLÜNDER et al. 1980 HSA und ein

Hapten über Diazoverbindun-

gen kombiniert

Hühner;

Schafe;

Kaninchen

ERHARD et al. 1991

ND-Virus Hühner YAMANAKA et al. 1993 HSA und ein

Hapten über Diazoverbindun-

gen kombiniert

Hühner;

*(Mäuse)

ERHARD et al. 1997 (a, b, e*)

FCA

(Freund’s Complete Adjuvant)

Lactovac^ (Coronavirus, Rotavirus, E.coli K99 Pili)

Hühner ERHARD et al. 1997 (a, b, c, d)

Haemophilus paragallinarum

Hühner BLACKALL u. REID 1987

Hühner REID u. BLACKALLl 1987

Hühner BLACKALL 1988

HSA und ein Hapten über Diazoverbindun-

gen kombiniert

Hühner ERHARD et al. 1991 Aluminiumhydroxid

(in Gelform (Alhydrogel^))

Hühner BLACKALL et al. 1992

HSA Hühner STEINBERG et al. 1970

Aluminium-phosphat

ND-Virus Hühner YAMANAKA et al. 1993 Adjuvant 65^

(86 % Erdnußöl, 4 %

Aluminiumstearat und 10 %

Arlacel A^®)

ND-Virus Hühner GOUGH u. ALLAN 1974

Lipidemulsion

(Emulsion mit pflanzlichen Fetten)

ND-Virus Hühner BRUGH et al. 1983

Öladjuvans ISA-70 ND-Virus Hühner YAMANAKA et al. 1993

(25)

Adjuvans Tot-Antigen Versuchs- tierart

Autoren Haemophilus

paragallinarum

Doppelemulsion (durch reemulgieren

einer Emulsion) ND-Virus Hühner RWEYEMAMU et al. 1986 Multiple Emulsion

(durch wiederholtes reemulgieren einer Emulsion)

Pasteurella

multocida Hühner PATEL et al. 1995

Hühner REID u. BLACKALL 1987

Quil A^

(aus Saponin

isoliert) ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998 ND-Virus Hühner RWEYEMAMU et al. 1986 Avridin

Acemannan

(polydisperses β- (1,4)-gebundenes acetyliertes

Mannan)

Breedervac III^

(Infectious Bursal Disease, Infectious Bronchitis,

Newcastle Disease)

Hühner CHINNAH et al. 1992

DPLA

(Diphosphoryl Lipid A)

HSA und ein Hapten über Diazoverbindun- gen kombiniert

Hühner ERHARD et al. 1991

HSA und ein Hapten über Diazoverbindun-

gen kombiniert

Hühner;

(*Mäuse)

ERHARD et al. 1997 (a, b, e*)

Lactovac^ (Coronavirus, Rotavirus, E.coli K99 Pili)

Hühner ERHARD et al. 1997 (a, b, c, d)

PCSL

(Pam3Cys-Ser- (Lys)4; Lipopeptid)

HSA;

Rekombinantes bovines

Somatotropin;

Humanes IgG

P-Th1

(Pam3Cys-Ser

konjugiert mit dem Epitop Th1 der T- Helferzelle)

HSA;

Somatotropin;

Humanes IgG

(26)

Adjuvans Tot-Antigen Versuchs- tierart

Autoren P-Th2

(Pam3Cys-Ser2

konjugiert mit dem Epitop Th2 der T- Helferzelle)

HSA;

Somatotropin;

Humanes IgG

IFN-γ

(rekombinantes Hühner-Interferon γ)

HSA;

Somatotropin;

Humanes IgG

Vitamin E E. coli; ND-Virus Hühner FRANCHINI et al. 1991 Vitamin A

(in täglichen Dosen um Impfzeitpunkt herum)

BRL 5907

(Interferon Inducer)

ND-Virus;

Influenza A

Puten GOUGH et al. 1975 PAA

(Polyacrylsäure) ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998 PSS

(Polystyren- sulphonat)

DDA

(Dimethyldiocta- decylammonium- bromid)

Corynebacterium parvum

(inaktiviert)

Bordetella pertussis (inaktiviert)

Bakterielles Endotoxin

(E.coli, Shigella flexneri)

Quarternäre

Ammoniumbestand- teile

(Arquad 2S, Arquad 2HAT)

(27)

Tabelle 2: In der Literatur verwendete Adjuvantiengemische Adjuvans Tot-Antigen Versuchs-

tierart

Autoren Titer-Max^ # R-1

(mikropartikulierte Silika mit Copolymer Sorbitan 80 und Squalen)

Pasteurella multocida

Hühner McCLIMON et al. 1994

Ribi-Adjuvant-

System^ (RAS # R- 700)

(Monophosphoryllipi d A, synthetisches Trehalose-

Dicorynomyolat, Zellwandskelett, Squalen und Monooleat)

Pasteurella

multocida Hühner McCLIMON et al. 1994

Aluminiumhydroxid

+ Mineralöl Haemophilus

paragallinarum Hühner REID u. BLACKALL 1987

Aluminiumhydroxid + Avridin

Avridin + Doppelemulsion

Avridin + Saponin ND-Virus Hühner RWEYEMAMU et al. 1986 BRL 5905 + FIA ND-Virus;

Influenza A

Puten GOUGH et al. 1975 Öl-in-Wasser-

Emulsion + Squalen ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998 Cyclodextrin +

