ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-Antikörper

ELISA-Antikörpertiter nach Impfung gegen Bordetella avium

In beiden Versuchsdurchgängen waren die Titer frühestens an Tag 7 nach der Vakzination zu bemerken, die höchsten Titer wurden erreicht mit Freund's inkomplettem Adjuvans, Freund's komplettem Adjuvans und Gerbu 100. Die

Titerhöhe ist mit 1000 - 2000 als mittelmäßig (siehe unten: Vergleich mit anderen Autoren) zu beurteilen. Der gleichmäßigste Anstieg wurde ohne Adjuvans erreicht, jedoch waren die Titer gering.

ELISA-Antikörpertiter nach Impfung gegen Pasteurella multocida

Bei der Pasteurellengruppe war ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Versuchsdurchgängen zu bemerken. So wird in beiden Versuchsdurchgängen zuerst die Antikörperbildung durch den kommerziellen Impfstoff verursacht, der auch die zweithöchsten Titer auslöst, wobei noch höhere Antikörpertiter aber im ersten Durchgang durch die Vakzine mit Freund's komplettem Adjuvans, im zweiten Durchgang durch die Vakzine mit Mineralölgemisch erreicht werden. Die Höhen der Titer sind hier mit Werten zwischen 2000 und 6800 schon zufriedenstellender und könnten eher Schutz vor einer Infektion bieten, zumal laut SOLANO et al. (1983), der Antikörpertiter des ELISA und Schutz bei Challenge-Infektion hoch korreliert sind. Ein gleichmäßiger Titeranstieg erfolgte in beiden Durchgängen bei Verwendung von den Freund'schen Adjuvantien und in jeweils einem Durchgang nach Impfung mit kommerzieller Vakzine und Impfstoff mit Aluminiumhydroxid.

ELISA-Ergebnisse im Vergleich zu anderen Autoren

In der Literatur wurden mit anderen Antigenen im gleichen Zeitraum nach der Impfung sehr unterschiedliche ELISA-Titer erreicht, z.B. Maximaltiter beim Huhn von 320 (PATEL et al. 1995), bei Broilern von 8500 mit viralem Antigen (CHINNAH et al.

1992), und im Eidotter gemessene Titer bei Hühnern von 7400 (ERHARD et al.

1997 a). Mit dieser Arbeit vergleichbare Titer wurden bei Hühnern (Titer unter 2000) von ERHARD et al. 1991, und McCLIMON et al. 1994 (Titer um 1500) beschrieben.

Da die Antigene und ELISA-Systeme aber alle unterschiedlich sind, ist hier ein Vergleich fast unmöglich und die obige Wertung nur ein Ansatz.

Auch im Vergleich mit anderen Autoren kann kein Titer festgelegt werden, der als protektiv festgelegt werden kann. Bei den meisten Autoren fehlen Angaben über Schutzwirkung und genaue Definitionen der ELISA-Systeme.

Bei den Autoren, die Freund's komplettes mit Freund's inkomplettem Adjuvans verglichen haben, werden mit dem kompletten die höheren Titer erreicht (FRENCH et al. 1970; YAMANAKA et al. 1993), ganz im Gegensatz zu den hier aufgezeigten Ergebnissen, wo in drei von vier Versuchen mit Freund’s inkomplettem Adjuvans höhere Antikörpertiter nachzuweisen waren als bei komplettem. Aluminiumhydroxid hat laut BENNET et al. (1992), ebenso wie in dieser Studie weniger Effekt als Freund's komplettes Adjuvans.

