Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

Zur Detektion systemischer, durch die Immunisierungen und die Belastungsinfektion hervorgerufener Antikörper dienten verschiedene ELISAs. Diese beruhten auf dem auch für die Vakzinierungen verwendeten MSP-Fusionsprotein, dem geschnittenem MSP und der GST. Zur Etablierung der Methode wurde in Vorversuchen mit den von Stammhaltungstieren gewonnenen Seren gearbeitet. Dabei wurde einerseits Serum parasitennaiver Kälber und andererseits Serum, welches 5 Wochen nach einer D. viviparus-Infektion entnommen wurde, genutzt. Die Behandlung und Lagerung der Blutproben erfolgte wie in 3.18.4 beschrieben.

Die in den Vorversuchen verwendeten aufgereinigten Fusionsproteine stammten aus gepoolten Small-scale-Expressionen und nicht aus den angefertigten ELISA-Pools.

Material und Methoden 93

Zunächst wurde in einem ersten Vorversuch der ELISA auf der Grundlage der MaxiSorp-Platten (NUNC) durchgeführt. Dazu dienten zwei unterschiedlich aufbereitete Fusionsproteine als Antigene. Zum einen wurden 150 µl (1 µg/µl) des Fusionsproteins mit 150 µl 8 M Harnstoffs gemischt, anschließend in 2700 µl Beschichtungspuffer aufgenommen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum anderen wurden 150 µl (1 µg/µl) Fusionsprotein direkt mit 2850 µl Beschichtungspuffer vermengt. Zur Beschichtung der Platten wurde mit beiden Antigenlösungen eine Titration durchgeführt, so dass schließlich eine Verdünnungsreihe von 5 µg Antigen/well bis 0,04 µg/well auf jeder Platte vorlag. Die Bindungsreaktion des Antigens an die Platte fand bei 4 °C über Nacht statt, die Platten waren wie bei allen folgenden Inkubationsschritten mit einer Folie (NUNC) bedeckt. Nach Entfernen der Antigenlösungen wurden die Platten drei Mal für jeweils fünf Minuten mit 1x PBS gewaschen (Immunowasher, NUNC). Die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen erfolgte mit 100 µl 5 %igem BSA-PBS/well für eine Stunde bei 37 °C im Glasperlenwasserbad (Wärmeschrank, HERAEUS). Nach Abgießen des Überstands und drei Waschschritten (Immunowasher, NUNC) mit PBS-Tween für je fünf Minuten folgte eine Inkubation der Platten mit positivem und negativem Serum. Dazu wurden die Seren 1:10 mit 1 %igem BSA-PBS-Tween verdünnt und 100 µl von dieser Verdünnung in jedes well gegeben. Als Leerwert diente ein well, welches kein Serum enthielt. Nach einer Lagerung der Platten von einer Stunde bei 37 °C im Glasperlenwasserbad, der Entfernung des Überstandes und dreimaligem Waschen mit PBS-Tween für je fünf Minuten wurde die Gebrauchslösung des Konjugates aufgetragen. Hierzu wurde eine 1:10000 Verdünnung des anti-bovinen IgG-Konjugates (SEROTEC) mit 1 %igem BSA-PBS-Tween angefertigt und 100 µl in jedes well pipettiert. Im Anschluss an die Inkubation für eine Stunde bei 37 °C im Glasperlenwasserbad erfolgten nach Abschütten des Überstandes drei Waschschritte von je fünf Minuten mit PBS-Tween, ehe 50 µl der frisch hergestellten Substratlösung in jedes well gegeben wurden. Nach einer Inkubation von 10 Minuten im Dunkeln und bei Raumtemperatur wurde die Bildung des Farbkomplexes durch Zugabe von 50 µl Stopplösung je well abgestoppt. Die Messung der optischen Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 490 nm in einem ELISA-Reader (BIO-TEK) durchgeführt.

Material und Methoden 94

In weiteren Vorversuchen folgte die Erprobung von zwei weiteren Mikrotiterplatten, Immobilizer^®Amino (NUNC) und Immobilizer^®Glutathion (NUNC). Die Durchführung dieser beiden ELISA fand nach dem gleichen Protokoll statt. Auch hier wurde bei der Beschichtung der Platten eine Antigentitration vollzogen, bei der als Ausgangslösung 300 µl (0,5 µg/µl) des Fusionsproteins mit 2700 µl 1x PBS je Platte vermischt wurden. Es ergab sich daraus wie bei den MaxiSorp-Platten eine Verdünnungsreihe von 5 µg/well bis 0,04 µg/well.

