Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid Isomerase (PDI) zur Immunisierung gegen
Dictyocaulus viviparus
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sonja Wolken
aus Sande
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. T. Schnieder
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. T. Schnieder 2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. L. Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 16. November 2006
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Sonja Wolken, Georg von Samson-Himmelstjerna, Thomas Schnieder (2005):
„Herstellung eines rekombinanten Vakzinekandidaten für Dictyocaulus viviparus“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Erkrankungen“
Potsdam, 22. – 24.06.2005
Sonja Wolken, Georg von Samson-Himmelstjerna, Thomas Schnieder (2006):
„Characterisation of Dictyocaulus viviparus protein disulfid isomerase and testing of its immunological potential”
22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Parasitologie (DGP) Wien, 22. – 25.02.2006
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...11
2 Literaturübersicht...13
2.1 Die Dictyocaulose des Rindes...13
2.1.1 Der Erreger ... 13
2.1.2 Entwicklungszyklus und Pathogenese ... 14
2.1.3 Epidemiologie und wirtschaftliche Bedeutung ... 17
2.1.4 Immunität ... 20
2.1.5 Diagnose... 23
2.1.6 Bekämpfung ... 26
2.1.6.1 Weidetechnische Maßnahmen... 27
2.1.6.2 Anthelminthika ... 27
2.1.6.3 Vakzinierung ... 28
2.1.6.4 Biologische Bekämpfung... 30
2.2 Antigene und Immunisierungsversuche bei D. viviparus...30
2.3 Die Protein Disulfid Isomerase (PDI)...36
2.3.1 Struktur der PDI und PDI-ähnlicher Enzyme... 37
2.3.2 Funktionen der PDI ... 41
2.3.2.1 Redox-Isomerase-Funktion der PDI... 41
2.3.2.2 Die PDI als Untereinheit der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase ... 42
2.3.2.3 Chaperon-Funktion und Anti-Chaperon-Funktion der PDI ... 43
2.3.2.4 Die PDI als Untereinheit des mikrosomalen ... Triglycerid-Transfer-Proteins (MTP)... 45
2.3.2.5 Funktionen des ERp57 ... 45
2.3.2.6 Weitere Funktionen der PDI... 46
2.3.3 Lokalisation der PDI außerhalb des ER ... 46
2.3.4 PDIs bei Helminthen ... 47
3 Material und Methoden...54
3.1 Materialien...54
3.1.1 Puffer und Lösungen... 54
3.1.2 Medien und Platten ... 56
3.1.3 Bakterien und Vektoren... 56
3.1.4 Reagenzien, Reaktionskits und Geräte... 57
3.1.5 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien... 60
3.2 Gewinnung und Aufbereitung des parasitologischen Probenmaterials ...61
3.2.1 Isolierung von Lungenwurmlarven aus dem Kot ... 61
3.2.2 Isolierung von adulten Lungenwürmern aus der Lunge ... 62
3.2.3 Herstellung von D. viviparus Rohantigen ... 62
3.3 Molekularbiologische Methoden ...63
3.3.1 mRNA Isolierung ... 63
3.3.2 Isolierung genomischer DNA... 64
3.3.3 cDNA-Synthese... 64
3.3.3.1 cDNA-Synthese für die konventionelle PCR ... 64
3.3.3.2 cDNA-Synthese für die RACE-PCR... 65
3.3.4 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ... 66
3.3.4.1 Allgemeines zur Methode... 66
3.3.4.2 PCR zur Erstamplifikation der PDI von D. viviparus... 67
3.3.4.3 Rapid amplification of cDNA ends (RACE PCR)... 69
3.3.4.4 PCR zur Selektion von Kolonien ... 70
3.3.4.5 PCR zur Ermittlung der genomischen Sequenz... 71
3.3.4.6 PCR zur Klonierung des ORF (open reading frame) der PDI... 72
3.3.5 Darstellung von Nucleinsäuren mittels Agarosegelelektrophorese ... 73
3.3.6 Isolierung von PCR-Amplifikaten aus Agarosegelen... 74
3.3.7 Klonierung von PCR-Amplifikaten ... 74
3.3.7.1 Klonierung in pCR®4-TOPO® ... 74
3.3.7.2 Klonierung in pGEX4T-3 ... 75
3.3.8 Transformation kompetenter Zellen ... 76
3.3.8.1 E. coli TOP 10... 76
3.3.8.2 E. coli BL 21 (DE3) ... 77
3.3.8.3 E. coli BL 21-Codon Plus® ... 77
3.3.9 Plasmidpräparation ... 78
3.3.9.1 Miniprep ... 78
3.3.9.2 Midiprep ... 79
3.3.10 Restriktionsenzymverdau... 79
3.3.10.1 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) ... 79
3.3.10.2 Darstellung des Inserts ... 80
3.3.11 Sequenzierung und Sequenzbearbeitung ... 80
3.4 Proteinbiochemische Methoden ...81
3.4.1 Proteinexpression ... 81
3.4.2 Gewinnung des Zelllysats ... 82
3.4.2.1 Zelllyse mittels MagneGST™ Protein Purification System... Lysispuffer (PROMEGA) ... 82
3.4.2.2 Zelllyse mittels Lysisprotokoll nach SAMBROCK (1989) ... 82
3.4.2.3 Zelllyse mittels Lysispuffer und Ultraschall... 82
3.4.3 Proteinaufreinigung ... 83
3.4.3.1 Magne GST™ Protein Purification System ... 83
3.4.3.2 Glutathione Sepharose™ High Performance ... 84
3.4.3.3 FPLC mit GSTrap™ HP Affinitätssäulen... 85
3.4.4 Proteinproduktion für die Immunisierungen... 86
3.4.5 Darstellung von Proteinen... 87
3.4.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 87
3.4.5.2 Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung von Proteinen ... 88
3.4.5.3 Transfer Blot ... 88
3.4.5.4 Western-Blot ... 89
3.4.6 Bestimmung der Proteinkonzentration ... 90
3.4.6.1 Bradford ... 90
3.4.6.2 Agilent 2100 Bioanalyzer ... 91
3.4.7 Aufkonzentrieren der Proteinlösung ... 92
3.4.8 Identifizierung der PDI mittels MALDI-TOF-MS... 92
3.5 Tierexperimentelle Untersuchungen...92
3.5.1 Versuchsplan ... 92
3.5.2 Genehmigung... 94
3.5.3 Tiermaterial ... 95
3.5.4 Tierhaltung ... 95
3.5.5 Verwendete Adjuvantien und Zubereitung des Impfstoffs ... 95
3.5.6 Applikation des Impfstoffs ... 96
3.5.7 Experimentelle Infektion... 96
3.5.8 Überwachung der Tiergesundheit ... 96
3.5.9 Medikamentöse Behandlung erkrankter Tiere ... 97
3.5.10 Gewinnung von Probenmaterial und dessen Aufbereitung ... 97
3.5.10.1 Blutproben... 97
3.5.10.2 Kotproben ... 98
3.5.11 Sektion ... 98
3.5.12 Größenbestimmung der adulten Stadien ... 98
3.6 Serologische Untersuchungen ...99
3.6.1 Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) ... 99
3.6.2 Überprüfung der Serokonversion mittels Western-Blot ... 101
3.7 Quantitative real-time PCR (QRT-PCR) ...101
3.7.1 Allgemeines zur Methode... 101
3.7.2 Konstruktion der Primer und Sonden ... 104
3.7.3 Gesamt-RNA Isolierung ... 104
3.7.4 DNAse-Verdau der Gesamt-RNA... 105
3.7.5 cDNA-Synthese für die quantitative real-time PCR ... 105
3.7.6 Absolute Quantifizierung ... 106
3.7.7 Relative Quantifizierung ... 107
3.7.8 Durchführung der QRT-PCR ... 107
4 Ergebnisse...109
4.1 Molekularbiologische Ergebnisse ...109
4.1.1 Amplifikation der Protein Disulfid Isomerase von D. viviparus... 109
4.1.2 Vergleich positiver Klone mittels RFLP ... 110
4.1.3 RACE-PCR ... 110
4.1.4 Identitätsvergleiche der PDI1 und PDI2 von D. viviparus mit PDIs ... anderer Spezies ... 112
4.1.5 Identifizierung konservierter Domänen... 115
4.1.6 Ermittlung der genomischen Sequenz der PDI2 von D. viviparus... 116
4.2 Proteinbiochemische Ergebnisse ...120
4.2.1 Optimierung der Proteinaufreinigung ... 120
4.2.1.1 Proteinexpression ... 121
4.2.1.2 Vergleich unterschiedlicher Lysebedingungen... 122
4.2.1.3 Unterschiedliche Aufreinigungbedingungen im Magne ... GST™-Protokoll und mittels Sepharose™-Medium... 123
4.2.1.4 Aufreinigung mittels FPLC ... 123
4.2.2 Proteinproduktion für die Immunisierungen... 124
4.2.3 Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Analyse ... 127
4.3 Tierexperimentelle Ergebnisse ...128
4.3.1 Tiergesundheit ... 128
4.3.1.1 Allgemeinuntersuchung... 128
4.3.1.2 Gewichtsentwicklung ... 131
4.3.1.3 Lokale Impfreaktionen... 132
4.3.1.4 Behandlung erkrankter Tiere... 134
4.3.1.5 Differentialblutbild ... 134
4.3.2 Larvenausscheidung ... 135
4.3.3 makroskopische Beurteilung der Lungen ... 137
4.3.4 Bestimmung der Anzahl adulter D. viviparus... 139
4.3.5 Bestimmung der Wurmgröße ... 141
4.4 Ergebnisse der serologischen Untersuchungen...142
4.4.1 ELISA... 142
4.4.2 Überprüfung der Serokonversion mittels Westernblot... 144
4.5 Ergebnisse der quantitativen real-time PCR ...147
4.5.1 Absolute Quantifizierung ... 147
4.5.2 Relative Quantifizierung ... 147
5 Diskussion ...150
5.1 Identifizierung der PDI von D. viviparus...150
5.2 Expression und Aufreinigung der rekombinanten PDI...152
5.3 Durchführung der Immunisierungsversuche...157
5.3.1 Wahl des Tiermaterials ... 157
5.3.2 Immunisierung und experimentelle Infektion... 158
5.4 Ergebnisse der Immunisierungsversuche ...159
5.4.1 Befunde der täglichen Beobachtung und klinischen Untersuchung .. 159
5.4.2 Etablierung der Infektion in den Kontrollgruppen ... 160
5.4.3 Larvenausscheidung und Wurmbürden ... 161
5.4.4 Ergebnisse der serologischen Untersuchungen... 164
5.4.5 Quantitative real-time PCR... 166
5.5 Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick ...168
6 Zusammenfassung ...170
7 Summary ...172
8 Literaturverzeichnis ...174
9 Anhang ...199
9.1 Vollständige cDNA-Sequenz und abgeleitete ... Aminosäurensequenz der PDI1 von D. viviparus...199
9.2 Vollständige cDNA-Sequenz und Aminosäurensequenz... der PDI2 von D. viviparus...200
9.3 Eosinophile Granulozyten ...203
9.4 Larvenausscheidung im I. u. II. Immunisierungsversuch...204
9.5 Längen und Breiten der adulten Würmer ...205
9.6 Indices für verschiedene Serumantikörpertiter ...206
9.7 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ...208
9.8 Symbole der Aminosäuren ...211
9.9 Abbildungsverzeichnis...212
9.10 Tabellenverzeichnis...213
Einleitung 11
1 Einleitung
Parasitosen stellen weltweit die häufigsten und verlustreichsten Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier dar. Zu dieser Situation trägt wesentlich die Tatsache bei, dass sich die Möglichkeiten zur Bekämpfung parasitärer Erkrankungen fast ausschließlich auf den Einsatz von Anthelminthika beschränken. Der intensive Einsatz chemotherapeutischer Substanzen birgt jedoch das ständige Risiko einer Resistenzentwicklung bei den Erregern. Aus vielen Ländern existieren bereits Berichte über das Vorliegen von Resistenzen bei veterinärmedizinisch relevanten Parasiten, wobei sich diese zum Teil gegen alle verfügbaren Substanzklassen richten.
