Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Parasitologie
Rekombinante Antigene als Vakzinekandidaten gegen den Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus – in vitro
Untersuchungen und Immunisierungsversuche
THESE
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Deborah Elisabeth Joekel aus Wuppertal
Hannover 2015
Supervisorin: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD
Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Univ.-Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann Prof. Dr. med. vet. Franz J. Conraths
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD Institut für Parasitologie
Tierärztliche Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. vet. Franz J. Conraths Institut für Epidemiologie
Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Anja Joachim Institut für Parasitologie
Veterinärmedizinische Universität Wien
Datum der Disputation: 30.04.2015
Förderung: Diese Arbeit wurde durch das EU-unterstütze FP7-Projekt „PARAVAC – Vaccines against helminth infections“ (Fördervertragsnummer 265862) gefördert.
Teile der Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Deborah Joekel, Wolfgang Bäumer, Dirk Werling, Thomas Schnieder, Christina Strube (2012)
„Immunzellassays zur Evaluierung des antigenen Potentials rekombinanter Vakzinekandidaten von Dictyocaulus viviparus“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und parasitäre Krankheiten“
Hannover, 02.07.-04.07.2012
Deborah Joekel, Wolfgang Bäumer, Dirk Werling, Thomas Schnieder, Christina Strube (2013)
„Sind Immunzellassays ein geeignetes System zur Evaluierung des antigenen Potentials von rekombinanten Vakzinekandidaten des bovinen Lungenwurms?“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und parasitäre Krankheiten“
Gießen, 08.07.-10.07.2013
Deborah Joekel, Wolfgang Bäumer, Dirk Werling, Thomas Schnieder, Christina Strube (2013)
„Is antigenicity of bovine lungworm vaccine candidates predictable by in vitroimmune cell assays?“
24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP)
Perth, Australien, 25.09.-29.09.2013
Deborah Joekel, Marie Raulf, Petra Hinse, Sandra Buschbaum, Ulla Küttler, Julia Korrell, Mandy Klick, Christina Strube (2014)
„Rekombinantes Paramyosin als Vakzinekandidat gegen den Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus”
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und parasitäre Krankheiten“
Leipzig, 30.06.-02.07.2014
Sabine Schicht, Julia Korrell, Deborah Joekel, Petra Hinse, Sandra Buschbaum, Ulla Küttler, Sabine Streichan, Christina Strube (2014)
„Cysteinproteasen als Vakzinekandidaten gegen den bovinen Lungenwurm Dictyocaulus viviparus“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und parasitäre Krankheiten“
Leipzig, 30.06.-02.07.2014
Deborah Joekel, Petra Hinse, Sandra Buschbaum, Dirk Werling, Wolfgang Bäumer, Christina Strube (2014)
„Das Adjuvans Matrix-QTM fördert im Gegensatz zu Quil A die Zellproliferation nach rekombinanter Vakzinierung von Rindern gegen Dictyocaulus viviparus“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und parasitäre Krankheiten“
Leipzig, 30.06.-02.07.2014
Teile der Arbeit wurden bereits in einer wissenschaftlichen Zeitschrift zur Publikation angenommen:
STRUBE, C., C. HAAKE, H. SAGER, S. SCHORDERET-WEBER, R. KAMINSKY, S. BUSCHBAUM, D. JOEKEL, S. SCHICHT, E. KREMMER, J. KORRELL, T. SCHNIEDER u. G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA (2015):
Vaccination with recombinant paramyosin against the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus considerably reduces worm burden and larvae shedding.
Parasit. Vectors 2015; doi: 10.1186/s13071-015-0733-5
“The absence of evidence is not the evidence of absence.”
Carl Sagan (1934-1996)
Meiner Familie, Steffen, Anja und Thomas in Dankbarkeit und Liebe gewidmet.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 13
2 Literaturübersicht ... 15
2.1 Dictyocaulus viviparus - der Lungenwurm des Rindes ... 15
2.1.1 Biologie ... 15
2.1.2 Entwicklungszyklus ... 16
2.1.3 Klinik, Pathogenese und Pathologie ... 17
2.1.4 Diagnose... 19
2.1.5 Bekämpfung ... 20
2.1.5.1 Weidetechnische Maßnahmen ... 20
2.1.5.2 Behandlung mit Anthelminthika ... 20
2.1.5.3 Vakzinierung gegen D. viviparus ... 21
2.2 Paramyosin ... 23
2.3 Immunitätsbildung gegen D. viviparus ... 24
3 Material und Methoden ... 27
3.1 Puffer, Lösungen und Medien ... 27
3.2 Verwendete Reagenzien, Enzyme, Reaktionskits, Software und Geräte . 29 3.3 Proteinherstellung ... 34
3.3.1 Rekombinante Proteinexpression von PMY des bovinen Lungenwurmes im Bakterium E. coli (EcPMY) ... 34
3.3.2 Rekombinante Proteinexpression von PMY des bovinen Lungenwurmes in der Hefe P. pastoris (PpPMY) ... 35
3.3.3 „Small-scale“ Expression ... 35
3.4 Reinigung der rekombinanten PMY-Proteine ... 36
3.4.1 Lyse der TSS-tranformierten E. coli-Zellen ... 36
3.4.2 Expressionskontrolle von rPMY mittels magnetischer Partikel ... 36
3.4.3 Reinigung von rPMY mittels Affinitäts-Chromatographie ... 37
3.4.4 Reinigung mittels Größenausschluss-Chromatographie (Gelfiltration) ... 37
3.4.5 Entsalzen und Umpuffern der Proteine ... 38
3.5 Darstellung der Proteine ... 38
3.5.1 SDS-PAGE... 38
3.5.2 Färbung der Proteine mittels Coomassie Blue ... 39
3.5.3 Western Blot ... 39
3.6 Quantifizierung der Proteine ... 40
3.7 Evaluierung rekombinanter Vakzinekandidaten in vitro ... 41
3.7.1 Tierhaltung der Versuchstiere für die Immunzellassays ... 41
3.7.2 Gewinnung peripherer mononukleärer Zellen (PBMC) für die Immunzellassays ... 42
3.7.3 Separation von PBMC ... 43
3.7.4 Zellzählung... 44
3.7.5 Stimulation der PBMC mit rekombinanten Proteinen ... 44
3.7.6 MACS-Separation CD14+ Zellen ... 45
3.7.7 Generierung boviner DCaus CD14+ Zellen... 46
3.7.8 DC-Ernte und anschließende Stimulation der Zellen ... 46
3.7.9 MACS-Separation CD4+ T-Zellen ... 47
3.7.10 Co-Inkubation stimulierter DC mit autologen CD4+ T-Zellen ... 47
3.7.11 Proliferationsmessung ... 48
3.7.12 Markierung der DC zur durchflusszytometrischen Analyse ... 48
3.7.13 Analyse der oberflächenexprimierten DC-Rezeptoren MHC-II und CD86 ... 49
3.8 Immunhistochemische Untersuchungen von PMY ... 49
3.9 Vakzineversuche mit rekombinantem Paramyosin (EcPMY und PpPMY) gegen D. viviparus ... 50
3.9.1 Tierhaltung der Versuchstiere für die Vakzineversuche ... 50
3.9.2 Ablauf der Vakzineversuche ... 51
3.9.3 Bestimmung der Larvenausscheidung, Wurmbürde und Wurmlänge 52 3.9.4 Antikörperdetektion via ELISA ... 52
3.9.5 Immunzellassays während der Vakzineversuche ... 53
3.10Statistische Auswertung ... 54
3.10.1 Immunzellassays ... 54
3.10.1.1 Proliferationsassays ... 55
3.10.1.2 Rezeptoranalyse der DC ... 55
3.10.2 Vakzineversuche: Gewicht, Wurmbürde, Wurmlänge, Larvenausscheidung ... 55
4 Ergebnisse ... 57
4.1 Proteinherstellung ... 57
4.1.1 Reinigung und Darstellung von EcPMY ... 57
4.1.1.1 SDS-PAGE nach HIS-Reinigung ... 57
4.1.1.2 SDS-PAGE nach Größenausschluss-Chromatographie (Gelfiltration) ... 57
4.1.1.3 Western Blot nach Größenausschluss-Chromatographie ... 58
4.1.2 Reinigung und Darstellung von PpPMY ... 59
4.1.2.1 SDS-PAGE nach HIS-Reinigung ... 59
4.1.2.2 Western Blot nach His-Reinigung ... 59
4.1.3 Quantifizierung von EcPMY und PpPMY... 60
4.2 Evaluierung rekombinanter Vakzinekandidaten in vitro ... 60
4.2.1 Stimulation der PBMC mit rekombinanten Proteinen ... 60
4.2.1.1 PBMC-Assays Lungenwurm-naiver Tiere ... 61
4.2.1.2 PBMC-Assays Lungenwurm-infizierter Tiere ... 64
4.2.1.3 Unterschied der Proliferation Lungenwurm-naiver und Lungenwurm-infizierter Rinder ... 66
4.2.2 T-Zell-Assays Lungenwurm-naiver Tiere ... 68
4.2.3 T-Zell-Assays Lungenwurm-infizierter Tiere ... 75
4.2.4 Durchflusszytomtrische Analyse oberflächenexprimierter DC- Rezeptoren MHC-II und CD86 ... 81
4.3 Immunhistochemische Lokalisation von PMY ... 83
4.4 Vakzinierungsversuche mit rekombinantem PMY (EcPMY und PpPMY) gegen D. viviparus ... 87
4.4.1 Gesundheit der Versuchstiere während der Vakzineversuche ... 89
4.4.2 Gewichtszunahme der Rinder ... 89
4.4.3 Larvenausscheidung ... 91
4.4.4 Wurmbürde ... 95
4.4.5 Wurmlänge ... 97
4.4.6 Entwicklung von Antikörpern ... 99
4.4.7 PBMC-Assays während der Vakzineversuche A, B und C ... 109
4.4.8 DC/T-Zell Assays während der Vakzineversuche B und C ... 118
4.4.9 MHC-II und CD86-Analyse boviner DC während des Vakzineversuchs C ... 120
5 Diskussion ... 122
5.1 Immunzellassays zur Evaluierung potentieller Vakzinekandidaten gegen den Rinderlungenwurm D. viviparus ... 122
5.2 Vakzinierungsversuche mit rekombinantem PMY gegen den Rinderlungenwurm D. viviparus ... 127
5.3 Immunzellassays im Zuge der klinischen Vakzineversuche ... 134
5.4 Schlussfolgerung und Ausblick ... 134
6 Summary ... 136
7 Zusammenfassung ... 138
8 Literaturverzeichnis ... 140
9 Anhang ... 155
9.1 Abkürzungsverzeichnis ... 155
9.2 Rohdaten ... 159
9.3 Abbildungsverzeichnis ... 213
9.4 Tabellenverzeichnis ... 216
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1 Einleitung
Der Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus ist einer der wirtschaftlich gefährlichsten Parasiten bei Rindern und führt in gemäßigten Klimazonen zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen durch beispielsweise reduzierte Milchleistung und Gewichtsverlust. Sowohl Lungenwurm-naive Rinder während ihrer ersten Weidesaison als auch Tiere, bei denen die Immunität abgeklungen ist, können nach der (Re-)Infektion an der parasitären Bronchopneumonie (Diktyokaulose) erkranken, wobei Lungenödeme, interstitielle Emphyseme, Alveolarepithelzell-Hyperplasie und sekundäre bakterielle Infektionen diese Parasitose erheblich verschlimmern können. Obwohl Helminthen verschiedenste Immunevasionsmechanismen nutzen, kann gegen den Rinderlungenwurm im Rind eine temporär belastbare Immunität induziert werden. In einigen europäischen Ländern steht ein Lebendimpfstoff basierend auf attenuierten röntgenbestrahlten L3 zur Verfügung (Handelsname u.a. Bovilis Huskvac®, MSD Animal Health). Da aber sowohl ethische, finanzielle als auch logistische Aspekte die Akzeptanz der Impfung vermindern, umfasst die Bekämpfungsstrategie vielerorts primär weidetechnische Maßnahmen sowie den Einsatz von Anthelminthika verschiedener Wirkstoffklassen.