Squalen ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998 Öl + Sulfat-

Polysucrose

ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998 PCSL + IFN-γ HSA ;

Somatotropin;

Humanes IgG

(28)

Autoren PCSL + P-Th1 HSA;

Somatotropin;

Humanes IgG

PCSL + P-Th2 HSA;

Somatotropin;

Humanes IgG

PAA + DDA ND-Virus Hühner HILGERS et al. 1998

Mehrere Autoren haben in ihren Untersuchungen Vergleiche zwischen verschiedenen Adjuvantien vorgenommen. Obwohl sich die Berichte oft durch die jeweilige Auswahl von Adjuvantien und Antigenen sowie weitere methodische Details unterscheiden, soll dennoch versucht werden, einen gewissen vergleichenden Überblick über die Eignung der verschiedenen Adjuvantien zu geben. Da sich aufgrund der Heterogenität der Arbeiten keine sachlich begründete Systematik für die Darstellung der Arbeiten ergab, erfolgt die Schilderung in der alphabetischen Reihenfolge der Autoren.

BENNET et al. (1992) verglichen Titer-Max mit Freund’s komplettem Adjuvans, Ribi- Adjuvant System, Adjuvax, Lipovant und Alhydrogel. Als Antigen wurden zwei verschiedene Eiweiße an Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Ziegen getestet. Die Antikörper-Titer stiegen hier mit Titer-Max am schnellsten auf die höchsten Titer an, die sich am längsten hielten, an zweiter Stelle kam Freund’s komplettes Adjuvans. Alle anderen hatten weniger hohe und weniger haltbare Titer, die erst später erreicht wurden. Die Entzündungsreaktion war mit Freund’schem kompletten Adjuvans am stärksten, Titer-Max rief eine Fremdkörperreaktion hervor, die aber wie die der anderen verwendeten Adjuvantien mild und transient war.

(29)

BLACKALL (1988) stellte Aluminiumhydroxid mit einer Doppelemulsion (siehe 2.1.3.2.2.), Avridin und Kombinationen aus Avridin und Aluminiumhydroxid bzw.

Avridin und der Doppelemulsion gegenüber. Antigen hier war Haemophilus paragallinarum, Versuchstiere spezifisch pathogen-freie (SPF) -Hühner.

Aluminiumhydroxid zeigte besseren Schutz als die Doppelemulsion. Ebenso erwies es sich pur und als Mischung mit Avridin als wirksamer als Avridin allein, wenn es subkutan oder intramuskulär verabreicht wurde, nicht aber nach intranasaler Gabe.

Es wurden keine systemischen oder lokalen Nebenreaktionen beobachtet.

BRODERSON (1989) verglich Freund’s komplettes mit inkomplettem Adjuvans an Kaninchen und Affen mit einem nicht erwähnten Antigen. Freund’s komplettes Adjuvans rief stärkere Läsionen hervor als das inkomplette.

McCLIMON et al. (1994) verwendeten in vergleichenden Studien Freund’s inkomplettes Adjuvans, Ribi-Adjuvant-System und Titer-Max. Als Antigen wurde Pasteurella multocida verwendet, als Versuchstiere Hühner. In der ersten Woche hatte Titer-Max die höchsten und Ribi-Adjuvant-System die zweithöchsten Titer, in der zweiten Woche Freund’s inkomplettes Adjuvans und Titer-Max. Nach der Boosterung hatte Freund’s inkomplettes Adjuvans die höchsten Durchschnittstiter, danach Titer-Max und Ribi-Adjuvant-System.

ERHARD et al. (1991) verglichen Diphosphoryl-Lipid A mit Aluminiumhydroxid in verschiedenen Konzentrationen und Freund’s komplettem Adjuvans an einem Eiweiß als Antigen an Hühnern, Schafen und Kaninchen. Bei den verschiedenen Spezies waren unterschiedliche Reaktionen festzustellen. Beim Huhn war der Titer mit Freund’s komplettem Adjuvans zwar höher als die der anderen, aber nicht signifikant.

Freund’s komplettes Adjuvans löste jedoch einen über 9 Wochen meßbaren Antikörper-Titer aus, während die anderen Adjuvantien nur eine Kurzzeitantwort von wenigen Tagen lieferten. Diphosphoryl-Lipid A und Aluminiumhydroxid (10 % und 50 %) unterschieden sich nicht signifikant von den Kontrollen. Bei Kaninchen

(30)

konnten die Titer nach der ersten Impfung bei Freund's komplettem Adjuvans 6 Wochen lang gemessen werden, bei den anderen Adjuvantien nur eine Woche, auch waren sie merkbar geringer. Bei Schafen konnte eine Immunreaktion nur mit Freund's komplettem Adjuvans erreicht werden.

