Bakterielle Antigene

Bordetella avium

Es wurde der Stamm Bordetella avium ATTC 35086 verwendet, der 1978 durch HINZ et al. beschrieben wurde und als Referenzstamm gilt. Die Bakterien befanden sich in lyophilisierter Form.

Pasteurella multocida

Der in dieser Arbeit verwendete Stamm von Pasteurella multocida wurde unter der Untersuchungsnummer 824 am 24.11.1999 in der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus einer toten Pute isoliert. Die Sektion ergab, dass das 25 Wochen alte Tier einer bakteriellen Mischinfektion erlegen war, bei der Pasteurella multocida die Hauptrolle spielte.

Es handelt sich bei dem verwendeten Stamm um einen schleimig ohne Hämolyse wachsenden Keim. Er befand sich in lyophilisierter Form.

Aufarbeitung der Bakterien (nach SPIERING 1992)

A. Vermehrung

Nach Inoculation von je 5 Blutagarplatten pro Keim mit der Magermilch-Bakteriensuspension lässt man sie 24 Stunden bei 37 °C unter reduzierter Sauerstoff-Spannung inkubieren. Die reduzierte Sauerstoff-Spannung wird erreicht, indem in einem geschlossenen Topf die darin enthaltene Luft bis 500 mbar abgesaugt und danach bis 900 mbar mit Stickstoff ersetzt wird.

B. Subkultur

Nach Verifikation der Reinheit der Bakterienkultur werden einige Kolonien auf 5 neue Blutagarplatten inokuliert und bei 37 °C 24 Stunden unter verminderter Sauerstoff-Spannung inkubiert. Danach werden die Kulturen über Nacht bei 4 °C bis zur weiteren Verarbeitung zwischengelagert. Die Kolonien wurden wie folgt charakterisiert:

Bordetella avium: klein (< 0,5 mm), durchscheinend, glänzend, kein charakteristischer Geruch.

Pasteurella multocida (hier): mittelgroß (um 2 mm), grau-weiß, glänzend, schleimig, süßlich-aromatischer Duft, ohne Hämolyse.

C. Vermehrung der Kolonien

Nach Inoculation von 75 Blutagarplatten mit den Kolonien der Subkultur werden sie 24 Stunden bei 37 °C wie oben beschrieben inkubiert.

D. Bakterienernte

Die mit reinen Kulturen bewachsenen Blutagarplatten werden mit 2 ml steriler isotonischer (0,9 %) Natriumchlorid (NaCl)-Lösung abgeschwemmt, die Oberfläche der Agarplatte vorsichtig mit der Pipette abgekratzt, um die Kolonien abzulösen, und die Suspension in einen Erlenmeyerkolben pipettiert. Die Platte wird erneut mit 1 ml steriler NaCl-Lösung beschichtet und die Flüssigkeit nochmals in den Erlenmeyerkolben abpipettiert. Die Suspension wird im Kolben auf knapp 250 ml aufgefüllt, dann die Bakterienanzahl mittels Verdünnungsreihen bestimmt.

E. Bestimmung der produzierten Bakterienanzahl

Es wird eine Verdünnungsreihe mit dem Faktor 10 erstellt. Um die Verdünnungsstufe 10^-1 zu erhalten, wird von der Bakteriensuspension 0,2 ml entnommen und zu 1,8 ml NaCl-Lösung gegeben und mittels eines Reagenzglasschüttlers (Merck, Darmstadt) gemischt. Die Herstellung weiterer Verdünnungsstufen erfolgt entsprechend. Von den Verdünnungen ab 10^-6 werden je 0,1 ml im Doppelansatz auf Blutagarplatten mit der für die Entnahme verwendeten 1 ml-Glaspipette ausgestrichen. Die Anzahl der nach dem Inkubieren (24 Stunden bei 37 °C, unter reduzierter Sauerstoff-Spannung) gewachsenen Kolonien wird protokolliert und die beiden höchsten Verdünnungsstufen, auf denen Wachstum verzeichnet werden konnte, wurden ausgezählt und unter Berücksichtigung der inokulierten Menge mit dem gewogenen arithmetischen Mittel die Keimzahl pro ml Reinkultur errechnet.

F. Inaktivierung der Bakterien

Die Bakterien werden durch eine 0,5 %ige Formalinlösung inaktiviert. Um diese in 250 ml Bakteriensuspension herzustellen, wird die Menge der konzentrierten Formalinlösung mit 36,5 %, die zugesetzt werden soll, auf 3,4 ml festgelegt. Nach Durchmischen der Suspension durch leichtes Schwenken wird sie 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschließend vor der weiteren Bearbeitung eine Nacht bei 4 °C zwischengelagert.

G. Waschen der Bakterien und Einstellung der Antigenkonzentration

Die Bakteriensuspension wird dreimal gewaschen, indem sie 30 min bei 10.000 x g bei 8 °C zentrifugiert wird und der bakterienhaltige Bodensatz mit steriler isotonischer Kochsalz(NaCl)-Lösung resuspendiert wird. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt.

Nach der letzten Waschung werden die Bakterien in eine Suspension der Dichte 2,5 * 10¹⁰ mit isotonischer Kochsalzlösung gebracht und es werden - wie im Europäischen Arzneibuch erlaubt - 0,05 % Formalin zugegeben.