Die Entwicklung eines rekombinanten Subunit-Impfstoffes als Prophylaxemaßnahme ist allgemein aus veterinärmedizinischer sowie aus landwirtschaftlicher Perspektive sehr erstrebenswert, um eine akzeptierte Alternative zur kommerziellen Lebendvakzine zu schaffen.
Des Weiteren würde die Bekämpfung der Diktyokaulose ohne den Einsatz von Anthelminthika der Entstehung möglicher Resistenzen entgegenwirken. Bereits in den vergangenen Jahrzehnten wurden mehrere rekombinante Antigene als Impfstoffkandidaten gegen den Rinderlungenwurm getestet. Diese beinhalteten verschiedene Erreger-assoziierte Moleküle wie Epitope auf der Oberfläche von Larven und adulten Würmer sowie exkretorisch/sekretorische (ES) Produkte verschiedener D. viviparus-Entwicklungsstadien. Allerdings resultierte keine der Impfungen im Wirt „Rind“ in einer signifikanten Schutzwirkung gegen die Diktyokaulose.
Um teure und zeitaufwändige Vakzineversuche mit nicht immunogenen Molekülen zu reduzieren, war das erste Ziel der vorliegenden Arbeit die Etablierung eines in vitro-Verfahrens zur Evaluierung des immunzellaktivierenden Potenzials einzelner rekombinant exprimierter Lungenwurmproteine, die möglicherweise bei der Wirt-Parasit-Interaktion beteiligt sein könnten und damit geeignete Kandidaten für Vakzineversuche darstellen. Im Rahmen der
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vorliegenden Arbeit wird ein Kandidat das Protein Paramyosin sein, welches im Muskel des Parasiten lokalisiert und damit für die Nahrungsaufnahme und Lokomotion bedeutsam ist.
Desweiteren wurden Proteine gewählt, die für das Überleben des Parasiten im Wirt bzw. die Reproduktion eine wichtige Rolle spielen könnten, wie beispielsweise verschiedene Cysteinproteasen, nämlich vier verschiedene Cathepsine und zwei Asparaginylpeptidasen (Legumaine) und weiterhin das Enzym Protein-Disulfid-Isomerase 2 und das Spermienprotein Major Sperm Protein. Diese rekombinant hergestellten Proteine sollten mit verschiedenen Immunzellen, nämlich peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), dendritischen Zellen (DC) und T-Zellen von naiven oder Lungenwurm-infizierten Rindern zur Analyse der potenziell immunzellstimulierenden oder -hemmenden Eigenschaft in vitro kultiviert werden.
Das Protein Paramyosin (PMY), welches als Bestandteil der Muskulatur von Invertebraten identifiziert wurde, zeigte als rekombinant exprimiertes Protein in vorangegangenen im Institut für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführten Impfstudien einen partiellen Schutz vor einer Belastungsinfektion mit D. viviparus. Darüber hinaus wurde mit rekombinantem PMY auch in verschiedenen anderen Impfstudien gegen Nematoden, Cestoden und Trematoden vielversprechende Erfolge erzielt. Vor diesem Hintergrund bestand das zweite Ziel der vorliegenden Arbeit in der Durchführung von drei klinischen Vakzineversuchen mit rekombinantem PMY gegen den Rinderlungenwurm D. viviparus. Dabei sollte sowohl prokaryotisch in Escherichia coli und eukaryotisch in der Hefe Pichia pastoris exprimiertes PMY genutzt werden. Das rekombinante Protein sollte mit zwei verschiedenen Adjuvanzien kombiniert werden, um das immunogene Potenzial zu erhöhen. Um die potenziell immunogene Wirkung der rekombinanten Vakzinekandidaten während der Impfversuche besser zu verstehen, sollten während ausgewählter Zeitpunkte der Impfversuche spezifische Analysen der oben erwähnten Immunzellpopulationen erfolgen.
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2 Literaturübersicht
2.1 Dictyocaulus viviparus - der Lungenwurm des Rindes
2.1.1 Biologie
Dictyocaulus viviparus, der große Lungenwurm des Rindes, ist taxonomisch der Familie der Dictyocaulidae und der Superfamilie der Trichostrongyloidae zugehörig. Diese Superfamilie gehört zur Ordnung der Strongylida, die alle im Stamm der Nematoda zu finden sind. Jüngere phylogenetische Sequenzarbeiten innerhalb des Stammes konnten insgesamt fünf Kladen im Stamm Nematoda identifizieren. In diesem Stammbaum ist die Ordnung Strongylida in Klade V eingeordnet (BLAXTER et al., 1998).
Die Gattung Dictyocaulus umfasst nach aktuellem Wissensstand sieben Arten. Neben D. viviparus (Wirte: Rind, Wildwiederkäuer) sind vor allem D. arnfieldi (Wirt: Equiden) und D. filaria (Wirt: kleine Wiederkäuer) bei mittel- und westeuropäischen Nutztieren vertreten.
Durch die Etablierung molekularbiologischer Methoden (EPE et al. 1997; GIBBONS u.
HÖGLUND 2002) konnten zwei weitere Dictyocaulus-Arten identifiziert werden: D. eckerti, welcher in einer großen Anzahl von Wildwiederkäuerarten parasitiert, sowie D. capreolus, der in Elchen und Rotwild nachgewiesen werden konnte (DIVINA et al. 2002; GIBBONS u.
HÖGLUND 2002). Bei afrikanischen Paarhufern existieren noch zwei weitere Dictyocaulus- Arten, nämlich D. africanus und D. cameli (GIBBONS u. KHALIL 1988).
D. viviparus ruft die parasitäre Bronchopneumonie (Bronchopneumonia verminosa) oder Diktyokaulose des Rindes hervor, wobei sich der adulte Parasit entsprechend seiner Namensbezeichnung in den Bronchioli, Bronchien und in der Trachea von Wiederkäuern befindet (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969; PRESIDENTE et al. 1972; PRESIDENTE u.
KNAPP 1973).
Epidemiologische Studien zeigten, dass der Parasit in gemäßigten Klimazonen wie z.B.
Deutschland (SCHNIEDER et al. 1993), Schweden (HÖGLUND et al. 2004), den Niederlanden (EYSKER et al. 1994; BORGSTEEDE et al. 2000), Belgien (AGNEESSENS et al. 2000), Schottland (JARRETT et al. 1957) und Irland (MURPHY et al. 2006) verbreitet ist, wobei dem
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Parasiten in endemischen Gebieten eine große wirtschaftliche Bedeutung zugesprochen wird, da diese erhebliche Verluste verzeichnen können (MICHEL u. SHAND 1955; WOOLLEY 1997). Darüber hinaus bleiben aber auch tropische und subtropische Gebiete von dieser Parasitose nicht verschont. Dies zeigen jüngste Studien aus Brasilien (DA SILVA et al. 2005), Costa Rica (JIMÉNEZ et al. 2008), Malaysia (LAT-LAT et al. 2010) und Pakistan (MAHMOOD et al. 2014).
2.1.2 Entwicklungszyklus
Der Rinderlungenwurm hat einen homoxenen Entwicklungszyklus. Das infektiöse Parasitenstadium ist die dritte Larve (L3), welche auf der Weide vom Wirtstier oral aufgenommen wird. Nach Passage der Mägen dringt die L3 in die Darmschleimhaut des Dünndarms ein, streift dabei ihre zwei Scheiden ab und gelangt auf dem Blut-Lymph-Weg zu den mesenterialen Lymphknoten, wo sie sich zur vierten Larven (L4) häutet (JARRETT et al.