Aus diesen Gründen beschäftigen sich weltweit Forschergruppen mit der Entwicklung von Vakzinen gegen Parasiten, wobei im Vergleich zu viralen und bakteriellen Erregern bislang erst wenige Erfolge erzielt wurden. Gründe hierfür sind unter anderem die komplexe Struktur und hohe genetische Organisation der Parasiten.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit einem Vakzinekandidaten gegen Dictyocaulus viviparus, dem großen Lungenwurm des Rindes. Die von D. viviparus verursachte parasitäre Bronchitis ist eine der wichtigsten und verlustreichsten Weideparasitosen in gemäßigten Klimazonen, wobei Rinder im ersten Weidejahr besonders gefährdet sind. Eine in den 1950er Jahren entwickelte Lebendvakzine kann für einige Monate eine belastbare Immunität induzieren, die jedoch durch erneute Infektion aufgefrischt werden muss.
Lebendvakzinen haben den Nachteil, dass ihre Produktion sehr aufwendig und teuer ist und die Handhabung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit und Notwendigkeit zur kühlen Lagerung eingeschränkt ist. Die aktuelle Vakzineentwicklung hat daher zum Ziel, Impfstoffe in rekombinanter Form herzustellen. Hierdurch ist die Produktion unabhängig von der Kultivierung des Erregers und die rekombinanten Antigene können in großem Umfang bei gleichbleibender Reinheit und Qualität hergestellt werden. Gegenstand dieser Arbeit ist die Protein Disulfid Isomerase (PDI). Dieses Enzym wurde bereits bei verschiedenen Helminthen beschrieben und stellt durch
12 Einleitung
seine vielfältigen Funktionen und nachgewiesene Immunogenität einen potentiellen Vakzinekandidaten dar. Unter anderem wird der PDI eine essentielle Bedeutung bei der Kutikula-Synthese der Nematoden zugesprochen. Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung und Charakterisierung der PDI bei D. viviparus. Weiterhin erfolgt in Immunisierungsversuchen eine Überprüfung der Immunogenität und Protektivität des Enzyms.
Literaturübersicht 13
2 Literaturübersicht
2.1 Die Dictyocaulose des Rindes
2.1.1 Der Erreger
Bereits 1727 wurde von RUYSCH über das Vorkommen von Lungenwürmern beim Rind berichtet. Die Erstbeschreibung erfolgte im Jahre 1782 durch BLOCH, der diesem Parasiten den Namen Gordius viviparus gab. Seinen endgültigen Namen Dictyocaulus viviparus erhielt der Rinderlungenwurm 1907 durch RAILLIET und HENRY.
Dictyocaulus viviparus, der große Lungenwurm des Rindes, gehört taxonomisch der Ordnung Rhabditida und der Familie der Trichostrongylidae an. Die geschlechtsreifen Stadien leben in den Bronchioli, Bronchien und der Trachea und verursachen eine parasitäre Bronchitis. Bis heute beinhaltet die Gattung Dictyocaulus sieben Arten, die zum Teil mehrere Wirtstierspezies befallen. Hierbei zeigen die Parasiten eine unterschiedliche Anpassung an ihre Wirte, was sich unter anderem in der Ausbildung einer patenten Infektion äußert. Rinder sind für D.
viviparus empfänglicher als Wildwiederkäuer (BIENIOSCHEK 1994). D. arnfieldi parasitiert in Equiden. Esel sind häufiger befallen als Pferde, zeigen jedoch seltener Symptome (GOTHE 1983; HASSLINGER 1989). D. filaria ist bei kleinen Haus- und Wildwiederkäuern zu finden (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969; GOTHE u. KANDELS 1984). Eine erstmals bei Rentieren beschriebene Art, D. eckerti (SKRJABIN 1931), wurde aufgrund morphologischer Unstimmigkeiten lange Zeit nicht als solche anerkannt. Molekulargenetische Untersuchungen konnten jedoch die Eigenständigkeit dieser Spezies beweisen (EPE et al. 1995; EPE et al. 1997;
SCHNIEDER et al. 1996b). Neben Rentieren konnten als weitere Wirte für D. eckerti Rotwild, Elche und Moschusochsen identifiziert werden (DIVINA et al. 2002;
HÖGLUND et al. 2003). Eine experimentelle Übertragung von D. eckerti auf das Rind ist möglich, es besteht jedoch nur eine geringe Empfänglichkeit (BIENIOSCHEK 1994).
14 Literaturübersicht
Eine neue Spezies, D. capreolus, wurde kürzlich bei Rehwild und Elchen in Schweden beschrieben (GIBBONS u. HÖGLUND 2002; HÖGLUND et al. 1999).
Eine experimentelle Übertragung dieser Spezies aufs Rind war nicht erfolgreich (DIVINA u. HÖGLUND 2002). Bei afrikanischen Paarhufern existieren als weitere Arten D. cameli und D. africanus (GIBBONS u. KHALIL 1988). Des Weiteren entdeckten DIVINA et al. (2002) ein Dictyocaulus-Isolat in Damwild, das molekulargenetisch keiner bekannten Spezies zugeordnet werden konnte.
2.1.2 Entwicklungszyklus und Pathogenese
Mit dem Wirtstierkot werden die 390 bis 450 µm langen, unbescheideten Erstlarven ausgeschieden, die sich in der Außenwelt unter günstigen klimatischen Bedingungen über ein einfach bescheidetes zweites Larvenstadium zur doppelt bescheideten, infektiösen dritten Larve entwickeln. Während dieser Entwicklungsphase nehmen die Larven keine Nahrung auf, sondern zehren von in Granula gespeicherten Reservestoffen (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; TAYLOR 1951). Nach URQUHART et al. (1973) lässt sich der Krankheitsverlauf in die vier Phasen Penetrationsphase, Präpatenz, Patenz und Postpatenz gliedern, die jede für sich eine eigene Symptomatik aufweisen. Der Schweregrad der klinischen Erscheinungen wird von der initial aufgenommenen Larvenmenge bestimmt. Darüber hinaus sind geringes Alter, ein schlechter Ernährungszustand und ungünstige Witterungsbedingungen prädisponierend für schwere Erkrankungen (TAYLOR 1951). Auch ein zusätzlich vorhandener Befall mit Magen-Darm-Würmern kann zu einer erhöhten Anfälligkeit führen (PFEIFFER 1971).
Die Penetrationsphase umfasst die Aufnahme der Larven bis zu ihrer Anwesenheit in der Lunge. Nach oraler Aufnahme werden die infektiösen Larven im Dünndarm durch den Kontakt mit Gallenflüssigkeit aktiviert (JØRGENSEN 1973) und durchdringen unter Verlust ihrer Scheiden die Dünndarmschleimhaut des Wirtes. Die hierdurch hervorgerufenen Läsionen führen zu einer subklinischen Enteritis. Über das Lymphgefäßsystem erreichen die Larven die Mesenteriallymphknoten, wo die Häutung zur vierten Larve erfolgt (JARRETT et al. 1957). Diese gelangen über den Ductus thoracicus und die Vena cava cranialis in die rechte Herzkammer, von wo aus sie über die Arteria pulmonalis das Kapillargebiet der Lunge erreichen. Hier
Literaturübersicht 15
überwinden die Larven die arterio-alveoläre Schranke, häuten sich in den Alveolen zum geschlechtlich differenzierten, etwa 1 mm großen, fünften Larvenstadium und ereichen etwa eine Woche post infectionem die Bronchioli und Bronchien (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Klinisch ist in dieser Phase lediglich ein leichter Hustenreiz zu beobachten (PFEIFFER 1971). Die Präpatenzphase, auch alveolar- bronchiale Phase genannt, umfasst den Zeitraum vom 8. bis etwa zum 21. Tag p.i. . Die fünften Larven zeigen ein intensives Größenwachstum und verursachen eine Entzündung der luftführenden Wege. In der zweiten Woche p.i. sind gelegentlicher Husten und ein Anstieg der Atemfrequenz feststellbar (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Diese Symptome können wieder abklingen oder sich bei schwerem Krankheitsverlauf verstärken, sodass Atemfrequenzen von über 70 Atemzüge pro Minute, frequenter Husten und Dyspnoe zu beobachten sind. In Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung kommt es zu einer mehr oder weniger weitreichenden Zerstörung des Zilienbesatzes der Bronchialepithelien mit daraus resultierender Verminderung der mukoziliären Clearence. Histologisch zeigt sich ein Ersatz des zerstörten Bronchialepithels durch hyperplastische Basalzellen, das flache Alveolarepithel wird durch kubische Typ II-Pneumozyten ersetzt. Der vermehrt gebildete Schleim obstruiert mit Zelltrümmern und Entzündungszellen die Bronchiolen, wodurch nachgeschaltete Alveolen atelektatisch werden. Klinisch tritt Nasenausfluss in Erscheinung (SCHNIEDER et al. 1989). Drei bis vier Wochen p.i.
liegen die ersten geschlechtsreifen Lungenwürmer vor. Männliche Adulte sind 3 bis 4 cm, weibliche 3 bis 8 cm lang (SCHNIEDER 2006). Die Eier werden embryoniert abgelegt, gelangen über das Flimmerepithel in den Larynx und werden vom Wirtstier abgeschluckt. Ein geringer Teil wird mit dem Sputum ausgehustet (TAYLOR 1951).