Ebenso wie hier bei der Pute erreichten ERHARD et al. (1991) beim Huhn mit verschiedenen Adjuvantien nur geringe Titerunterschiede. Mit Freund's komplettem Adjuvans wurden dabei die höchsten Titer erreicht, die jedoch nicht signifikant waren (Wilcoxon-Test). Der Impfstoff mit Aluminiumhydroxid unterschied sich überhaupt nicht von der nicht immunisierten Kontrollgruppe. Auch bei STEINBERG et al. (1970), war bei Aluminiumhydroxid keine Titererhöhung gegen die Kontrolle festzustellen, während eine Öl-Emulsion einen dreifachen Anstieg hervorrief. Eine Mineralöl-Emulsion erreichte bei HILGERS et al. (1998), einen 16-fachen Titeranstieg im Vergleich mit der alleinigen Antigengabe, allerdings wurde dieser Versuch an Hühnern mit einem viralen Antigen durchgeführt. In dieser Arbeit dagegen stellten sich die Titer des “PAT” genannten Mineralölgemisches mit einem 0,42-fachen Titerabfall im Vergleich zur Immunisierung mit Bordetellen ohne Adjuvans eher schwach dar, genauso wie bei der Impfung mit Pasteurellen im Vergleich nur ein 2,4-fachen Anstieg der Titer gegenüber der Impfung ohne Adjuvans zu bemerken war (siehe Tabellen 33 – 36 im Anhang). Die in diesem Vergleich besten Anstiege wurden durch Freund’s inkomplettes Adjuvans bei der Bordetellengruppe (13-facher Anstieg) und durch Freund’s komplettes Adjuvans bei der Pasteurellengruppe (11,5-facher Anstieg) erreicht. Einen Antigeneffekt stellten auch ERHARD et al. (1997 a), fest, indem sich die Immunantwort bei einem bakteriellen Antigen von denen mit viralem Antigen oder Eiweiß sehr unterschied.

5.2.5. Immundiffusion

Zu bemerken ist an dieser Stelle, dass in den Ergebnissen der Immundiffusion keine Übereinstimmung mit den Ergebnissen des ELISA besteht. Auch wenn der ELISA noch keine Serumtiter anzeigte, waren laut Immundiffusion schon bei einigen Tieren Antikörper vorhanden. Auch der zeitliche Verlauf unterscheidet sich deutlich. Dies gilt sowohl für die Bordetellen- wie auch für die Pasteurellengruppe.

Präzipitierende Antikörper nach Impfung gegen Bordetella avium

Wie die Ergebnisse in zwei Versuchsdurchgängen zeigen, führt die Verwendung von Freund’s inkomplettem Adjuvans insgesamt am häufigsten zum Antikörpernachweis.

An zweiter Stelle kommt in einem Durchgang Freund's komplettes Adjuvans, in dem anderen Aluminiumhydroxid. An dritter Stelle sind hier jeweils in einem Durchgang nochmals Freund's komplettes Adjuvans und Gerbu 100 zu nennen. Die wenigsten Antikörperreaktionen waren in beiden Durchgängen in der Gruppe ohne Adjuvans nachweisbar. Das Auftreten präzipitierender Antikörper in der nicht immunisierten Kontrollgruppe zeigt, dass diese Antikörper auch nach einer Infektion entstehen.

Präzipitierende Antikörper nach Impfung gegen Pasteurella multocida

Die besten Effekte hatte in beiden Durchgängen der Impfstoff mit Freund's komplettem Adjuvans, gefolgt von Freund's inkomplettem Adjuvans. Die nächstbesten Antikörper-Ergebnisse wurden hier erstaunlicherweise von der Gruppe ohne Adjuvans, dann von der mit Mineralöl und der kommerziellen Vakzine erreicht.

Die wenigsten Antikörperreaktionen wurden bei Verwendung von Gerbu 100 als Adjuvans festgestellt.

5.2.6. Bakteriologische Untersuchung

Die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung kann bei den Pasteurellen leider nicht als Beurteilungskriterium einfließen, da der verwendete Stamm sich als nicht pathogen herausstellte und bei der Untersuchung 7 Tage nach der Inoculation nicht

mehr nachweisbar war. Bei den Bordetellen dagegen ist dieses Kriterium zu beurteilen. Man kann dort bemerken, dass bei der Kontrollgruppe im Chi-Quadrat-Test signifikant und auch der Gruppe ohne Adjuvans in beiden Durchgängen mehr Tiere mit Bordetellen nachgewiesen werden konnten, als bei den übrigen Versuchsgruppen. In beiden Durchgängen schneiden hier das Mineralölgemisch und Aluminiumhydroxid als die Adjuvantien mit den meisten nachweisbaren Bordetellen am schlechtesten ab.