Die Inkubation der Platten erfolgte ebenfalls bei 4 °C über Nacht, wobei die Platten bei diesem und jedem weiteren Schritt mit Folie abgeklebt waren. Im Anschluss an die Beschichtung wurde der Überstand abgegossen und die Platten dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Zur Inkubation mit positivem und negativem Serum wurden 100 µl des vorher 1:10 in PBS-Tween verdünnten Serums in jedes well gegeben, wobei ein well je Platte ohne Serum blieb und als Leerwert diente. Nach einer Stunde bei 37 °C im Glasperlenwasserbad wurden die Platten wie oben beschrieben dreimal gewaschen. Daran anschließend fand die Detektion der Primärantikörper durch das Konjugat statt, wozu jedes well mit 100 µl der Gebrauchslösung des anti-bovinen IgG-Konjugates (SEROTEC) gefüllt wurde. Diese war vorher durch eine 1:10000 Verdünnung des Sekundärantikörpers in PBS-Tween hergestellt worden. Die folgende Inkubation bei 37 °C im Glasperlenwasserbad für eine Stunde wurde durch ein dreimaliges Waschen mit PBS-Tween beendet. Nach Zugabe von 50 µl/well des

frisch angesetzten Substrats wurde eine Zeitspanne von 10 Minuten abgewartet, ehe 50 µl/well der Stopplösung zugefügt wurden. Während dieser Zeit lief die stattfindende

Farbreaktion bei Raumtemperatur im Dunkeln ab. Die optische Dichte wurde im ELISA-Reader (BIO-TEK) bei einer Wellenlänge von 490 nm bestimmt.

Nach Auswertung dieser Vorversuche wurden alle weiteren ELISA und auch die in 3.20.2.2, 3.20.2.3 sowie 3.22 dargestellten ELISA mit der Immobilizer^®Amino Platte (NUNC) ausgeführt.

Material und Methoden 95

3.20.2.2 ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Fusionsproteins

Mit diesem ELISA wurden die aus allen drei Durchgängen vorhandenen Seren getestet, wobei nur die ab Tag -7 wöchentlich entnommenen Proben berücksichtigt wurden. Zur Darstellung des Beginns der Antikörperbildung nach der jeweiligen ersten Immunisierung dienten zusätzlich die an den Tagen 4 und 11 entnommenen Seren.

Nach der Durchführung von Schachbretttitrationen des Antigens und des Serums sowie der Erprobung verschiedener Konjugat-Verdünnungsstufen konnte dann ein gemeinsames Protokoll für alle ELISA auf der Grundlage des Fusionsproteins erstellt werden. Dazu musste das für die Immobilizer^®Amino Platte beschriebene Protokoll nur geringfügig modifiziert werden. Die eingesetzten Konjugate zum Nachweis von bovinem IgA, IgG, IgG1, IgG2 und IgM (SEROTEC) konnten alle in einer Verdünnung von 1:10000 verwendet werden. Die Beschichtung der Platten erfolgte mit 0,5 µg Fusionsprotein/well aus dem angefertigten ELISA-Pool, die Konzentration des Proteins wurde hierbei über den Bradford-Assay bestimmt. Die Seren wurden schließlich 1:40 in PBS-Tween verdünnt und als Duplikate getestet.

Als positive und negative Kontrollen wurden auf jeder Platte Duplikate der aus Stammhaltungstieren gewonnenen Seren verwendet, wobei bei den ELISA des dritten Durchgangs auf einen einheitlichen Pool zurückgegriffen werden konnte.

Die Ergebnisse der ELISA des ersten und zweiten Durchgangs wurden als Mittelwert der optischen Dichten (OD) der Probe nach Subtrahieren der OD des Leerwerts angegeben. Zur Auswertung der ELISA der dritten Vakzine wurde ein Index-Wert berechnet, der auch auf den Mittelwerten der Duplikate beruhte:

Index = ODProbe - ODLeerwert / ODpositivesReferenzserum - ODLeerwert

3.20.2.3 ELISA auf der Grundlage des geschnittenen MSP und der GST

Auch diese ELISAs fanden mit wenigen Veränderungen nach dem in 3.20.2.1 beschriebenen Protokoll für die Immobilizer^®Amino Platte statt. Nachdem verschiedene Konjugatverdünnungen getestet und zur Ermittlung der optimalen Antigenkonzentration und Serumverdünnung auch Schachbretttitrationen durchgeführt worden waren, konnten für alle

Material und Methoden 96

ELISAs auf Basis des geschnittenen MSP sowie für alle GST-ELISA einheitliche Antigen-, Serum- und Konjugatverdünnungen festgelegt werden.

Als Antigen des MSP-ELISA wurde dabei 0,25 µg Protein/well eingesetzt, die Seren wurden 1:40 verdünnt als Duplikate aufgetragen und die Konjugate in einer Gebrauchslösung von 1:10000 angewendet.

GST dagegen wurde in einer Menge von 1 µg/well gebraucht, die Seren für diesen ELISA wurden 1:20 verdünnt und auch als Duplikate getestet. Die Gebrauchslösung der Konjugate betrug ebenfalls 1:10000.