ERHARD et al. (1997 a) verwendeten Freund’s komplettes Adjuvans zur Erstimpfung und Freund's inkomplettes Adjuvans und verglichen dies mit der Aminosäurenkombination Pam³CysSer-(Lys)⁴. Als Antigene wurden ein Eiweiß und Lactovac verwendet, das inaktiviertes Coronavirus, Rotavirus und E. coli K99-Pilus- Antigen enthält. Bei den als Versuchstiere gebrauchten Hühnern wurden die Antikörper im Eidotter bestimmt. Die Aminosäurenkombination brachte hier die höchsten Titer (7352 Einheiten/ml nach Erstimpfung, 8603 nach Boosterung), gefolgt von Freund’schem Adjuvans (2661 nach Erstimpfung, 2741 nach Boosterung) bei Impfung mit einem Eiweiß. Bei Lactovac war es ähnlich was die viralen Antigene betrifft, bei E.coli konnten keine Unterschiede zwischen der Aminosäurenkombination und Freund’schem kompletten Adjuvans gefunden werden. Histologisch wurde bei der Aminosäurenkombination eine geringe Proliferation des lokalen Lymphgewebes gefunden, während bei der Kombination von Freund’schem kompletten und inkompletten Adjuvans miliare Granulome und multiple Abszesse zu entdecken waren.

ERHARD et al. (2000) verglichen rekombinantes Hühner-Interferon-y mit Pam³CysSer-(Lys)⁴ (PCSL), Kombinationen aus den beiden, Pam³CysSer konjugiert mit dem Epitop Th1 (P-Th1) und seine Kombination mit PCSL sowie Pam³CysSer² konjugiert mit dem Epitop Th2 (P-Th2) und seine Kombination mit PCSL. Antigen waren drei verschiedene Eiweiße: Humanes Serumalbumin, humanes Immunglobulin G und rekombinantes bovines Somatotropin. Versuchstiere waren Hühner. Antikörper wurden im Serum und Eidotter bestimmt und zwischen spezifischem Antikörper-Titer im Serum und Immunoglobin Y-Konzentration im Serum und Eidotter unterschieden. Messungen wurden erst nach der ersten und zweiten Boosterung vorgenommen. Mit humanem Serumalbumin hatten weder PCSL

(31)

noch IFN-y allein Adjuvanseffekt, die Kombination aus beiden hatte die höchsten Titer eine Woche nach den Boosterungen. Auch konnte kein Dosis-Effekt von IFN-y festgestellt werden. Mit humanem Immunglobulin G erreichte PCSL allein eine Erhöhung der Titer, die geringer ausfiel als die Kombination mit Hühner-Interferon.

Weniger auffallend war der Effekt von P-Th2 in Kombination mit PCSL und P-Th1 allein, vergleichbar den Ergebnissen von IFN-y PCSL mit rekombinantem bovinen Somatotropin. Bei 5-Monate-alten Hühnern war die Immunantwort immer niedriger als bei 9-Monate-alten, nur bei der Verwendung von PCSL war es umgekehrt. Die lichtmikroskopische Untersuchung des Brustmuskels ergab bei allen Gruppen nur geringe Proliferation des lokalen Lymphgewebes.

FRANCHINI et al. (1991) verwendeten Leicht-Mineralöle und verschiedene Prozentanteile Vitamin E als Adjuvantien mit den Antigenen Newcastle Disease-Virus und E. coli an Hühnern. Zusatz von 20 % bis 30 % Vitamin E hatten höhere Titer als die Mineralölvakzinen zur Folge, die Titer bei 40 % Vitamin E-Zugabe waren ungefähr diesen gleich, 50 % Zusatz von Vitamin E führte zu gar keiner Antikörperbildung. Dies gilt für das Newcastle Disease-Virus, bei E. coli wurde keinerlei Titer-Ausbildung durch Vitamin E festgestellt. Bei der Beurteilung der Impfschäden zeigten sich histologisch bis zum 30. Tag nach der Applikation mit Zusätzen von Vitamin E bis 30 % schwere granulomatöse Läsionen, mit 40 % - 50 % Vitamin E kleinere Läsionen und schnellere Abheilung.

FRENCH et al. (1970), verglichen Freund’s komplettes und inkomplettes Adjuvans.

Als Antigen wurde ein Eiweiß an Hühnern verwendet, untersucht wurde vor allem die Phase nach dem 21. Tag post vakzinationem. Es wurden zwei Peaks in den Immunantworten festgestellt, wobei der erste um Tag 8 - 12 nach der Inlektion bei Freund’s komplettem Adjuvans viel höher ausfiel als bei inkomplettem. Ohne Adjuvans kam es zu keinem zweiten Anstieg der Titer. Nach Meinung der Autoren geht der erste Antikörper-Peak von der Milz und anderen lymphoiden Geweben aus,

(32)

während der zweite bei den öligen Emulsionen von dem Granulom an der Injektionsstelle ausgelöst sein könnte.

GOUGH et al. (1975) verwendeten den Interferon-Inducer BRL 5907 und Freund’s inkomplettes Adjuvans und Mischungen daraus zu Vergleichszwecken mit den Antigenen Influenza- und Newcastle Disease-Viren an drei Wochen alten Hühnern und Eintagsküken. Die Mischung aus BRL 5907 und Freund’s inkomplettem Adjuvans führte zu einer Verbesserung des Schutzes gegen Challenge-Infektion v.a.

bei Tieren mit maternalen Antikörpern. Adjuvans mit BRL 5907 allein hatte 6 Tage nach der Verabreichung keine Schutzwirkung gegen Challenge-Infektion.

