Tierärztliche Hochschule Hannover
Entwicklung eines Milch-ELISAs für Dictyocaulus viviparus und anschließende
D. viviparus und Fasciola hepatica Seroprävalenzstudien bei Milchviehbetrieben
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Christiane Fiedor
aus Trier
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder, Institut für Parasitologie
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. L. Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 10.03.2009
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Merial GmbH und Novartis GmbH
meiner Familie &
meinen Freunden
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
C. Fiedor, A. B. Forbes, G. v. Samson-Himmelstjerna, C. Strube, T. Schnieder (2007)
„Entwicklung eines Milch-ELISAs zur Diagnostik des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus mit anschließender Seroprävalenzstudie“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Krankheiten“
Celle, 04.-06.06.2007
C. Strube, C. Fiedor, A. B. Forbes, G. v. Samson-Himmelstjerna, T. Schnieder (2007)
„Sequential patterns of serum and milk antibodies following experimental infection with Dic- tyocaulus viviparus in lactating dairy cows“
World Association for the Advancement of Veterinary Parasitologie (WAAVP) Gent, 19. - 23.08.2007
C. Fiedor, B. Schunack, T. Schnieder, G. v. Samson-Himmelstjerna (2007)
„A bulk milk epidemiological study of Fasciola hepatica infection in dairy cattle in Northern Germany“
World Association for the Advancement of Veterinary Parasitologie (WAAVP) Gent, 19. - 23.08.2007
1 EINLEITUNG ... 11
2 SCHRIFTTUM... 12
2.1 DIE DICTYOCAULOSE DES RINDES... 12
2.1.1 Erreger... 12
2.1.2 Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung... 12
2.1.3 Biologie und Entwicklungzyklus ... 14
2.1.4 Klinik und Pathogenese... 15
2.1.5 Immunität ... 16
2.1.6 Diagnose... 18
2.1.7 Serologische Verfahren ... 19
2.1.7.1 Komplementbindungsreaktion (KBR) ... 19
2.1.7.2 Indirekter Hämagglutinationsassay (IHA) ... 19
2.1.7.3 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ... 20
2.1.7.4 Einsatz von Milchproben im ELISA... 23
2.1.7.5 Korrelationen des Antikörpertiters in Serum- und Milchproben ... 23
2.1.7.6 Einflüsse auf den Antikörpertiter in der Milch ... 24
2.1.8 Bekämpfung ... 25
2.2 DAS MAJOR SPERM PROTEIN (MSP) ... 25
2.2.1 Vorkommen... 26
2.2.2 Funktion ... 27
2.2.3 Spermienmotilität ... 27
2.2.4 Oozytenreifung und Ovulation... 29
2.3 DIE FASCIOLOSE DES RINDES... 29
2.3.1 Erreger... 29
2.3.2 Vorkommen und Bedeutung ... 30
2.3.2.1 Deutschland ... 30
2.3.2.2 Europa... 31
2.3.3 Wirtschaftliche Bedeutung... 32
2.3.4 Entwicklungszyklus ... 33
2.3.5 Der Zwischenwirt... 33
2.3.6 Klinik und Pathogenese... 34
2.3.7 Immunität ... 34
2.3.8 Diagnose... 35
2.3.9 Bekämpfung ... 36
2.3.9.1 Fasziolizide... 37
2.3.9.2 Benzimidazole ... 37
2.3.9.3 Salicylsäureanilide... 38
2.3.9.4 Weidehygienische Maßnahmen... 39
3 MATERIAL UND METHODEN ... 40
3.1 PUFFER UND LÖSUNGEN... 40
3.2 REAGENTIEN, ENZYME, REAKTIONSKITS, GEFÄßE UND GERÄTE... 40
3.3 PHARMAZEUTIKA UND SOFTWARE... 42
3.4 VERSUCHSPLAN... 42
3.5 LUNGENWURM-STAMMHALTUNG... 43
3.6 INFEKTIONSVERSUCHE MIT D. VIVIPARUS... 43
3.6.1 Haltung der Versuchstiere ... 45
3.6.2 Gewinnung von Probenmaterial und dessen Aufbereitung ... 45
3.6.2.1 Kotproben ... 45
3.6.2.2 Blutproben ... 45
3.6.2.3 Milchproben... 47
3.6.3 Milchdaten der infizierten Tiere... 47
3.7 MAJOR SPERM PROTEIN... 48
3.8 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) ... 48
3.8.1 Probenaufbereitung ... 48
3.8.2 Vorversuche – Einzelmilchproben ... 49
3.8.3 Vorversuche - Tankmilchproben... 51
3.8.4 Validierung des Einzel- und Tankmilch-ELISAs... 51
3.8.5 Feldproben ... 52
3.9 PRÄVALENZSTUDIEN... 52
3.9.1 Untersuchungsgebiet und Probenanzahl... 52
3.9.2 Untersuchung der Feldproben auf Antikörper gegen Fasciola hepatica... 54
3.9.3 Auswertung der Proben - F. hepatica... 54
3.9.4 Untersuchung der Feldproben auf Antikörper gegen D. viviparus... 55
3.9.5 Erhebung betriebswirtschaftlicher Daten ... 55
3.10 STATISTISCHE AUSWERTUNG... 60
4 ERGEBNISSE ... 61
4.1 INFEKTIONSVERSUCHE... 61
4.2 I. INFEKTIONSDURCHGANG... 61
4.2.1 Ergebnisse der Kotproben - I. Infektionsdurchgang... 62
4.2.2 Ergebnisse der Serumproben - I. Infektionsdurchgang ... 62
4.2.3 Ergebnisse der Milchproben - I. Infektionsdurchgang ... 63
4.2.3.1 Verdünnte Milchproben... 64
4.2.3.2 Unverdünnte Milchproben... 65
4.2.4 Vergleich der Ergebnisse - I. Infektionsdurchgang ... 65
4.3 II. INFEKTIONSDURCHGANG... 67
4.3.1 Ergebnisse der Kotproben - II. Infektionsdurchgang ... 67
4.3.2 Ergebnisse der Serumproben - II. Infektionsdurchgang ... 68
4.3.3 Ergebnisse der Milchproben - II. Infektionsdurchgang... 69
4.3.3.1 Verdünnte Milchproben... 69
4.3.3.2 Unverdünnte Milchproben... 71
4.3.4 Vergleich der Ergebnisse - II. Infektionsdurchgang... 71
4.4 III. INFEKTIONSDURCHGANG... 73
4.4.1 Ergebnisse der Kotproben - III. Infektionsdurchgang ... 73
4.4.2 Ergebnisse der Serumproben - III. Infektionsdurchgang... 74
4.4.3 Ergebnisse der Milchproben, III. Infektionsdurchgang... 76
4.4.3.1 Verdünnte Milchproben... 76
4.4.3.2 Unverdünnte Milchproben... 77
4.4.4 Vergleich der Ergebnisse - III. Infektionsdurchgang ... 79
4.5 GEMITTELTE ERGEBNISSE DER DREI INFEKTIONSDURCHGÄNGE... 81
4.6 KORRELATIONEN DES ANTIKÖRPERTITERS VON SERUM- UND MILCHPROBEN... 81
4.7 MILCHINHALTSSTOFFE... 82
4.8 EINZELTIERMILCH-ELISA AUF DER GRUNDLAGE DES MSP... 83
4.8.1 Validierung des ELISAs für Einzelmilchproben... 84
4.9 TANKMILCH-ELISA AUF DER GRUNDLAGE DES MSP ... 86
4.9.1 Ermittlung der Detektionsgrenze des Tankmilch-ELISAs ... 88
4.9.2 Vergleich von Tank- und Einzelmilchproben auf Ak gegen D.viviparus... 89
4.10 SEROPRÄVALENZSTUDIEN... 90
4.10.1 Auswertung der Fragebögen ... 90
4.10.2 Untersuchung der Tankmilchproben auf Ak gegen F. hepatica... 95
4.10.3 Tankmilchuntersuchung vs. betriebswirtschaftliche Daten – F. hepatica... 97
4.10.4 Untersuchung der Tankmilchproben auf Ak gegen D. viviparus... 98
4.10.5 Tankmilchuntersuchung vs. betriebswirtschaftliche Daten – D. viviparus... 102
5 DISKUSSION ... 104
5.1 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) ... 104
5.2 EVALUIERUNG DES EINZEL- UND TANKMILCH-ELISAS... 105
5.3 INFEKTIONSVERSUCHE... 109
5.4 EINFLUSS EINER ANTHELMINTHISCHEN BEHANDLUNG AUF DEN ANTIKÖRPERTITER... 113
5.5 MILCHDATEN... 115
5.6 SEROPRÄVALENZSTUDIEN... 117
5.7 DICTYOCAULUS VIVIPARUS-SEROPRÄVALENZSTUDIE... 117
5.8 FASCIOLA HEPATICA-SEROPRÄVALENZSTUDIE... 125
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 132
7 SUMMARY ... 133
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 134
9 ANHANG ... 151
9.1 LARVENAUSCHEIDUNG UND INDEXWERTE DER INFEKTIONSVERSUCHE... 151
9.2 MILCHDATEN... 163
9.3 ELISA – TITRATIONSDATEN... 165
9.4 SIMULIERUNG VON TANKMILCH... 167
9.5 GEGENÜBERSTELLUNG EINZEL- VS. TANKMILCHERGEBNISSE DER 15 HÖFE... 168
9.6 ELISA – EVALUIERUNG; INDEXWERTE... 169
9.7 SEROPRÄVALENZSSTUDIE – D. VIVIPARUS... 172
9.8 SEROPRÄVALENZSSTUDIE – F. HEPATICA... 176
9.9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... 182
9.10 ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS... 184
1 Einleitung
Dictyocaulus viviparus, der große Lungenwurm des Rindes, stellt in gemäßigten Klimazonen einen der wirtschaftlich bedeutsamsten Parasiten als Verursacher der parasitären Broncho- pneumonie dar, die in unterschiedlich heftigen Krankheitserscheinungen auftritt und bis hin zum Tod der Tiere führt.
