Bakteriologische Untersuchung

Von den in der Sektion steril entnommenen Organen wurde zunächst eine frische Schnittfläche geschaffen, die auf Blutagarplatten aufgedrückt und mit einer sterilen Öse ausgestrichen wurde. Nach der Inkubation unter reduzierter Sauerstoff-Spannung über 24 Stunden bei 37 °C wurde von jeder Kultur durch Überimpfen der Kolonien auf eine neue Blutagarplatte eine Reinkultur hergestellt und von den Bakterien dann eine Gramfärbung angefertigt. Die Fähigkeit zur Katalasebildung wurde durch Blasenbildung in Kontakt mit Wasserstoffperoxid festgestellt, die zur Bildung von Cytochromoxidase wurde durch Verfärbung jeweils mit N,N-Dimethyl-p-Phenylen-Diamin (Product-Code: D-5004, Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) und N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-Phenylen-Diamin-Dihydrochlorid

(Product-Code: GA 12845, Firma Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz) überprüft. Diese Untersuchung war ausschließlich auf die Keime ausgerichtet, die bei der Challenge-Infektion eingesetzt wurden.

Bordetellen und Pasteurellen stellen sich hier gleich als gram-negative kokkoide Stäbchen dar, die Katalase- und Cytochromoxidase-positiv sind. Zur Sicherheit wurde die Kultur nochmals mit einer wie vorn unter 3.3.1.2. beschriebenen Musterkultur verglichen.

3.8. Antikörpernachweis

Das laut Versuchsplan (siehe 3.2.) regelmässig mit einer Einwegskanüle aus der Vena ulnaris entnommene gegen Gerinnung mit Heparin versetzte Blut wurde bei 3777 x g (3000 U/min) 5 min zentrifugiert (Minifuge RF der Firma Heraeus, Hannover) und das gewonnene Plasma umgehend bei –70 °C in jeweils zwei Portionen eingefroren. Jeweils eine Portion wurde gebraucht für die folgend beschriebenen Tests.

3.8.1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Die Seren der einen Antigengruppe wurden mit kommerziell erwerbbaren ELISA-Testkits der Firma KPL Synbiotics Corporation, Lyon, Frankreich, auf Pasteurella multocida untersucht mit dem Kit Proflock PM 900 Tests Turkey (AUTPM900), die der anderen Gruppe auf Bordetella avium mit dem Kit Proflock BA 900 Tests Turkey (AUTBA900).

Das ELISA-Testkit für Pasteurella multocida erfasst die Serotypen 1, 3 und 4. Beide Kits arbeiten mit Ziegen-Antikörpern gegen Puten-IgG und dem Enzym Peroxidase, das das Chromagen von klar nach grün-blau umschlagen lässt. Auf jeder Platte wurden parallel zu jeweils 90 Testseren je drei positive und drei negative

Kontrollseren mitgetestet. Das Vorgehen richtete sich nach den Angaben des Herstellers. Die Titer wurden mittels eines ELISA-Readers (INC^® Flow, Titertek^® Multiscan Plus Mk 11, Meckenheim) bei 405 – 410 nm bestimmt. Die Ergebnisse aus der Bestimmung der optischen Dichte wurden wie folgt ausgewertet:

Der Mittelwert der optischen Dichte der positiven Kontrollseren ergibt die positive Kontrolle, der Mittelwert der optischen Dichte der negativen Kontrollseren ergibt die Normal-Kontrolle. Durch Subtrahieren der Normal-Kontrolle von der positiven Kontrolle ergibt sich die korrigierte positive Kontrolle.

Von den erhaltenen optischen Dichten der Testseren wird die Normal-Kontrolle abgezogen und die Differenz durch die korrigierte positive Kontrolle dividiert. Der erhaltene Titer ergibt sich aus dem Antilogarhithmus des LOG10 Titers.

Bei Pasteurella multocida sind die Ergebnisse gültig, wenn der Mittelwert der optischen Dichte der Normal-Kontrolle unter 0.250 und der der korrigierten positiven Kontrolle zwischen 0.250 und 0.900 liegt. Optische Dichten von 0.199 und weniger bekommen hier einen Titer von 0 und werden als negativ angesehen.

Bei Bordetella avium sind die Ergebnisse gültig, wenn der Mittelwert für die Normal-Kontrolle unter 0.250 liegt und der der korrigierten positiven Normal-Kontrolle zwischen 0.350 und 1.000. Optische Dichten kleiner als oder gleich 0.299 werden als negativ angesehen und bekommen einen Titer von 0.