5.3. Schlussfolgerung

Eine Beurteilung der Adjuvantien für bestandsspezifische Impfstoffe bei Puten ist mit der vorliegenden Arbeit möglich. Abhängig von den verschiedenen Testsystemen kommt man auf unterschiedliche Ergebnisse, aber zusammengefasst lässt sich aufgrund der durchgeführten Untersuchungen eine Wertung der Adjuvantien vornehmen. In einigen Fällen ließ sich nachweisen, dass zwischen Adjuvans und dem verwendeten Antigen, Bordetellen bzw. Pasteurellen, eine Wechselbeziehung besteht. In den meisten Fällen hat das Antigen aber keinen Effekt auf die Wirkung des Adjuvans, das heisst, dass diese bei allen Antigenen gleich gut einsetzbar sind.

Bei der Abwägung der Argumente für und gegen die einzelnen Adjuvantien ist die Korrelation zwischen größter Wirksamkeit und größten Schäden an der Applikationsstelle leider gegeben. Man muss also entscheiden, ob man die bestmögliche Titerantwort erhalten will und dabei größere Schäden in Kauf nimmt, was bei Versuchstieren sicher der Fall ist, oder auf die höchsten Titer verzichtet und ein Adjuvans wählt, das weniger Schäden verursacht, wie z.B. Aluminiumhydroxid.

Es konnten keine bestimmten Titerhöhen als protektive Titer festgelegt werden, da in den Challenge-Infektionen dieser Studie keine Tiere erkrankten und auch in der Literatur keine eindeutigen Informationen verfügbar sind. Zudem sind manche in der Immundiffusion nachweisbare Antikörper nicht im ELISA als Titer registrierbar, was nahelegt, dass ein eventueller Schutz auch ohne nachgewiesene Titer vorhanden sein kann. In dieser Arbeit konnten teilweise keine Unterschiede zwischen

Adjuvansimpfstoffen und der Vakzine ohne Adjuvans nachgewiesen werden, was nochmals überprüft werden sollte. Bei den Bordetellen könnte es daran liegen, dass Teile von Bordetellen als Adjuvans wirken und daher auch als solche eingesetzt werden (STEINBERG et al. 1970: Verwendung von inaktivierten Bordetella pertussis). Zu bedenken sind hier auch die relativ großen Standardabweichungen (siehe Tabellen im Anhang), die eine Überprüfung empfehlenswert machen. Sicher sollten noch weitere Versuche in ähnlichem Aufbau mit anderen und neueren auf dem Markt erhältlichen Adjuvantien, beispielsweise Saponin, Quil A, ISCOMs, Interferone und anderen, vorgenommen werden, da diese Arbeit nur eine Grundlage bilden kann.

Die Einbeziehung des kommerziellen Impfstoffs in diese Arbeit hat gezeigt, dass ein zugelassener Stoff mehr Schäden verursachen kann, als das immer als sehr tier-belastend beurteilte Freund'sche Adjuvans (BENNET et al. 1992; ERHARD et al.

1997 a; BRODERSON 1989; YAMANAKA et al. 1993). Interessant wäre im Rückblick noch gewesen, den inzwischen vom Markt genommenen Pasteurellen-Impfstoff der Firma Intervet®, der hier verwendet wurde, mit dem zu der Zeit etablierten jedoch auslaufenden Impfstoff Pabac® der Firma Fort Dodge® zu vergleichen. Während der kommerzielle Impfstoff in diesem Versuch in beiden Durchgängen die größten Irritationen an der Applikationsstelle hervorrief, ist nur in einem Durchgang in den ELISA-Titern ein Vorteil gegenüber dem Freund'schen Adjuvans festzustellen. Somit ist dieses dem kommerziellen Impfstoff in seiner Wirkung in etwa gleichzusetzen.

Erwartungsgemäß hatten von den verwendeten Adjuvantien die Freund'schen die größte Wirkung sowohl was Titerhöhen als auch was Irritationen an der Applikationsstelle betrifft. Überraschend an dieser Stelle war, dass bei den Pasteurellen in beiden, bei den Bordetellen in einem Durchgang Freund's inkomplettes Adjuvans größere Schäden im Impfbereich hervorrief als Freund's komplettes Adjuvans. Soweit nachweisbar, sind Aluminiumhydroxid, Mineralöl und Gerbu 100 zwar weniger schädlich, erreichen aber auch in keiner Messung ähnlich hohe nachweisbare Antikörpertiter wie die Freund'schen Adjuvantien. In der