1957). Die L4 wird anschließend über Lymphe und Blut zum rechten Herzen und anschließend mit dem Blutstrom zur Lunge transportiert. In den Alveoli der Lunge häuten sich die Larven zu geschlechtlich differenzierten Präadulten, welche nach Wanderung in die Bronchien an Größe gewinnen. Adulte Würmer sind makroskopisch mit einer Länge bis zu 8 cm erkennbar, wobei die weiblichen Adulten durchschnittlich länger sind als die männlichen. Nach der Präpatenz von ca. drei Wochen produzieren die Weibchen Eier, welche bei der Ablage bereits die L1 enthalten. Die Eier oder teils schon geschlüpften ersten Larven gelangen über das Flimmerepithel der Trachea in den Pharynx und werden anschließend abgeschluckt oder teilweise ausgehustet. Während der Magen-Darmpassage schlüpfen die übrigen L1 und werden anschließend mit dem Kot ausgeschieden (PFEIFFER u. SUPPERER 1980).
In der Außenwelt häutet sich die unbescheidete L1 innerhalb einer Woche erst zur L2 und schließlich zur infektiösen, doppelt bescheideten L3, die bis zu einem Jahr infektiös sein kann (JARRETT et al. 1954). Die Zeit bis zur Entwicklung der L3 ist u.a. abhängig von der Temperatur und kann unter optimalen Bedingungen innerhalb von fünf Tagen abgeschlossen sein (URQUHART et al. 1973; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Da Rinder es vermeiden, in der unmittelbaren Umgebung von Kothaufen zu grasen, müssen sich die Larven von diesen entfernen, um von den Rindern auf oralem Wege aufgenommen zu werden. Dies geschieht durch Eigenbewegung als auch mechanische Verbreitung durch die Rinder selbst, durch
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Oberflächenwasser, sowie durch Vektoren wie Insekten, Vögel und koprophile Pilze der Gattung Pilobolus (JØRGENSEN et al. 1982).
Der Rinderlungenwurm überwintert entweder auf der Weide oder im Wirtstier. Ersteres wurde in der Studie von JARRETT et al. (1954) erstmals im Westen Schottlands nachgewiesen. Auf einer mit Lungenwurmlarven kontaminierten Weide konnte ein Jahr später in naiven Rindern eine patente Infektion induziert werden. Allerdings ist die Fähigkeit der Larven zur Überwinterung auf der Weide in erheblichem Maße von nicht standardisierbaren Einflüssen wie Witterung und Klima, sowie der Bodenbeschaffenheit und Bepflanzung abhängig. Die Überwinterung des Parasiten im Wirtstier gelingt durch die Ausbildung entwicklungsgehemmter Stadien des Lungenwurmes. Dabei wird ein sogenanntes hypobiotisches oder frühes fünftes Stadium ausgebildet, da die Lebensdauer des adulten Stadiums für eine Überwinterung zu kurz ist (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Betroffene Rinder agieren als stumme Parasitenträger und sind die Hauptursache für die Kontamination der Weiden nach Austrieb in Frühjahr. JARRETT et al. (1957) wies diesbezüglich in den Monaten Januar bis Mai eine Inzidenz der stummen Parasitenträger von 30 % bei Jährlingen sowie 4 % bei ausgewachsenen Rindern in Schottland nach.
2.1.3 Klinik, Pathogenese und Pathologie
Der Krankheitsverlauf der Diktyokaulose des Rindes kann nach JARRETT et al. (1957) in vier Phasen eingeteilt werden, wobei jede durch ein spezifisches Krankheitsbild gekennzeichnet ist:
Penetrations- oder Migrationsphase (1.-7. Tag p.i.), alveolär-bronchiale Phase (7.-25. Tag p.i.), Patenzphase (25.-55. Tag p.i.) und Postpatenzphase (55.-70. Tag p.i.). Während bei der Penetrationsphase durch das Einbohren der Larven in die Darmschleimhaut meist nur eine subklinische Enteritis hervorgerufen wird, ist die alveolär-bronchiale Phase, sowie die Phase der Patenz durch ein spezifisches Krankheitsbild charakterisiert (JARRETT et al. 1957). Die zwei letztgenannten Phasen äußern sich klinisch durch die Wanderung der Larven durch den Körper des Rindes, das Einbohren in das gesunde Lungengewebe und die Entwicklung in den Bronchien und Bronchiolen zu adulten Würmern. Die klinischen Symptome der alveolär- bronchialen Phase sowie der Patenzphase sind stark von der Anzahl der aufgenommen Larven, den Witterungsbedingungen, sowie dem Immunstatus des Tieres abhängig (URQUHART et al. 1973). Dabei sind generell eine Verschlechterung des Allgemeinzustandes (Gewichtsverlust durch Inappetenz, Leistungsminderung bei Milchvieh, Pyrexie, Apathie, „Stöhnen“), sowie die
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respiratorische Symptome (Husten, Dyspnoe oder Tachypnoe, Nasenausfluss, Bauchatmung, Maulatmung mit Schaumbildung durch nicht abgeschluckten Speichel) zu beobachten (JARRETT et al. 1954; MICHEL u. SHAND 1955; PFEIFFER 1971; PFEIFFER u.
SUPPERER 1980; LEKEUX et al. 1985). Die Erkrankung kann durch verschiedenste Sekundärinfektionen sowohl viraler als auch bakterieller Natur verschlimmert werden und zu einer katarrhalisch-purulenten Bronchopneumonie führen (SCHNIEDER et al. 1989), was nicht selten den Tod des Tieres zur Folge hat (PANUSKA 2006). Mitverantwortlich hierfür ist der zerstörte Zilienbesatz der Bronchialepithelien während der Präpatenz sowie der patenten Phase, so dass die mukoziliare Clearance vermindert ist (SCHNIEDER et al. 1991). Dies führt zu einem nicht ausreichenden Auswurf von Schleim, Partikeln, Lungenwurmeiern und Pathogenen.
Pathologisch sind hauptsächlich Bronchopneumonien, generalisierte Lungenödeme, interstitielle Emphyseme und lobuläre Atelektasen sowie die adulten Würmer in den größeren Luftwegen zu verzeichnen (MICHEL u. SHAND 1955; JARRETT et al. 1957; SIMPSON et al. 1957; LEKEUX et al. 1985). Starke Infektionen können peribronchiale Fibrosen zur Folge haben (JARRETT et al. 1954). Ebenso sind subkutane Emphyseme durch Luftinfiltration aus dem Mediastinum bei stark infizierten Tieren zu beobachten (JARRETT et al. 1957).
Histologisch ist neben den peribronchialen Zellhyperplasien massiv Exudat in den Bronchiolen nachweisbar, welches hauptsächlich Lungenwurmlarven, eosinophile Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen und Riesenzellen beinhaltet (MAHMOOD et al. 2014). Eine Epithelisierung der Alveoli ist eine häufige Folge nach Abklingen der klinischen Symptome (JARRETT et al. 1954; JARRETT et al. 1957).
In der Phase der Postpatenz werden die adulten Würmer durch das Immunsystem aus der Lunge des Rindes weitestgehend eliminiert und die klinischen Symptome verbessern sich. Abhängig vom Ausmass der Lungenschädigung können die Tiere aber weiterhin respiratorische Symptome wie Husten und Tachypnoe zeigen (JARRETT et al. 1957). Stark infizierte Tiere oder insbesondere Tiere mit einem schwachen Immunsystem, können aber lebenslang kümmern und entsprechend nur partiell die Leistung von nicht infizierten Tieren erreichen.
19 2.1.4 Diagnose
Neben den hinweisenden klinischen Symptomen nach der Infektion mit Lungenwürmern, welche meist gegen Ende der Weidesaison zu verzeichnen sind, können verschiedene diagnostische Tests zur Diagnosefindung genutzt werden. Zwei dieser Tests wurden im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt und sollen daher an dieser Stelle beschrieben werden.
Eine diagnostische Testmöglichkeit besteht darin, die Larven im Rinderkot durch das Auswanderverfahren nach BAERMANN (1917) zu bestimmen. Dafür wird eine definierte Menge frischen Rinderkots auf ein Sieb gegeben und dieses in einen mit Leitungswasser gefüllten und unten verschlossenen Trichter gestellt. Die Larven wandern durch ihre Eigenbewegung aus dem Kot aus, sinken an das untere Ende des Trichters und können anschließend auf eine Zählkammer überführt werden. Dort sind sie mit einer Größe von ca.
400 µm unter dem Mikroskop erkennbar. Bei diesem Test sind einige Faktoren zu beachten, so kann er z.B. nur während der Patenzzeit erfolgreich angewendet werden. Ebenso ist bei diesem Nachweis wichtig, dass die Kotprobe alsbald nach Gewinnung untersucht wird. Studien von RODE u. JØRGENSEN (1989) zeigten nämlich, dass schon nach 24-stündiger Lagerung der Proben bei 20 °C die Auswanderrate der Larven um 60 % reduziert ist. Bei latent infizierten bzw. teilimmunen Tieren kann die Larvenausscheidung darüber hinaus sehr gering ausfallen, so dass infizierte Tiere durch die Untersuchung einer zu geringen Kotmenge nicht identifiziert werden können. Ein weiterer Nachteil ist der Umstand, dass infizierte Rinder nicht kontinuierlich und gleichermassen Larven mit dem Kot ausscheiden (TAYLOR 1951). Deshalb sollte bei der Diagnostik darauf geachtet werden, dass bei Lungenwurmverdacht und einer negativen Kotuntersuchung mindestens noch eine weitere Kotprobe untersucht wird.
Eine weitere Diagnosemöglichkeit besteht in der Durchführung eines serologischen Tests. Bei diesem handelt es sich um einen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), der auf der Detektion von spezifischen Antikörpern gegen das vom männlichen Wurm sezernierte Major Sperm Protein (MSP) beruht (VON HOLTUM et al. 2008; FIEDOR et al. 2009; SCHUNN et al. 2012). Dieser ELISA kann gebildete Antikörpertiter ab etwa drei Wochen bis hin zu mehreren Monaten p.i. in Serum oder Milch (Einzelmilch und Tankmilchproben) nachweisen.