Die hiermit angezeigten Titer implizieren keinen Schutz; Impferfolg und Infektion können nicht unterschieden werden.

3.8.2. Immundiffusion

Bei der Immundiffusion handelt es sich wie unter 2.5.3.2. beschrieben um eine Diffusion, bei der das Serum bzw. Plasma und die Antigensuspension in halbfestem

Medium aufeinander zu diffundieren und im Zentrum bei gleicher Konzentration von Antigen und Antikörper mit dem Antigen-Antikörper-Komplex ein sichtbares Präzipitat entsteht. Weitere Einzelheiten sind im Folgenden beschrieben.

A. Herstellung des Agars mit Puffergemisch nach Sörensen

(1) Ansetzen von zwei Stammlösungen:

1/15 molare Na2HPO4-Stammlösung (1):

11,866 g Na2HPO4 * 2 H2O in 1000 ml Reinstwasser lösen.

1/15 molare KH2PO4-Stammlösung (2):

9,073 g KH2PO4 in 1000 ml Reinstwasser lösen.

(2) Herstellung einer 10-fach konzentrierten Stammlösung:

60 ml Stammlösung (1) mit 40 ml Stammlösung (2) vermischen und die erhaltenen 100 ml mit 900 ml Reinstwasser auffüllen.

(3) Herstellung einer Gebrauchslösung:

100 ml 10-fach konzentrierter Stammlösung wurden mit 900 ml Reinstwasser aufgefüllt.

(4) Herstellung des Agars:

Zu 500 ml Gebrauchslösung wurden nun 40 g NaCl und 5 g Purified Agar (Bacto-Agar, Firma Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) gegeben, gut durchgemischt und der pH-Wert mittels pH-Meter und 0,1 N NaOH-Lösung auf 7,2 eingestellt. Anschließend wurde die erhaltene Lösung 15 min bei 121 °C autoklaviert und je 5 ml noch heiß in Petrischalen (Durchmesser 55 mm) gefüllt. Nach dem Erstarren bei Raumtemperatur wurde der Agar im Kühlschrank in einer feuchten Kammer aufbewahrt.

B. Herstellung der Antigene (in Anlehnung an HAAS 1994)

Die in Magermilch bei -70 °C gelagerten Bakterienstämme wurden aufgetaut und mit ihnen wurde eine Vermehrung und Abschwemmung durchgeführt wie unter 3.3.1.

beschrieben. Die Bakterien wurden dann wie bei der Herstellung der Impfstoffe nur ohne Formalin-Zusatz gewaschen und über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank inkubiert.

Am nächsten Tag wurde die Bakteriensuspension in einem Eiswasserbad mit einem Ultraschallstab dreimal im Abstand von einer Minute für 30 Sekunden mit 10 Mikron beschallt (150 Watt Ultrasonic Disintegrator, Fa. MSE). Danach wurde wiederum bei 6700 x g (6000 U/min) in einer Minifuge RF (Firma Heraeus) zentrifugiert und der gewonnene Überstand in einem neuen Zentrifugenglas bei 4 °C mit 40.000 g (18.000 U/min) 30 Minuten zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit der Pipette abgenommen und in 2 ml Portionen bei -70 °C eingefroren.

Anschließend erfolgte die Bestimmung des Gesamtproteins nach der Methode von LOWRY et al. (1951). Die Proteindichte der Antigensuspension wurde daraufhin auf 1 mg/ml eingestellt.

C. Durchführung der Immundiffusion

Mit einer speziellen Stanze, bei der 6 Löcher von ca. 2 mm Durchmesser um ein ebenso großes zentrales Loch innerhalb eines Durchmessers von 1,5 cm angeordnet sind, werden zunächst die Löcher für Antigen und Seren aus dem Agar gestanzt und die losen Stücken mit der Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Die Agarplatte wird beschriftet und ein entsprechendes Protokoll angegelegt. Die zu untersuchenden Seren sowie Positiv- und Negativ-Kontrolle werden zu je 10 µl in die äußeren Löcher, das präzipitierende Antigen in das zentrale Loch pipettiert. Die beimpften Platten werden bei Zimmertemperatur in einer feuchten Kammer aufbewahrt und nach 24 und 48 Stunden bei schräg einfallendem Licht abgelesen. Als positive Reaktion wird die Bildung einer Präzipitationslinie zwischen Serum und Antigen verstanden und in

das Protokoll eingetragen. Treten keine Präzipitationslinien auf, gilt dies als negative Reaktion.