3.3.2. Adjuvantien

3.3.2.1. Aluminiumhydroxid (Alu)

Aluminiumhydroxid wurde in Form von Alhydrogel von der Firma Superfos, Vedbaek, Dänemark, bezogen. Es handelt sich dabei um ein kolloidales Aluminiumhydroxidgel, das stabil, viskös und homogen ist. Es wird steril pyrogenfrei vertrieben und hat eine einheitlich hohe Adsorptionskapazität. Alhydrogel ist in Abwesenheit von Elektrolyten positiv geladen und bildet Komplexe mit Aminosäuren.

Die Bindungskapazität ist abhängig von der Konzentration und der Natur des Antigens und der zugegebenen Substanzen, dem pH-Wert der entstandenen Mischung und der Konzentration von Salzen und puffernden Ionen.

Das hier verendete Alhydrogel, bezeichnet als „Grade B“, enthält 2,0 % Al2O3

Trockenmasse, was 3,0 % Al(OH)3 entspricht. Der pH-Wert beträgt 6 - 6,5 die Absorptionskapazität bezogen auf Bovines Serum Albumin (BSA) ist 8,0 mg pro ml Alhydrogel und die Proteinbindungsfähigkeit 17 mg/ ml bezogen auf Humanes Serum Albumin (HSA). Aluminiumhydroxid wird im Folgenden der Länge des Wortes wegen auch mit dem Kürzel "Alu" bezeichnet.

3.3.2.2. Gerbu Adjuvant 100 (Gerbu)

Gerbu Adjuvant 100 ist ein von der Firma Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg (Produkt-Nummer # 3100), entwickeltes und vertriebenes Adjuvans für Versuchstiere, speziell für Kaninchen und Hühner. Es enthält pro 5 ml Adjuvans 100 µg des Glycopeptids GMDP (N-Acetyl-glucosaminyl-(ß,1-4)-N-acetylmuramyl-L-Alanyl-D-Isoglutamin, beschrieben von LEDERER 1980) gelöst in einer wäßrigen Nanosuspension eines festen, biologisch abbaubaren Lipids aus Cetylpalmitat.

Weiterhin enthalten 5 ml Adjuvans als Synergist 400 µg DDA

(Dimethyldistearoylhydroxyethyl-Ammoniumchlorid (Esterquat 1)) zur Erzeugung der wirkungssteigernden positiven elektrischen Ladung. Zudem sind Emulgatoren (Tween 80^/ Span 80^) enthalten, die für die Stabilisierung des Adjuvans sorgen.

Das GMDP besteht aus einem Zellwandbaustein von Lactobacillus bulgaricus, hergestellt nach BOGDANOV et al. (1957), und soll bezogen auf Freund’s Complete Adjuvant die Mycobakterien ersetzen. Die Nanopartikel des Lipids sollen für eine Balance zwischen Phagozytose-Effekt und Gewebereaktion sorgen. Sie sollen hohe humorale Antikörpertiter (MESHERIAKOVA et al. 1991) und eine Th1-Reaktion hervorrufen (DOZMOROV et al. 1991).

Laut beigefügtem Informationsblatt der Firma Gerbu treten bei kleinen Tieren bei subkutaner Injektion keine Nebenwirkungen auf, die Bestandteile sind oral und parenteral nichttoxisch (GRUBHOFER 1994). Größere Tiere allerdings reagieren sensibler auf das enthaltene DDA mit Granulomen und offenen Abszessen.

Gerbu 100 wird im Folgenden auch nur als "Gerbu" angesprochen.

3.3.2.3. Mineralöl (PAT)

Das hier als „Mineralöl“ bezeichnete Adjuvans wurde selbst hergestellt auf Anregung verschiedener unter 2.1.3.2. genannter Artikel. Insbesondere wurde die Untersuchungen von STONE et al. (1981 und 1983) zur Ermittlung der optimalen Konzentration und die Erfahrungswerte anderer Autoren (STONE 1987; STONE u.

XIE 1990) mit dieser Vakzine verwendet.

Hier wurden 15 g Paraffinum liquidum mit 0,5 g Arlacel A^® (Firma Brenntag Eurochem GmbH, Mühlheim a. d. Ruhr, Produkt-Nummer: 460000) autoklaviert, 10 ml wässriges Bakterieninaktivat mit 0,3 ml Tween 80^® (Firma Carl Roth GmbH &

Co. KG, Karlsruhe, Artikel-Nummer: 9139.1) gemischt und in die autoklavierte Öllösung gegeben. Mit dem Ultraturrax (nach Prof. Willems, Firma Janke & Klinkel GmbH, IKA Werk, Staufen) wurde das Ganze unter Eiskühlung gründlich gemischt,

homogenisiert und steril abgefüllt. Als Kurzbezeichnung für die Kombination von Paraffin, Arlacel und Tween wurde "PAT" gewählt.

3.3.2.4. Freund’s inkomplettes Adjuvans (FIA)

Freund’s inkomplettes Adjuvans wurde von der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, bezogen (Produkt-Code: F5506). Die Kurzbezeichnung "FIA" ergibt sich aus den Anfangsbuchstaben sowohl der deutschen (siehe oben) als auch der englischen Bezeichnung Freund's Incomplete Adjuvant.

3.3.2.5. Freund’s komplettes Adjuvans (FCA)

Freund’s komplettes Adjuvans wurde von der Firma Difco Laboratories, Detroit, MI, USA, bezogen (Produkt-Nummer: 263810). Die Kurzbezeichnung "FCA" ergibt sich aus den Anfangsbuchstaben der englischen Bezeichnung Freund's Complete Adjuvant.