Aufreinigung der rekombinanten Proteine

Außer dem mit einem luminiszierenden Tag verbundenen MSP aus der Gateway^® Technology besaßen alle anderen exprimierten Proteine die Möglichkeit der Aufreinigung über einen GST-Tag. Nach Aufschluß der Bakterien mittels Ultraschall befand sich das rekombinante MSP als löslicher Bestandteil in dem entstandenen Zelllysat. Über den N-terminalen GST-Tag der Fusionsproteine fand daraufhin eine Bindung an immobilisiertes Glutathion statt, das entweder an magnetische Partikel oder aber an Sepharose gebunden war.

Während dieser Bindungsreaktion wurden die restlichen, ungebundenen Proteine des Lysats

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mit mehreren Waschschritten entfernt und das gebundene Fusionsprotein schließlich wieder in reiner Form über die Zugabe eines Elutionspuffers eluiert.

3.13.1 Lyse der Zellen

Sowohl die Zellpellets der Small-scale- als auch die der Large-scale-Expression wurden nach Resuspension in 1x PBS (Proteine aus pGEX-Vektoren) bzw. in Gateway-Lysispuffer (Proteine aus Gateway-Vektoren) mit Ultraschall behandelt. Dazu wurden die Pellets der 50 ml Kulturen in jeweils 500µl 1x PBS bzw. Gateway-Lysispuffer aufgenommen und anschließend für drei Minuten bei einer Amplitude von 20 Micron einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt (MSE). Dieser Prozess fand in Intervallen von je 15 Sekunden statt, bei denen auf jede Ultraschallbehandlung eine Abkühlungsphase folgte. Die in einem 2 ml Eppendorfgefäß enthaltene Proteinsuspension wurde während der gesamten Zeit in Eiswasser gekühlt. Zum Entfernen der nach der Lyse vorhandenen groben Zellbestandteile wurde das Lysat bei 16000 g und Raumtemperatur für fünf Minuten zentrifugiert (HERAEUS). Die daran angeschlossene Aufreinigung erfolgte mit dem entstandenen Überstand.

Zum Aufschluss der Zellen aus der Large-scale-Expression wurden jeweils zwei Pellets in 10 ml 1x PBS resuspendiert und in ein 50 ml Falcon überführt. Die Ultraschallbehandlung wurde mit den oben beschriebenen Intervallen für eine Dauer von 6 Minuten und bei einer Amplitude von 20 Micron durchgeführt. Auch hier befand sich die Proteinsuspension während der gesamten Zeitdauer in einem Eiswasserbad. Die Zentrifugation (HERAEUS) fand bei 4 °C und 2750 g für 15 Minuten statt. Der proteinhaltige Überstand wurde abgenommen und im folgenden Schritt aufgereinigt.

3.13.2 Aufreinigung über MagneGST^®-Partikel

Mit diesem Verfahren wurden nur die aus der Small-scale-Expression gewonnenen Fusionsproteine aufgereinigt. Jedes aus einer 50 ml Kultur erhaltene Lysat wurde in einem 2 ml Eppendorfgefäß mit 100 µl der magnetischen MagneGST^®-Partikel (PROMEGA) versetzt, die zuvor in drei Waschschritten mit jeweils 250 µl MagneGST^®-Waschpuffer (PROMEGA) equilibriert wurden. Der Überstand in allen durchgeführten Wasch- und Bindungsschritten konnte nach Anlagerung der Partikel an einen Magneten, der außen an das

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Gefäß gehalten wurde, abgenommen werden. Die Bindung der Fusionsproteine bzw. der GST an die Partikel fand bei Raumtemperatur für 30 Minuten statt, nach Entfernen des Lysats wurden die Partikel insgesamt fünfmal für je 45 Minuten mit jeweils 800 µl MagneGST^® -Waschpuffer gewaschen. Sowohl das nach der Bindung entfernte Lysat als auch der nach jedem Waschen vorhandene Überstand wurden verworfen. Die Elution der gebundenen Proteine wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 500 µl Elutionspuffer für Proteine durchgeführt. Alle Schritte zur Aufreinigung wurden mit einem Überkopf-Schwenker (GFL) betrieben. Das eluierte Protein wurde anschließend sterifiltriert (RENNER), bei -20 °C gelagert und in einer Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zusammen mit den aus dem zweiten Aufreinigungsverfahren gewonnenen Proteinen aufgetrennt und mittels Coomassie Blue gefärbt. Damit waren eine Beurteilung des Grades der Aufreinigung beider Methoden und ein Vergleich der eluierten Proteinmengen möglich.

3.13.3 Aufreinigung über Glutathione Sepharose^® High Performance

Diese zweite Methode wurde nach einem ähnlichen Protokoll wie die oben dargestellte durchgeführt. Es wurden hier aber sowohl die in der Small-scale-Expression produzierten Proteine als auch die der Large-scale-Expression verwendet.