Immundiffusion sieht die Anzahl positiver Reagenten dagegen auch hier günstiger aus. Da Gerbu 100 nur ein Versuchstier-adjuvans ist, das außerhalb von Labors nicht zugelassen ist, kann nach dieser Studie für Mastputen nur der Einsatz von Aluminiumhydroxid oder auch noch dem Mineralölgemisch aus Paraffin, Arlacel und Tween (PAT) als Adjuvans in stallspezifischen Impfstoffen empfohlen werden, da bei den Vakzinen, die höhere Titer erreichen, der gewebeirritierende Effekt zu viel Schaden am Schlachtkörper auslöst. Diese Stoffe stehen im Anhang II der Verordnung EWG 2377/90 und sind somit ohne Beschränkung zugelassen. Bei Elterntieren könnte, da diese länger leben und die Gewebeschäden somit besser ausheilen können, der Einsatz von den Freund'schen Adjuvantien in Erwägung gezogen werden. Unter dem Aspekt des Tierschutzes ist dies den Tieren gemäß dieser Studie zuzumuten, da das Allgemeinbefinden niemals gestört war. Die gesamte Studie kann natürlich nur Grundlage für weitere Forschung sein, in der dann wie oben erwähnt andere und neuere Adjuvantien getestet werden sollten, auch mit anderen Versuchstieren und anderen Antigenen, z.B. Viren oder Spaltvakzinen.

6. Zusammenfassung

Heidi van der Ven (2002):

Zur Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien in bakteriellen bestandsspezifischen Vakzinen für Puten

Nur wenige Impfstoffe gegen bakteriell bedingte Erkrankungen des Geflügels, insbesondere der Pute, sind kommerziell erhältlich. Nach dem Tierseuchengesetz (TierSG § 17 c Abs. 1 (2) und § 17 d Abs. 2) ist es zulässig, unter Verwendung von Erregerisolaten für einen Bestand "bestands-spezifische Vakzinen" herzustellen.

Diesen Impfstoffen werden im Allgemeinen Adjuvantien zugesetzt, um die Immunantwort auf ein Antigen zu erreichen oder zu verstärken, obwohl ihre Wirkprinzipien sehr unterschiedlich und teilweise noch unbekannt sind. Dies war der Anlaß, Aluminiumhydroxid, Freund's inkomplettes und komplettes Adjuvans sowie ein Mineralöl-Arlacel-Tween-Gemisch als zugelassene Adjuvantien (Anhang II EWG 2377/90) im Vergleich mit dem bei Versuchstieren verwendeten Adjuvans Gerbu 100 auf ihre Eignung in Impfstoffen für Puten zu prüfen.

Als bakterielle Antigene wurden Bordetella avium und Pasteurella multocida wegen ihrer Bedeutung als Krankheitserreger bei Puten verwendet. Die hergestellten Impfstoffe enthielten 10⁹ - 10¹⁰ KBE Formalin-inaktivierter Bakterien. Als Kontrollen fungierte eine mit Bakterien ohne Adjuvans immunisierte Tiergruppe und eine, der nur die gleiche Menge isotonischer Kochsalzlösung ohne Antigen injiziert wurde.

Zusätzlich zu den den Pasteurella-Vakzinen wurde ein zugelassener kommerzieller Impfstoff zum Vergleich eingesetzt. Die Tiere wurden im Alter von drei Wochen geimpft und zur Überprüfung der Immunität in der 10. Lebenswoche einer Challenge-Infektion unterzogen. Während des gesamten Versuchszeitraumes bis zur 11. Lebenswoche wurden die Puten regelmäßig serologisch untersucht. Zur Beurteilung des Gesundheitsstatus wurde neben der klinischen Beobachtung die Gewichtsentwicklung verfolgt. Die Versuche wurden einmal wiederholt. Zusätzlich wurde der durch die Vakzination verursachte Schaden an der Applikationsstelle adspektorisch und mittels Messung der Gewebeschwellung beurteilt.

Das klinische Bild und die Gewichtsentwicklung in den verschiedenen Tiergruppen wurde weder durch die unterschiedlichen Adjuvantien in den Impfstoffzubereitungen, noch durch das jeweils verwendete Antigen beeinflusst. Die Challenge-Infektion löste keine klinische Erkrankung sowohl bei den geimpften als auch bei den nicht geimpften Puten aus.