HILGERS et al. (1998) verglichen eine Wasser-in-Öl-Emulsion mit verschiedenen Öl- in-Wasser-Emulsionen, Cyclodextrin gemischt mit Squalen in Wasser, Polyacrylsäure (PAA) in verschiedenen Konzentrationen und Molekülmassen. Weiterhin wurden Polystyrensulphonat (PSS) in verschiedenen Konzentrationen, Öl (S-Ficoll-400) in verschiedenen Konzentrationen mit der wässrigen Antigenlösung, Dimethyl- dioctadecylammoniumbromid (DDA) in verschiedenen Konzentrationen, Quil A^ in verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen aus PAA und DDA in verschiedenen Konzentrationen in die Untersuchung einbezogen. Als Antigen wurde Newcastle Disease-Virus an SPF-Hühnern verwendet. Es wurde der Antikörpertiter nach dem Priming und nach der Boosterung bestimmt. Das Priming war mit Wasser- in-Öl-Emulsion am erfolgreichsten, mit DDA ergaben sich keine Titer. Bei der Boosterung wurde mit DDA ein 4-facher, mit Wasser-in-Öl-Emulsion ein 16-facher Titeranstieg im Vergleich zu Antigengabe ohne Adjuvans erreicht. Cyclodextrin gemischt mit Squalen in Wasser und PAA-3000 erreichten die höchsten Titer, gefolgt von der Wasser-in-Öl-Emulsion; Öl-in-Wasser-Emulsion, DDA und PSS konnten die Sekundärantwort geringer erhöhen. Schlechter noch fielen die Antikörpergehalte von Quil A^ und Öl (Ficoll-400) aus.

REID und BLACKALL (1987) verglichen Aluminiumhydroxid mit Mineralöl in verschiedenen Konzentrationen mit der wässrigen Antigenlösung, eine Mischung aus

(33)

beiden und Quil A^ in ihrer immunitätsstimulierenden Wirkung mit einem australischen Stamm von Haemophilus paragallinarum an SPF-Hühnern. Alle Tiere waren bei Challenge-Infektion geschützt, allein Mineralöl rief Schwellungen und Granulome hervor. Es konnte kein Zusammenhang zwischen Agglutinationstiter und Schutz bei Challenge-Infektion festgestellt werden.

RWEYEMAMU et al. (1986) verwendeten in vergleichenden Studien eine Wasser-in- Öl-Emulsion und eine Doppelemulsion, Avridin und einer Kombination aus Avridin und Saponin. Als Antigen wurde Newcastle Disease-Virus an Hühnern benutzt.

Avridin war in der hier mit vier Wochen angelegten Kurzzeitimmunität der Wasser-in- Öl-Emulsion und seiner Mischung mit der Doppelemulsion überlegen. Saponinzusatz machte keinen Unterschied zu alleiniger Avridingabe. Bei der Langzeitimmunität bis zu 120 Tage nach der Injektion waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den verwendeten Adjuvantien nachzuweisen.

STEINBERG et al. (1970) verglichen Aluminiumphosphat, eine Wasser-in-Öl- Emulsion, Freund’s komplettes Adjuvans, inaktiviertes Corynebacterium parvum, Endotoxin aus E. coli und Shigella flexneri, inaktivierte Bordetella pertussis, quaternäre Ammoniumbestandteile (Arquad) und tägliche Dosen Vitamin A mit einem Eiweiß als Antigen an Hühnern. Aluminiumphosphat brachte keine Erhöhung der Titer im Vergleich zur Kontrolle, die Wasser-in-Öl-Emulsion steigerte sie circa um das dreifache. Die Endotoxine und Mikroorganismen brachten keine signifikanten Peakanstiege, Freund’s komplettes Adjuvans erhöhte den Antikörper-Titer in Kombination mit 40 µg humanem Serumalbumin (HSA); mit Mengen des HSA in mg zeigte es alllerdings keine Wirkung.

YAMANAKA et al. (1993) verglichen ein bestimmtes Mineralöl, Freund’s inkomplettes Adjuvans, Freund’s komplettes Adjuvans und Aluminiumphosphatgel; als Antigen fungierte Newcastle Disease-Virus an Hühnern. Die höchsten Antikörper-Titer lieferte Freund’s komplettes Adjuvans, das Mineralöl an zweiter Stelle;

Aluminiumphosphatgel hatte nur sehr mäßige Titer. An der Injektionsstelle zeigten

(34)

die mit dem Mineralöl geimpften Tiere nur ein leichtes Ödem, keine Verhärtung oder Schwellung. Dabei war der Muskel bis zur 12. Woche weißlich verfärbt. Freund’s inkomplettes Adjuvans hatte eine im Vergleich etwas ernstere exsudative Entzündung zur Folge, die im Muskel verbleibenden Zysten waren größer als bei dem Mineralöl. Freund’s komplettes Adjuvans hinterließ schwerste Veränderungen:

Ödem, gelbliche Verfärbung des Muskels, Granulome. Aluminiumphosphatgel verursachte eine käsige gelbe Substanz zwischen den Pektoralmuskeln, die nach 16 Wochen verschwunden war.

2.1.5. In kommerziellen Vakzinen verwendete Adjuvantien

Für eine Übersicht der in kommerziellen Vakzinen verwendeten Adjuvantien wurden die Beipackzettel von 53 kommerziell erwerbbaren Vakzinen mit inaktivierten bakteriellen Antigenen der Firmen Hoechst Roussel Vet^®, Intervet^®, aniMedica^®, Boehringer Ingelheim^®, Essex^®, Merial^®, Lohmann Animal Health^®, Impfstoffwerk Dessau-Tornau GmbH^®, WDT^®, Albrecht^®, Fort Dodge^® und Hydro-Chemie^® ausgewertet. Zu allen Vakzinen wurde nur jeweils ein Adjuvans zugesetzt; Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Häufigkeiten der Verwendung der einzelnen Adjuvantien.