20 2.1.5 Bekämpfung
Um die Diktyokaulose des Rindes erfolgreich zu bekämpfen, werden bis dato verschiedene Strategien umgesetzt. Diese umfassen weidetechnische Maßnahmen, den Einsatz von Anthelminthika verschiedener Wirkstoffklassen sowie die Vakzinierung gefährdeter Rinderpopulationen mit der kommerziell verfügbaren Lebendvakzine (Handelsname u.a.
Bovilis Huskvac®, MSD Animal Health). Da diese Vakzine allerdings in Deutschland wie auch manchen anderen EU-Ländern nicht (mehr) zugelassen ist, beschränkt sich hierzulande die Bekämpfung der Diktyokaulose vorwiegend auf weidetechnische Maßnamen und die (metaphylaktische und therapeutische) Behandlung mit Anthelminthika.
2.1.5.1 Weidetechnische Maßnahmen
Das Weidemanagement ist eine Möglichkeit der Prophylaxe gegen den Rinderlungenwurmbefall, wobei ein Austrieb naiver Rinder auf eine lungenwurmfreie Weide den sichersten Schutz darstellt. Durch die bereits erwähnte Problematik der „stummen Parasitenträger“ sollte grundsätzlich eine gemeinsame Nutzung der Weide durch ältere und junge respektive naive Rinder vermieden werden (JARRETT et al. 1957). Da Lungenwurmlarven eine gewisse Zeit auf der Weide überleben können, sollte zumindest ein Jahr gewartet werden, bevor naive Tiere auf eine Weide ausgetrieben werden, auf der vorher infizierte Rinder standen. Um die Infektion durch Oberflächenwasser zu minimieren, sollten die naiven Tiere darüber hinaus mit künstlichen Tränken versorgt werden und möglichst auf trockenen Weiden grasen (PFEIFFER 1971; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Ein Umtrieb der Rinder alle 4 Tage auf eine andere Weide kann darüber hinaus das Infektionsrisiko stark minimieren, da die Lungenwurmlarven mindestens 4 Tage benötigen, um infektiös zu werden (EYSKER et al. 1992). Dies ist aber nur in Betrieben mit ausreichender Weidefläche möglich und aufgrund der intensiven Zeitbeanspruchung für den Landwirt heutzutage kaum praktikabel.
2.1.5.2 Behandlung mit Anthelminthika
Der Einsatz von Anthelminthika verschiedener Wirkstoffklassen ist in der Literatur umfassend beschrieben (VERCRUYSSE et al. 1997; EPE et al. 1999; STROMBERG et al. 1999; VON SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. 2000). An dieser Stelle soll auf die ausführlichen Arbeiten von KOHLER-BELLMER (1991) und VON HOLTUM (2006) verwiesen werden.
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Heutzutage werden meist Breitbandanthelminthika wie Benzimidazole oder makrozyklische Laktone zur Bekämpfung des Rinderlungenwurmes eingesetzt (HUBERT et al. 1995;
WHELAN et al. 1995; EPE et al. 1999). Allerdings besteht die Gefahr, dass sich die natürliche Immunität unter einer anthelminthischen Behandlung nicht ausreichend ausbilden kann, so dass behandelte Tiere in Folgejahren für eine Infektion empfänglich bleiben. Was die Anthelminthikaresistenzsituation angeht, so liegt für D. viviparus bis dato lediglich ein Bericht aus Brasilien vor (MOLENTO et al. 2006), so dass im Gegensatz zu den gastrointestinalen Wiederkäuernematoden die Resistenzlage bislang noch als günstig einzuschätzen ist.
2.1.5.3 Vakzinierung gegen D. viviparus
In einigen europäischen Ländern steht ein Lebendimpfstoff basierend auf attenuierten (röntgenbestrahlten) L3 zur Verfügung (Handelsname u.a. Bovilis Huskvac®, MSD Animal Health). Dieser wurde von JARRETT et al. (1960) bereits vor mehr als einem halben Jahrhundert entwickelt. Diese Impfung enthält pro Impfdosis ca. 1000 mit 400 Gray bestrahlte dritte Larven und wird zweimalig im Abstand von vier Wochen oral appliziert. Zum Zeitpunkt der Impfung sollten die Rinder ein Alter von mindestens acht Wochen erreicht haben und klinisch gesund sein. Allerdings führen verschiedene Anwendungsnachteile wie die hohen Herstellungskosten, besondere Lagerungsansprüche (Kühlung bei 2 °C bis 8 °C), die kurze Haltbarkeit der Vakzine von ca. zwei Wochen, sowie die unverzichtbare Nutzung von Ausscheidertieren zu einer begrenzten Akzeptanz von Seiten der Tierärzte und Landwirte. Um einen optimalen Vakzineerfolg zu gewährleisten, ist es darüber hinaus wichtig, dass sich die geimpften Tiere einer natürlichen Infektion auf der Weide aussetzen, um die durch die Vakzine induzierte Immunität länger als eine Weidesaison aufrecht zu halten.
Um eine Alternative zur Lebendvakzine zu entwickeln, wurden insbesondere in den vergangenen zwei Jahrzehnten mehrere rekombinant exprimierte Proteine als Impfstoffe gegen den Rinderlungenwurm getestet. Diese Impfstudien beinhalteten verschiedene Erreger- assoziierte Moleküle wie Epitope auf der Oberfläche von Larven und adulten Würmern sowie exkretorisch/sekretorische (ES) Produkte verschiedener D. viviparus-Entwicklungsstadien.
MCKEAND et al. (1995a) immunisierten in diesem Zusammenhang Meerschweinchen, ein Wirtsmodell der Diktyokaulose, mit ES-Produkt adulter Lungenwürmer. Dieses Experiment führte zu einer signifikanten Protektion der ES-geimpften Tiere nach einer experimentellen Belastungsinfektion verglichen mit einer Kontrollgruppe die nur mit dem Freund’s Complete Adjuvant vakziniert wurde. In einer weiteren Studie (MCKEAND et al. 1995b) wurde eine mit
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Acetylcholinesterase (AChE) angereicherte Proteinfraktion zur Immunisierung von Meerschweinchen genutzt, da dieses Enzym von den Autoren als eines der Hauptbestandteile des ES-Produktes von adulten Lungenwürmern identifiziert wurde (MCKEAND et al. 1994).
Auch diese zweite Immunisierungsstudie an Meerschweinchen zeigte, dass bestimmte Moleküle in den ES-Produkten wie die AChE reduzierte Rinderlungenwurmbürden gegenüber der Kontrollgruppe in vivo nach Belastungsinfektion induzieren können. Dies führte zur Studie von MATTHEWS et al. (2001), welche die AChE erstmalig als rekombinante Vakzine im Rind testeten. Jedoch konnte bei diesem Versuch kein signifikanter Schutz nach experimenteller Lungenwurminfektion beobachtet werden. Weiterhin wurden rekombinante Lungenwurmproteine wie das vom Männchen zur Reproduktion sezernierte MSP (KÖHRMANN 2002; VON HOLTUM 2006) oder die Protein-Disulfid-Isomerase 2 (PDI) in der Studie von WOLKEN (2006) als Vakzine gegen D. viviparus im Rind eingesetzt. Aber trotz des Anstieges spezifischer Antikörperklassen in den geimpften Rindern gegen die vakzinierten Moleküle konnte kein Schutz vor einer anschließenden experimentellen Lungenwurminfektion induziert werden.
Wesentliche Bestandteile der ES-Produkte in Helminthen, einschließlich D. viviparus, sind Cysteinproteasen (REGE et al. 1989; BRITTON et al. 1992; SHAREEF u. ABIDI 2014). Es wird vermutet, dass Cysteinproteasen wie z.B. Cathepsine oder Asparaginylpeptidasen (Legumaine) von wichtiger Bedeutung für das Überleben des Parasiten sind, da sie unter anderem an der Gewebemigration, Verdauung und Modulation der Wirtsimmunantwort beteiligt sind und somit ein geeignetes Ziel für das Immunsystem darstellen (KNOX et al. 1993;
KONG et al. 1994; WASILEWSKI et al. 1996; OLIVER et al. 2006; CHANTREE et al. 2012;
SANSRI et al. 2013). Cysteinproteasen wurden im Rahmen des EU-Projektes „PARAVAC- Vaccines against helminth infections“ erst kürzlich im Institut für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in Impfstudien gegen den Rinderlungenwurm eingesetzt.
Diese umfassten die rekombinant hergestellten Cathepsine B1, B2, B3 und L sowie die Legumaine 1 und 2 des bovinen Lungenwurmes, welche einzeln oder in Kombination in mehreren Vakzineversuchen in Rindern eingesetzt wurden. Hierbei ist zu erwähnen, dass es sich bei den genannten Cysteinproteasen jedoch vermutlich um Darm-assoziierte Proteine und nicht um Bestandteile des ES-Produktes handelt (KORRELL 2014; unveröffentliche Ergebnisse). Allerdings konnten weder die einzeln eingesetzten Proteasen noch die Kombinationsimpfungen eine statistisch signifikante Protektion gegen den Lungenwurm nach experimenteller Belastungsinfektion von Rindern induzieren (KORRELL 2014; SCHICHT et
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al. 2014). Des Weiteren wurde das Muskelprotein Paramyosin (PMY) in zwei Vakzineversuchen gegen den bovinen Lungenwurm im Rind eingesetzt. Pilot-Vakzineversuche mit rekombinant in E. coli exprimierten Lungenwurm-PMY, welches in Kombination mit dem Adjuvans Quil A verabreicht wurde, konnten eine vielversprechende Schutzwirkung vor einer Belastungsinfektion zeigen (STRUBE et al. 2015). So wurde in einem ersten Versuch die Wurmbürde um 54,8 % und in einem zweiten Versuch um 30,9 % reduziert. Darüber hinaus verringerte sich die Larvenausscheidung um 46,6 % bzw. 57,3 %.