Der Nachweis einer Dictyocaulose erfolgte bisher durch koproskopische Untersuchungen sowie der Detektion von Antikörpern im Serum mittels ELISA, die vornehmlich auf nativen Antigenen beruhten. Durch den Einsatz eines rekombinanten Major Sperm Proteins (MSP) als Antigen, welches ursprünglich aus adulten männlichen Würmern isoliert wurde, konnte die Empfindlichkeit des Tests für serologische Untersuchungen optimiert werden.
Fasciola hepatica, der große Leberegel, kommt weltweit bei Herbivoren und als Zoonoseer- reger beim Menschen vor. Seine Entwicklung ist an das Vorhandensein von Zwergschlamm- schnecken der Gattung Lymnaea gebunden, die als Zwischenwirt fungieren. Die chronische Form der Fasciolose, als häufigstes Erscheinungsbild beim Rind, führt zu erheblichen öko- nomischen Einbussen der Landwirte. Zur Diagnosestellung können einerseits Leberegeleier durch koproskopische Analyse, andererseits Antikörper in Serum- und Milchproben mittels ELISA nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wird die Entwicklung eines Milch-ELISAs zur Detektion von Anti- körpern gegen den bovinen Lungenwurm auf Grundlage des rekombinanten MSPs beim Ein- zeltier als auch auf Herdenbasis in der Tankmilch beschrieben. Dargestellt werden der Verlauf des Antikörpertiters bei experimentell infizierten Tieren während einer Dictyocaulose sowohl im Serum als auch in der Milch sowie der Einfluss einer anthelminthischen Behandlung zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Infektion auf den Antikörpertiter. Die anschließende Un- tersuchung von Tankmilchproben auf Antikörper gegen D. viviparus sowie F. hepatica soll die aktuelle Prävalenzsituation dieser beiden Parasiten in Milchviehherden im nordwestlichen Niedersachsen aufzeigen.
2 Schrifttum
2.1 Die Dictyocaulose des Rindes
2.1.1 Erreger
Der große Lungenwurm des Rindes, Dictyocaulus viviparus, ist als Nematode in der Ordnung der Rhabditina, der Familie Trichostrongylidae mit der Unterfamilie Dictyocaulinae einzu- ordnen. Er lebt als adulter Wurm in den mittleren und großen Bronchien sowie der Trachea und ist Verursacher der parasitären Bronchopneumonie (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969;
PRESIDENTE et al. 1972; PRESIDENTE u. KNAPP 1973; SCHNIEDER 2006). Zur Unter- familie der Dictyocaulinae gehören neben D. viviparus, der hauptsächlich beim Rind und einigen Wildwiederkäuern vorkommt, weiterhin D. filaria, der Lungenwurm der kleinen Wiederkäuer, D. arnfieldi, D. eckerti und D. capreolus. Eine D. arnfieldi-Infektion ist asymp- tomatisch beim Endwirt Esel, beim Pferd hingegen kommt es zu klinisch auffällig verlaufen- den Infektionen (GOTHE u. KANDELS 1984; HASSLINGER 1989; MOAZENI u. KHO- DAKARAM JAFTI 2007). D. eckerti wurde bei verschiedenen Wildwiederkäuern nachge- wiesen, u. a. in Dam- und Rotwild, während D. capreolus ausschließlich bei Elchen und Re- hen vorkommt (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969; DIVINA et al. 2002; HØGLUND et al.
2003b; REHBEIN u. VISSER 2007). Durch Etablierung von molekularbiologischen Metho- den konnte gezeigt werden, dass es sich bei D. eckerti und D. capreolus um eigenständige Arten handelt (SCHNIEDER et al. 1996a; EPE et al. 1997; GIBBONS u. HØGLUND 2002).
Einige Dictyocaulus-Arten parasitieren in mehreren Wirtstieren und zeigen dabei eine unter- schiedlich gute Adaptation durch die Ausbildung einer patenten Infektion. D. arnfieldi verur- sacht häufiger Infektionen beim Esel als beim Pferd und D. viviparus ist besser an das Rind als an Wildwiederkäuer angepasst (HASSLINGER 1989; BIENIOSCHEK et al. 1996).
2.1.2 Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung
Den weltweit vorkommenden bovinen Lungenwurm D. viviparus findet man in Gebieten mit Rinderhaltung, wenn zumindest temporär Temperaturen von 15 °C – 20 °C sowie eine nieder-
schlagsreiche Witterung vorherrschen (PFEIFFER 1971; SCHNIEDER 2006). In Niedersach- sen wurde 1987 eine Prävalenz von 39,9 % bei erstsömmrigen Rindern durch Untersuchungen von Serumproben auf Antikörper (Ak) gegen D. viviparus festgestellt (SCHNIEDER et al.
1993). Der Nachweis adulter Helminthen nach Sektion von 15 Bullen wies in einem Betrieb in Schleswig-Holstein bei 73 % der Tiere eine Infektion mit D. viviparus auf (REHBEIN et al.
2003). In den Niederlanden zeigten sich 1992 durch Kotuntersuchungen in Milchviehbetrie- ben Prävalenzen von 15 % nach der Stallperiode, 77 % im April/Juni und 40 % im Ju- li/August, wobei die Autoren noch weitaus höhere Zahlen vermuteten (EYSKER et al.
1994b). In einer weiteren Studie im Jahr 1997 (PLOEGER et al. 2000), in der Serumproben von 86 Betrieben untersucht wurden, entsprach die ermittelte Prävalenz von 41 % bei den erst- und zweitsömmrigen Rindern den beschriebenen Zahlen von SCHNIEDER et al. (1993), während die Befallshäufigkeit in Belgien laut einer Studie aus demselben Jahr nur 7 % betrug (AGNEESSENS et al. 2000). HØGLUND et al. (2001) veröffentlichten Ergebnisse von Bio- höfen in Schweden, die auf einen starken Befall (73,3 % der Höfe 1997/1998) mit D. vivi- parus für diese Betriebsform hinwiesen. In einer weiteren flächendeckenden Studie 2001 konnten diese Ergebnisse nicht bestätigt werden, dafür wurden Prävalenzen von 39,5 % posi- tiven Herden bei den erstsömmrigen Kälbern in der konventionellen Milchviehhaltung gefun- den (HØGLUND et al. 2004). Neuere Daten aus Irland weisen eine Prävalenz von 14 % posi- tiven Larvenfunden in Kotproben auf, die von Schlachttieren in den Jahren 2002/2003 unter- sucht wurden (MURPHY et al. 2006). Im Jahre 1991 verendeten auf einer Farm im Norden von Queensland, Australien, 48 Rinder einer Herde, wobei bei weiteren 25 % der übrigen 1190 Tiere Husten und Gewichtsverluste beobachtet wurden. Sowohl durch Sektion als auch durch Untersuchungen von Kotproben konnte die Diagnose Dictyocaulose verifiziert werden (TOWNSEND et al. 1992). In Costa Rica wurden im Jahr 2002/2003 Kälber von zwei Far- men aus unterschiedlichen Klimazonen (Hochland/Tiefland) koproskopisch und serologisch untersucht. 10,8 % bzw. 1,8 % der Tiere stellten sich durch Larvenfunde positiv dar, während die Prävalenz durch den Nachweis von Ak im Serum bei 42,1 % bzw. 34,3 % lag (JIMENEZ et al. 2007). Im gleichen Zeitraum wurden Schlachtrinder in der Türkei auf adulte Helminthen untersucht, allerdings konnte in dieser Studie kein einziger boviner Lungenwurm detektiert werden (YILDIZ 2006).
Der ökonomische Verlust, der durch den Befall mit D. viviparus in einem Milchviehbetrieb entsteht, ist auf verschiedene Faktoren zurückzuführen. Zu diesen zählen Tierverluste, gerin- gere Milcheinnahmen, verursacht durch die Wartezeit auf Milch nach Behandlungen bzw.
eine verminderte Milchproduktion erkrankter Tiere sowie anfallende Behandlungskosten. Für
eine Herde mit 100 Tieren wurde der finanzielle Schaden in Großbritannien, bei einer milden Infektion mit D. viviparus, Ende der Neunziger Jahre mit £ 5500, bei einem schweren Infekti- onsgeschehen sogar mit £ 20.000 angegeben (WOOLLEY 1997).