Während der Magen-Darm-Passage schlüpfen die ersten Larven und gelangen mit dem Kot in die Außenwelt. Die Phase der Patenz ist durch eine Verschlechterung des klinischen Bildes gezeichnet (JARRETT et al. 1957). Das Allgemeinbefinden der Tiere ist gestört. Sie zeigen Fieber, Inappetenz und Dyspnoe. Aufgrund der fortschreitend erschwerten Atmung nehmen die Tiere zur Entlastung eine sägebockartige Haltung mit nach vorne gestrecktem Kopf ein (MICHEL u. SHAND 1955). Es kommt zu Hustenanfällen und der Nasenausfluss nimmt mukösen
16 Literaturübersicht
Charakter an (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Das histologische Bild zeigt Massen von in die Alveolen eingewanderten Entzündungszellen. Makrophagen umschließen Würmer und aspirierte Eier und fließen zu Fremdkörperriesenzellen zusammen (JARRETT et al. 1957; SCHNIEDER et al. 1989). Aufgrund der erschwerten Atmung werden die terminalen Bronchioli gedehnt und können reißen. Hierbei kommt es zur Ausbildung eines interstitiellen Lungenemphysems, das sich weiter ausdehnen kann und in schweren Fällen als subkutanes Knistern palpierbar ist (JARRETT et al.
1957). Neben echten Sekundärinfektionen können sich im geschädigten Lungengewebe auch fakultativ pathogene Keime etablieren, die bereits vor der Infektion mit Lungenwurmlarven vorhandenen waren. Die Folge ist eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie, wodurch das Infektionsgeschehen verkompliziert wird (SCHNIEDER et al. 1989). Bei laktierenden Tieren sinkt die Milchleistung und in der späten Phase der Trächtigkeit kann es zu Aborten kommen (MICHEL u. SHAND 1955). Acht bis zehn Wochen nach der Infektion sind die Parasiten eliminiert und die Krankheitssymptome klingen ab. In der Phase der Postpatenz nehmen die Tiere wieder Futter auf und kehren zu ihrem Ausgangsgewicht zurück (JARRETT et al. 1957). Je nach Ausmaß der vorangegangen Schädigung können jedoch respiratorische Symptome in Form von Husten und erhöhter Atemfrequenz auch noch mehrere Monate anhalten. Bei massiver Larvenaufnahme durch hochempfängliche Tiere kann es zu einem so schweren Verlauf kommen, dass die Tiere nach wenigen Tagen sterben (MICHEL u.
SHAND 1955).
Wenn Kühe plötzlich einem hohen Infektionsdruck ausgesetzt werden, z.B. durch Grasen auf stark kontaminierten Kälberweiden, kann es zum so genannten Reinfektionssyndrom kommen. Bei unzureichender Immunität gelangen viele Larven in die Lunge und führen zu einer akuten, schweren Erkrankung.
Werden Larven in der Außenwelt Temperaturen unter 8°C ausgesetzt, tritt nach Aufnahme durch den Wirt eine Entwicklungshemmung im frühen präadulten Stadium ein (Hypobiose). Im nächsten Frühjahr wird die Entwicklung fortgesetzt und die Tiere scheiden erneut Larven aus (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Bezüglich der
Literaturübersicht 17
Mechanismen der Hypobiose soll an dieser Stelle auf die Arbeit von STRUBE (2004) verwiesen werden.
2.1.3 Epidemiologie und wirtschaftliche Bedeutung
Dictyocaulus viviparus ist weltweit in Gebieten verbreitet, wo es Rinder gibt und zumindest zeitweise gemäßigte Temperaturen von 15-20°C herrschen. Die Larven auf den Weiden sind empfindlich gegen Hitze und Trockenheit (JØRGENSEN 1980).
Feuchte Weiden und langes Gras haben einen positiven Einfluss auf die Überlebenszeit (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; TAYLOR 1951). Höhere Temperaturen beschleunigen die Entwicklung, sodass es bei warmer, feuchter Witterung zu einer schnellen Anhäufung infektiöser Stadien kommt. Da Rinder es vermeiden, in unmittelbarer Nähe von Kothaufen zu grasen, ist zur Aufrechterhaltung der Infektionskette eine Translokation der Larven nötig. Die Larven selbst zeigen kaum ein gerichtetes Wandervermögen, sodass dieser Prozess über belebte Vektoren wie Käfer und Vögel oder mechanisch durch Zertreten der Kotfladen erfolgt. Des Weiteren haben koprophile Pilzen der Gattung Pilobolus eine Bedeutung bei der Verbreitung der Larven. Die Sporen dieser Pilze wachsen im Rinderkot zu Hyphen aus und bilden Fruchtträger (Sporangien). Die Larven wandern auf die Sporangien oder bohren sich basal in diese ein. Bei steigenden Temperaturen und Lichteinfall explodieren die Sporangien und die Sporen werden mitsamt den Larven bis zu einem Meter vom Kotfladen weggeschleudert (DONCASTER 1981).
JØRGENSEN et al. (1982) zeigten, dass bei Kälbern, die auf einer Pilobolus-freien Weide gehalten wurden, die Larvenausscheidung reduziert war und weniger klinische Symptome auftraten.
Wildwiederkäuer können mit D. viviparus infiziert sein und als Erregerreservoir dienen (BIENIOSCHEK 1994). In der Regel liegen jedoch Infektionen mit D. eckerti oder D. capreolus vor. Da Rinder für D. eckerti nur eine sehr geringe und für D.
capreolus keine Empfänglichkeit zeigen, besteht hierin nur eine geringe Infektionsgefahr (BIENIOSCHEK 1994; DIVINA u. HÖGLUND 2002).
Berichte von Ausbrüchen und Prävalenzstudien stammen überwiegend aus den Ländern Deutschland, Niederlande, England und Schweden. Sporadisch wird über Ausbrüche in Nordamerika und Kanada berichtet, wobei dies nach Meinung von
18 Literaturübersicht
JOHNSTONE (1998) nicht die tatsächlichen Verhältnisse wiederspiegelt, da der Erreger aus Unwissenheit häufig nicht diagnostiziert werde.
Grundsätzlich können alle Rinder ohne belastbare Immunität erkranken. Dies sind in erster Linie erstsömmrige Kälber. Jedoch können auch ältere Tiere betroffen sein, da eine erlangte Immunität nach etwa einem halben bis einem Jahr wieder verloren geht, wenn keine Reinfektion stattfindet (DÜWEL 1971; MICHEL u. SHAND 1955).
Prävalenzstudien in Norddeutschland (SCHNIEDER et al. 1993), den Niederlanden (PLOEGER et al. 2000) und Schweden (HÖGLUND et al. 2004b) zeigten, dass die Seroprävalenz bei Jährlingsherden bei etwa 40% liegt. Verschiedene Autoren berichteten in den letzten Jahren von einem vermehrten Vorkommen von Dictyocauloseausbrüchen, wobei ungewöhnlich häufig Milchkühe betroffen waren.
So verzeichnete VIDA (Veterinary Investigation Diagnosis Analysis) im Jahr 1993 135 Dictyocauloseausbrüche in England und Wales, wobei es sich in 60% der Fälle um erwachsene Tiere handelte (DAVID 1993). In den Folgejahren verzeichnete VIDA einen kontinuierlichen Anstieg mit einem Peak von 543 Ausbrüchen Im Jahr 1997.
Bis 2004 schwankte die Zahl der jährlichen Ausbrüche zwischen 250 und 480 (VETERINARY LABORATORIES AGENCY 2006). Diese steigende Prävalenz wird auf den exzessiven Einsatz von Anthelminthika statt der Vakzinierung und einer damit verbundenen mangelhaften Immunitätsbildung zurückgeführt (PLOEGER 2002). In Schweden wird vermutet, dass die Zunahme an ökologisch arbeitenden Betrieben mit dem damit verbundenen Verbot der prophylaktischen Behandlung zur Erhöhung der Prävalenz in den letzten Jahren geführt hat. HÖGLUND et al. (2001) fanden bei einer Prävalenzstudie auf Ökobetrieben in Schweden 80% seropositive Betriebe. In einer späteren Studie konnte dies jedoch nicht bestätigt werden. Bei der Untersuchung von zehn Herden fand sich nicht ein seropositives Tier (HÖGLUND et al. 2004b).
Für die Aufrechterhaltung der Infektionskette sind vor allem zwei Faktoren von Bedeutung. Zum einen können Lungenwurmlarven unter geeigneten Bedingungen auf den Weiden überwintern (ENIGK u. DÜWEL 1962; JARRETT et al. 1955;
OAKLEY 1979) und im nächsten Frühjahr von empfänglichen Tieren aufgenommen werden, zum anderen können ältere Tiere den Erreger im hypobiotischen Stadium
Literaturübersicht 19
über den Winter beherbergen und so als symptomlose Ausscheider fungieren, die im nächsten Frühling die Weiden kontaminieren (MICHEL u. SHAND 1955). EYSKER et al. (1994) fanden bei einer Pävalenzstudie in den Niederlanden im Frühling bei sechs von 40 Kuhherden mindestens ein patentes Tier. Die Anzahl positiver Herden nahm im Laufe der Weidesaison ab, jedoch waren auch im August noch Ausscheider vorhanden. Die Rolle von auf der Weide überwinterten Larven im Infektionsgeschehen wird klimabedingt regional von verschiedenen Autoren unterschiedlich bewertet (POUPLARD 1968). SCHNIEDER et al. (1989) stellten in Norddeutschland fest, dass Herden, die vor dem 15.5. ausgetrieben wurden, signifikant häufiger mit Lungenwürmern infiziert waren als die später ausgetriebenen, was die Bedeutung der überwinterten Larven unterstreicht. Ebenso wurde aus England, Schottland und Belgien von überwinterten Larven als Infektionsquelle berichtet, während diese in Österreich, der Schweiz, in Dänemark, in den Niederlanden und in Schweden kaum auftreten bzw. für das Infektionsgeschehen keine große Bedeutung haben (EYSKER et al. 1994; HU et al. 2002; JARRETT et al.
