Darstellung der Proteine

Zum Nachweis und zur Visualisierung von Proteinen dienen im Wesentlichen zwei Methoden, zum einen die SDS-PAGE mit anschließender Proteinfärbung und zum anderen der Western Blot. Die SDS-PAGE nach LÄMMLI (1970) ist eine vertikale Gelelektrophorese, bei der Proteine anhand ihrer Größe aufgetrennt werden. Die natürliche Ladung der Eiweiße spielt dabei keine Rolle, da durch den beigegebenen Probenpuffer alle Proteine negativ geladen sind. Nach der Auftrennung der einzelnen Fraktionen kann eine unspezifische Färbung aller enthaltenen Proteine stattfinden, oder es kann ein Western Blot angeschlossen werden. Diese Methode bietet den Vorteil, dass einzelne Proteine spezifisch nachgewiesen werden können. Im Anschluss an eine SDS-PAGE werden dazu die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen der Membran wird dann ein Primärantikörper aufgetragen, der an das membrangebundene Protein bindet. In einem zweiten Schritt wird der Primärantikörper von einem für ihn spezifischen Sekundärantikörper detektiert. Dieser ist mit einem Enzym gekoppelt, das durch die Bildung eines farbigen Substratkomplexes das Protein darstellt und nachweist.

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3.14.1 SDS-PAGE

Zur Auftrennung der rekombinanten Proteine diente ein 12 %iges, ca. 6x8 cm großes und ca.

1 mm tiefes SDS-Polyacrylamidgel (Trenngel), das nach einer Polymerisierungsdauer von einer Stunde mit einem 5 %igem SDS-Polyacrylamidgel (Sammelgel) überschichtet wurde.

Die Taschen dieses Sammelgels wurden nach einer Aushärtungszeit von einer halben Stunde mit den vorbereiteten Proben befüllt. Dazu wurde jede Proteinprobe im Verhältnis von 2:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und anschließend für fünf Minuten auf 99 °C erhitzt (BIOMETRA), um eine negative Ladung aller Proteine und die Auftrennung von Disulfid-Bindungen zu gewährleisten. Anschließend wurden jeweils 15 µl von diesen Proben in eine Tasche geladen, als Größenstandard diente Roti^®Mark prestained (ROTH). Es wurde zunächst eine Spannung von 70 Volt für 20 Minuten angelegt (PHARMACIA LKB), um die Proteine im Sammelgel auf einer einheitlichen Höhe zu sammeln. Darauffolgend fand die Auftrennung der Proteine anhand ihrer Größe bei einer Spannung von 120 Volt und über eine Zeitdauer von ca. 1,25 Stunden statt. Für diese Gelelektrophorese stand das Mini-Protean II^®-System (BIORAD) zur Verfügung.

3.14.2 Färbung der Proteine mittels Coomassie Blue

Nach Durchführung der SDS-PAGE wurden die Polyacrylamidgele für 30 Minuten in der Coomassie Fixier- und Färbelösung geschwenkt (LABORTECHNIK FRÖBEL), die eine Nachweisgrenze von 0,3 – 1 µg Protein pro Bande besitzt. Nicht gebundene Farbkomplexe wurden über die Coomassie-Entfärbelösung nach mehrmaligem Wechseln der Lösung entfernt. Alle Färbe- und Entfärbungsschritte wurden in Schalen mit einem Deckel durchgeführt, um ein Verflüchtigen der Substanzen zu vermeiden. Die Dokumentation der Ergebnisse erfolgte durch Einspannen und Trocknen der vorher über Nacht in Reinstwasser geschwenkten Gele zwischen zwei Lagen Gel Drying Film^® (PROMEGA). Dazu wurden sowohl die Gele als auch der Gel Drying Film^® für kurze Zeit vor dem Einspannen in die Geltrocknungslösung eingelegt.