Humorale Antikörper wurden quantitativ mit einem kommerziellen ELISA und qualitativ mittels Immundiffusion nachgewiesen. Impfstoffe mit Bordetella-Antigen induzierten die höchsten Antikörpertiter, wenn Freund’s komplettes oder inkomplettes Adjuvans zugesetzt war. Die Titer waren bereits ab dem 21. Tag nach der Vakzination signifikant höher als in der Kontrollgruppe (Wilcoxon-Test). In der Immundiffusion waren präzipitierende Antikörper bei vielen Tieren bereits ab der 1. Woche nach Vakzination vorhanden. Ihr Auftreten war dabei unabhängig von der Höhe der ELISA-Titer.

Bei den gegen Pasteurellen geimpften Putengruppen unterscheiden sich die ELISA-Titer erst 28 Tage nach Impfung von denen der ungeimpften Kontrollgruppe. Der kommerzielle Impfstoff führte reproduzierbar zur besten humoralen Immunantwort.

Eine gute Immunreaktion konnte auch mit dem Impfstoff mit Zusatz von Freund’s komplettem Adjuvans erzielt werden. Impfstoffe mit anderen Adjuvantien führten in beiden Versuchsdurchgängen zu variierenden Ergebnissen. Präzipitierende Antikörper sind in den Seren aller Tiergruppen bereits ab dem 10. Versuchstag nachweisbar.

Die Messungen der Gewebeschwellung bei den gegen Bordetellen geimpften Tiergruppen ergaben die höchsten Werte anfangs bei dem Impfstoff mit Freund’s inkomplettem Adjuvans, später bei dem mit Freund’s komplettem Adjuvans. Beide unterschieden sich signifikant von der Negativ-Kontrolle (Varianzanlyse). Bei den gegen Pasteurellen immunisierten Putengruppen wurden die signifikant größten Schwellungen nach dem Impfen mit kommerziellen Impfstoff und mit Freund’s inkomplettem Adjuvans erreicht.

Bei der adspektorischen Beurteilung der Gewebeirritationen wurden bei den gegen Bordetellen geimpften Tieren von den Impfstoffen mit den Freund’s komplettem bzw.

inkompletten Adjuvans im Vergleich zur ungeimpften Kontrolle signifikant stärkere Reaktionen ausgelöst (Varianzanalyse). Nach Impfung gegen Pasteurellen löst nur der kommerzielle Impfstoff in Bezug auf Häufigkeit und Ausmaß Gewebereaktionen aus, die sich statistisch von denen der nicht immunisierten Kontrollgruppe absetzen.

Eine Challenge-Infektion gelang nur mit Bordetella avium. Alle getesteten Impfstoffe führten unabhängig vom eingesetzten Adjuvans zu einer in Chi-Quadrat-Test bzw.

Fisher’s Exact Test signifikant geringeren Reisolationsrate des Erregers im Vergleich zur nicht immunisierten Kontrolle. Eine nachweisbare Infektion mit Pasteurella multocida gelang nicht. Krankheitsfälle traten in allen Versuchsgruppen zu keinem Zeitpunkt auf.

In Bezug auf die Wirksamkeit der verschiedenen Adjuvantien als Zusatz von Vakzinen für Puten zeigt sich, dass Freund’s komplettes Adjuvans und Freund’s inkomplettes Adjuvans unabhängig vom Antigen zu den höchsten im ELISA nachweisbaren Antikörpertitern führen. Der zu Vergleichszwecken mitgeprüfte kommerzielle Pasteurellen-Impfstoff führte ebenfalls zu hohen Antikörpertitern.

Allerdings weisen diese Impfstoffe auch die ausgeprägtesten Gewebsreaktionen auf.

Da in der Immundiffusion nachweisbare präzipitierende Antikörper unabhängig vom gewählten Adjuvans zu etwa gleichen Zeitpunkten und in ähnlicher Häufigkeit auftraten und außerdem die antiinfektiöse Immunität am Beispiel einer Bordetella avium-Infektion etwa gleichwertig ausgeprägt ist, können auch Aluminiumhydroxid und ein Mineralöl-Arlacel-Tween-Gemisch als gut geeignete Adjuvantien angesehen werden ohne den Nachteil, schwerste Gewebereaktionen auszulösen. Das für Versuchstiere propagierte Adjuvans Gerbu 100 konnte nicht als überlegen beurteilt werden.