Tabelle 3: Adjuvantien in 53 kommerziell erwerbbaren Vakzinen Anzahl der Vakzinen

Im Beipackzettel angegebenes Adjuvans 26 Aluminiumhydroxid

3 Kombinationen aus Aluminiumhydroxid und Saponin/Quil A 1 Aluminiumhydroxid und inaktivierten Bordetella pertussis 14 verschiedene Zubereitungen mit Öl und Ölgemischen

1 Saponin 2 Kaliumaluminiumsulfat 1 Carboxymethylen 2 dl-α-Tocopherolacetat

1 Carbopol 1 Carboxypolymethylen 1 Carbomer 934 P

(35)

2.2. Antigene

2.2.1. Allgemeine Beschreibung

Antigene sind definiert als Moleküle, die mit Antikörpern reagieren. Der Name kommt durch die Fähigkeit zustande, Antikörper zu generieren.

Antigene können vollständige Bakterien oder Viren sein oder nur Teile davon, von denen man weiß, dass sie für die Antikörperbildung verantwortlich sind. Als Spalt- oder Subunitvakzine bezeichnet man Impfstoffe, die nur diese Anteile der krankmachenden Organismen enthalten. Eine Oberfläche, die selbst keine Antikörperbildung auslöst, aber in Verbindung mit einem sogenannten Carrier (meist ein größeres Protein) gekoppelt dazu in der Lage ist, bezeichnet man als Hapten.

Antigene können lebend (natürlich oder abgeschwächt), oder tot verwendet werden, wobei die lebenden in der Regel die bessere Immunantwort erzeugen, die abgetöteten jedoch sicherer sind in Bezug auf die Möglichkeit einer Erkrankung durch die Impfung (JANEWAY u. TRAVERS 1995).

2.2.2. Charakterisierung ausgesuchter Antigene

Da in der folgenden Arbeit Bordetella avium und Pasteurella multocida als Antigene verwendet wurden, werden in diesem Kapitel diese Keime näher beschrieben.

2.2.2.1. Bordetella avium

Die Bordetellen sind kleine gram-negative zeitweise kokkoid erscheinende Stäbchen (0,2 – 0,5 x 0,5 – 1,0 µm) mit Kapsel, die strikt aerob sind und keine Sporen bilden.

Sie verwerten keine Kohlenhydrate, sondern beschaffen sich Energie aus der Oxidation von Aminosäuren. Bordetellen sind Katalase- und Oxidase-positiv. Sie sind

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in der Umwelt relativ widerstandsfähig, vor allem bei geringer Luftfeuchtigkeit.

Bordetella avium ist motil durch peritriche Begeißelung und wächst auf MacConkey- Agar. Abzugrenzen ist es vor allem von Alcaligenes faecalis, der ihm sehr ähnelt und in der älteren Literatur auch oft synonym genannt wird. Alcaligenes faecalis kommt in Boden, Wasser und Faeces vor und unterscheidet sich nur durch wenige biochemische Reaktionen (beispielsweise positive Assimilation von Caprat) von Bordetella avium (HINZ 1992; SIEGMANN 1993; QUINN et al. 1994).

Bordetellen kommen primär auf den Schleimhäuten des oberen Respirationstraktes von gesunden und erkrankten Menschen, Säugetieren und Vögeln vor. Bordetella avium findet man vorrangig im Respirationstrakt von infiziertem Geflügel, vor allem Puten, wo es den Putenschnupfen auslöst, eine Rhinotracheitis und Sinusitis besonders junger Puten mit hoher Morbidität und geringer Mortalität. Indirekte Übertragung kommt vor (HINZ 1992; QUINN et al. 1994).

Infektionen verringern den im Atmungstrakt vorhandenen Clearance-Mechanismus und erleichtern anderen Organismen das Eindringen. Bakterielle Besiedelung verursacht eine Abschwächung von zellvermittelte Immunreaktionen und produziert einen Histamin-sensibilisierenden Faktor ähnlich dem Toxin von Bordetella pertussis.

Den Krankheitsprozess beeinflussen auch ein Zytotoxin, ein Hämagglutinin und ein dermonekrotisierendes Toxin (HINZ 1992; SIEGMANN 1993; QUINN et al. 1994).

Die Bakterien werden durch Kultivierung von Nasentupfern, Trachealwaschungen und Abstrichen aus pneumonischen Lungen nachgewiesen. Diese können auf MacConkey- oder Schafblutagar 24 - 48 Stunden bei 37 °C aerob kultiviert werden.

Bei Nasentupfern benötigt man evtl. ein Selektivmedium wie z.B. Smith-Baskerville- Medium mit oder ohne Antibiotika, das auch als Indikatormedium fungiert. Die entstehenden Kulturen sind nach 24 Stunden sehr klein, konvex, glatt mit einem deutlichen Rand und nicht hämolytisch. Phasenmodulation kommt bei Subkulturen von Bordetella avium vor durch Verlust einer kapselähnlichen Struktur.

(37)

Morphologisch unterscheiden sich die Phasen in Größe, Glanz, Konvexität und Form des Randes (QUINN et al. 1994).