Zur Aufreinigung der 50 ml Kulturen dienten je 100 µl Glutathion Sepharose^® High Performance (AMERSHAM). Die Equilibrierung der Partikel erfolgte durch dreimaliges Waschen mit je 500 µl 1x PBS. Im Anschluss an jeden Wasch- und Bindungsschritt musste zur Abtrennung der Sepharose vom Überstand das 2 ml Gefäß für fünf Minuten bei 500 g und Raumtemperatur zentrifugiert werden (HERAEUS). Nach Equilibrierung folgte die Bindung des Proteins an die Sepharose für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Der nach der Zentrifugation vorhandene Überstand wurde ebenso wie die nach allen Waschschritten erhaltenen Überstände verworfen. Es wurde insgesamt fünfmal mit jeweils 1 ml 1x PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Elution des Proteins erfolgte mit 500 µl Elutionspuffer für Proteine für eine Stunde bei Raumtemperatur. Auch hier wurden alle Schritte mit dem Überkopf-Schwenker (GFL) durchgeführt. Die eluierten Proben wurden wie in 3.13.2 beschrieben weiterverwendet.

Die in der Large-scale-Expression exprimierten MSP-Fusionsproteine und GST wurden wie oben geschildert aufgereinigt, es wurden hier nur das Volumen der Partikel und Puffer

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variiert. Zu dem aus jeweils einem Liter Kultur hergestellten Lysat wurden je drei ml Sepharose-Partikel gegeben, die Equilibrierung fand mit je 15 ml 1x PBS statt. Alle Schritte wurden in 50 ml Falcons durchgeführt, die Zentrifugation fand bei 500 g und Raumtemperatur für 15 Minuten statt (HERAEUS). Zum Waschen dienten je 10 ml 1x PBS.

Die Elution der Proteine mit je 1 ml Elutionspuffer für Proteine wurde einmal wiederholt. Die aus dieser ersten und zweiten Elution gewonnenen Proteine wurden gepoolt und das Volumen mit autoklaviertem Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt. Nach Sterilfiltration (RENNER) und Aufteilung in 10 ml Aliquots wurden diese bei -80 °C (Kryosafe, SCHRÖDER) eingefroren.

Damit konnte für die Durchführung der Impfungen und der ELISA des zweiten und dritten Vakzinedurchgangs auf eine Proteincharge zurückgegriffen werden. Im Rahmen des ersten Vakzineversuch mit den dazugehörigen ELISA wurde ein weiterer Proteinpool verwendet.

3.13.4 Schneiden des Fusionsproteins mittels Thrombin

Das mit dem MSP-Klon 2T 4.14 produzierte rekombinante Fusionsprotein besaß durch den Vektor pGEX-2TK die Möglichkeit, den GST-Tag abzuspalten. Dazu konnte nach der Expression das Enzym Thrombin Protease spezifisch an dieser Stelle ansetzen und den GST-Tag vom MSP trennen.

Es wurden zwei verschiedene Verfahren durchgeführt, um das Fusionsprotein zu schneiden und anschließend getrennt vom GST in reiner Form zu erhalten. Zunächst wurde der Thrombinverdau im Verlauf der Aufreinigung getestet. Dazu wurde nach einer Small-scale-Expression die Aufreinigung sowohl mit MagneGST^®-Partikeln als auch mit Glutathion Sepharose^®High Performance wie in 3.13.2 und 3.13.3 beschrieben ausgeführt, wobei der Elutionsschritt jedoch entfiel. Stattdessen wurden nach Ende des letzten Waschschrittes 25 units Thrombin (AMERSHAM) in 500 µl 1x PBS auf die Partikel gegeben. Während einer Über-Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Blotschüttler (LABORTECHNIK FROEBEL) wurde dann das MSP von dem an die Partikel gebundenen GST geschnitten.

Nach einer Zentrifugation für fünf Minuten bei Raumtemperatur und 500 g konnte dann der Überstand mit dem reinem MSP von der Sepharose abgenommen werden. Der gleiche Schritt wurde mit einem Magneten bei den MagneGST^®-Partikeln durchgeführt. Anschließend wurde das noch gebundene GST mit dem Elutionspuffer für Proteine eluiert. Beide Proteinfraktionen wurden bei -20 °C gelagert und in einer SDS-PAGE analysiert.

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Als weitere Möglichkeit des Thrombinverdaus wurde das Fusionsprotein nach der Elution geschnitten. Da das hierbei verwendete 10 ml Aliquot aus der Large-scale-Expression das MSP-Fusionsprotein im Elutionspuffer-/Aqua bidest.-Gemisch enthielt, musste ein Pufferaustausch vorgenommen werden. Mit Hilfe der Vivaspin 6 ml Konzentratoren (SARTORIUS) wurde das Volumen des Elutionspuffer-/Aqua bidest.-Gemischs auf einen ml verringert. Die dazu notwendige Zentrifugation (HERAEUS) fand bei 2750 g und Raumtemperatur für ca. 30 Minuten statt. Daraufhin wurde das Volumen mit 1x PBS wieder auf fünf ml aufgefüllt. Nach Überführung in ein 12 ml Falcon wurden 40 units Thrombin zugesetzt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur, wobei das Gefäß über Kopf geschwenkt wurde (GFL). Um das geschnittene MSP schließlich vom GST zu separieren wurde die in 3.15 dargestellte Elektro-Elution gewählt.