3.14.3 Färbung des Proteins mittels des Lumio^® Green Detection Kits

Zur Darstellung des Proteins, das durch das Gateway^® Technology System (INVITROGEN) mit einem lumineszierenden Tag verbunden war, musste eine andere Färbung gewählt

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werden. Alle im Folgenden beschriebenen Schritte sind in Anlehnung an das von Invitrogen mitgelieferte Protokoll durchgeführt worden. Zunächst wurden ein 12 %iges SDS-Trenngel und ein 5 %iges SDS-Sammelgel wie in 3.14.1 beschrieben hergestellt. 37,5 µl des nicht aufgereinigten Proteins wurde daraufhin im Verhältnis von 4:1 mit 12,5 µl des im Kit enthaltenen Lumio^® Gel Sample Buffers versetzt. Nach Zugabe von 0,5 µl Lumio^® Green Detection Reagent wurde die Probe kurz gevortext und für 10 min bei 70 °C inkubiert (Thermoblock, BIOMETRA). Es folgte eine zweiminütige Abkühlung bei Raumtemperatur, anschließend wurde 5 µl Lumio^® In-Gel Detection Enhancer hinzugefügt und die Probe kurz gemischt. Einer Inkubation von fünf Minuten bei Raumtemperatur schloss sich die SDS-PAGE (siehe 3.14.1) an, wobei 25 µl Probe und 5 µl BenchMark^® Fluorescent Protein Standard (INVITROGEN) aufgetragen wurden. Die Lumineszenz der Proteine wurde nach Ende der Elektrophorese bei einer Wellenlänge von 312 nm auf einem UV-Tisch (INTAS) sichtbar gemacht und mit einer Digitalkamera (OLYMPUS) fotografiert.

3.14.4 Western Blot

Die Übertragung der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Hybond-C-Extra^®, AMERSHAM) fand im horizontalen Semi-Dry Verfahren in einer TE 70 Blotkammer (HOEFER) statt. Die nach der SDS-PAGE vorhandenen Gele wurden zusammen mit den vorher in Blotpuffer eingelegten Nitrocellulosemembranen zwischen mehrere Lagen in Blotpuffer getränkten Blotting-Papiere (MACHEREY&NAGEL) gelegt. Der Transfer der Proteine wurde bei einer Stromstärke von 100 mA über 90 Minuten durchgeführt (PHARMACIA LKB). Die Membranen wurden in allen nachfolgend beschriebenen Wasch- und Bindungsschritten auf einem Blotschüttler (LABORTECHNIK FROEBEL) geschwenkt.

Zunächst wurden die Membranen jeweils in eine Schale überführt und für fünf Minuten mit 1x TBS gewaschen, um den restlichen Blotpuffer zu entfernen. Es folgte eine einstündige Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit jeweils 25 ml Roti-Block^® (ROTH), ehe sich drei Waschschritte von jeweils fünf Minuten mit TBS-Tween anschlossen. Daraufhin wurden die Membranen mit dem Primärantikörper für eine Stunde inkubiert. Dabei wurden ein aus Mäusen isolierter anti-GST-Antikörper (SIGMA-ALDRICH) in einer Verdünnung von 1:10000 oder positives bzw. negatives Rinderserum in einer Verdünnung von 1:50 eingesetzt.

Diese Seren wurden entweder von mit D. viviparus infizierten Rindern oder aber von

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parasitennaiven Kälbern gewonnen. Alle Verdünnungen wurden ebenso wie die Verdünnungen der verwendeten Konjugate mit TBS-Tween angesetzt. Als Sekundärantikörper diente ein mit Alkalischer Phosphatase konjugierter anti-mouse IgG-Antikörper (SIGMA-ALDRICH) in einer Verdünnung von 1:20000 oder ein monoklonaler anti-bovine IgG-Antikörper (SIGMA-ALDRICH), der 1:500000 verdünnt war. Die Inkubation mit den Konjugaten wurde nach drei jeweils fünfminütigen Waschschritten mit TBS-Tween für eine Dauer von einer Stunde durchgeführt. Im Folgenden wurden die Membranen einmalig für fünf Minuten mit TBS-Tween und anschließend zweimal je fünf Minuten lang mit 1x TBS gewaschen, bevor die Western-Blot-Färbelösung als Substrat für die Alkalische Phosphatase in die Schalen gegeben wurde. Nachdem die Banden durch die Bildung eines blauen, unlöslichen Farbkomplexes sichtbar geworden waren, wurde die Lösung abgegossen und die Reaktion durch die Zugabe von Reinstwasser gestoppt. Die Membranen wurden zum Abschluss zwischen zwei Lagen Filterpapier getrocknet.