2.1.3 Biologie und Entwicklungzyklus
Der Entwicklungszyklus von D. viviparus verläuft homoxen. Die in den luftführenden Teilen der Lunge sitzenden Weibchen legen embryonierte Eier, die mit dem Bronchialschleim aus- gehustet oder abgeschluckt werden. Während der Magen-Darm-Passage schlüpfen die unbe- scheideten ersten Larven, die mit dem Kot ausgeschieden werden und sich bei Temperaturen über 16 °C innerhalb von vier Tagen zu infektiösen dritten Larven (L3) entwickeln (TAYLOR 1951). Während dieser in der Außenwelt verlaufenden Phase zehren die Larven von Energiereserven, die in Form von Granula inkorporiert sind (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Durch ungerichtete Bewegungen der Larven, hauptsächlich jedoch durch passive Mechanismen (belebte und mechanische Vektoren), gelangen die Larven in kotfreie Areale der Weide, wo sie durch weidende Endwirte oral aufgenommen werden. Koprophile Pilze der Gattung Pilobolus spielen hierbei eine wichtige Rolle. Nach Passieren des Darmkanals von Herbivoren keimen diese Pilze auf den Faeces aus und bilden Sporangien, in welche die Larven von basal hineinwandern. Durch das Platzen der Fruchtkörper werde die Larven bis zu einem Meter weit vom Kothaufen weggeschleudert (DONCASTER 1981).
Durch Gallenflüssigkeit aktiviert (JØRGENSEN 1973) dringen die L3 unter Verlust ihrer Scheiden in die Darmwand ein und gelangen über die Lymphe in die Mesenteriallymphkno- ten, wo sie sich innerhalb von drei bis acht Tagen durch Häutung zu bereits geschlechtlich differenzierten vierten Larven entwickeln (SOLIMAN 1953; JARRETT 1957; PANUSKA 2006). Über den Ductus thoracicus und die Vena cava cranialis erreichen die Larven die rech- te Herzkammer; von dort werden sie über die Arteria pulmonalis in das Kapillargebiet der Lunge geschwemmt. Nach Eindringen in die Alveolen durch Überwindung der arterio- alveolären Schranke findet ca. 7 - 15 Tage nach der Infektion die letzte Häutung zu den prä- adulten fünften Larven statt (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Die Entwicklung zur Geschlechtsreife erfolgt in den Bronchioli und Bronchien zwischen dem 21. bis 25. Tag post infectionem (pi) mit einer folgenden Patenz von bis zu zwei Monaten (JARRETT 1957;
DÜWEL 1971).
Liegen Temperaturen unter 7 °C während der Entwicklung zur dritten Larve vor, kommt es im Stadium der vierten und fünften Larven zu einer Entwicklungshemmung, der so genannten Hypobiose, die maßgeblichen Einfluss auf das Fortbestehen des Infektionsgeschehens hat (JARRETT et al. 1955; INDERBITZIN 1976; PFEIFFER 1976). Hypobiotische Larven über- dauern im Wirt klimatische Umweltbedingungen, die für die exogene Larvenentwicklung und die Infektion neuer Wirtstiere ungünstig sind (PFEIFFER 1976). Des Weiteren wurde gezeigt, dass Larven unter geeigneten klimatischen Verhältnissen auf der Weide überwintern können, um im nächsten Jahr zu einer erneuten Infektion zu führen (JARRETT et al. 1955; PFEIFFER u. SUPPERER 1980; SCHNIEDER et al. 1989).
2.1.4 Klinik und Pathogenese
Der Verlauf der Dictyocaulose wird in vier Phasen eingeteilt (JARRETT 1957; PFEIFFER u.
SUPPERER 1980). Nach oraler Aufnahme der Larven beginnt mit deren Wanderung durch die Darmschleimhaut bis in die Lunge die Penetrationsphase. Die dabei auftretende katarrha- lische Enteritis verläuft symptomlos (JARRETT 1957). In der ab Tag 8 bis Tag 25 pi folgen- den präpatenten Phase kommt es aufgrund der Larven in den Luftwegen zu einer Bronchiolitis und Bronchitis (TAYLOR et al. 2007). Durch Abwehrmechanismen des Immunsystems sammelt sich in den Alveolen, Bronchioli und Bronchien ein eosinophiles Exudat, das in den betroffenen Lungenbereichen zu Atelektasen und im folgenden zu Ödemen, Emphysemen und Sekundärinfektionen in der Lunge führt (JARRETT 1957). Klinisch auffällig ist die erschwer- te Atmung, stoßweiser Husten, einzelne Fieberschübe bis über 40 °C sowie die beginnende Fressunlust (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). In der Patenz von Tag 26 bis Tag 60 pi ist das pathologische Bild der Dictyocaulose durch die adulten, geschlechtsreifen Lungenwürmer gekennzeichnet. Sie bewirken die Infiltration von Eosinophilen, aus der eine Schädigung des Bronchialepithels resultiert. Damit einhergehend kommt es zum Verlust des Zilienbesatzes sowie der Hyperplasie des Epithels durch undifferenzierte Zellen, so dass die mukoziliäre Clearance als Reinigungsmechanismus der Lunge eingeschränkt und die Manifestation von Sekundärinfektionen begünstigt wird. Durch einen funktionellen Umbau sekretorischer Zellen kommt es zu einer qualitativ veränderten Sekretion, die sich u.a. in einer vermehrten Schleimproduktion äussert. Ein Teil des Schleims tritt klinisch als Nasenausfluss in Erschei- nung (JARRETT 1957; SCHNIEDER et al. 1989). Aufgrund der anatomischen Trennung der einzelnen Lungenläppchen in der Rinderlunge sind die makroskopisch scharf umschriebenen,
entzündeten Bereiche auf die mit Würmern befallenen Regionen der Lunge beschränkt, die emphysematös, ödematös oder atelektatisch sind (MICHEL u. SHAND 1955; JARRETT 1957). Das sich verschlechternde klinische Bild ist gekennzeichnet durch Tachypnoe bis hin zur Dyspnoe, permanenten Husten, auskultatorisch feststellbare Atemgeräusche, Fieber und Fressunlust (MICHEL u. SHAND 1955; JARRETT 1957; PFEIFFER u. SUPPERER 1980).
Die Dyspnoe als prägendes klinisches Symptom der Erkrankung ist charakterisiert durch die pathologischen Veränderungen, die aus einer gesteigerten alveolo-arteriellen Sauerstoffdiffe- renz sowie einer verminderten Compliance der Lunge resultieren. Der von dem Tier aufzu- bringende zusätzliche Energieaufwand für die Atmung führt zu einem erhöhten Erhaltungsbe- darf bei gleichzeitig krankheitsbedingter reduzierter Futteraufnahme. Gewichtsverluste, eine verringerte Milchleistung bei laktierenden Kühen sowie Todesfälle sind die Folge (MICHEL u. SHAND 1955; LEKEUX et al. 1985). Tag 61 bis Tag 90 pi kennzeichnet die postpatente Phase in der die Dezimierung der Würmer eintritt und die klinischen Symptome langsam ab- klingen. Als pathologische Befunde werden weiterhin entzündete Bronchien und z. T. bron- chiale sowie peribronchiale Fibrosen beschrieben, die noch mehrere Wochen bis Monate fort- bestehen können. In 25 % der Fälle einer starken Infektion kommt es zu einem erneuten Auf- flackern der klinischen Symptome in dieser Phase. Als Ursache wird zum einen eine Ver- dickung des Alveolarepithels durch immunologische Reaktionen auf tote Lungenwürmer dis- kutiert, die den Gasaustausch beeinträchtigt, zum anderen bakterielle Sekundärinfektionen, die eine katarrhalisch-eitrige Pneumonie verursachen können (JARRETT 1957; PFEIFFER u.
SUPPERER 1980; SCHNIEDER et al. 1989).
2.1.5 Immunität
Nach Infektion mit D. viviparus kommt es zu einer protektiven Immunität, an der sowohl hu- morale als auch zellvermittelnde Komponenten des Immunsystems beteiligt sind (JARRETT 1973; SCOTT et al. 1996). Bei Tieren, die nach Erlangen der Immunität einem ständigen In- fektionsdruck ausgesetzt sind, wird die Entwicklung der Larven zur Geschlechtsreife inhi- biert, während sie ohne Reinfektion für eine Infektion mit klinischer Ausprägung erneut emp- fänglich werden (MICHEL u. SHAND 1955; PLOEGER u. EYSKER 2002). Als wichtigster Abwehrmechanismus gilt die zellvermittelte Zytotoxizität. Antigene der Helminthen aktivie- ren IgE, welches an Mastzellen in der Schleimhaut gebunden ist und zur Ausschüttung von Histamin und chemotaktisch wirkenden Mediatoren führt. Dadurch kommt es zur Vasodilata-
tion und Erhöhung der Permeabilität des Gewebes sowie der Migration von Zellen des Im- munsystems in das Lumen von Atmungs- und Gastrointestinaltrakt (JARRETT 1973;
SOULSBY 1985). Anschließend werden die Parasiten durch sezernierte, oxidative Substan- zen von Phagozyten, insbesondere eosinophilen Granulozyten geschädigt und durch Phagozy- tose beseitigt. Nach Infektionsversuchen wurde ein Anstieg der Immunglobuline (Ig) A, E, M und G, sowie der Subklassen G1 und G2 im Serum nachgewiesen, wobei ein erhöhter IgA- Titer bereits nach sieben Tagen gemessen wurde. Ursächlich wird die Positionierung von IgA in Schleimhäuten und damit erstem Kontaktpunkt für die durch die Darmwand migrierenden Larven diskutiert (SCOTT et al. 1996). Während der Patenz steigt initial die IgM- Konzentration im Serum, die bei fortdauernder Krankheit und immunen Tieren durch einen erhöhten IgG1- und IgG2-Spiegel im Blut ersetzt wird (McKEAND et al. 1996). Letzterer ist dabei positiv mit einer vermehrten Ausscheidung von ersten Larven korreliert (SCOTT et al.