Serologisch läßt sich eine vorangegangene Infektion mit Bordetella avium durch Antikörpernachweis in der Röhrchenagglutination, Mikroagglutination und im ELISA nachweisen (HINZ 1992; SIEGMANN 1993; QUINN et al. 1994).

2.2.2.1.1. Krankheitsbild durch Bordetella avium bei Puten: Putenschnupfen

Beim Putenschnupfen handelt es sich um eine enzootische, hochkontagiöse Erkrankung der Puten, die sich fast ausschließlich im Kükenalter abspielt. Das gleiche Krankheitsbild kann auch bei Masthühnern und Enten beobachtet werden.

Die Krankheit kommt weltweit vor allem in den USA und auch in der Bundesrepublik Deutschland relativ häufig vor und löst bedeutende wirtschaftliche Verluste aus.

Infektionsquellen sind infizierte Vögel, eine kontaminierte Umwelt und häufiger Personenverkehr in den Ställen. Die Ausbreitung erfolgt horizontal von Tier zu Tier und über die Tränken.

Das Infektionsgeschehen wird durch den starken Tropismus des Erregers zur zilienbesetzten Schleimhaut und seine geringe Invasivität auf den Respirationstrakt beschränkt. Das Krankheitsbild setzt sich aus dem Zusammenspiel dystrophisch- nekrobiotischer Alterationen der Schleimhaut und katharralisch-fibrinöser entzündlicher Abwehrreaktion des Organismus zusammen, später abgelöst von produktiv-entzündlichen Reparaturvorgängen. Komplikationen und letaler Verlauf entstehen vor allem durch allgemeine Schwächung der spezifischen und unspezifischen Abwehr und eine verminderte Adaptationsfähigkeit der Tiere (HINZ 1992; SIEGMANN 1993).

(38)

Die Inkubationszeit beträgt 4 – 11 Tage. Die Küken erkranken meist in der 1. – 6.

Lebenswoche; später entwickelt sich eine altersbedingte relative Resistenz; z.B. sind Puten über 6 Wochen selten klinisch manifest erkrankt. Die Krankheit breitet sich rasch aus (meist 100 % Morbidität), verursacht aber in der Regel nur eine geringe Mortalität (1 – 5 %). Kommt es zu Komplikationen durch Sekundärinfektionen steigt die Mortalität zwischen dem 10. – 14. Krankheitstag an und kann 20 – 80 % erreichen.

Die Tiere zeigen zunächst für 2 – 3 Wochen verminderte Lebhaftigkeit und Futteraufnahme und reduzierte Gewichtsentwicklung. Dazu kommt wässriger bis trüber oder flockiger Nasen- und Augenausfluß, geschwollene, verklebte Augenlider sowie selten aufgetriebene Infraorbitalsinus, Dyspnoe, rasselnder Atem und veränderte Vokalisation. In den folgenden 2 – 3 Wochen tritt nur bei einem Teil der Tiere Schnabelatmung, veränderte Lautgebung, Rasselgeräusche beim Atmen und verminderte Gewichtsentwicklung auf (HINZ 1992; SIEGMANN 1993).

Bei Sektionen findet man serös-schleimiges Exsudat auf den Schleimhäuten der Nase, des Infraorbitalsinus und der Trachea, die deformiert oder kollabiert sein kann.

Seltener treten Schleimpfröpfe in den Bronchien und emphysematöse und pneumonische Herde in der Lunge auf. Bei Komplikationen findet man fibrinöse Bronchopneumonien und Aerosacculitis.

Histologisch fallen vor allem dystrophische Veränderungen, Ziliostase, Zilienverlust, Desquamation und Depletion der Becherzellen und alveolaren Schleimdrüsen auf, die mit heterophilen Granulozyten und selten Lymphozyten infiltriert sind. In späteren Stadien sind Metaplasien des Schleimhautepithels, peribronchiale lympho- histiozytäre Entzündungsherde, serofibrinöse herdförmige Pneumonien oder interstitiell-granulomatöse Herde in der Lunge zu sehen. Der Nachweis von Bordetella avium erfolgt kulturell (HINZ 1992; SIEGMANN 1993).

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2.2.2.2. Pasteurella multocida

Pasteurellen sind kleine (0,2 – 2,0 µm) gram-negative kokkoide Stäbchen, die nicht motil, fakultativ anaerob und Katalase- und Oxidase-positiv sind, keine Sporen bilden und am besten auf mit Serum oder Blut supplementierten Nährmedien wachsen. Sie können bekapselt und unbekapselt sein. In der Umwelt sind sie Austrocknung und Desinfektionsmitteln gegenüber sehr empfindlich.

Ein weites Wirtsspektrum steht den Pasteurellen zur Verfügung, doch die meisten sind Kommensalen der Schleimhäute des oberen Atemtraktes und Darmtraktes der Tiere. Von den 13 Arten der Gattung Pasteurella sind 7 bisher bei Vögeln nachgewiesen worden (SIEGMANN 1993; QUINN et al. 1994).

Die sogenannte Geflügelcholera ist ein durch Pasteurella multocida ausgelöstes septikämisches Geschehen, bei dem Endotoxine eine große Rolle spielen. Die Infektion kann sowohl endogen als auch exogen erfolgen; am häufigsten ist jedoch die Aufnahme über den Atmungstrakt. Die Virulenz kann sich durch Transmission von Tier zu Tier erhöhen. Alle Pasteurellen stellen extrazellulär parasitierende Bakterien mit variablen Virulenzfaktoren dar, z.B. das thermolabile Dermonekrotoxin von einigen D-Stämmen von Pasteurella multocida (SIEGMANN 1993; QUINN et al.