2.2 Paramyosin
Das Muskelprotein Paramyosin (PMY) wurde als eine strukturelle Komponente der Muskelzellen von Wirbellosen identifiziert und stellt einen wesentlichen Bestandteil der Körperwand und Pharynxmuskulatur von Helminthen, inklusive D. viviparus dar (SCHMITZ et al. 1996; NARA et al. 1997; CANCELA et al. 2004; STRUBE et al. 2015). PMY ist üblicherweise mit Myosin und den Kernproteinen des Muskels assoziiert und bildet dort die makromolekularen dicken Filamente (EPSTEIN et al. 1985; ARDIZZI u. EPSTEIN 1987). Im Allgemeinen liegt das Molekulargewicht des Proteins bei etwa 100 kDa und ist durch eine zweikettige alpha-helikale Coiled-Coil-Struktur charakterisiert (LANAR et al. 1986).
Untersuchungen an verschiedenen Plathelminthen zeigten, dass PMY die Fähigkeit besitzt, Kollagen zu binden. Es interagiert darüber hinaus mit Teilen des Komplementsystems, vermutlich durch Bindung an die kollagenartigen Stielregionen des Komplementfaktors C1q (LACLETTE et al. 1990; LACLETTE et al. 1992). Eine weitere Studie wies für Taenia crassiceps-PMY die Fähigkeit nach, den Fc-Teil von Antikörpern zu binden (KALINNA u. MCMANUS 1993). Somit kann eine sezernierte oder nicht-filamentöse und oberflächengebundene Form von PMY, wie sie für Schistosoma mansoni vermutet wird, den Parasiten vor dem Immunsystem des Rindes maskieren (LOUKAS et al. 2001). Diese Ergebnisse deuten auf eine multifunktionelle Rolle von PMY hin, das somit nicht nur eine strukturelle Komponente des kontraktilen Apparates darstellt, sondern auch zur Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts fähig sein könnte, um so das Überleben der Parasiten zu gewährleisten. In Bezug auf den Rinderlungenwurm konnten STRUBE et al. (2009) zeigen, dass PMY während des gesamten Lungenwurmzyklus transkribiert wird und rekombinantes PMY (rPMY) von D. viviparus ebenfalls die Fähigkeit besitzt, Rinder-IgG sowie Rinderkollagen in vitro zu binden. So könnte das Rinderlungenwurm-PMY
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immunmodulatorische Funktionen zum Schutz gegen Abwehrmechanismen des Wirtes besitzen und damit ein potenzielles Ziel für einen Impfstoff gegen die parasitäre Bronchopneumonie beim Rind darstellen.
Diese Annahme wird dadurch untermauert, dass rPMY bereits in Impfstudien gegen Trematoden wie Schistosoma spp. (ZHANG et al. 2006) und Fasciola gigantica (ABOU- ELHAKAM et al. 2013) eingesetzt wurde. Diese Studien im Maus- bzw. Kaninchenmodell führten zu einer Erhöhung spezifischer Antikörperklassen in den Seren geimpfter Tiere.
Impfstudien in Nutztieren wie Rindern, Schafen oder Schweinen mit rekombinantem S. japonicum-PMY resultierten in einem partiellen Schutz vor experimentellen Belastungsinfektionen: Nach Immunisierung von Schweinen mit dem rekombinantem S. japonicum Antigen rSJPM konnte beispielsweise eine 32-35 %ige Reduktion der Wurmbürde beobachtet werden (CHEN et al. 2000). Bei Verwendung des 3'-Fragmentes von S. japonicum-PMY im Wirtsmodell Schaf wurde eine 37 %ige und eine 42 %ige Reduktion der Eizahl sowie eine 30 %ige Reduktion der Würmbürde verzeichnet, währenddessen die native Form des S. japonicum-PMY einen höheren Schutz (63 %ige Reduktion der Eizahl und 48 %ige Reduktion der Wurmbürde) induzierte (TAYLOR et al. 1998). MCMANUS et al. (2001) benutzten rPMY von S. japonicum in Kombination mit dem Adjuvans Quil A um Wasserbüffel zu impfen und erreichten eine 49 %ige Reduktion der ausgeschiedenen Eizahl sowie eine 34 %ige Reduktion der Wurmbürde. Die erzielte Schutzwirkung von rekombinanten PMY gegen den Nematoden D. viviparus ist im vorangegangegen Kapitel dargestellt. Alle genannten Ergebnisse legen nahe, dass PMY einen vielversprechenden Impfkandidaten bei Helminthen darstellt, weshalb sein Schutzpotenzial gegen den Rinderlungenwurm in der vorliegenden Arbeit erneut getestet wurde, um die vorangegangenen Ergebnisse zu untermauern oder zu widerlegen.
2.3 Immunitätsbildung gegen D. viviparus
Die Immunreaktion des Wirtes auf den bovinen Lungenwurm umfasst sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten. Damit kann das Immunsystem des Rindes nach Infektion mit D. viviparus, wenn auch nur für maximal 12 Monate, eine belastbare Immunität ausbilden.
Antikörper spielen eine entscheidende Rolle bei dieser Immunitätsbildung, was durch passive Immunisierungsversuche von JARRETT et al. (1955) gezeigt werden konnte. Lungenwurm-
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naive Tiere wurden hier nach Antikörpertransfer von Lungenwurm-infizierten Tieren vor der experimentellen Infektion mit Lungenwurmlarven geschützt. Spätere Studien von MCKEAND et al. (1996), SCOTT et al. (1996), COLLIE et al. (2001) und KOOYMAN (2002) wiesen lokale sowie systemische Anstiege spezifischer Antikörperklassen (IgA, IgM, IgE, IgG, IgG1 sowie IgG2) auf Rinderlungenwurmantigene nach. KOOYMAN (2002) berichtet weiterhin, dass das Gesamt-Serum-IgE mit der Anzahl der peripheren eosinophilen Granulozyten zwischen dem 14. und 28. Tag nach der Primärinfektion korreliert. Die im Serum Lungenwurm-infizierter Rinder vorkommenden Antikörper konnten in der Studie von BRITTON et al. (1992) verschiedene Serin-, Cystein- und Metalloproteinasen aus ES-Produkt des bovinen Lungenwurmes erkennen und die enzymatische Aktivität dieser Moleküle sogar inhibieren.
MCKEAND et al. (1996) untersuchten Seren Lungenwurm-naiver und infizierter Rinder sowie Seren von Tieren, die mit der Lebendvakzine geimpft wurden, auf die Bindung an Oberflächenantigene vitaler L3 und adulter boviner Lungenwürmer. Bei infizierten Tieren konnten dabei Antikörper gegen die Oberfläche der Scheide von L3 (die Kutikula der L2) detektiert werden und die Untersuchung entscheideter L3 mit Seren Lungenwurm-naiver Tiere zeigte einen hohen Titer heterophiler IgM-Antikörper. Patent infizierte Tiere zeigten darüber hinaus IgM,- IgG1- und IgG2- Antikörper gegen die Oberfläche adulter Lungenwürmer.
Lungenwurm-vakzinierte Tiere wiesen nur einen niedrigen Antikörpertiter gegen die Oberfläche von bescheideten als auch entscheideten dritten Larven auf, eine Antikörperreaktion gegen adulte Oberflächenantigene fehlte. Diese Ergebnisse suggerieren, dass die Oberfläche verschiedener Lungenwurmstadien immunogen wirkt und dass die durch die Lebendvakzine induzierte Immunität vermutlich nicht auf Oberflächenmolekülen der adulten Lungenwürmer beruht.
Verschiedene Zellen des erworbenen und angeborenen Immunsystems wie eosinophile Granulozyten und Mastzellen scheinen bei der Immunantwort gegen D. viviparus systemisch als auch lokal eine Rolle zu spielen (SCHNIEDER u. DAUGSCHIES 1993;
MCKEAND 2000). Die Anzahl dieser Zellen korreliert aber vermutlich nicht mit der induzierten Immunität gegen den Rinderlungenwurm (KOOYMAN et al. 2002). Darüber hinaus wurde in der Lunge infizierter Tiere ein Anstieg der mRNA spezifischer Zytokine (Interleukine und Interferone) wie IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 und IL-13 zwischen Tag 15 und 42 p.i. nachgewiesen (JOHNSON et al. 2005). Diese deuten auf eine gemischte Th1- und Th2- Antwort des Rindes während der Diktyokaulose hin. Leukozyten oder periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), eine Mischung von antigenpräsentierenden und antigenspezifischen
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Zellen, reagierten in Form von polyklonaler Proliferation nach in vitro Inkubation mit D. viviparus-Homogenat (HAGBERG et al. 2008). Ein definierter Stimulus konnte jedoch nicht identifiziert werden. Ebenfalls scheinen bestimmte T-Zellpopulationen (γδ-T-Zellen) eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen diesen Parasiten zu spielen, da ansteigende Zellproliferationsvorgänge während der Infektion, vor allem lokal in der Lunge nachgewiesen werden konnten (HAGBERG et al. 2005).
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3 Material und Methoden
In den Kapiteln 3.1 und 3.2 sind die für diese Arbeit verwendeten Puffer, Lösungen, Medien, Reagenzien bzw. Reaktionskits, Software und Geräte aufgeführt.