1996). Bis auf IgE konnte indes kein Zusammenhang zwischen dem Anstieg der Immunglo- buline und ihrer Beteiligung an einer protektiven Immunität festgestellt werden (KOOYMAN et al. 2002). Die lokale Immunantwort ist vor allem durch steigende IgG- und IgA-Titer cha- rakterisiert, die bei Reinfektionen, im Gegensatz zur systemischen Immunantwort, potenziert werden (SCOTT et al. 1996). Antigen-wirksame Strukturen der Lungenwürmer sind stadien- spezifisch und konnten bei dritten Larven auf der Kutikula nachgewiesen werden (GILLEARD et al. 1995; McKEAND et al. 1996).
In verschiedenen Studien wurde untersucht, ob die protektive Immunität, die sich während einer Dictyocaulose im Wirtstier entwickelt, durch den Einsatz von Anthelminthika beein- flusst wird. Durch die Verwendung von Ivermectin-, Doramectin- und Fenbendazol-Boli führ- te eine Infektion mit D. viviparus zu einer belastbaren Immunität, die sich im Vergleich zu unbehandelten, naiven Tieren in milderen bzw. keinen klinischen Symptomen sowie einer stark reduzierten Larvenausscheidung äußerte (TAYLOR et al. 1988; SCHNIEDER et al.
1996b; SCHNIEDER et al. 1998; TAYLOR et al. 2000). HØGLUND et al. (2003a) veröffent- lichten Daten zur Behandlung mit Eprinomectin während einer Dictyocaulose. Die in der frü- hen Patenz mit Eprinomectin behandelten Tiere waren acht Mal empfänglicher für eine Rein- fektion als Tiere, die eine Infektion ohne Behandlung durchliefen. Diese Erkenntnis veran- lasste die Autoren zu der Annahme, dass unter Anwendung von Eprinomectin in diesem In- fektionsstadium zwar eine belastbare Immunität entsteht, diese jedoch stärker ausgeprägt ist, wenn das Wirtstier mit juvenilen als auch adulten Stadien des Lungenwurms in Kontakt ge- kommen ist.
2.1.6 Diagnose
Die Verdachtsdiagnose einer Dictyocaulose kann über die Erhebung klinischer Befunde ge- äußert und durch den Nachweis von Larven durch koproskopische Methoden oder der Detek- tion von Ak mit Hilfe serologischer Verfahren am lebenden Tier bestätigt werden.
Treten ab Anfang Juli bei Tieren ohne protektive Immunität die Krankheitsymptome Husten, Tachypnoe, Dyspnoe sowie Gewichtsverluste auf, so kann zumindest die Verdachtsdiagnose Dictyocaulose erhoben werden (TAYLOR 1951; JARRETT 1957; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Die Bedeutung der klinischen Befunde als pathognomische Symptome für die bovine Lungenwurminfektion wird kontrovers diskutiert, da der Lunge bei sämtlichen Affektionen nur ein begrenztes Spektrum an Abwehrmechanismen zur Verfügung steht. Zudem treten im klinischen Erscheinungsbild große Variationen sowohl beim Individuum als auch innerhalb der Herde auf (MICHEL u. SHAND 1955; JARRETT 1957; SCHNIEDER et al. 1989).
Der koproskopische Nachweis einer Dictyocaulose erfolgt unter Anwendung des Auswander- verfahrens (BAERMANN 1917), mit welchem ausgeschiedene erste Larven während der Pa- tenz nachgewiesen werden können. Aufgrund verschiedener Faktoren ist die Reproduzierbar- keit der Ergebnisse allerdings schwierig. So ist die Sensitivität bei adulten Tieren aufgrund des größeren Kotvolumens herabgesetzt (EYSKER 1997). Untersuchungen bezüglich Tempe- ratur und Dauer der Lagerung vor Ansetzen der Kotproben zeigten, dass bei Temperaturen von 4 °C und 16 °C nach 24 h eine Reduktion der ausgewanderten Larven um 20 % im Ver- gleich zu sofort bearbeiteten Proben erfolgte. Bei 20 °C war die Zahl nach 24 h um 60 % und nach 48 h sogar um 80 % reduziert (RODE u. JØRGENSEN 1989). Des Weiteren konnten bei ungekühlten Kotproben bereits nach einem Tag keine Larven mehr detektiert werden, wäh- rend die Lagerung für 1 – 2 Wochen bei 8 °C z. T. bessere Resultate lieferte als frisch unter- suchte Proben (EYSKER 1997). Zudem können in älteren Proben Larven von Magen- Darmnematoden und bei nicht rektal gewonnenem Material Erdnematoden gefunden werden, was zu Verwechslungen führen kann (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Weiterhin zu beach- ten ist die Dauer des Auswanderverfahrens, da der Großteil der Larven erst nach 10 h aus- wandert, um in den folgenden Stunden zu sedimentieren (RODE u. JØRGENSEN 1989).
In Vergleichsstudien konnten mit dem so genannten Spitzglasverfahren, einer modifizierten Form des Auswanderverfahrens, doppelt so viele D. viviparus-Larven gewonnen werden, wie mit dem Trichterverfahren. Als Ursache für die geringere Sedimentation wurden vor allem die Form des Trichters sowie die Enge des Schlauches diskutiert. Bestätigt wurden diese Ergeb- nisse durch Studien, in denen die Anzahl gefundener Larven im Spitzglasverfahren sogar
137 % höher war, wobei die Methode generell als einfacher durchführbar und weniger anfäl- lig für Kreuzkontaminationen gilt (BUCHWALDER 1963; McKENNA 1999).
2.1.7 Serologische Verfahren
Als serologische Verfahren wurden seit Anfang der fünziger Jahre die Komplementbindungs- reaktion, ein indirekter Hämagglutinationsassay und verschiedene ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays) zur Detektion von Antikörpern gegen D. viviparus eingesetzt.
2.1.7.1 Komplementbindungsreaktion (KBR)
Bei der KBR handelt es sich um ein Testverfahren, bei dem Antigene durch den Nachweis von komplementbindenden Ak detektiert werden können. Kommt es zur Bildung von Anti- gen-Antikörper (Ag-Ak-)-Komplexen durch vorhandenes Antigen in der zu untersuchenden Probe, werden für diesen Schritt Faktoren des Komplementsystems benötigt und verbraucht.
Die anschließende Zugabe von Erythrozyten und Ak, welche diese lysieren können, führt auf- grund des Mangels an freien Komplementfaktoren nicht zur Bildung von Ag-Ak-Komplexen und folgender Lyse der Erythrozyten; das Ergebnis ist positiv. Ebenso können Ak mit diesem Test durch Zugabe eines definierten Antigens nachgewiesen werden. Die Detektion von Ak gegen D. viviparus gelang bei natürlichen und experimentellen Infektionen ab Tag 31 pi mit Maximalwerten um Tag 77,5 pi (CORNWELL u. MICHEL 1960), wobei Ergebnisse aus Fol- geuntersuchungen eine große Variation in der Ak-Antwort aufzeigten. Des Weiteren konnten vakzinierte Tiere nicht von ungeimpften Tieren unterschieden werden, da als Reaktion auf eine Immunisierung mit röntgenattenuierten Larven gebildete Ak ebenfalls detektiert wurden (CORNWELL 1960a, b).
2.1.7.2 Indirekter Hämagglutinationsassay (IHA)
Im IHA werden Erythrozyten mit spezifischen Antigenen beschichtet. Ak, die gegen diese Antigene gerichtet sind, führen zur sichtbaren Verklumpung der Erythrozyten, wobei die
Stärke der Hämagglutination mit der Verdünnungsstufe des getesteten Serums angegeben wird, bei der eine Hämagglutination gerade noch ablesbar ist. Zur Detektion von Ak gegen D. viviparus wurden Erythrozyten vom Schaf mit einem Rohantigen des Lungenwurms be- schichtet und mit dem zu testenden Serum versetzt. Die serologischen Ergebnisse zeigten eine
80 %ige Übereinstimmung zu klinischen Befunden, mit messbaren Ak-Titern ab Tag 42 – 70 pi, wobei auch hier eine Unterscheidung zwischen geimpften und ungeimpften
Tieren nicht möglich war. Aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität von 78,1 % und 99,6 % sowie dem Ausbleiben von Kreuzreaktionen mit anderen Nematoden und Trematoden, wurde der IHA zur Routinediagnostik vom Tiergesundheitsdienst in den Niederlanden bis 1995 eingesetzt (CORNELISSEN et al. 1997).