1994; HAFEZ 1997). Der Erreger verliert seine Infektiosität beim Erhitzen auf 60 °C für 10 Minuten. Auch in der Umwelt wird der Keim rasch inaktiviert; in kühler und feuchter Umgebung kann er sich jedoch mehrere Wochen halten. Desinfektionsmittel in üblichen Konzentrationen sind in der Regel wirksam (MÉSZÁROS 1992).

Es existieren verschiedene Typen bzw. Serogruppen bei Pasteurella multocida, die auf Unterschieden in der Polysaccharidstruktur der Kapsel beruhen und mit den Buchstaben A – F bezeichnet werden. Zusätzlich werden noch somatische Typen unterschieden, die sich über die Lipopolysaccharidstruktur definieren und mit

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Nummern angegeben werden. Bei Geflügel kommen vor allem Pasteurella multocida Typ A (Geflügelcholera) und D (sekundäre Pneumonie) vor; bei Puten kann auch Typ F mit bisher ungeklärter Bedeutung gefunden werden (SIEGMANN 1993; QUINN et al. 1994; HAFEZ 1997).

Klinisch werden Pasteurellen an Randteilen pneumonischer Lungen bzw. bei Septikämien an Leber- oder Nierenteilen nachgewiesen. Von lebenden Tieren kann man auch Eiter, Exsudate oder Nasentupfer verwenden. In der direkten Mikroskopie läßt sich manchmal bei Organ- und Herzblutausstrichen in Giemsa-Färbung oder mit Methylenblau die bipolare Anfärbung der Pasteurellen erkennen, die jedoch nach einigen Kulturpassagen verloren geht. Kultivierung erfolgt auf MacConkey-Agar und bluthaltigen Medien 24 – 48 Stunden aerob bei 37 °C. Die nach 24 Stunden in der Regel sichtbaren Kolonien sind mittelgroß, rund und grau-weiß. Man kann mukoide, glatte und rauhe Kolonieformen unterscheiden. Pasteurella multocida ist nicht hämolytisch, wächst nicht auf MacConkey-Agar, produziert Indol und hat einen typischen süßlichen Geruch. Typ A -Stämme haben oft relativ große, mukoide Kolonien, ihrer großen Kapseln mit Hyaloronsäure wegen.

Von Pasteurella multocida existieren drei Subspezies, die sich nur minimal in ihrer biochemischen Fermentation von Kohlenhydraten unterscheiden: Pasteurella multocida subspecies multocida, subspecies septica und subspecies gallicida, letzterer ist der Erreger der Geflügelcholera (SIEGMANN 1993; QUINN et al. 1994;

HAFEZ 1997).

2.2.2.2.1. Krankheitsbild durch Pasteurella multocida bei Puten: Geflügelcholera

Die Geflügelcholera ist eine enzootisch auftretende hochkontagiöse Erkrankung des Wirtschaftsgeflügels, die bei Puten perakut bis akut, aber auch chronisch verlaufen kann. Sie wurde 1932 zum ersten Mal in Maryland, USA beschrieben und unterlag in Deutschland bis zum 30.6.1991 der Anzeigepflicht mit gesetzlichem Schlachtverbot bei amtlicher Feststellung (HAFEZ 1997). Die Häufigkeit des Vorkommens hat sich

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nach dem zweiten Weltkrieg bedeutend verringert, dennoch kommt die Pasteurellose in sämtlichen bewohnten Erdteilen vor. Besonders im Herbst treten Seuchenausbrüche mit gehäufter Mortalität auf; in kälteren klimatischen Zonen beobachtet man jedoch die akute Form nur selten, dafür sporadisch den chronischen Verlauf (MÉSZÁROS 1992).

Der Erreger gehört nicht zur Normalflora des Geflügels; als Infektionsquelle kommen chronisch kranke Tiere und genesende Träger des Bakteriums sowie freilebende Vögel, Muriden, Haustiere oder sogar Insekten in Frage. Die Verbreitung erfolgt aerogen, über direkten Kontakt oder indirekt über belebte und unbelebte Vektoren.

Der Ausbruch der Krankheit ist abhängig von der Erregervirulenz sowie der Abwehrlage des Wirtes; Pute und Ente sind zudem von sich aus hoch anfällig (SIEGMANN 1993). Bei der Pute schlägt auch die medikamentelle Therapie nur schlecht an. Wildvögel sind dagegen meist hochresistent (MÉSZÁROS 1992). Für das Entstehen der Geflügelcholera sind zum Teil die Endotoxine von Pasteurella multocida verantwortlich (QUINN et al. 1994).

Bei Puten erkranken vor allem Tiere über 8 Wochen. Eintrittspforten stellen die Schleimhäute der Schnabelhöhle und des Pharynx sowie Hautwunden dar. Die Erkrankung verläuft meist primär septikämisch in Form einer systemischen Koagulopathie. Die Tiere sterben an einem durch freiwerdendes Endotoxin ausgelösten Schockgeschehen. Bei geringer Erregervirulenz kann sich die Krankheit auch nur auf den Atemtrakt beschränken oder eine sekundäre Organmanifestation ausbilden nach vorübergehender nichtletaler Bakteriämie. Die Inkubationszeit kann wenige Stunden bis 9 Tage betragen, die Mortalität schwankt zwischen 3,5 und 90 %.