3.1 Puffer, Lösungen und Medien
AP-Puffer: 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 100 mM Tris-HCl (pH 9,5)
BCIP-Stocklösung: 50 mg/ml BCIP
100 %igem Dimethylformamid
Blotpuffer für Western Blot: 24 mM Tris; 192 mM Glycin; 20 % Methanol (pH 8,3) Coomassie-Färbelösung: 40 % Methanol; 10 % Eisessig; 10 % 0,01 %ige
Coomassie-Blue Stammlösung (Farbstoff Brilliant blue R 250)
Coomassie-Entfärbelösung: 10 % Eisessig
DC-Medium: 100 ml TCM, 2 ml rbo IL-4; 2 ml rbo GM-CSF Desoxycholsäure: 100 mg/ml Ethanol
DNAse-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 50 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT; 50 % Glycerol [v/v]
Elektrophoresepuffer: 0,025 M Tris; 0,192 M Glycin; (pH 8,5)
ELISA-Substrat: 12,5 ml Reinstwasser; 6,075 ml Zitratpuffer; 6,425 ml Phosphatpuffer; 10 mg o-Phenylendiamine- dihydrochlorid; 10 µl 30 %iges H2O
Laemmli-SDS-Probenpuffer: 0,7 mM Tris-HCl; 1 % SDS; 36 % Glycerin; 0,144 M Bromphenolblau; 1,42 M β-Mercaptoethanol
Laufpuffer für SDS-PAGE: 0,025 M Tris; 0,192 M Glycin; 0,1 % SDS (pH 8,5)
LB-Agar: LB-Medium, versetzt mit 15 g Agar/l
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LB-Medium: 1 % Bacto Trypton; 0,5 % Hefeextrakt; 1 % NaCl (pH 7) Lysispuffer: 20 mM NaH2PO4; 0,5 M NaCl; 20 mM Imidazol; kurz
vor Gebrauch 10 mg Lysozym pro ml Pufferlösung zugeben
MACS-Puffer: PBS mit 0,5 % BSA; 2 mM EDTA
2-Mercaptoethanol-Stocklösung: 17,5 µl 2-ME zu 5 ml TCM
NBT-Stocklösung: 50 mg/ml NBT in 70 %igem Dimethylformamid
PBS: 150 mM NaCl; 16 mM Na2HPO4 x 7 H2O; 4 mM NaH2PO4 x 2 H2O
PBS-BSA: PBS mit 1 % BSA
PBS-Tween: PBS mit 0,05 % Tween®20
Phosphatpuffer: 0,2 M Na2HPO4
Säulenpuffer A: 20 mM NaH2PO4; 500 mM NaCl; 20 mM Imidazol (pH 7,4)
Säulenpuffer B: 20 mM NaH2PO4; 500 mM NaCl; 500 mM Imidazol (pH 7,4)
Säulenpuffer C: 50 mM Tris (pH 8,1); 150 mM NaCl
SDS-Sammelgel, 5 %ig: 2,92 ml Reinstwasser; 0,375 ml 40 %iger Acrylamidmischung (Rotiphorese); 0,38 ml 1,0 M Tris (pH 6,8); 30 µl 10 %iges SDS; 30 µl 10 %iges Ammoniumpersulfat; 4 µl TEMED
SDS-Probenpuffer: 5,4 ml Reinstwasser; 0,5 ml 1,0 M Tris (pH 6,8); 2 ml 10 %iges SDS; 1 ml Glycerol; 0,1 ml Bromphenolblau (aus Stocklösung: 5 mg/100 µl)
SDS-Trenngel, 12 %ig: 4,3 ml Reinstwasser; 3 ml 40 %iger Rotiphorese; 2,5 ml 1,5 M Tris (pH 8,8); 100 µl 10 %iges SDS; 100 µl 10 %iges Ammoniumpersulfat; 4 µl TEMED
Vakzinierungs-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
29 Stopplösung für ELISA: 2,5 M H2SO4
TB-Medium: 1,2 % enzymatisch verdautes Casein; 2,4 % Hefeextrakt;
1,25 % K2HPO4; 0,23 % KH2PO4; (pH 7,2); Zusatz von 4 ml Glycerin pro Liter Medium
TBS: 140 mM NaCl; 10 mM Tris-Base (pH 7,3)
TBS-Tween: TBS mit 0,05 % Tween®20
TCM: RPMI 1640 mit GlutaMAXTM HEPES; 10 % steriles FCS;
100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin; 5 µg/ml Amphotericin B
TSS-Solution: 5 g PEG 6000; 2,5 ml DMSO; 2,5 ml 1 M MgSO4; mit LB-Medium auf 50 ml auffüllen; pH-Wert auf 6,5 mit ca.
10 µl konz. HCl einstellen
Western Blot-Substratlösung: 10 ml AP-Puffer; 66 µl NBT-Stocklösung; 33 µl BCIP- Stocklösung
Zitratpuffer: 0,1 M C6H6O7
3.2 Verwendete Reagenzien, Enzyme, Reaktionskits, Software und Geräte
AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH EUROPE GMBH, Deutschland OD-Messgerät Ultraspec 2000
APPLICHEM GMBH, Deutschland DNase I
BECKMANN COULTER GMBH, Deutschland
Zentrifuge J2-21M/E; Durchflusszytometer Epics XL-MCL
30 BIO-RAD ABD SEROTEC GMBH, Deutschland
Konjugate für ELISA: polyklonaler Schaf-Anti-Rind-IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgA-Antikörper (alle HRP konjugiert); monoklonaler Maus-Anti-Histidin-Tag-IgG1-Antikörper (AP konjugiert); polyklonaler Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (AP konjugiert); Ziege-Anti- Maus-IgG-Antikörper (FITC konjugiert); Ziege-Anti-Maus-IgG2a (FITC konjugiert)
BIO-RAD LABORATORIES GMBH, Deutschland
Mini-Protean II®-System; Quick StartTM Bradford Protein Assay BIOTEK INSTRUMENTS GMBH, Deutschland
PowerWave HT Mikroplatten-Spektralphotometer 340 BIOZOL DIAGNOSTIKA VERTRIEB GMBH, Deutschland Ziege-Anti-Maus-IgG1 (RPE konjugiert)
CANDOR BIOSCIENCE GMBH, Deutschland
Low Cross Buffer® (wurde für alle Anwendungen 1:2 mit Reinstwasser verdünnt) CARL ROTH GMBH + CO. KG, Deutschland
BCIP; NBT; BSA; Roti-Block®; Kanamycin; Ethanol 70 % vergällt; Tween®20; Rotiphorese 40 %
DEVELOPMENTAL STUDIES HYBRIDOMA BANK, UNIVERSITY OF IOWA, DEPARTMENT OF BIOLOGY
Maus-Anti-C.elegans Paramyosin-Antikörper
DOCCHECK MEDICAL SERVICES GMBH, Deutschland Heidelberger Verlängerung 30 cm
LEIBNIZ-INSTITUT DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GMBH, Deutschland
E. coli-K12
31 EPPENDORF AG, Deutschland
Mikrozentrifuge 5415R
FERMENTAS GMBH, Deutschland PageRuler Prestained Protein Ladder
FISHER SCIENTIFIC - GERMANY GMBH, Deutschland
Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder; SuperfrostTMplus slides GE HEALTHCARE BUCHLER GMBH UND CO. KG, Deutschland
ÄKTA FPLC; ÄKTA-Säule: HisTrapTMHP; HiLoadTM 16/60; HiPrepTM 26/10 GERBU BIOTECHNIK GMBH, Deutschland
Adjuvans Quil ATM
GREINER BIO-ONE GMBH, Deutschland
Leucosep-Röhrchen mit Trennscheibe; 96-Well-Platten mit U-Boden, steril HARTMANN ANALYTIC GMBH, Deutschland
[methyl-H3] Thymidin, 37MBq (1mCi)/ml
HELMHOLTZ ZENTRUM MÜNCHEN, Deutschland
Monoklonaler Ratte-Anti-Rind-IgE-Antikörper Klon 5A2 (hergestellt vom Kooperationspartner Dr. E. Kremmer)
HOLTON, Deutschland
Sterilbank MSC II 48 Seriennummer 040788
IBM SPSS SOFTWARE SOLUTIONS, Deutschland Software SPSS Statistics (Version 15.0)
ISCONOVA AB, Schweden Adjuvans Matrix-QTM
32 JACKSONIMMUNORESEARCH INC., USA Anti-Ratte-IgG-Antikörper (HRP-konjugiert) LABO-MED-GMBH, Deutschland
BD Vacutainer Blutröhrchen mit 170 IU Na-Heparin
LEICA MIKROSYSTEME VERTRIEB GMBH, Deutschland
Jung Tissue Freezing Medium; Gefriermikrotom JungFrigocut 2800 E LIFE TECHNOLOGIES GMBH, Deutschland
RPMI 1640+Hepes/GlutamaxTM; Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS; Pichia Pink Expression SystemTM inklusive PAD-Agar, BMGY-Medium und BMMY-Medium;
One Shot® BL21 Star™ (DE3) Chemically Competent E. coli
MACHEREY&NAGEL GMBH & CO. KG, Deutschland Porablot NCL Nitrocellulosemembran
MILTENYI BIOTEC GMBH, Deutschland
CD 14 MicroBeads, human; Anti-Maus IgG MicroBeads; LS Columns; MACS MultiStand;
QuadroMACSTM Separator
NIKON CORPORATION, Deutschland
Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti; COOLPIX L810 Kamera NONLINEAR DYNAMICS LTD., UK
TotalLab TL Analysis Software
OLYMPUS SOFT IMAGING SOLUTIONS GMBH, Deutschland CellB Basic imaging software (version 3.1)
OMNILAB-LABORZENTRUM GMBH & CO. KG, Deutschland 6-Well-Platten, steril
33 PAA LABORATORIES GMBH, Deutschland
FCS; Penicillin/Streptomycin100 IU; Amphotericin B PAUL MARIENFELD GMBH & CO. KG, Deutschland Neubauer Zählkammer
PEQLAB BIOTECHNOLOGIES GMBH, Deutschland Blotkammer PerfectBlueTM SedecTM
PROFILAB24 GMBH, Deutschland GFL Schüttelinkubator 3033
PROMEGA CORPORATION, Deutschland
MagneHis™ Protein Purification System; Gel Drying Film®
ROYAL VETERINARY COLLEGE, United Kingdom
Rekombinantes bovines GM-CSF, rekombinantes bovines IL-4, Maus anti-Rind CD4 Antikörper [CC8, IgG2a], Maus anti-MHC-II Antikörper [IgG2a], Maus anti-Rind CD86 [IgG1]
(hergestellt vom Kooperationspartner Prof. Dr. D. Werling) SANYO ELECTRIC CO. LTD., Deutschland
CO2-Inkubator MCO-20AIC
SARSTEDT AG & CO., Deutschland
Zellschaber; 0,45 µm Filter Filtropur S; Rotator M2000 SIGMA ALDRICH CORPORATION, Deutschland Histopaque 1083; Concanavalin A
SYSTAT SOFTWARE GMBH, Deutschland SigmaStat 3.1
VWR INTERNATIONAL GMBH, Deutschland Nunc® Immobilizer™ Amino Plates
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Die 0,5 ml, 1,5 ml und 2 ml Safe-Lock Reaktionsgefäße sowie die 1 ml, 50 ml und 120 ml Gefäße und die genutzten Pipettenspitzen stammten von den Firmen EPPENDORF, BIOZYM SCIENTIFIC, CARL ROTH und SARSTEDT. Alle genutzten Pipetten stammten von den Firmen EPPENDORF und BIOHIT/SARTORIUS und wurden regelmäßig (mindestens einmal pro Jahr) geeicht.