2.1.7.3 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Dem ELISA liegt als Prinzip eine Antigen-Ak-Reaktion zugrunde, die sowohl zum Nachweis von spezifischen Ak als auch zur direkten Detektion von Antigenen aus Untersuchungsmate- rialien dient. Je nach Nachweisparameter werden entweder spezifische Ak oder Antigene an eine feste Phase - häufig Mikrotiterplatten aus Polystyrol - gebunden. Anschließend erfolgt die Zugabe der Probe und des spezifischen, enzymgekoppelten Ak bzw. Anti-Antikörpers im Fall des Ak-Nachweises. Das Enzym katalysiert den Farbumschlag eines zugefügten Sub- strates im positiven Fall, der dann photometrisch gemessen werden kann.
Der Nachweis von Ak gegen den bovinen Lungenwurm durch Anwendung eines ELISAs wurde erstmals von MARIUS et al. (1979) beschrieben. Unter Verwendung von Rohantige- nen aus adulten Lungenwürmern gelang die Detektion von Ak im Serum, Nasenausfluss und Lungenspülungen ab der fünften Woche pi, wobei ein IgA-Anstieg nur bei letzteren Proben vorlag.
BOON et al. (1982) dokumentierten für ihren ELISA ebenfalls die Nutzung von adultem D. viviparus-Rohantigen und detektierten Ak ab der dritten Woche pi, wobei zu einem gewis- sen Grad Kreuzreaktionen mit Ostertagia spp. und Cooperia spp. auftraten. Für den Einsatz zur Herdendiagnostik erwies sich die Methode durch die ermittelte Sensitivität von 100 % sowie der positiven Korrelation zwischen den gewonnenen Ergebnissen und der IHA- Technik, den parasitologischen Befunden und klinischen Symptomen trotz der nur geringen Spezifität von 28 % als diagnostische Möglichkeit. In einer späteren Studie wurden mit die- sem ELISA Serum- und Einzelmilchproben sowie entsprechende Tankmilchproben unter-
sucht. Korrelationskoeffizienten zwischen den Ak-Titern ergaben Werte von r = 0,56 für Ein- zeltierseren und –milchproben und r = 0,61 bei der Gegenüberstellung der Mittelwerte.
Gemessene Ak-Titer als Herdenmittelwert in Serumproben zeigten Korrelationen von r = 0,67 und in Einzeltiermilchproben von r = 0,82 im Vergleich zu Tankmilchproben (KLOOSTER- MAN et al. 1993).
In einem weiteren Versuch wurde der Einsatz von Antigen aus vierten Larven gegenüber Antigen aus adulten Würmern bei der Diagnose von natürlich und experimentell infizierten Tieren getestet. Der Titeranstieg erfolgte in beiden Fällen ab der fünften Woche pi, wobei vakzinierte Tiere keinen Anstieg des Ak-Titers in Bezug auf das Larven- und lediglich einen geringen Anstieg auf das Adulten-Antigen zeigten. Ein geringer Grad an Kreuzreaktionen mit Nematoden des Gastrointestinaltraks lag auch hier vor (WASSALL 1991).
TENTER et al. (1993) evaluierten anhand von Seren aus experimentell infizierten Kälbern einen ELISA auf der Grundlage eines somatischen Antigens aus adulten Lungenwürmern.
Spezifische Ak der Immunglobulinklasse G konnten zwischen Tag 30 – 44 pi bis mindestens acht Wochen nach Beendigung der Patenz detektiert werden. Die dabei ermittelten prozentua- len Werte für Sensitivität, Spezifität sowie den positiven und negativen prädiktiven Wert lagen bei über 90 % zwischen der 13. – 17. Woche nach Austrieb auf mit Lungenwürmern kontaminierten Weiden.
DE LEEUW u. CORNELISSEN (1991) untersuchten in einem indirekten ELISA das antigene Potential von somatischem Antigen sowohl aus adulten Lungenwürmern und dritten Larven als auch von exkretorisch-sekretorischem (E/S-) Antigen. Bei der gleichzeitigen Untersu- chung auf Kreuzreaktionen mit anderen Magen-Darmnematoden und Fasciola hepatica stellte sich ein 17 kDa großes Protein im Western Blot dar, das spezifisch mit Ak gegen D. viviparus reagierte und ausschließlich aus adulten Würmern isoliert werden konnte. Vergleichende Un- tersuchungen des isolierten Proteins mit dem somatischen Antigen im ELISA zeigten eine Übereinstimmung bei experimentell infizierten Kälbern sowohl in der Detektion der Serokon- version ab der vierten Woche pi als auch im weiteren Verlauf des Infektionsgeschehens. Wei- tere Untersuchungen der Autoren bestätigten die spezies- und stadiumbezogene Spezifität des isolierten Proteins im indirekten ELISA, durch dessen Anwendung eine Sensitivität und Spe- zifität von jeweils 97 % erreicht werden konnte. Bei natürlich und experimentell infizierten Tieren, nicht aber bei vakzinierten Tieren, konnte damit nach vier bis sechs Wochen pi eine Serokonversion detektiert werden (DE LEEUW u. CORNELISSEN 1993). In einer Folgestu- die konnte die Sensitivität und Spezifität des indirekten ELISAs auf 100 % bzw. 99,2 % im Vergleich zu 78,1 % bzw. 99,6 % des IHA erhöht werden. Der Zeitpunkt der Serokonversion
konnte im ELISA zwischen Tag 28 – 42 pi bestimmt werden mit einer anschließenden Nach- weisbarkeit der Ak bis Tag 168 pi. Der Anstieg des Ak-Titers im IHA war frühestens ab Tag 42 pi messbar (CORNELISSEN et al. 1997). Aufgrund der Ergebnisse im direkten Ver- gleich zum IHA wurde der ELISA validiert und im Jahre 1995 anstelle des IHA zur routine- mäßigen Diagnostik des Tiergesundheitsdienstes in den Niederlanden eingesetzt. Gleichzeitig wurde er als kommerziell erhältliches Testkit zur Diagnose einer bovinen Lungenwurminfek- tion auf dem Europäischen Markt eingeführt (Ceditest® Lungworm, CEDI-DIAGNOSTICS, Lelystad, Niederlande) und war bis zum 01.01.2007 im Handel erhältlich (persönliche Mittei- lung von Y. Meier der Firma Prionics).
Die Verwendung eines rekombinanten Antigens im ELISA wurde erstmals von SCHNIEDER (1992) beschrieben. Grundlage war das Genfragment Dv3-14 mit einer Länge von 471 Ba- senpaaren, dessen Translationsprodukt ein Molekulargewicht von 15,5 kDa aufweist und wahrscheinlich mit dem nativen 17 kDa großen Protein von DE LEEUW u. CORNELISSEN (1991) übereinstimmt. Aufgrund einer 84 %igen Identität in einem 62 Aminosäuren umfas- senden Abschnitt des Dv3-14 Proteins zu Proteinen von Ascaris suum und Caenorhabditis elegans wurde die Proteinsequenz der Gruppe der Major Sperm Proteine (MSP) zugeordnet.
Die Expression dieses MSPs erfolgte als Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein (DvGST3-14) in Escherichia coli mit anschließender Reinigung über die Affinitätschroma- tographie. Im ELISA wurde das MSP sowohl als GST-Fusionsprotein als auch in reiner, vom GST-Fragment getrennter Form (Dv3-14) eingesetzt. Anhand der Ergebnisse konnte für expe- rimentell infizierte Tiere eine Spezifität von jeweils über 99 % für beide Antigenpräparatio- nen sowie eine Sensitivität von 93 % (DvGST3-14) bzw. 91 % (Dv3-14) berechnet werden. In natürlich infizierten Kälbern lag die Spezifität und Sensitivität bei 90 % bzw. 85 % für DvGST3-14 sowie bei über 99 % bzw. 70 % für Dv3-14 (SCHNIEDER 1992, 1993a).
Bei der Verwendung des MSP in Form eines Dipstick-Tests, der auf dem Prinzip des Immu- noblots basierte und eine Sensitivität und Spezifität von jeweils über 99 % zwischen Tag 30 und 85 pi aufwies, konnte innerhalb von 90 min nach Blutentnahme das Ergebnis abgelesen werden. Weiterhin traten keine Kreuzreaktionen mit Ak gegen gastrointestinale Nematoden auf, so dass mit diesem Test eine viel versprechende und einfach durchzuführende Methode zur Detektion von Ak gegen D. viviparus zur Verfügung stand (SCHNIEDER 1993b).
Durch weitere Modifikationen des auf dem MSP-Fusionsprotein basierenden ELISAs zum Nachweis lungenwurmspezifischer IgG1 konnte die Sensitivität, Spezifität, sowie der positive und negative prädiktive Wert auf jeweils 100 % für experimentell infizierte Kälber erhöht werden (v. HOLTUM 2006).