1955; JØRGENSEN 1980; VERCRUYSSE et al. 1998). Typischerweise entwickeln sich im Laufe einer Weideperiode drei bis vier Lungenwurmgenerationen. Besteht anfangs ein niedriger Infektionsdruck, werden nur wenige Tiere schwach befallen und klinische Symptome bleiben aus. Diese Tiere tragen jedoch zu einer fortschreitenden Kontamination der Weiden bei, sodass es in den folgenden Generationen zu massiven Infektionen und schweren klinischen Erscheinungen bei empfänglichen Tiere kommt (DÜWEL 1971; MICHEL u. SHAND 1955). Eine hohe Besatzdichte erhöht weiterhin den Infektionsdruck (TAYLOR 1951). Aufgrund der Generationsfolge werden die meisten Dictyocauloseausbrüche im Herbst verzeichnet.
Neuere Erkenntnisse zur Epidemiologie der Dictyocaulose liefern populationsdynamische Studien. Die Bestimmung populationsgenetischer Marker in Dictyocaulus-Isolaten von verschiedenen Farmen in Schweden zeigte, dass innerhalb eines Isolats eine geringe genetische Vielfalt vorhanden ist, die Populationen sich untereinander jedoch deutlich unterscheiden (HÖGLUND et al.
2004a; HÖGLUND et al. 2006; HU et al. 2002). Es konnte keine größere Ähnlichkeit
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zwischen Isolaten von benachbarten Farmen als zwischen Isolaten von weit entfernten Farmen festgestellt werden. Aufgrund dieses geringen genetischen Flusses halten die Autoren es für wahrscheinlich, dass Dictyocauloseausbrüche im Zusammenhang mit Tiertransporten eher so interpretiert werden können, dass empfängliche Tiere in die Herde eingebracht werden, als dass der Erreger eingeschleppt wird. Populationsdynamische Studien haben auch Bedeutung für die Verbreitung von Resistenzen. Aufgrund der gefundenen populationsgenetischen Strukturen in Schweden vermuten die Autoren, dass im Falle des Auftretens einer Anthelminthikaresistenz bei Dictyocaulus, die Ausbreitung der Resistenz verzögert erfolgen würde (HÖGLUND et al. 2004a). Für andere Regionen liegen noch keine populationsgenetischen Untersuchungen vor, sodass keine Aussagen über die Allgemeingültigkeit der gefundenen Daten getroffen werden können. Es wird vermutet, dass die geringe genetische Vielfalt innerhalb der Isolate auch mit der schlechten Überwinterungsrate der Larven in Schweden zusammenhängt, da hieraus ein starker Selektionsdruck resultiert (HÖGLUND et al. 2006).
Wirtschaftliche Verluste entstehen durch Todesfälle, Lebendmasseverluste, verringerte Milchleistung und allgemeine Beeinträchtigung der Leistungsfähigkeit durch chronische Lungenschäden (SCHNIEDER et al. 1989). WOOLEY (1997) kalkulierte für einen mittelschweren Ausbruch in einer Herde mit 100 Milchkühen unter der Annahme, dass alle Tiere behandelt werden, einen Verlust von 20.000£.
Hierin einbezogen waren die Kosten für Milchverluste, reduzierte Fertilität, Behandlung und Totalverluste von erkrankten Tieren und durch Aborte. Allerdings erfolgte diese Kalkulation unter der Annahme, dass aufgrund der Wartezeit ein dreitägiger Milchverlust während der Behandlung erfolgt. Da mit der Substanz Eprinomectin (GIBB et al. 2005) inzwischen ein Präparat ohne Wartezeit zur Verfügung steht, würde eine Kalkulation zum jetzigen Zeitpunkt moderater ausfallen.
2.1.4 Immunität
Die Ausbildung einer Immunität ist im Infektionsgeschehen der Dictyocaulose von großer Bedeutung. Nach einer Infektion wird eine belastbare Immunität entwickelt, deren Grad allerdings schon nach 6 Monaten wieder abnimmt, wenn es zwischenzeitlich nicht zu einer erneuten Infektion kommt. Dies führt dazu, dass Tiere,
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die länger als zwölf Monate keinen Kontakt mit dem Erreger hatten, erneut an einer Infektion erkranken. Dies geschieht unabhängig vom Alter; eine Altersresistenz besteht nicht. MICHEL (1958) zeigte, dass nach einem Jahr reinfizierte Tiere zwar nicht patent wurden, sich in der Schwere der klinischen Symptome aber nicht von den erstmals exponierten Tieren unterschieden.
Die Ausbildung der Immunität verläuft phasenweise. Schon im Stadium der Larvenwanderung, 8 bis 10 Tage nach Infektion, entwickelt sich eine frühe Teilimmunität, die durch die Anwesenheit der adulten Stadien verstärkt wird.
PLOEGER u. EYSKER (2002) zeigten, dass die von Larven vermittelte Immunität abhängig von der aufgenommenen Larvendosis ist, jedoch die spätere Gesamtimmunität unabhängig von der Infektionsdosis ist. In einem früheren Infektionsversuch konnten EYSKER et al. (2001) zeigen, dass bereits die Applikation von 30 Larven 35 Tage vor einer Belastungsinfektion zu einer um 80% verringerten Larvenausscheidung und einer um mehr als 70% verringerten Wurmbürde führte.
Die genauen Mechanismen der Immunitätsbildung und Elimination der Parasitenstadien aus der Lunge sind nicht bekannt. Eine Beteiligung humoraler Komponenten an der Immunantwort wurde schon 1957 von JARRETT et al.
demonstriert. Ihnen gelang die passive Immunisierung von Rindern mit dem Serum experimentell infizierter Tiere. Auch MCKEAND et al. (1995b) zeigten, dass die Wurmbürden passiv immunisierter Meerschweinchen signifikant geringer waren als die einer Kontrollgruppe.
Die Bestimmung der lokalen und peripheren Antikörperspiegel für IgG, IgG1, IgG2, IgM und IgA in einer Langzeitstudie mit drei Infektionen (Tag 0, 65, 112) zeigte einen Anstieg aller Antikörperklassen nach jeder Infektion in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF), wobei höchste Titer nach der dritten Infektion erreicht wurden. Im Gegensatz dazu zeigte sich, außer bei IgA, kein Anstieg der Serumantikörper nach der dritten Infektion, sondern ein kontinuierlicher Abfall. Der bei allen Infektionen vorhandene frühe Anstieg der schleimhautschützenden IgA- Antikörper wird mit der Larvenmigration in Zusammenhang gebracht. Weiterhin zeigte sich eine Korrelation zwischen Larvenausscheidung und IgG2a(1). Tiere mit hohen Ausscheidungsraten hatten auch hohe IgG2a(1)-Titer, sowohl im Serum als
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auch in der BALF. Da die IgG2-Produktion von IFNγ und IL-2 stimuliert wird, wurde vermutet, dass bei diesen Tieren eine Th1-Antwort vorherrscht (SCOTT et al. 1996).
Die Bedeutung von IgE bei der Immunantwort wurde von KOOYMAN et al. (2002) demonstriert. Die Autoren zeigten, dass die gesamt IgE-Antikörperspiegel im Serum nach Reinfektion positiv mit der Protektion gegen eine Belastungsinfektion korreliert sind, wobei bereits zehn Tage nach Reinfektion ein Anstieg zu verzeichnen war.
Weiterhin war die Ausbildung einer Eosinophilie positiv mit dem IgE-Spiegel, jedoch nicht mit der Protektion korreliert. Hohe IgE-Spiegel und Eosinophilie sind Ausdruck einer Th2-Immunantwort, sodass davon auszugehen ist, dass dieser Reaktionstyp bei der Infektion mit D. viviparus vorherrscht. Eine besondere Bedeutung wird in diesem Zusammenhang einem Glykanantigen mit Lewisx-Epitop auf der Oberfläche von D. viviparus beigemessen. Lewisx-Epitope sind eine Hauptkomponente der Glykokonjugate bei Schistosomen, jedoch ist D. viviparus der einzige Nematode, bei dem diese Struktur bislang nachgewiesen wurde. Lewisx-Strukturen fungieren als Immunmodulatoren, indem sie die Th2-Immunantwort fördern und so möglicherweise die zelluläre Immunantwort des Wirtes auf den Parasiten einschränken (HASLAM et al. 2000).
Die lokale Cytokinexpression im Lungengewebe, in der Trachea und in den Bronchiallymphknoten nach experimenteller Infektion wurde von JOHNSON et al.
(2005) untersucht. Die Autoren fanden ein gemischtes Expressionsmuster, da sowohl die Th2-Cytokine IL-4, IL-5 und IL13, als auch die Th1-Cytokine IL-p35 und IFNγ am Tag 15 nach der Infektion hochreguliert waren. Dies korrespondiert mit dem Zeitpunkt der Larvenmigration durch die Lunge. Gegen Ende des Versuchs fielen die Cytokinspiegel wieder ab und am Tag 42 zeigte sich in der Sektion, dass nur noch wenige Lungenwürmer in der Lunge vorhanden waren, also eine Erregerelimination stattgefunden haben musste. Die Serum-IgG1-Spiegel waren hingegen am Ende des Versuchs am höchsten, also negativ mit der Cytokinantwort korreliert. Ob die Th1- Cytokine essentiell für die Immunität sind oder die Th2-Antwort modulieren, ist noch nicht geklärt.