3.3 Proteinherstellung
Die in E.coli exprimierten rekombinanten Proteine MSP, PDI und NMT des bovinen Lungenwurmes sowie GST, welches auf der Sequenz des Trematoden Schistosoma mansoni beruhte und als sog. „GST-Tag“ bei der Expression mit den genannten Zielproteinen des Lungenwurms fusioniert wurde, lagen bereits zu Beginn der Arbeit in einer Konzentration von 100 µg/ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) im Institut für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vor. Aufgrund der Fusionierung der Proteine MSP, PDI und NMT mit einem GST-Tag wurde GST bei den Immunzellassays als Kontrolle eingesetzt um zu beurteilen, welchen Einfluss die Lungenwurmproteine an sich auf die Immunzellen aufweisen.
Die rekombinanten P. pastoris-exprimierten bovinen Lungenwurmproteine CPL, CPB-1, CPB- 2, CPB-3, LEG-1 und LEG-2 lagen ebenfalls zu Beginn der Arbeit in einer Konzentration von 100 µg/ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) im Institut für Parasitologie vor.
Die transformierten Hefezellen, welche das Protein PpPMY exprimieren, lagen zu Beginn der Arbeit in Form von weißen, ca. 0,5 mm großen Kolonien auf PAD-Agarplatten vor.
3.3.1 Rekombinante Proteinexpression von PMY des bovinen Lungenwurmes im Bakterium E. coli (EcPMY)
Zur ersten Anzucht wurden 50 µl BL21 Star Zellen (LIFE TECHNOLOGIES) in 10 ml LB- Medium im Schüttelinkubator (PROFILAB24) bei 37 °C und 200 rpm angezüchtet, bis die OD600 einen Wert von 0,3 betrug. Anschließend wurden die Zellen in 2 ml Reaktionsgefäße aliquotiert und bei 250 g für 10 Minuten zentrifugiert (Zentrifuge J2-21M/E). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen mit 100 µl eiskaltem TSS vorsichtig resuspendiert und auf Eis gestellt, bevor 1 µl Plasmid-Lösung (100 ng/µl) zu den Zellen gegeben und vorsichtig
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gemischt wurde. Diese Plasmid-Lösung beinhaltete den Expressionsvektor pET41a, in den die PMY-Sequenz ligiert wurde. Die nun folgenden Arbeitsschritte umfassten die Inkubation für 10 Minuten auf Eis, anschließend für 10 Minuten bei RT und danach wieder für 10 Minuten auf Eis. Nach Zugabe von 900 µl LB-Medium (ohne Antibiotika-Zusatz) zu jedem Gefäß und einstündiger Inkubation bei 37 °C und 200 rpm im Schüttelinkubator, wurden jeweils 3 ml der transformierten Zellen zu 250 ml LB-Medium, das 50 µg/ml Kanamycin (CARL ROTH) enthielt, pipettiert. Die anschließende Inkubation bei 37 °C erfolgte über Nacht bei 200 rpm im Schüttelinkubator.
Am nächsten Tag wurde TB-Medium (ROTH) mit Kanamycin versetzt (pro Liter Medium 500 µl Kanamycin, Endkonzentration im Medium 50 µg/ml) und 250 ml des Mediums in 500 ml Erlenmeyerkolben überführt. Die Kolben wurden daraufhin mit den Zellen vom Vortag so beimpft, dass eine OD600 von ungefähr 0,150 erreicht wurde. Durch regelmäßige OD- Messung wurden die Zellen bei einer OD600 von ca. 0,600 mit 1 mM IPTG induziert und anschließend über Nacht bei 37 °C und 200 rpm im Schüttelinkubator geschüttelt.
Am folgenden Tag wurden die Zellen in 50 ml Gefäßen bei 5000 g für 10 Minuten zentrifugiert und, falls die pelletierten Zellen nicht sofort einer Lyse unterzogen wurden, bei - 80 °C gelagert.
3.3.2 Rekombinante Proteinexpression von PMY des bovinen Lungenwurmes in der Hefe P. pastoris (PpPMY)
Das rekombinante Protein PpPMY wurde in der Hefe P. pastoris exprimiert. Dazu wurde das Expressionssystem Pichia Pink Expression SystemTM (LIFE TECHNOLOGIES) gemäß den Herstellerangaben verwendet. Die erfolgreich transformierten Hefezellen lagen als weiße Kolonien auf PAD-Agarplatten vor.
3.3.3 „Small-scale“ Expression
Für diese Expression wurde eine weiße Einzelkolonie mit einer sterilen Pipettenspitze von der PAD-Platte gepickt und in 10 ml BMGY-Medium (PichiaPink Media Kit, LIFE TECHNOLOGIES), das sich in einem 100 ml Schikane-Kolben befand, für 2 Tage bei 27 °C im Schüttelinkubator (200 rpm; PROFILAB24) kultiviert. Die Kultur wurde anschließend in
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50 ml-Gefäßen bei 1500 g zentrifugiert und der entstandene Überstand verworfen. Danach wurde 5 ml BMMY-Medium (PichiaPink Media Kit, LIFE TECHNOLOGIES), das mit 0,5 % Methanol zur Induktion der Expression versetzt war, zum Pellet gegeben, bevor eine erneute Kultivierung bei 27 °C im Schüttelinkubator über Nacht erfolgte. Das Protein wurde dabei in das Kulturmedium sezerniert, was durch eine in Kap. 3.4.2 beschriebene Expressionskontrolle überprüft wurde. Das im Medium gelöste Protein wurde anschließend entweder weiter aufgereinigt oder bei - 80 °C eingefroren.
3.4 Reinigung der rekombinanten PMY-Proteine
3.4.1 Lyse der TSS-tranformierten E. coli-Zellen
Um die Zellen aufzuschließen, wurde das Pellet aus 250 ml Kulturmedium in 5 ml Lysispuffer resuspendiert. Der anschließenden Zugabe von 125 µl DNase (APPLICHEM; 2 mg/ml gelöst in Dnase-Puffer) pro 5 ml Lysispuffer folgte das Schwenken auf Eis für 40 Minuten. Danach wurde 200 µl Desoxycholsäure (100 mg/ml) pro 5 ml Lysispuffer ergänzt, bevor nochmals 125 µl DNase pro 5 ml Lysispuffer dazugegeben wurde und die zähe Suspension bei 37 °C im Inkubator schüttelte (200 rpm), bis sie wieder flüssig war. Die lysierte Suspension wurde bei 5000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Protein befand sich nun im Überstand. Anschließend folgte entweder eine Expressionskontrolle sowie die Reinigung des Proteins wie in Kap. 3.4.2-3.4.5 beschrieben oder der Überstand wurde bei - 80 °C eingefroren.
3.4.2 Expressionskontrolle von rPMY mittels magnetischer Partikel
Um die Kulturüberstände nach der Small-Scale Expression und nach Lyse der TSS- transformierten Zellen auf das Vorhandensein rekombinanter Proteine zu testen, wurde eine Testreinigung mit dem MagneHis™ Protein Purification System (PROMEGA) vorgenommen.
Dazu wurden je 30 µl magnetischer Beads (MagneHis™ Ni-Particles) insgesamt zweimal mit 500 µl Waschpuffer gewaschen und anschließend zu 200 µl des Überstandes in ein Gefäß (1,5 ml) gegeben und gut gemischt. Die folgende Inkubation dauerte 45-60 Minuten bei 20 rpm im Rotator (SARSTEDT). Die His-Bindungsstellen der Proteine (His-Tag) heften sich dabei an die Nickel-Chelate der magnetischen Beads. Danach wurde der Komplex durch Zugabe von
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1000 µl Waschpuffer (MagneHis™ Binding/Wash Buffer; PROMEGA) gewaschen. Durch anschließendes Anhalten eines Magneten konnten die Beads von der Waschlösung getrennt werden. Um schließlich die Beads wieder von den Proteinen zu trennen, wurden 100 µl des Elutionspuffers (MagneHis™ Elution Buffer; PROMEGA) zugegeben und die Suspension gemischt. Durch erneutes Anhalten eines Magneten an das Gefäß konnte der Elutionspuffer, der nun die His-getaggten Proteine enthielt, in ein frisches 1,5 ml Gefäß überführt werden. Die danach durchgeführte SDS-PAGE diente der Visualisierung der Proteine und ist in Kapitel 3.5.1 beschrieben.
3.4.3 Reinigung von rPMY mittels Affinitäts-Chromatographie
Die für die Zellassays und Vakzineversuche eingesetzten Proteine PpPMY und EcPMY wurden nach der Expression mit Hilfe der Affinitätschromatographie (ÄKTA FPLC, GE HEALTHCARE) gereinigt. Dazu wurden die Säulen mit 12,5 Säulenvolumen (SV) Säulenpuffer A äquilibriert und anschließend der steril filtrierte (0,45 µm; SARSTEDT) Überstand über zwei HisTrapTM HP 1 ml Säulen (GE HEALTHCARE) mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min aufgetragen. Die Säulen dienten der Bindung des His- Tag und somit der Isolierung der Proteine aus dem Kulturüberstand. Anschließend wurden die Säulen mit 12 SV Säulenpuffer A gewaschen und danach das Protein mit 5 SV Säulenpuffer B von der Säule eluiert und als 500 µl Fraktionen in 1,5 ml Gefäßen aufgefangen. Anschließend wurden die Proteine bei - 80 °C bis zur Reinigung mittels Größenausschluss-Chromatographie (im Falle von EcPMY) bzw. Entsalzen und Umpuffern gelagert.