2.1.7.4 Einsatz von Milchproben im ELISA
In den letzten Jahren ist der Einsatz von Milchproben zur Diagnose und Überwachung von verschiedenen Infektionserregern zunehmend zur Routine geworden und die Überprüfung von Ak-Titern in Einzeltier- und Tankmilchproben spielt in vielen Ländern zur Kontrolle von Rinderkrankheiten und in Eradikationsprogrammen eine bedeutende Rolle (PRITCHARD et al. 2002; BÖTTCHER et al. 2003). In der Literatur wird die Untersuchung von Milchproben mittels ELISA auf Ak u. a. für Neospora caninum, Mycobacterium avium subsp. paratubercu- losis, F. hepatica, Salmonellen, Ostertagia ostertagi und verschiedene Virusinfektionen wie mit dem Bovinen Herpesvirus 1, der Brucellose und der Bovinen Virusdiarrhoe beschrieben (BÖTTCHER et al. 2003; CHARLIER et al. 2007a; NIELSEN et al. 2007; NUOTIO et al.
2007; SALIMI-BEJESTANI et al. 2007; BAPTISTA et al. 2008; SOTIRAKI et al. 2008). Die Nutzung von Milchproben stellt im Vergleich zu Serumproben eine einfache, kostengünstige und nicht-invasive Methode zur Überprüfung des Infektionsgeschehens im Einzeltier oder auf Herdenbasis dar.
2.1.7.5 Korrelationen des Antikörpertiters in Serum- und Milchproben
In unterschiedlichen Studien konnte gezeigt werden, dass bei vielen Infektionen eine gute Korrelation zwischen dem Ak-Titer in der Milch und im Serum besteht. Wie bereits in Kap. 2.1.7.3 erwähnt, wiesen die Korrelationen für Ak im Serum gegen D. viviparus Werte von r = 0,56 im Vergleich der Einzeltierproben und von r = 0,61 im Herdenmittelwert auf.
Die Gegenüberstellung des Ak-Titers in der Tankmilch und dem Herdenmittelwert der Serumproben ergab eine Korrelation von r = 0,67 bzw. von r = 0,82 für den Herdenmittelwert der Milchproben (KLOOSTERMAN et al. 1993). Eine ebenfalls gute Übereinstimmung die- ses Infektionsparameters mit sowohl positiven Serum- als auch entsprechenden Milchproben ermittelten NISKANEN et al. (1989) für das BVD-Virus, MOLLOY et al. (2005) für F. hepa- tica-Infektionen sowie KRAMPS et al. (2008) für das Bluetongue virus. Die Eignung von Milchproben zur Überprüfung von Ak gegen M. avium subsp. paratuberculosis zeigte sich in einer Korrelation von r = 0,92 für Serum- und Milchproben und r = 0,7 für den Ak-Titer in Tankmilchproben und der entsprechenden Seroprävalenz innerhalb der Herde (van WEERING et al. 2007). Untersuchungen zur natürlichen IgG1-Konzentration in der Milch
ergaben bei nicht-infizierten Eutervierteln eine moderate Korrelation (r = 0,28) zwischen dem IgG1-Gehalt im Serum und der Milch (CAFFIN et al. 1983).
2.1.7.6 Einflüsse auf den Antikörpertiter in der Milch
In verschiedenen Vergleichsstudien war der gemessene Ak-Titer in der Milch niedriger als in den entsprechenden Serumproben (NISKANEN et al. 1989; van WEERING et al. 2007;
KRAMPS et al. 2008). PRITCHARD et al. (2002) beschrieben hingegen für IBR- und BVD- Infektionen einen höheren OD-Wert für den Ak-Titer in der Milch im Vergleich zum Serum, wobei der Unterschied bei IBR-Infektionen signifikant und bei BVD-Infektionen nicht signi- fikant war.
Das Laktationsstadium wird von einigen Autoren als Einflussfaktor auf den Ak-Titer in der Milch beschrieben. Demnach ist der Ak-Titer in der Milch negativ mit der Milchproduktion der Tiere korreliert (NISKANEN et al. 1989; BARTELS et al. 2007). Gleiches wurde für Tankmilchproben dargelegt, bei denen die Indexwerte in der Tankmilch bei steigender Milch- leistung der Einzeltiere sanken (SANCHEZ et al. 2002; BARTELS et al. 2007). NIELSEN et al. (2002) präsentierten Ergebnisse, nach denen die Wahrscheinlichkeit eines positiven ELI- SA-Ergebnisses einer M. avium subsp. paratuberculosis-Infektion zu Beginn der Laktation in der Milch und zum Ende der Laktation im Serum am höchsten war. Zur Detektion von Ak gegen das Maedi-Visna-Virus empfahlen MAZZEI et al. (2005) die Untersuchung von Milchproben, die in der Mitte der Laktationsphase gewonnen wurden, da zu diesem Zeitpunkt ähnliche Ak-Titer in Milch und Serum gefunden wurden. KLOOSTERMAN et al. (1993) berechneten in ihrer Studie mit D. viviparus eine signifikante Korrelation zwischen Lakta- tionsstadium und Ak-Titer in der Milch, die zu Beginn der Laktation niedrigere Werte auf- wies als zum Ende der Laktation. PRITCHARD et al. (2002) hingegen beschrieben das Lakta- tionsstadium in Bezug auf den Ak-Titer in der Milch als nicht relevanten Faktor.
Mit zunehmender Anzahl an Laktationen wurde ein generell höherer Indexwert ausschließlich in der Milch festgestellt (KLOOSTERMAN et al. 1993; MAZZEI et al. 2005), so dass bei einem vorgegebenen Serumergebnis sich ältere Tiere häufiger positiv im Milch-ELISA dar- stellen als jüngere (PRITCHARD et al. 2002). Dieser Befund wird im Zusammenhang mit einer generell höheren IgG1-Konzentration bei älteren Tieren von CAFFIN et al. (1983) dis- kutiert. Die Autoren ermittelten in der Milch aus gesunden Eutervierteln ähnliche IgG1- Konzentrationen zu Beginn und Mitte der Laktation, die zum Ende der Laktation signifikant
erhöht waren und große individuelle Unterschiede aufwiesen. Während der ersten drei Lakta- tionen wurden IgG1-Konzentrationen von 0,42 – 0,44 mg/ml gemessen, die in den folgenden Laktationen auf Werte von 0,48 – 0,57 mg/ml anstiegen. Durch Infektionen mit Krankheitser- regern wie Staphylococcus aureus und dem Corynebacterium bovis kann der IgG1-Gehalt in den betroffenen Vierteln ebenfalls erhöht sein.
Als weitere Einflussfaktoren auf den Ak-Titer in der Milch wurden der Protein- und Fettge- halt aufgezeigt. Für beide Faktoren wurde eine schwach-positive, signifikante Korrelation zum Ak-Titer mit r = 0,25 bzw. r = 0,17 beschrieben (KLOOSTERMAN et al. 1993). Zudem sollten Milchproben vor der Untersuchung im ELISA entrahmt werden, da der OD-Wert von dem in der Milch enthaltenen Fettgehalt beeinflusst wird (WITTE et al. 1989).
2.1.8 Bekämpfung
Zur Bekämpfung der Dictyocaulose können unterschiedliche Methoden angewendet werden.
Als Prophylaxe können weidetechnische Maßnahmen oder die Vakzinierung gefährdeter Tie- re erfolgen. Zur Therapie und Metaphylaxe stehen Anthelminthika verschiedener Wirkstoff- klassen zur Verfügung. Insgesamt sei bei der Bekämpfung auf Spezialliteratur oder auf v. HOLTUM (2006) verwiesen, da an dieser Stelle auf diesen Aspekt nicht weiter eingegan- gen werden soll.
2.2 Das Major Sperm Protein (MSP)
Major Sperm Proteine (MSPs) sind Spermien-spezifische Proteine von Nematoden mit einem Molekulargewicht von ca. 14 kDa und bestehen aus maximal 150 AS. Die MSPs werden in den Spermatozyten exprimiert und sind mit 15 % des gesamten und 40 % des gelösten Zell- proteins die am häufigsten in den Spermien vorkommenden Proteine (WARD u. KLASS 1982; SCOTT 1996). Bedeutsam sind sie bei der Reproduktion der Helminthen, wo sie zum einen intrazellulär als zytoplasmatische Komponenten die Spermienmotilität bewirken und zum anderen durch extrazelluläre Signale die Ovulation und Oozytenreifung im weiblichen Geschlechtstrakt beeinflussen (MILLER et al. 2001). Aufgrund ihrer Spezifität und des hohen Grades an evolutionärer Konservierung in Nematoden wurden die MSPs als ein Erfolg ver-
sprechender Angriffspunkt für die Bekämpfung von Nematoden durch Chemotherapeutika beschrieben (SCOTT et al. 1989; MILLER et al. 2001). Das in dieser Arbeit verwendete MSP wurde erstmals von SCHNIEDER (1993a) in seiner Nukleotidsequenz dargestellt, als Dv3-14 bezeichnet und nach vorgenommenen Korrekturen unter der Accessions-Nummer EF012201 in der Datenbank „GenBank“ des National Centre for Biotechnology Information (NCBI) veröffentlicht.