7. Summary

Heidi van der Ven (2002):

Studies on the efficacy of different adjuvants in live stock specific bacterial vaccines for turkeys

Only a few vaccines against bacterial infections of poultry especially the turkey can be obtained commercially. It is permitted by the German animal epidemic law (TierSG § 17 c Abs. 1 (2) and § 17 d Abs. 2) to produce so-called “herd-specific vaccines” for live stock using pathogen-isolates. Usually adjuvants are added to these vaccines to evoke or increase an immune response to an antigen, although their modes of action differ greatly and are still practically unknown. This was the reason for testing aluminum hydroxide, Freund’s complete and incomplete adjuvant and a mineral oil-Arlacel-Tween-mixture all being licensed adjuvants (Anhang II EWG 2377/90) as compared to the adjuvant Gerbu 100 – a substance licensed for the use on experimental animals - in respect to their suitability for this purpose.

Bordetella avium and Pasteurella multocida were used as antigens because with turkeys they are of significance. The produced vaccines contained 10⁹ to 10¹⁰ CFU of formaldehyd-inactivated bacteria. A group of animals that was injected with isotonic sodium chloride solution only and another that was vaccinated with the antigen in sodium chloride solution served as controls. Additionally, a commercial Pasteurella-vaccine was used for comparison. The turkeys were vaccinated at the age of three weeks and examined clinically as well as serologically up to their 11th week of age.

The damage at the application site was rated by adspection and measurement of the swelling of the tissue. Additionally, the weight of the animals was determined. In their 10^th week the animals underwent a challenge-infection. The experiments were repeated once.

Concerning the clinical examination and weight-measurements no differences between the different adjuvant-vaccinated groups were detected and no effects

caused by the applied antigens were observed. One week after the challenge-infection disease was detected in neither of the groups – including the control-groups.

Humoral antibodies were detected quantitatively using ELISA and qualitatively using immuno diffusion. In the serological examination of the Bordetella-vaccinated group both treatments with Freund’s adjuvants showed the highest titres, which differed significantly from the unvaccinated control after 21 days. In the immunodiffusion assay antibodies could be precipitated from the first week after vaccination onwards.

There was no correlation between the humoral immune response detected by precipitation and by ELISA.

In the Pasteurella-vaccinated group a difference in ELISA-titers as compared to the unvaccinated control group could only be detected after 28 days. Significant differences in titer, however, were seen in both sets of experiments using the commercial vaccine. The titres of the vaccines in combination with different adjuvants differed greatly between the two sets of experiments. In all groups precipitating antibodies were detected at the latest 10 days after vaccination.

The measurements of the swelling of the tissue in the Bordetella-vaccinated group in the beginning showed the largest swellings in the animals injected with Freund’s incomplete adjuvant. Both differed significantly from the unvaccinated control. In the Pasteurella-vaccinated group a maximum of tissue thickness was measured in those groups treated with commercial vaccine as well as those treated with Freund’s incomplete adjuvant.

As for the adspection of the application site significantly more irritation of tissues was detected in the Bordetella-vaccinated group as a result of both kinds of Freund’s adjuvant than in the unvaccinated control while in the Pasteurella-vaccinated group only the commercial vaccine gave rise to significant irritations.

A challenge-infection succeeded only in animals infected with Bordatella avium. In comparison to the unvaccinated animals all vaccinated animals no matter which adjuvant was used showed a distinct and significant reduction of the reisolation rate.

In the Pasteurella-group the challenge-infection failed. The disease did not break out in either of the groups.

Regarding the suitability of different adjuvants as additives to vaccines for turkeys it can be seen that the highest rise in titer seems to be induced by Freund’s complete

Regarding the suitability of different adjuvants as additives to vaccines for turkeys it can be seen that the highest rise in titer seems to be induced by Freund’s complete

Im Dokument Zur Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien in bakteriellen bestandsspezifischen Vakzinen für Puten (Seite 111-131)