HAGBERG et al. (2005) untersuchten mononukleäre Zellen in der BALF. Sowohl nach einmaliger Infektion als auch nach Reinfektion waren γ/δ-TCR-Zellen signifikant
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erhöht. Dieser Zelltyp erfüllt wichtige Funktionen bei der Regulierung der T- und B- Zellaktivität sowie bei der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten und der Produktion von IgE. Eosinophile Granulozyten waren sowohl in der BALF, als auch im Blut erhöht, wobei nach Reinfektion höhere Spiegel erreicht wurden, als nach Erstinfektion. Für CD4-, CD8-, CD14- und Ig-Zellen konnten in der BALF keine signifikanten Unterschiede zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren festgestellt werden.
Des Weiteren spielen individuelle Unterschiede des Wirtes bei der Antigenerkennung eine Rolle bei der Immunantwort. BRITTON et al. (1992a) lieferten Hinweise, dass diese Individualität bei der Antigenerkennung genetischen Ursprungs ist. Die Seren vakzinierter oder infizierter Rinder wiesen eine deutliche Heterogenität im Antigenerkennungsprofil auf. Dies war auch für einen Meerschweinchen- Auszuchtstamm der Fall. Der Vergleich zweier Inzuchtstämme zeigte eine deutliche Heterogenität zwischen den Stämmen, jedoch wenig individuelle Unterschiede innerhalb der Stämme. Ähnliche Beobachtungen konnten auch MCKEAND et al.
(1994a) bei Immunisierungsversuchen mit verschiedenen Meerschweinchen- stämmen machen. Neben qualitativen und quantitativen Unterschieden im Antikörperrepertoire waren die Stämme nach der Immunisierung auch unterschiedlich gut gegen eine Belastungsinfektion geschützt. Da die Inzuchtstämme identisch bezüglich des MHC Klasse I Locus waren, wurde vermutet, dass die Unterschiede auf Gene des MHC II Locus zurückzuführen sind.
2.1.5 Diagnose
Die Symptome der Dictyocaulose sind nicht pathognomonisch. Leichte respiratorische Symptome sechs bis acht Wochen nach Weideaustrieb geben zwar einen Verdacht, erfordern aber weitere Nachweisverfahren. Dies sind zum einen direkte Verfahren, die den Erreger selbst nachweisen, zum anderen serologische Verfahren zum Nachweis der Immunantwort auf den Parasiten. Ein häufig angewandtes Verfahren zum Nachweis der Dictyocaulus-Larven im Kot ist das Trichterauswanderverfahren nach BAERMANN (1917), bei dem ein mit Kot beladenes Sieb in einen wassergefüllten, unten verschlossenen Trichter gelegt wird.
Die aktiv aus dem Kot auswandernden Larven sammeln sich am unteren Ende des
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Trichterhalses und können abgelassen werden. Sensitivität und Spezifität des Verfahrens hängen von der Art der Probennahme und der Durchführung der Methode ab. Negativen Einfluss auf die Sensitivität haben lange Lagerung des Kotes, feste Kotkonsistenz, hohe Temperaturen und kurze Auswanderzeiten. RODE u. JØRGENSEN (1989) zeigten, dass nach 24stündiger Lagerung bei 20°C die Auswanderrate im Vergleich zur sofortigen Probenverarbeitung um 60% reduziert ist.
Des Weiteren war nach zehnstündigem Ansatz erst ein sehr geringer Teil der Larven (<10%) ausgewandert. EYSKER et al. (1994; 1997) zeigten, dass die Methode für jüngere Tiere eine höhere Sensitivität aufweist als für ältere, da bei letzteren durch die größere Kotmenge ein Verdünnungseffekt der Larven auftritt. Darüber hinaus erfolgt die Larvenausscheidung intervallweise und quantitativ unterschiedlich (BUCHWALDER 1963; DÜWEL 1971). Daher sollte zur Absicherung eines negativen Ergebnisses die Probennahme an mehreren aufeinander folgenden Tagen durchgeführt werden Ein erster Nachweis von Larven im Kot kann drei Wochen p.i.
erfolgen (DÜWEL 1971).
Erste serologische Nachweisverfahren wurden in den 50er Jahren entwickelt. Auf Grundlage eines aus adulten Parasiten gewonnenen Gesamtantigens war ein Titeranstieg komplementbindender Antikörper vier bis fünf Wochen nach Infektion zu verzeichnen (CORNWELL 1960; JARRETT et al. 1959). Nach zweimaliger Applikation einer Vakzine aus röntgenattenuierten Larven konnten keine oder nur sehr geringe Titer nachgewiesen werden. Patente Infektionen lassen sich ebenfalls im Agargelpräzipitationstest nachweisen. Allerdings zeigten PARFITT u. SINCLAIR (1967) Kreuzreaktionen mit D. filaria. BOKHOUT et al. konnten mittels indirektem Hämaglutinationstest einen Titeranstieg sowohl nach einer Infektion als auch nach einer Vakzinierung zeigen (BOKHOUT et al. 1979).
Die ersten Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) für D. viviparus erwiesen sich als sehr sensitiv. Mit dem von MARIUS et al. (1979) vorgestellten indirekten ELISA auf Grundlage von Adultenantigen war ein Titeranstieg drei (BOON et al.
1982) bis vier (MARIUS et al. 1979) Wochen nach Infektion nachweisbar. Unter Einsatz von somatischem Antigen aus in vitro kultivierten vierten Larven konnten BOS u. BEEKMAN ( 1985 ) bereits zwei Wochen p.i. einen signifikanten Titeranstieg
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nachweisen. DE LEEUW und CORNELISSEN (1991) fanden für den Rohantigen- ELISA Kreuzreaktionen mit Cooperia oncophora, Ostertagia ostertagi, Ascaris suum und Fasciola hepatica. Den Autoren gelang jedoch die Isolierung eines 17 kDa- Antigens aus adulten Würmern, das im ELISA und im Western-Blot nicht mit Antiseren der genannten Spezies kreuzreagierte. Ein Titeranstieg war mit dem 17 kDa-Antigen vier Wochen p.i. nachweisbar. Der Vergleich eines Rohantigen- ELISAs mit dem 17 kDa-ELISA und einem kompetitiven ELISA, bei dem ein gegen das 17 kDa-Antigen gerichteter monoklonaler Antikörper eingesetzt wurde, zeigte eine Sensitivität des Rohantigen-ELISAs von 99%, des 17 kDa-ELISAs von 97% und der kompetitive ELISA hatte eine 73%ige Sensitivität. Die Spezifität war beim kompetitiven und beim 17 kDa-ELISA in etwa gleich (97%), im Rohantigen-ELISA mit 67% jedoch wesentlich geringer. Die Seren vakzinierter Tiere reagierten nicht (DE LEEUW u. CORNELISSEN 1993). Der Vergleich des 17 kDa-ELISAs mit dem indirekten Hämagglutinationstest (IHA) zeigte für beide eine hohe Spezifität (99,2%
und 99,6%). Die Sensitivität des ELISAs war jedoch mit 100% signifikant höher als die des IHA (78,1%). Darüber hinaus konnten mit dem ELISA bereits 28-42 Tage p.i.
Antikörper nachgewiesen werden, was mit dem IHA erst nach 42-70 Tagen möglich war. Mit dem IHA konnten jedoch bis zum Ende des Experiments (Tag 196), mit dem ELISA nur bis Tag 168 Antikörper nachgewiesen werden. Weiterhin wurde der ELISA in einem Ringversuch auf seine Reproduzierbarkeit getestet. Zwischen fünf Labors konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (CORNELISSEN et al.
1997). Die erhaltenen Ergebnisse führten dazu, dass der ELISA 1995 den bis dahin eingesetzten IHA als Routinetest für die Tiergesundheitsdienste in den Niederlanden ablöste. Dieser ELISA ist mittlerweile als kommerzieller Kit unter der Bezeichnung CEDITEST erhältlich.
TENTER et al. (1993) etablierten einen ELISA auf Grundlage von Adultenantigen, der sich als sehr geeignet für den Einsatz bei epidemiologischen Fragestellungen erwies. Die Kalkulation von Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem prädiktivem Wert lieferte die sichersten Ergebnisse für einen Untersuchungszeitraum von 13 bis 17 Wochen nach Weideauftrieb.
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Den ersten Einsatz eines rekombinanten Antigens in einem Dictyocaulus-ELISA beschrieb SCHNIEDER (1992). Hierbei handelte es sich um ein adultenspezifisches 18 kDa Antigen, das als GST-Fusionsprotein exprimiert wurde. Nach experimenteller Infektion hatte der ELISA sowohl mit Fusionsprotein (DvGST3-14) als auch mit Thrombin-geschnittenem Protein (Dv3-14) eine Spezifität von >99%. Die Sensitivität lag bei 93% (DvGST3-14) und 91% (Dv3-14). Bei Feldseren lagen Spezifität und Sensitivität bei 90 und 85% (DvGST3-14) bzw. >99 und 70% (Dv3-14). Eine Serokonversion wurde 30 Tage p.i. festgestellt. Auf Basis des rekombinanten Antigens wurde ein Diagnostik-Schnelltest entwickelt. Grundlage dieses Dipstick- Assays ist ein optimierter, verkürzter Immunoblot, der bereits nach 90 Minuten ein Ergebnis liefert. Das Dv3-14-Antigen ist hierbei an Filterpapierstreifen gebunden, die mit Serum oder auch mit Vollblut beprobt werden. Nach experimenteller Infektion zeigte der Test eine Spezifität und Sensitivität von mehr als 99% zwischen Tag 30 und 85 p.i.. Die mit Antigen beladenen Filterpapierstreifen zeigten nach zwölfmonatiger Lagerung bei –20°C bzw. sechswöchiger Lagerung bei 4°C keinen Verlust der Sensitivität (SCHNIEDER 1993a). Der dem Dipstick-Assay zugrundeliegende Immunoblot wird in der Routinediagnostik des Instituts für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eingesetzt.