2.2.1 Vorkommen
MSPs konnten bisher in 25 Nematodenspezies nachgewiesen werden, die 20 verschiedene Gattungen repräsentieren. Dabei variiert die Anzahl von msp-Genen von zwei Genen in A. suum bis zu 60 Genen in C. elegans inkl. der Pseudogene. Die bei A. suum, O. volvulus und Brugia malayi vorhandenen zwei MSP-Gene kodieren für zwei Isoformen des MSP (MSPα und MSPβ), die sich bei letzteren beiden in fünf und bei A. suum sogar nur in vier AS unter- scheiden (SCOTT et al. 1989; SCOTT 1996). Die Übereinstimmung zwischen A. suum und C. elegans liegt auf Nukleinsäureebene bei 70 % und auf Proteinebene bei 86 % (BENNETT u. WARD 1986). Im Vergleich mit A. suum und C. elegans zeigt O. volvulus auf Proteinebene Identitäten von über 80 %, ebenso wie Oesophagostomum dentatum auf Nukleinsäureebene (SCOTT et al. 1989; COTTEE et al. 2004). Der hohe Konservierungsgrad des Proteins konnte durch Übereinstimmung in der AS-Sequenz von über 80 % in den MSP-Sequenzen von weite- ren Nematoden und mit 93 – 97 %iger Identität zwischen O. volvulus und Mansonella ozzardi bestätigt werden (HOJAS u. POST 2000; COTTEE et al. 2004). HØGLUND et al. (2008) konnten für D. viviparus nur einen sehr geringen Polymorphismus der genomischen msp- Sequenzen zwischen verschiedenen Isolaten des bovinen Lungenwurms trotz des hohen Gra- des an sonstiger genetischer Variation zeigen. Im Vergleich zu msp-Sequenzen von D. capre- olus und D. eckerti stellten sich ebenfalls nur geringe, jedoch konstant nachzuweisende Un- terschiede dar. Die genomische Organisation der msps variiert zwischen den verschiedenen Spezies insofern, als dass Gene mit und ohne Introns beschrieben wurden (HOJAS u. POST 2000; COTTEE et al. 2004). Durch die quantitative Real-time PCR konnte die geschlechts- und stadienspezifische Transkription von msp bestätigt werden. Untersuchungen an B. ma- layi und O. volvulus zeigten msp-Transkripte nur in männlichen adulten Würmern und, in geringerer Menge, in späten vierten Larven, während in dritten und frühen vierten Larven keine Transkription von msp-Genen stattfand (COTTEE et al. 2004; LI et al. 2004).
2.2.2 Funktion
Während der Spermatogenese entstehen im Hoden der Nematoden aus Spermatogonien zu- nächst primäre und sekundäre Spermatozyten, die infolge meiotischer Teilungen haploide Zellkerne enthalten (WOLF et al. 1978). Die Zellkerne wandern zum Rand der Zelle und bil- den mit dem Zytoplasma und einer Auswahl an speziellen Organellen durch Knospung unbe- wegliche Spermatiden. Diese verbleiben bis zur Ausreifung zum Spermium, induziert durch die Paarung, im Vas deferens. Die für die Biosynthese von Proteinen notwendigen zellulären Strukturen verbleiben ausnahmslos bei der Knospung im Residualkörper, so dass alle Mole- küle, die für die Differenzierung und Funktion der Spermien notwendig sind, früh in der Spermatogenese gebildet und in den Spermatiden gespeichert werden (ROBERTS et al.
1986). Die MSPs werden daher in den Spermatozyten exprimiert und anschließend in Form von fibrösen Körpern im Zytoplasma gelagert. Bei der Bildung der Spermatiden durch die Knospung werden die fibrösen Körper mit in die Spermatiden übernommen und verbleiben dort als MSP-Vorrat bis zur Aktivierung der Spermien (SCOTT 1996).
2.2.3 Spermienmotilität
Nematoden produzieren Spermien, die durch die Ausbildung von Pseudopodien amöboide, kriechende Bewegungen vollziehen können und dabei Geschwindigkeiten von 70 µm/min erreichen (SCOTT 1996). Die Grundlage des Pseudopodiums bildet ein Zytoskelett aus MSP- Filamenten. Ähnliche Fortbewegungsmechanismen in anderen eukaryontischen Zellen beru- hen auf der Anwesenheit von Aktin. Vergleiche zwischen MSP und Aktin zeigten weder eine Sequenzhomologie noch Ähnlichkeiten in der Struktur sowie Zusammensetzung ihrer Fila- mente. Als größter Unterschied wurde eine fehlende Polarität beim MSP festgestellt, die eine Steuerung der Zytoskelettbildung durch Motorproteine wie Myosin unmöglich macht. Trotz- dem ist das mechanische Prinzip ihrer Kriechbewegungen fast identisch, so dass die Autoren von einer externen Steuerung und Organisation der MSP-Polymerisation sprechen (ROBERTS u. STEWART 2000; STEWART u. ROBERTS 2005). Die Organisation der MSP-Filamente zu fibrösen Komplexen erfolgt an hervorstehenden Membranbereichen am Vorderende des Pseudopodiums und bewirkt ein Vorwärtsschieben des Zellausläufers. Paral- lel dazu findet die Dissoziation des polymerisierten MSP an deren Basis statt. Neben dieser Schubkraft existiert eine für die Bewegung notwendige unabhängige Zugkraft. Durch Adhä-
sion des Zytoskeletts an die Membran des Pseudopodiums zwischen Vorderende und Basis entsteht einerseits diese Retraktionskraft, die das Nachziehen des Zellkörpers verursacht, an- dererseits aber der Neutralisation der beiden Kräfte entgegenwirkt. Dieses Prinzip wird auch als ‚Push-Pull Mechanismus’ bezeichnet (MIAO et al. 2003; STEWART u. ROBERTS 2005).
Abb.: 1 Push-pull Modell zur Fortbewegung des Nematodenspermiums (ROBERTS u. STEWART 2000)
Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass das MSP nicht alleine diese amöboiden Bewegungen hervorruft (SCOTT 1996; STEWART u. ROBERTS 2005). Zwei identifizierte zytosolische Komponenten sind die MSP-Fiber-Proteine (MFP) 1 und 2. Während MFP-1 die Bildungsrate von MSP-fibrösen Komplexen senkt, erhöht MFP-2 diese Rate (BUTTERY et al. 2003). Wie die Interaktion dieser beiden Proteine funktioniert, ist noch unklar. Neuere Un- tersuchungen konnten die Bindung eines Bestandteils von MFP-1 an MSP zeigen (TARR u.
SCOTT 2005a). Des Weiteren wurde unter den Transmembranproteinen in Ascaris-Spermien ein 48 kDa großes Phosphorprotein gefunden (MPOP: MSP polymerization-organising protein), das die Polymerisation und Verankerung der MSP ausschließlich am Vorderende des Pseudopodiums stimuliert (LECLAIRE et al. 2003; TARR u. SCOTT 2005b) und mit einem zytosolischen Protein (MPAK: MSP polymerization-activating kinase) interagiert, das durch die Verbindung der Aktivitäten von MPOP und MFP-2 an der Bewegungsbildung beteiligt ist (YI et al. 2007). Über Veränderung des intrazellulären pH-Wertes kann der Auf- und Abbau der fibrösen Körper im Pseudopod beeinflusst werden. Am Vorderende, wo die Polymerisati- on stattfindet, ist der pH-Wert geringfügig alkalischer als an der Basis, wo die fibrösen Kör- per wieder zerfallen (ITALIANO et al. 1999; STEWART u. ROBERTS 2005).
Neueste Studien zeigten, dass MSP, wie auch Aktin, zwei Strukturformen annehmen kann, die Netzwerk- und Bündelform. Letztere wurde bei der Untersuchung von Filopodien ent- deckt, die bei der Entwicklung von unbeweglichen Spermatiden zu den beweglichen Sper-
mien für 30 - 60 sek gebildet werden und sich drei- bis viermal so schnell verlängern wie die fibrösen Körper in den Pseudopodien (MIAO et al. 2007).
2.2.4 Oozytenreifung und Ovulation
Bei den Metazoa wird die Meiose während der Oozytenentwicklung mit der Ovulation und teilweise der Fertilisation koordiniert, um die Fusion der haploiden Gameten zu sichern (MILLER et al. 2001). Studien an C. elegans stellten bei Absenz von Spermien einen Ent- wicklungsstopp der Oozyten in der Diakinese fest. Durch die Freisetzung von hormonell wir- kendem MSP von Spermien erfolgte die Wiederaufnahme der Meiose sowie die Induktion der Ovulation durch Kontraktion von Zellen in der Gonadenhülle (YAMAMOTO et al. 2006).
Zwei Signalregionen auf dem MSP vermitteln diese Vorgänge. So sind Regionen am C-terminalen Ende an der Ovulation und am N-terminalen Ende an der Oozytenreifung betei-
ligt (MILLER et al. 2001). Durch von Spermatiden und Spermien abgesonderte Vesikel, die aus einer inneren und äußeren Membran mit dazwischen liegendem MSP-Molekül bestehen, gelangt das MSP zu den Oozyten und wird durch Auflösung der Vesikel freigesetzt (KOSINSKI et al. 2005). Die anschließende Transduktion der Signale, durch Bindung der MSP-Moleküle an Rezeptoren der Oozyten und Gonadenhülle, löst eine intrazelluläre Enzymkaskade aus, die als Resultat befruchtungsfähige Eizellen zur Verfügung stellt (MILLER et al. 2001; KUWABARA 2003; MILLER et al. 2003).