Man unterscheidet zwischen verschiedenen Verlaufsformen, wobei bei perakutem Verlauf keine Symptome am Einzeltier beobachtet werden können, sondern nur plötzlich vermehrte Verluste im Betrieb eintreten. Akut erkrankte Tiere zeigen Störungen des Allgemeinbefindens, gelb-grauen bis grünlichen Durchfall, Zyanose

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der Kopfanhänge und Dyspnoe mit Schnabelatmung. Selten wird blutiger Ausfluß aus der Schnabelhöhle beobachtet. Die Tiere sterben nach 2 – 4 Tagen bei zunehmender Dyspnoe unter Krämpfen. In der chronischen Form zeigen sich lokalisierte Entzündungserscheinungen, z.B. an den Sprunggelenken, der Brustblase, den Sinus oder den Augen und/oder Atemgeräusche und Schnupfensymptome (SIEGMANN 1993; HAFEZ 1997). Die Kehllappen sind zunächst geschwollen, entwickeln aber später umgrenzte harte Herde, die meist aufbrechen (Läppchenkrankheit). Durch Futterverweigerung magern die Tiere ab, werden teilweise anämisch. Verlust des Gleichgewichtssinnes durch Erkrankung des Mittelohrs, Lähmungen und Tortikollis (GLÜNDER et al. 1982) können auch auftreten. Periarthritische Abszesse oder solche in Haut und Unterhaut brechen auf oder verkapseln sich. Die genannten Symptome treten meist nicht zusammen, sondern nur eins zur Zeit auf, manchmal vergesellschaftet mit Durchfall. Ein krampfartig abgesetztes, gelblich-bröckeliges Exkret weist auf Eileiterentzündung hin (MÉSZÁROS 1992).

Bei Sektionen findet man bei perakuten Verläufen meist gar nichts oder nur epikardiale Petechien und ekchymatöse Blutungen in Schleimhäuten und serösen Häuten; selten eine exsudative Pneumonie. Bei akutem Verlauf zeigen sich ein- oder beidseitige exsudative fibrinopurulente Pneumonien (bei Puten oft kruppös), Leberschwellungen und serofibrinöse Entzündungen des Perikards, der Luftsäcke und des Peritonäums. Petechien, Ekchymosen, Hydroperikard und Nekrosen in verschiedenen Organen sind nicht selten. Fibrinauflagerungen kann man auf vielen Organen und im Darmkanal entdecken, wo kleine Erosionen, hämorrhagische bis fibrinöse Enteritis und Blutbeimengungen des Inhaltes auftreten können. Bei chronischer Erkrankung stehen katarrhalisch fibrinöse Rhinitis, Sinusitis und Blepharokonjunktivitis oder Tracheitis mit Bronchopneumonie im Vordergrund.

Hochgradige lokale entzündlich-regressive Veränderungen der Skelettmuskulatur, Knochen, Meningen, Augen und des Mittelohrs, Gelenk- und Schleimbeutelentzündungen mit massenhaft serofibrinösem Exsudat und Eileiter-,

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Eierstock- und Bauchfellentzündungen kommen auch vor (MÉSZÁROS 1992;

SIEGMANN 1993; HAFEZ 1997).

Histologisch können vor allem die Gefäßwandschädigungen, Störungen der Hämodynamik und Gerinnung, bei akutem Verlauf Hyperämie, Ödemblutungen und Gefäßthromben nachgewiesen werden. Daneben werden oft Koagulationsnekrosen in parenchymatösen Organen und Infiltrationen mit heterophilen Granulozyten gefunden (SIEGMANN 1993).

Die Diagnose kann nur über Erregerisolierung und –identifikation nach der Verdachtsdiagnose gestellt werden. Als Differentialdiagnose muß dabei vor allem an Putenrhinotracheitis (TRT), klassische Geflügelpest, Newcastle Disease, Aviäre Influenza A, Tuberkulose, Mykotoxikose sowie Ornithobacterium rhinotracheale- Infektion, Salmonellen-, Streptokokken- und Staphylokokken, Rotlauf- und Yersinieninfektion gedacht werden (MÉSZÁROS 1992; SIEGMANN 1993; HAFEZ 1997).

2.3. Die Pute

Die Gesamtzahl gehaltener Puten hat sich in den letzten Jahren merklich erhöht, es ist zur Zeit die einzige Fleischart, deren Pro-Kopf-Verbrauch stetig ansteigt. Zudem ist in den nächsten Jahren mit einem weiteren Anstieg vor allem der Öko- Nahrungsmittel auf 10-15 % des Gesamtnahrungsmittelverbrauchs zu rechnen. Die am Ende der Mast erreichten Gewichte haben sich durch Zucht in den letzten zwanzig Jahren stark gesteigert; war das Durchschnittsgewicht eines Masthahns 1972 etwa 11,5 kg, erreicht er heute rund 19 kg. Bei Hennen wurde eine Steigerung um rund 3 kg erreicht (FELDHAUS u. SIEVERDING 2001).

Achtzig Prozent der Puten auf dem Weltmarkt werden in den USA (54 %) und Westeuropa (26 %) erzeugt. Die so produzierten Mastputen werden unterschieden in