In der Bestimmung der akute Phase Proteine (APP) Haptoglobin, Serum Amyloid A und Fibrinogen sehen GANHEIM et al. (2004) ein mögliches diagnostisches Instrument. In Infektionsversuchen wurde gezeigt, dass der durch die Parasiten verursachte Gewebsschaden in der Lunge zu einem signifikanten Anstieg der APP führt. Bei gleichzeitigem Vorliegen einer Eosinophilie sehen die Autoren hierin einen Indikator für das Vorliegen einer Infektion mit Lungenwürmern. Allerdings ist der Anstieg der APP dosisabhängig und niedrige Spiegel bei gleichzeitiger Eosinophilie schließen die Infektion nicht aus.
2.1.6 Bekämpfung
Die Bekämpfung der Dictyocaulose kann durch weidetechnische Maßnahmen, Vakzinierung und den Einsatz von Anthelminthika erfolgen (ROMMEL u.
SCHNIEDER 1989). Da eine vollständige Unterbindung der Infektion kaum möglich ist (SELMAN 1984), besteht das Ziel in der Vermeidung wirtschaftlicher Verluste.
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Grundsätzlich und besonders in enzootischen Gebieten sollte die Ausbildung einer protektiven Immunität bei erstsömmrigen Rindern angestrebt werden.
2.1.6.1 Weidetechnische Maßnahmen
Ein später Weideauftrieb kann das Infektionsrisiko signifikant senken, da überwinterte Larven absterben. Durch Mähen des ersten Aufwuchses zur Heu- oder Silageverarbeitung kann die Anzahl vorhandener Larven reduziert werden (SCHNIEDER u. BELLMER 1993). Da Feuchtigkeit für das Überleben der Larven notwendig ist, sollten Jungrinderweiden möglichst trocken sein. Die Tiere sollten über künstliche Tränken versorgt werden, da eine Verbreitung der Larven über Grabenwasser möglich ist (PFEIFFER 1971). Eine zu hohe Besatzdichte fördert das Grasen in der Nähe von Kothaufen. Durch Zufütterung kann das Risiko gesenkt werden (BELLMER 1990). In Gebieten mit geringer Inzidenz kann versucht werden, die Infektion durch Austrieb auf lungenwurmfreie Weiden zu verhindern. Ein gemeinsames Weiden von Kälbern und älteren Tieren, die als Ausscheider fungieren können, sollte grundsätzlich vermieden werden. Auch sollten Kälber nicht auf Weiden getrieben werden, die vorher von Ausscheidern beweidet wurden. Die in der Literatur angegebenen Wartezeiten reichen von fünf Wochen bis zu einem Jahr und sind stark klimaabhängig. Da die ersten Larven mindestens vier Tage brauchen, um Infektionsreife zu erlangen, kann ein Weidewechsel im Abstand von vier Tagen massiven Infektionen vorbeugen (POUPLARD 1968). Grundsätzlich sollten empfängliche Tiere täglich kontrolliert werden, um beim ersten Auftreten respiratorischer Symptome eingreifen zu können. Bei gesicherter Diagnose sollte die ganze Herde behandelt werden (SCHNIEDER et al. 1993).
2.1.6.2 Anthelminthika
Für den pro- und metaphylaktischen Einsatz bei der Bekämpfung der Dictyocaulose stehen verschiedene Breitbandanthelminthika zur Verfügung. Größte Bedeutung hat hierbei die Substanzklasse der makrozyklischen Laktone mit den Vertretern Ivermectin, Doramectin, Moxidectin und Eprinomectin. Injektions- und Pour-on- Präparate bewirken eine mindestens 99%ige Reduktion der Wurmbürde für etwa vier bis sechs Wochen. (EDDI et al. 1993; EPE et al. 1999; GOUDIE et al. 1993;
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HUBERT et al. 1997; STROMBERG et al. 1999; VERCRUYSSE et al. 1997;
WEATHERLEY et al. 1993; WHELAN et al. 1995). Intraruminale Boli geben den Wirkstoff kontinuierlich oder intervallweise ab, wodurch die Wirkungsdauer auf etwa drei bis vier Monate verlängert wird. (SCHNIEDER et al. 1996a). Ein intensiver Anthelminthikaeinsatz wird von verschiedenen Autoren als Ursache für ein seit den 1990er Jahren vermehrtes Auftreten von Dictyocaulosefällen bei älteren Tieren genannt (CONNAN 1993; DAVID 1993). Studien zur Immunitätsentwicklung unter Anthelminthikaeinsatz führten zu gegensätzlichen Ergebnissen, wobei eine Abhängigkeit vom herrschenden Infektionsdruck vorhanden zu sein scheint. Werden große Larvenmengen aufgenommen, erhöht sich die Chance, dass einzelne Larven die Darmwand durchdringen und die Immunitätsbildung stimulieren bevor sie abgetötet werden (PLOEGER 2002). Bei geringem Antigenstimulus unter Langzeitbehandlung wird jedoch möglicherweise keine ausreichende Immunität ausgebildet, sodass starke Infektionen zu einem späten Zeitpunkt zu massiven Erkrankungen führen können (SCHNIEDER et al. 1998).
2.1.6.3 Vakzinierung
Die Grundlagen der Immunisierung von Kälbern gegen den Befall mit Lungenwürmern wurden von JARRETT et al. (1957) erarbeitet. Hierauf basierend wurde eine Lebendvakzine entwickelt, die 1959 auf den Markt kam. Dieser Impfstoff besteht aus dritten Larven, deren Virulenz durch Röntgenbestrahlung mit 400 Gy abgeschwächt ist. Das antigene Potential ist erhalten, sodass für einige Monate eine belastbare Immunität induziert wird (ECKERT 1972). Vor allem in endemischen Gebieten wird die Impfung erstsömmriger Kälber und älterer Tiere, die länger keinen Lungenwurmkontakt hatten empfohlen (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Eine Impfdosis enthält etwa 1000 Larven. Die Verabreichung erfolgt oral zweimal im Abstand von vier Wochen. Alle Tiere einer Weidegruppe sollten immunisiert werden.
Zum Zeitpunkt der ersten Vakzinierung sollten die Kälber mindestens acht Wochen alt und gesund sein. Zwischen den Impfungen und drei bis vier Wochen danach sollten die Tiere aufgestallt bleiben (DÜWEL 1963). Die Vakzine ist für die Tiere weitgehend unschädlich. Da allerdings ein großer Teil der Larven in die Lunge einwandert und sich zum Teil zum fünften Stadium entwickelt bevor sie absterben,
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können sieben bis zwölf Tage nach der Vakzinierung leichter Husten und eine Erhöhung der Atemfrequenz auftreten (ECKERT 1972). Die Impfung schützt die Tiere bei einer Reinfektion vor dem Auftreten klinischer Symptome, erzielt aber keine sterile Immunität. Ein Teil der Tiere scheidet in geringem Maße Larven aus, wodurch eine gewisse Weidekontamination stattfindet. Dies ist notwendig, da die durch die Impfung erlangte Immunität durch natürliche Infektionen aufgefrischt werden muss.
Ohne diesen Boostereffekt würde die Immunität lediglich drei bis fünf Monate anhalten (MICHEL u. MACKENZIE 1965). Die Vakzine ist bei 2 bis 4°C zehn bis vierzehn Tage haltbar. Fehlerhafte Aufbewahrung und Verwendung überalteter Vakzine, aber auch die Impfung zu junger Tiere und ein zu langer Abstand zwischen Vakzinierung und Austrieb können zum Versagen der Impfung führen. Erkrankungen wie infektiöse Pneumonien anderer Genese oder ein starker Befall mit Magen-Darm- Strongyliden können zu Störungen der Immunitätsbildung oder zu einem Impfdurchbruch führen. Deshalb sollte eine Bekämpfung der Magen-Darm-Parasiten immer mit einbezogen werden (ECKERT 1972).
Im Zuge der Problematik des vermehrten Auftretens von Dictyocaulosefällen bei erwachsenen Tieren (siehe Punkt 2.1.6.2) wurde der Einsatz der Vakzine bei Rindern während der ersten Trächtigkeit und Laktation untersucht. HOLZHAUER et al. (2005) konnten keinen negativen Einfluss der Vakzine auf die Trächtigkeit und Milchproduktion feststellen. Die Larvenvakzine kann also auch bei Jungrindern sicher angewendet werden, wenn deren Immunitätsstatus fragwürdig ist und in einem Problembestand Erkrankungsfälle bei adulten Tieren aufgetreten sind.
Eine Studie zum Einsatz der Larvenvakzine bei Rotwild in Neuseeland zeigte, dass bei dieser Spezies keine zufriedenstellende Effektivität gegeben ist. Weder bei den mit D. viviparus, noch den mit D. eckerti infizierte Tieren zeigten die vakzinierten Tiere eine signifikant niedrigere Larvenausscheidung. Eine gewisse Protektivität war gegeben, da die vakzinierten Tiere signifikant weniger Würmer in den Lungen aufwiesen (JOHNSON et al. 2003).
Die Lungenwurmvakzine wird von der Firma Schering Plough Animal Health unter dem Handelsnamen Dictol® und von Intervet unter der Bezeichnung Bovilis®
vertrieben. Zur Zeit hat die Vakzine keine Zulassung in Deutschland.
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2.1.6.4 Biologische Bekämpfung
Ein mögliches Instrument zur biologischen Bekämpfung stellt der nematophage Pilz Duddingtonia flagrans dar. Dieser Pilz wurde aus Rinderkot isoliert und ist in der Lage, Nematodenlarven in einem Hyphennetz zu immobilisieren und zu zerstören (LARSEN 1999). HENRIKSEN et al. (1997) fanden nach Zusatz von 50.000 Chlamydosporen/g Kot eine Reduktion der D. viviparus-Larven um durchschnittlich 86%. Nach LARSEN (1999) könnte der Pilz als Futterzusatzstoff oder in Form von Lecksteinen eingesetzt werden und durch Reduktion der infektiösen Larven auf der Weide klinische Erkrankungen vermeiden.
Auf Neuseeländischen Wildfarmen wurde die Beobachtung gemacht, dass Tiere, denen Chicoree gefüttert wurde, weniger wurmbelastet waren als Tiere auf normalem Grasland. Als hierfür verantwortliche Substanzen wurden kondensierte Tannine und Sesquiterpen Lakton identifiziert. Diese Stoffe haben durch einen noch nicht bekannten Mechanismus hemmenden Einfluss auf die Motilität der larvalen Stadien. Im Larven-Migrations-Inhibitions-Test führten Konzentrationen, wie sie auch bei der Fütterung erreicht werden, bis zu einer 73%igen Inhibition (MOLAN et al.