2.3 Die Fasciolose des Rindes
2.3.1 Erreger
Fasciola hepatica, der große Leberegel, ist weltweit verbreitet und kommt bei Herbivoren bzw. beim Menschen als Zoonoseerreger vor, wobei alle Wiederkäuer, Schweine, Pferde, Esel und einige wildlebende Tiere als Endwirte fungieren können (HARDMAN et al. 1970;
HAROUN u. HILLYER 1986; GARCIA et al. 2007).
Die Verbreitung des großen Leberegels umfasst klimatisch gemäßigte Gebiete mit ausrei- chender Feuchtigkeit, in denen man die Habitate von Zwergschlammschnecken der Gattung Lymnaea, welche die Zwischenwirte des Egels sind, vorfindet (OVER 1982).
Neben F. hepatica existiert F. gigantica, der ebenfalls bei Wiederkäuern parasitiert und als alleiniger Egel in Afrika südlich der Sahara sowie in den Subtropen und Tropen Asiens zu finden ist, während er in Ländern östlich des Mittelmeers zusammen mit F. hepatica vor- kommt. Hinsichtlich pathologischer Veränderungen in der Leber, klinischer Krankheitsbilder sowie der Pathogenität besteht eine Ähnlichkeit zwischen F. gigantica und F. hepatica (KHANDELWAL et al. 2008). Bei optimalen Umweltbedingungen verläuft die Leberegel- entwicklung (s. Kap. 2.3.4) vom späten Frühjahr bis frühen Herbst (BORAY 1985), wobei das Infektionsrisiko von der Anzahl überwinterter Eier und Zwischenstadien des Leberegels abhängt, die in Schnecken und auf der Weide den Winter überdauern können (GAASENBEEK et al. 1992; LUZON-PENA et al. 1995). Durch die Zunahme der Schne- ckenpopulation im Verlauf des Sommers erhöht sich das Infektionsrisiko der Endwirte gegen Ende der Weidesaison, wobei der größte Verseuchungsgrad der Weiden mit Zwischenstadien (Metazerkarien) nach BORAY (1985) vom Spätsommer bis frühen Herbst, nach GRÄFNER (1989) von Anfang September bis Mitte Oktober vorherrscht. Weitere Endwirte wie Rehe, Rotwild und Wildkaninchen (GRÜNDER 2002) sowie chronisch infizierte Schafe können durch ausgeschiedene Eier im Kot den Kontaminationsgrad der Weiden zusätzlich erhöhen.
2.3.2 Vorkommen und Bedeutung
2.3.2.1 Deutschland
In Schleswig-Holstein wurden in dem Zeitraum von November 2005 bis April 2006 insge- samt 2136 Tankmilchproben im ELISA untersucht und bei 50 % der Proben F. hepatica- spezifische Ak detektiert. Im Kreis Dithmarschen waren 74 % der Tankmilchproben positiv (BOLLN et al. 2007).
BERNING (2002) dokumentierte die Situation verschiedener Landkreise in Nord- Niedersachsen. Danach lag die Prävalenz von Leberegeleiern 1986 in Friesland bei 48,7 % und in Ammerland, nach flächendeckender parasitologischer Kotuntersuchung von 159 Be- trieben, bei 15,1 %. Im Weser-Ems-Gebiet wurden in den Jahren 1990 – 1999 Prävalenzen
zwischen 2 % bis 10 % festgestellt, während 1997 im Landkreis Celle keine Leberegeleier in 27 Sammelkotproben detektierbar waren. In seinen eigenen Untersuchungen stellte BER- NING (2005) anhand von Schlachtbefunden von 32.623 Rindern eine Prävalenz von 1,1 % für Nord-Niedersachsen fest.
In Nordrhein-Westfalen wurde im Landkreis Steinfurt 1966 ein Verseuchungsgrad nach Fun- den von geschlachteten Tieren von 90 % festgestellt, der aufgrund von Bekämpfungsmaß- nahmen auf unter 5 % im Jahr 1974 gesenkt werden konnte, bevor ein erneuter Anstieg auf 8 % im Jahr 1984 verzeichnet wurde (LEMMERMÖHLE 1984; WEICHEL 1987). In einem Feuchtwiesengebiet, das anteilig in den Landkreisen Borken und Coesfeld lag, bezifferte sich die Prävalenz der Leberegel-infizierten Bestände in den Jahren 1987 – 1992 auf durchschnitt- lich 55,8 % (BERNING 2002).
In Bayern wurden im Jahr 2003/2004 bei Untersuchungen des Tiergesundheitsdienstes Bay- ern e.V. (TGD) vor allem im Voralpenraum Befallsfrequenzen von bis zu 70 % dokumentiert.
Die erste flächendeckende serologische Untersuchung auf das Vorhandensein von Ak gegen F. hepatica in Milchviehbetrieben in Bayern wurde in den Jahren 2003 – 2005 durchgeführt und bestätigte mit ermittelten Prävalenzen von 64,5 % für die Voralpenregionen die Ergebnis- se des TGD. Die durchschnittliche Herdenprävalenz für das gesamte Gebiet des Freistaates lag bei 32,2 % betroffene Betriebe (KOCH 2005).
2.3.2.2 Europa
Bei im Zeitraum 1999 – 2002 durchgeführten Untersuchungen des Zwischenwirtes L. trunca- tula aus 130 Habitaten, die sich auf Weiden sowie Feldern zur Heugewinnung von 70 Betrie- ben in der Schweiz befanden, wurden 51 mit F. hepatica infizierte Schneckenpopulationen identifiziert. Von der Gesamtzahl untersuchter Schnecken waren 7 % befallen, wobei das Ri- siko einer Infektion bei Schnecken, die aus Habitaten an Flüssen stammten, niedriger war (SCHWEIZER et al. 2007). Die wahre Prävalenz der Fasciolose in der Schweiz wurde von RAPSCH et al. (2006) durch die gleichzeitige Untersuchung von Kot, Galle, Leber und Se- rum von 1331 Schlachtrindern im Zeitraum 2004 – 2005 ermittelt und ergab 18 %.
In einer Studie an Schlachttieren in Irland im Jahr 2002/2003 zeigten 65 % der Lebern entwe- der einen direkten Befall mit Egeln oder pathologische Veränderungen, die auf eine Fasciolo- se schließen ließen (MURPHY et al. 2006). In England und Wales wurden mit einem für
Tankmilchproben neu validierten ELISA 48 % bzw. 86 % positive Herden ermittelt (SALI- MI-BEJESTANI et al. 2005a).
Zur vergleichenden Analyse der Sensitivität zweier ELISAs mit unterschiedlicher Antigen- Beschichtung (E/S-Antigen vs. f2-Antigen von F. hepatica), wurden in Frankreich die Seren von 310 Färsen auf Ak getestet. Unter Verwendung des E/S-Antigens waren 79 % der Tiere positiv, mit dem f2-Antigen lediglich 25,6 % (SALEM u. JACQUIET 2007). 2004 - 2005 zeigten sich 48,8 % von 1331 getesteten Herden im Serum-ELISA positiv (MEISSONNIER u. BOUTET 2007).
Prävalenzstudien im zentralen und östlichen Polen bezifferten mittels neu etablierter PCR- und serologischer Methoden die Befallsrate von Rindern auf 34,9 % (KOZAK-CIESZCZYK 2006).
2.3.3 Wirtschaftliche Bedeutung
Der hohe wirtschaftliche Schaden der Fasciolose entsteht durch die Verwerfung von befalle- nen Lebern am Schlachthof, eventuelle Todesfälle bei massivem Egelbefall, verminderte Fut- terverwertung mit folgender reduzierter Mastleistung, geringere Gewichtszunahmen laktie- render Kühe sowie durch verminderte Milchleistungen, die bis zu 450 Litern/Tier/Jahr betra- gen können (HAROUN u. HILLYER 1986; SIMMANK 1987; ILCHMANN et al. 2002).
Die Verluste durch den Befall mit F. hepatica bei Bullen der Rasse „Weißblaue Belgier“
wurden auf ca. 58 Euro infolge geringerer täglicher Gewichtszunahmen von 1,66 kg im Ver- gleich zu 1,98 kg bei nicht infizierten Tieren geschätzt (GENICOT et al. 1991). Andere Auto- ren dokumentierten reduzierte Gewichtszunahmen bis zu 28 % bei Mast- und Zuchttieren (JOHNSON 1991; MARLEY et al. 1996).
SCHWEIZER et al. (2005) berechneten für die Schweiz einen jährlichen Gesamtverlust durch die Fasciolose von 50 Millionen Euro. Bezogen auf das infizierte Einzeltier bedeutet das Ein- bußen in Höhe von 299 Euro, wobei die deutlichsten finanziellen Verluste durch die vermin- derte Milchproduktion und Fertilisationsstörungen verursacht werden. Geringere Auswirkun- gen verzeichneten sie für die reduzierte Fleischproduktion sowie die Verwerfung der befalle- nen Lebern am Schlachthof. Der jährliche wirtschaftliche Verlust aller in Endemiegebieten weidenden Wiederkäuer wurde auf 2 bis 3,2 Milliarden US-Dollar geschätzt (BORAY 1985;
SPITHILL 1999).