3.4.4 Reinigung mittels Größenausschluss-Chromatographie (Gelfiltration)
Um die Menge des nicht an EcPMY fusionierten GST in der Proteinsuspension zu reduzieren, wurde EcPMY nach der Affinitäts-Chromatographie zusätzlich mittels Größenausschluss- Chromatographiesäule [HiLoadTM 16/60, GE HEALTHCARE; Puffer: 50 mM Tris-HCl (pH 8,1); 150 mM NaCl] gereinigt. Dazu wurde das Protein auf die mit Säulenpuffer C äquilibrierte HiLoadTM 16/60 Säule mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,3 ml/min aufgetragen und der Größe nach separiert. Fraktionen von je 3 ml wurden in 15 ml Gefäßen gesammelt. Die PMY-haltigen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot identifiziert und bis zum Umpuffern und Entsalzen bei - 80 °C gelagert.
38 3.4.5 Entsalzen und Umpuffern der Proteine
Zum Pufferaustausch in den Vakzinepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4) wurden Entsalzungssäulen (HiPrepTM 26/10 GE HEALTHCARE) eingesetzt. Die Proteine wurden auf die mit Vakzinepuffer äquilibrierte Entsalzungssäulen (maximales Auftragsvolumen: 15 ml) aufgetragen und bei einer Flussgeschwindigkeit von 12 ml/min mit dem Vakzinepuffer wieder von der Säule eluiert. Während des ganzen Laufes wurde das Säuleneluat als 1 ml Fraktionen mit Hilfe eines Kollektors gesammelt. Anschließend wurde die Säule mit 5 SV Vakzinepuffer gewaschen und bis zur nächsten Nutzung in 20 %igem Ethanol gelagert. Die PMY-haltigen Fraktionen wurden wieder mittels SDS-PAGE identifiziert, die entsprechenden Fraktionen daraufhin gepoolt und die Proteinkonzentration mit Hilfe eines Bradford-Tests (BIO-RAD) bestimmt. Die Proteine wurden bis zur Testung in den Immunzellassays oder den Vakzineversuchen aliquotiert und bei - 80 °C gelagert.
3.5 Darstellung der Proteine
3.5.1 SDS-PAGE
Um die erfolgreiche Expression der rekombinanten Proteine zu überprüfen, wurden 500 µl der Kultur abgenommen und für 5 Minuten bei 1500 g zentrifugiert (Mikrozentrifuge 5415R;
EPPENDORF). Davon wurden 20 µl des Überstandes mit 20 µl SDS-Probenpuffer und 4 µl 1 M DTT vermischt und anschließend bei 99 °C für 5 Minuten erhitzt, was eine negative Ladung aller Proteine und die Auftrennung von Disulfid-Bindungen zur Folge hatte. Zur Auftrennung der rekombinanten Proteine wurde ein 10 %iges 0,75 mm dickes SDS- Polyacrylamidgel (Trenngel) verwendet, welches nach Polymerisierung mit einem 5 %igem SDS-Polyacrylamidgel (Sammelgel) überschichtet wurde. Nachdem das Sammelgel ausgehärtet war, wurde je ca. 20 µl des Probengemisches in die einzelnen Taschen geladen. Als Größenstandard dienten pro Gel 10 µl des Markers Spektra Multicolor Broad Range Protein Ladder (THERMO SCIENTIFIC) bzw. Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS). Das Mini-Protean II®-System (BIO-RAD) erzeugte eine Spannung von 150 V, welche für ca. 45 Minuten aufrechterhalten wurde und die Auftrennung der Proteine anhand ihrer Größe gewährleistete.
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3.5.2 Färbung der Proteine mittels Coomassie Blue
Nach der SDS-PAGE wurden die Polyacrylamidgele für ca. eine Stunde in einer Coomassie Fixier- und Färbelösung geschwenkt. Anschließend wurde die Coomassie-Lösung abgegossen und alle nicht an Proteine gebundenen Farbkomplexe mit 10 %iger Essigsäure entfernt. Die Färbe- bzw. Entfärbeschritte wurden in Schalen mit einem Deckel durchgeführt, um ein Verflüchtigen der Substanzen zu vermeiden. Um die Gele anschließend zu trocknen, wurden sie zunächst für eine Nacht in Reinstwasser geschwenkt und anschließend zwischen 2 Lagen Gel Drying Film® (PROMEGA) zum Trocknen eingespannt.
3.5.3 Western Blot
Die Übertragung der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (MACHEREY&NAGEL) wurde im horizontalen Semi-Dry-Verfahren in einer Blotkammer (PEQLAB) durchgeführt.
Dazu wurde die Nitrocellulosemembran auf Gelgröße zurechtgeschnitten, in Blotpuffer getränkt und anschließend zusammen mit dem SDS-Gel zwischen mehrere Lagen in Blotpuffer getränkte Blotting-Papiere (MACHEREY&NAGEL) gelegt. Durch Anlegen einer Stromstärke von 100 mA über mindestens eine Stunde wurden die Proteine auf die Membran transferiert.
Danach schwenkte die Membran während mehrerer Wasch- und Bindungsschritte die im Folgenden näher erläutert werden auf einem Blotschüttler (LABORTECHNIK FROEBEL):
Zunächst ist die Membran für 5 Minuten mit 1x TBS gewaschen worden, bevor eine mindestens einstündige Inkubation in 1:10 verdünntem Roti-Block® (CARL ROTH) erfolgte, um unspezifische Bindungsstellen zu eliminieren. Nach folgendem dreimaligem Waschen für 5 Minuten mit TBS-Tween wurde der erste Antikörper dazu gegeben. Für rPMY wurde dazu ein Maus-anti-C. elegans PMY-Antikörper (Antikörperbezeichnung: 5-23, DEVELOPMENTAL STUDIES HYBRIDOMA BANK; Verdünnung 1:5000 in TBS-Tween) genutzt. Nach erneutem dreimaligem Waschen für jeweils 5 Minuten in TBS-Tween wurde der Sekundärantikörper hinzugefügt. Hierbei handelte es sich um einen mit Alkalischer Phosphatase-konjugierten anti-Maus IgG-Antikörper (BIO-RAD ABD SEROTEC) in einer Verdünnung von 1:10000 in TBS-Tween. Anschließend wurde die Membran erneut für je 5 Minuten einmal mit TBS-Tween und zweimal mit TBS gewaschen, bevor die Substratlösung hinzugefügt und innerhalb von 10 Minuten Banden durch Bildung eines blauen, unlöslichen Farbkomplexes auf der Membran sichtbar wurden. Zum Stoppen der Farbreaktion wurde die
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Substratlösung abgegossen und die Schale mit Reinstwasser aufgefüllt. Das folgende Trocknen der Membran fand zwischen zwei Lagen Filterpapier statt.
3.6 Quantifizierung der Proteine
Die Quantifizierung der oben genannten Fusionsproteine wurde mit Hilfe des Bradford-Tests (BIO-RAD) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Als Standardreihe diente bovines Gammaglobulin in einer Verdünnungsreihe von 2000 µg/ml bis 125 µg/ml, welches im Kit mitgeliefert wurde. Sämtliche Reaktionen wurden als Doppelansätze geführt. Die Bestimmung der optischen Dichte (OD) erfolgte bei einer Wellenlänge von 595 nm in einem Photometer (BIOTEK). Die Mittelwerte der Duplikate der Verdünnungsreihe dienten zur Anfertigung einer Standardkurve, anhand derer die finale Konzentration der rekombinanten Proteine abgelesen werden konnte.
Da die Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gele aber zeigten, dass im Impfprotein PpPMY noch P. pastoris-Proteine enthalten waren (ersichtlich z.B. in Abb. 7), wurde für PpPMY zusätzlich ein densitometrischer Test durchgeführt. Dazu wurden die SDS-PAGE-Gele eingescannt (CANO SCAN LIDE 700F) und mit der Software TOTALLAB TL100 (NONLINEAR DYNAMICS) analysiert. Dabei wurde die Standardeinstellung zur 1 D Gel-Analyse benutzt.
Die zu untersuchenden Banden wurden manuell markiert und die restlichen Banden als Hintergrund mit der Einstellung „Minimum Profile“ subtrahiert. Zur Detektion der Banden wurden folgende Einstellungen genutzt: Minimum Slope: 100; Noise Reduction: 5; % Max.
Peak: 5. Anschließend wurden die Werte der einzelnen Banden summiert und zur Gesamtmenge des Proteins ins prozentuale Verhältnis gesetzt. Die daraus resultierende PMY- Menge in Prozent diente als Grundlage zur Berechnung der PMY-Menge im Bradford Test, welcher die Gesamtproteinmenge misst und keine Unterscheidung einzelner Proteine erlaubt.
Ergab sich beispielsweise bei der Software-basierten Messung der verschiedenen Banden ein prozentualer Anteil von 80 % an PMY, so wurde für die Berechnung der erforderlichen Impfdosis mittels Bradford Test der gemessene Gesamtproteingehalt um 20 % nach unten korrigiert.
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3.7 Evaluierung rekombinanter Vakzinekandidaten in vitro
3.7.1 Tierhaltung der Versuchstiere für die Immunzellassays
Die Blutentnahmen bei Rindern zur Gewinnung und anschließender Isolation von bestimmten Immunzellpopulationen aus dem Vollblut wurden vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit unter der Referenznummer: AZ33.9-42502-04- 11/0494 genehmigt. Die zu beprobenden Holstein-Frisian-Rinder wurden entweder in den Stallungen des Institutes für Parasitologie oder auf dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gehalten. Die jeweilige Anzahl der für die Immunzellassays beprobten Tiere ist in Tabelle 1 aufgeführt.