2003).
2.2 Antigene und Immunisierungsversuche bei D. viviparus
Die ersten näher bei D. viviparus untersuchten Enzyme waren Proteasen. REGE et al. (1989) identifizierten in Extrakten von adulten D. viviparus eine Cysteinprotease mit der in vitro Fähigkeit Typ I-Kollagen und Hämoglobin zu lysieren. Es wurde vermutet, dass das Enzym eine Rolle bei der Nahrungsaufnahme des Parasiten spielt und eventuell am Pathomechanismus der Infektion beteiligt ist. In von BOS et al. (1989) durchgeführten Immunisierungsversuchen wurden Meerschweinchen zweimal im Abstand von vier Wochen mit je 100 µg aufgereinigter Cysteinprotease bzw. Wurmextrakt und Freund’s inkompletem Adjuvans (FIA) intramuskulär immunisiert. Zwei Wochen nach der Boosterimpfung erfolgte die Belastungsinfektion.
Die Cysteinprotease-immunisierten Tiere zeigten eine signifikante Reduktion der Wurmbürde um 42%. Bei den Wurmextrakt-immunisierten Tieren war eine Reduktion um 66% vorhanden. In einem Rinderimmunisierungsversuch war dieser Effekt nicht
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konstant reproduzierbar. BRITTON et al. (1992b) untersuchten Extrakte von dritten Larven und Adulten und lösliche Komponenten, die vom Parasiten an die Umgebung abgegeben werden (excretory-secretory-products, ES-Produkte) auf proteolytische Aktivitäten. Mit Hilfe spezifischer Inhibitoren identifizierten sie Serin-, Cystein- und Metalloproteasen, wobei die ES-Produkte eine höhere proteolytische Aktivität aufwiesen. In den Adulten-ES-Produkten wurden die Enzyme von Serum IgG- Antikörpern vakzinierter oder infizierter Rinder erkannt und inhibiert, jedoch nicht in den Wurmhomogenaten. In den Larvenextrakten reagierten nur Serum IgG- Antikörper vakzinierter Tiere. Dies spricht dafür, dass die somatischen Proteasen normalerweise nicht für das Immunsystem zugänglich sind, jedoch bei der Immunisierung frei werden, da attenuierte Larven vermehrt absterben.
MCKEAND et al. (1995b) führten Meerschweinchenimmunisierungsversuche mit Extrakten aus adulten D. viviparus und dritten Larven sowie mit ES-Produkten von Adulten durch. Es zeigte sich, dass nur die mit Adulten-ES-Produkten immunisierten Tiere signifikant besser geschützt waren als die Kontrollgruppe. Die Meerschweinchen wurden zweimal im Abstand von vier Wochen subkutan immunisiert. In der ersten Immunisierung wurden 60 µg Protein mit einem equivalenten Volumen Freund’s komplettem Adjuvans (FCA) eingesetzt. Die zweite Vakzinedosis bestand aus 100 µg Protein mit FIA. Vier Wochen nach der zweiten Impfung erfolgte die Belastungsinfektion mit 3000 L3. Sechs Tage später wurden die Tiere seziert. In der mit ES-Produkten immunisierten Gruppe war die Anzahl fünfter Larven um 85,5% reduziert. In einer zweiten Versuchsreihe wurden Meerschweinchen passiv immunisiert, um die protektive Rolle von Antikörpern bei der Immunantwort zu untersuchen. Hierzu wurde von mit ES-Produkten immunisierten oder mit dritten Larven infizierten Meerschweinchen Serum gewonnen und anderen Meerschweinchen intraperitoneal appliziert. Eine Stunde nach der Seruminjektion wurden die Tiere mit 6000 L3 infiziert. Bei der Sektion war sowohl in der Gruppe, die das Anti-L3-Serum erhalten hatte, als auch in der Anti-ES-Gruppe die Wurmbürde signifikant reduziert. Im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die Serum nicht immunisierter und nicht infizierter Tiere erhalten hatte, war eine Reduktion von 79,7% bzw. 64,6% vorhanden.
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Ein Enzym, das bereits in den ES-Produkten diverser parasitischer Nematoden nachgewiesen wurde und dem große Bedeutung bei der Immunabwehr des Wirtes beigemessen wird, ist die Acetylcholinesterase (AChE). Es konnte gezeigt werden, dass AChEs von Nematoden sezerniert werden, jedoch konnte die biologische Bedeutung der sezernierten Formen noch nicht vollständig geklärt werden. Es wird davon ausgegangen, dass durch die Hydrolyse des wirtseigenen Acetycholins Funktionen blockiert werden, die zur Parasitenabwehr beitragen. Hierzu zählen Darmperistaltik und Schleimsekretion, aber auch Effekte des Acetylcholins auf Zellen des Immunsystems wie Neutrophilenchemotaxis, Mastzelldegranulation und Lymphozytenproliferation (MCKEAND et al. 1994b; MCKEAND et al. 1995a).
MCKEAND et al. (1994b) konnten in Extrakten und ES-Produkten adulter D.
viviparus Acetylcholinesteraseaktivität nachweisen, wobei in ES-Produkten eine 200fach höhere Aktivität vorhanden war als in den Extrakten. Hieran zeigte sich, dass es sich bei der Acetylcholinesterase (AChE) um ein von D. viviparus sezerniertes Enzym handelt. Vergleiche mit dritten und vierten Larven wiesen darauf hin, dass das Protein erst in einem späten Entwicklungsstadium produziert wird. Bei dritten Larven konnte keine, bei vierten Larven nur eine geringe AChE-Aktivität nachgewiesen werden. Nach gelelektrophoretischer Trennung und Färbung der Extrakte und ES-Produkte wurden fünf Isoformen des Enzyms identifiziert, die alle mit Serum IgG von natürlich und experimentell infizierten Rindern reagierten, wodurch ihre Antigenität demonstriert wurde. Das Enzym reagierte jedoch nicht mit dem Serum von mit röntgenattenuierten Larven vakzinierten Kälbern, was die Autoren darauf zurückführten, dass nicht genügend Larven ein Entwicklungsstadium erreichen, in dem ausreichend AChE produziert wird, um eine Immunantwort hervorzurufen. Dass es sich bei den fünf Isoformen um Produkte verschiedener Gene handelt, konnten Sequenzanalysen und Aktivitätsessays für zwei Formen bestätigen (LAZARI et al. 2003; SELKIRK et al. 2005). Weiterhin wurde eine gewebsständige Form der AChE identifiziert (LAZARI et al. 2004). Das protektive Potential der AChE wurde in einem Immunisierungsversuch überprüft (MCKEAND et al. 1995a). Meerschweinchen wurden mit einer AChE-angereicherten Fraktion der adulten ES-Produkte immunisiert. Eine weitere Gruppe erhielt nicht angereichertes
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ES-Produkt. Die Impfdosen enthielten 80 µg Protein beim nicht angereicherten ES- Produkt und 20 µg bei der angereicherten Fraktion sowie FIA bei der ersten und FCA bei der zweiten Immunisierung. Acht Wochen nach der zweiten Impfung wurden die Tiere mit 6000 L3 infiziert. Die mit der AChE-angereicherten Fraktion immunisierte Gruppe wies eine signifikante Reduktion der Wurmbürde im Vergleich zur Adjuvans- Kontrollgruppe auf (-64,8%). Im Gegensatz zum vorangegangen Immunisierungs- versuch mit ES-Produkten (MCKEAND et al. 1995b) zeigte jedoch die mit nicht- angereicherten ES-Produkten immunisierte Gruppe keine signifikante Reduktion der Wurmbürde (-43,4%). Die Autoren führten dies auf das veränderte Versuchsprotokoll zurück. Da nicht ausreichend Larven zur Verfügung standen, erfolgte die Infektion acht statt vier Wochen nach der zweiten Immunisierung. In einem Rinderimmunisierungsversuch mit rekombinanter AChE und Adulten-ES-Produkten konnte das protektive Potential der AChE nicht bestätigt werden (MATTHEWS et al.
2001). Für diesen Versuch wurde eine 10% kürzere Teilsequenz der AChE in einen Expressionsvektor kloniert und als His-getagtes Fusionsprotein in E. coli exprimiert.
Die Immunogenität des rekombinanten Proteins wurde durch die Reaktion mit dem Serum Dictyocaulus-infizierter Rinder und mit dem Serum von mit ES-Produkten immunisierten Meerschweinchen bestätigt. Die rekombinante AChE wies jedoch keine AChE-Aktivität auf. Im Immunisierungsversuch erhielt eine Gruppe zweimal im Abstand von vier Wochen 100 µg des aufgereinigten Fusionsproteins mit FIA. Eine weitere Gruppe Kälber wurde mit ES-Produkten immunisiert. Die Challengeinfektion erfolgte acht Wochen nach der zweiten Impfung. Obwohl die Tiere AChE-spezifische Antikörper bildeten, zeigte keine der beiden Immunisierungsgruppen eine Reduktion der Wurmbürde im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Fusionsprotein-immunisierte Gruppe hatte mit 97 Würmern sogar eine höhere mittlere Wurmbürde als die Kontrolltiere, bei denen im Durchschnitt 80 Würmer vorhanden waren. Mögliche Ursachen für den fehlgeschlagenen Versuch sehen die Autoren in der Versuchsdurchführung, aber auch im Enzym selbst. Rechtliche Grundlagen machten es notwendig, statt FCA wie in den vorhergegangen Versuchen, FIA als Adjuvans einzusetzten. Andere Autoren hatten bei einem Wechsel von FCA zu FIA ebenfalls einen Verlust des protektiven Potentials beobachtet. Weiterhin führten die Autoren
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auf, dass es sich bei der rekombinant hergestellten AChE nicht um ein vollständiges Transkript handelte und dass die Expression in E. coli aufgrund inkorrekter Faltung zu einem Verlust wichtiger immunogener Epitope geführt haben könnte. Insgesamt halten die Autoren die AChE nicht für einen geeigneten Vakzinekandidaten.