Diese ELISAs dienten ausschließlich zum Testen der Seren des dritten Vakzinedurchgangs, es wurden hierzu Seren der Tage 0, 21, 42, 63, 70, 77, 84, 91 und 98 genutzt. Zudem wurde hier nicht das anti-bovine IgM-Konjugat verwendet. Als positives und negatives Referenzserum wurden für den ELISA mit dem geschnittenen MSP die in 3.20.2.2 genannten Seren eingesetzt. Im GST-ELISA dagegen diente als positive Referenz ein Pool aus Seren, der aus den an Tag 46 des ersten Vakzineversuchs aus den Impfgruppen entnommenen Proben bestand.

Die Auswertung der Ergebnisse wurde nach der Berechnung der Mittelwerte der Duplikate wie in 3.20.2.2 geschildert als Index-Werte vorgenommen

3.20.2.4 Ceditest^® Lungworm

Dieser kommerzielle ELISA (CEDI-DIAGNOSTICS) zum Nachweis einer Lungenwurm-Infektion basiert auf einer aus adulten D. viviparus angereicherten, nativen Proteinfraktion.

Der Hauptbestandteil der Fraktion scheint nach Herstellerangaben identisch zu sein mit dem von SCHNIEDER (1993b) beschriebenen und auch in der vorliegenden Dissertation bearbeiteten MSP. Daher sollte der Ceditest^® Lungworm in den durchgeführten Immunisierungsversuchen dazu dienen, die Bindungfähigkeit der gegen das rekombinante MSP gebildeten Immunglobuline an natives MSP nachzuweisen.

Der ELISA wurde nach dem mitgelieferten Protokoll durchgeführt und ausgewertet, es wurden hierzu die Seren der Tage 0, 21, 42, 63, 70, 77, 84, 91 und 98 aus allen drei Durchgängen verwendet. Die an Tag -7 des ersten Impfversuches entnommenen Seren wurden ebenfalls mit dem Ceditest^® Lungworm getestet.

Material und Methoden 97

3.20.2.5 Western Blot mit nativem Lungenwurmantigen

Auch diese Methode erfolgte zur Überprüfung der Bindungsfähigkeit der Impfantikörper an native Epitope des MSP von D. viviparus. Das verwendete Rohantigen wurde dabei sowohl aus männlichen als auch aus weiblichen adulten Würmern gewonnenen, die aus dem Bestand des Instituts für Parasitologie stammten und bei -80 °C gelagert worden waren. Nach Überführung der Würmer in einen Glashomogenisator und Zugabe von 0,5 ml 1x PBS wurden diese für zwei Minuten manuell zerkleinert, woraufhin sich eine Ultraschallbehandlung (MSE) der entstandenen Suspension in einem 12 ml Falcon anschloss.

Dazu wurde die Suspension unter ständiger Kühlung in Eiswasser für drei Minuten dem Ultraschall ausgesetzt, wobei nach einer 15 Sekunden langen Lysierungsphase bei 20 Micron die Probe für darauffolgende 15 Sekunden abgekühlt wurde. Anschließend wurde das Lysat in 2 ml Eppendorfgefäße überführt und für fünf Minuten bei 16000 g und Raumtemperatur zentrifugiert (HERAEUS). Der Überstand wurde abgenommen und bei -20 °C aufbewahrt.

Die Proteinkonzentration in dem aus den männlichen und den weiblichen Würmern erhaltenen Lysat wurde mit dem unter 3.17.1 dargestellten Bradford-Assay bestimmt. Im Anschluss wurde die Konzentration beider Proben durch Zugabe von 1x PBS auf 160 µg/ml eingestellt.

Eine SDS-PAGE präparativer Gele diente zur Auftrennung der nativen Proteine. Dazu wurde wie in 3.14.1 beschrieben ein 12 %iges SDS-Tenngel hergestellt und mit einem 5 %igem SDS-Sammelgel überschichtet. In die kleine Tasche dieses 1 mm tiefen Gels wurde dann als Größenstandard 5 µl Roti^®Mark prestained (ROTH) gegeben, während die große Tasche mit 200 µl des aufbereiteten Rohantigens geladen wurde. Die Probenaufbereitung fand ebenso wie die Elektrophorese und der Western Blot unter den in 3.14.1 und 3.14.4 genannten Bedingungen statt. Die weiteren Schritte des Immunoblots wurden mit den an Tag 0, 63 und 98 gewonnenen Seren der Rinder des ersten Durchgangs nach dem in 3.14.4 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Nach der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurde allerdings die Nitrocellulosemembran in ca. 4 mm breite Streifen geschnitten, von denen jeder mit einem Serum in einer einzelnen Kammer inkubiert werden konnte (Multiscreen Kammer, HOEFER).

Material und Methoden 98

3.21 Parasitologische Auswertung der Vakzinierungsversuche