Das Vorhandensein stadienspezifischer Oberflächenantigene wurde von BRITTON et al. (1993) demonstriert. Mit dem Serum vakzinierter Rinder konnte die Oberfläche bescheideter L3 erkannt werden, jedoch nicht die von Adulten, Eiern und ersten Larven. Letztere Stadien wurden jedoch von Serumantikörpern patent infizierter Rinder detektiert. Dies zeigt, dass Adulte, Eier und erste Larven Oberflächenantigene besitzen, für die vakzinierte Tiere keine Antikörper bilden, da es hier nicht zur Ausbildung einer patenten Infektion kommt. Weiterhin demonstriert das Vorhandensein von Antikörpern gegen Obeflächenantigene von bescheideten L3, dass die infektiösen Stadien bei der Penetration der Darmwand ihre Scheide nicht abstreifen bzw. dass zumindest ein ausreichender Anteil die Scheide behält und eine Immunantwort im Wirt hervorruft. Mittels monoklonaler Antikörper identifizierten GILLEARD et al. (1995b) ein immunodominantes Antigen auf der Oberfläche der Scheide von dritten Larven. Dieses 29-40 kDa große Protein erwies sich als innerhalb strongylider Nematoden konserviert, da der monoklonale Antikörper auch Oberflächenproteine der Scheide diverser anderer Spezies detektierte. Jedoch detektierten Seren von mit gastrointestinalen Nematoden (H. contortus, C.
oncophora, O. ostertagi) infizierten Tieren dieses Antigen nicht, was von den Autoren darauf zurückgeführt wird, dass diese Parasiten während ihres Lebenszyklus im Verdauungstrakt verbleiben (GILLEARD et al. 1995a). Ob dieses Antigen ein effektives Ziel der Immunabwehr des Wirtes ist oder, da die Scheide frühzeitig während der Migration abgestreift wird, Teil der Strategie des Parasiten ist, den Immunmechanismen auszuweichen, konnte nicht geklärt werden.
Ein weiteres Antigen, dem eine wichtige Funktion im Infektionsgeschehen beigemessen wird, wurde von BRITTON et al. (1994) identifiziert. Die Autoren wiesen in ES-Produkten und Extrakten von Adulten und dritten Larven Superoxid- Dismutase-Aktivität nach. Superoxid-Dismutasen (SOD) katalysieren die Umwandlung von zwei Superoxidanionen (O2-) in Wasserstoffperoxid und
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molekularen Sauerstoff. Superoxidanionen werden während des „oxidatory burst“
von Phagozyten freigesetzt und schädigen Krankheiterreger durch die Oxidation von Membranen, Proteinen und Nukleinsäuren. Es wird davon ausgegangen, dass Parasiten SOD synthetisieren, um diese toxischen Substanzen zu neutralisieren. Bei D. viviparus identifizierten BRITTON et al. (1994) mehrere Isoformen des Enzyms, die alle ein Kupfer-Zink-Abhängigkeit aufwiesen. Nur eine Isoform war sowohl in den ES-Produkten als auch in den Adulten- und Larven-Extrakten vorhanden. Eine weitere, nur in ES-Produkten vorhandene Isoform wies darauf hin, dass die SOD tatsächlich von D. viviparus sezerniert wird. Die SOD-Aktivität konnte durch Serum- IgG von infizierten und vakzinierten Rindern inhibiert werden.
Ein immunodominantes Protein mit möglicher Rolle bei der Lungenpathologie im Verlauf der D. viviparus Infektion wurde von BRITTON et al. (1995) in somatischen Extrakten und ES-Produkten identifiziert und charakterisiert. Das DvA-1 (D. viviparus Antigen-1) weist Ähnlichkeiten zum ABA-1 von A. suum auf. Von diesem ist bekannt, dass es zu den Hauptallergenen des Parasiten gehört und eine IgE-Antwort induziert. Ferner konnte bei Brugia malayi infizierten Patienten eine Korrelation zwischen IgE-Reaktion auf das Allergen und der Entwicklung pathologischer Veränderungen gezeigt werden. In einem Schafmodel zur Untersuchung der lokalen Immunmechanismen in der Lunge nach Antigenapplikation zeigten COLLIE et al.
(2001), dass Schafe, die vorher durch systemische Applikation des rekombinanten DvA-1 sensibilisiert worden waren, auf die lokale Applikation des Antigens mit einem starken Anstieg an neutrophilen und eosinophilen Granulozyten in der BALF sowie mit einer lokalen Antikörperproduktion reagierten (siehe auch Punkt 2.1.4). Dies bestätigt die Rolle des DvA-1 im Pathomechanismus der Lungenwurminfektion. Als Vakzinekandidat ist dieses Antigen wahrscheinlich nicht geeignet, da mit einer Sensibilisierung gerechnet werden muss.
BRITTON u. MURRAY (2002) identifizierten bei D. viviparus eine innerhalb der Nematoden konservierte Cathepsin L Protease. In C. elegans konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym essentiell für die Embryonalentwicklung ist. RNA- Interferenz (RNAi) des Gens führte bei 98% der Embryonen zum Stillstand der
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Embryonalentwicklung in einer frühen Phase (HASHMI et al. 2002). Ob die Cathepsin L Protease immunogenes Potential hat, wurde nicht gezeigt.
KÖHRMANN (2002) immunisierte Rinder mit in E. coli exprimiertem Major Sperm Protein (MSP) (SCHNIEDER 1993b). Die Wurmbürde war in der immunisierten Gruppe um 71% niedriger. Dieses Ergebnis war jedoch aufgrund der geringen Tierzahl in der Impfgruppe (n = 3) statistisch nicht signifikant.
Um neue Vakzinekandidaten zu identifizieren, trennten MATTHEWS et al. (2004) Adulten-ES-Produkte mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese auf und testeten diese im Immunoblot. Hierbei wurden Seren von drei verschiedenen Meerschweinchenstämmen eingesetzt, die nach Immunisierung mit ES-Produkten eine Unterschiedliche Empfänglichkeit für Belastungsinfektionen gezeigt hatten.
Durch Vergleich der von den Seren im Immunoblot erkannten Spots wurden sieben Spots identifiziert, die nur mit den Seren von Meerschweinchen reagierten, die nach einer Immunisierung mit ES-Produkten signifikant geschützt waren. Bei der MALDI- TOF-Analyse dieser Spots wurde ein Protein als Major Sperm Protein, MSP;
(SCHNIEDER 1993b) identifiziert. Die Fingerprints der übrigen Proteine zeigten keine signifikanten Ähnlichkeiten mit Sequenzen anderer Nematoden. Die Autoren beabsichtigen Proteinsequenzierungen dieser Spots durchzuführen, um degenerierte Primer für die Amplifikation der Kandidaten konstruieren zu können (MATTHEWS et al. 2004).
2.3 Die Protein Disulfid Isomerase (PDI)
Die Protein Disulfid Isomerase wurde erstmals von GOLDBERGER et al. (1963) in Rattenleberlysaten identifiziert. Nachdem die PDI auch aus Humangeweben und diversen weiteren eukaryotischen Spezies isoliert werden konnte, wird heute davon ausgegangen, dass es sich um ein ubiquitär vorhandenes Protein handelt. Die PDI ist ein multifunktionales Enzym mit Hauptfunktionen bei der Ausbildung und Modifikation von Disulfidbrückenbindungen sowie als molekulares Chaperon und Untereinheit zweier Enzymkomplexe.
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2.3.1 Struktur der PDI und PDI-ähnlicher Enzyme
Neben der PDI existieren eine Reihe strukturell und funktionell ähnlicher Enzyme, die in der Familie der Protein Disulfid Isomerasen zusammengefasst werden. Die Enzymfamilie der humanen PDIs zählt bis heute 14 Mitglieder und drei weitere, nicht publizierte Sequenzen sind in Datenbanken zu finden (ELLGAARD u. RUDDOCK 2005). Aufgrund der Sequenzidentität der in dieser Arbeit identifizierten PDIs soll im folgenden Überblick in erster Linie auf die PDI selbst und auf das nahe verwandte Enzym Erp57 intensiver eingegangen werden.
Allen Protein Disulfid Isomerasen gemeinsam ist das Vorkommen mindestens einer Thioredoxin-ähnlichen Domäne, womit sie zur Thioredoxin-Superfamilie gehören.
Thioredoxin ist ein ubiquitär vorkommendes Protein mit einer Größe von etwa 100 Aminosäuren. Das Enzym besteht aus einer einzelnen Domäne mit einer zentralen fünfsträngigen β-Faltblattstruktur, die von vier α-Helices umgeben ist. Die beiden Cysteine des aktiven -Cys-Gly-Pro-Cys-Zentrums können eine intramolekulare Disulfidbrücke ausbilden, womit das Molekül an diversen Redoxreaktionen beteiligt ist (MARTIN 1995). Bereits die erste Sequenzierung der PDI aus Rattenleber-cDNA durch Edman et al. (1985) führte zur Aufstellung eines Vier-Domänen-Modells. Es wurden zwei Sequenzbereiche mit hoher Ähnlichkeit zueinander und zu Thioredoxin identifiziert. Diese als a und a’ bezeichneten Bereiche wiesen beide die Aminosäurenabfolge -Trp-Cys-Gly-His-Cys-Lys- auf, und es wurde vermutet, dass es sich um die aktiven Zentren des Enzyms handelt. Des Weiteren fanden sich im mittleren Teil des Proteins zwei Sequenzbereiche b und b’, die gewisse Ähnlichkeit zueinander aufwiesen, für die jedoch zuerst keine Identität zu anderen Proteinen identifiziert werden konnte. Die Autoren konnten mit ihrer Strukturanalyse nicht das gesamte Protein abdecken. Weitere Studien führten zur Aufstellung eines Sechs- Domänen-Modells mit der Struktur a-e-b-b’-a’-c (FREEDMAN et al. 1994). Aufgrund der Identität zu einer Östrogen-bindenden Domäne des humanen Östrogenrezeptors wurde zwischen der a- und der b-Domäne eine e-Domäne vermutet. Dieses Konzept wurde jedoch wieder verworfen und zur ursprünglichen vier-Domänen-Struktur zurückgekehrt, wobei die Domänengrenzen allerdings anders als ursprünglich definiert wurden (KEMMINK et al. 1997). Zusätzlich zu diesen vier Domänen findet