Larvenausscheidung und Wurmbürden

Am Tag 84 (= 21 dpi) war bei jeweils einem Tier der Al(OH)3-Kombi-Gruppe und der PDI-Quil-A-Gruppe jeweils eine Larve im Trichteransatz vorhanden. Am 23. Tag nach der Infektion waren alle Tiere patent. Lediglich bei einem Rind der PDI-Quil-A-Gruppe setzte die Larvenausscheidung erst am 24. Tag p.i. ein. Diese Beobachtung deckt sich mit den Angaben anderer Autoren. PFEIFFER (1971) ermittelte ein Einsetzten der Larvenausscheidung zwischen dem 20. und 25. Tag p.i., wobei in den meisten Fällen am Tag 23 die ersten Larven im Kot zu finden waren. In den in dieser Arbeit durchgeführten Immunisierungsversuchen konnten keine Unterschiede zwischen den Kontroll- und Impfgruppen bezüglich des Einsetzens der Patenz festgestellt werden. Sowohl die tägliche als auch die Gesamtlarvenausscheidung der Einzeltiere wies sehr hohe Standardabweichungen auf. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Eine interessante Beobachtung konnte allerdings bei der Gesamtlarvenausscheidung der Gruppen im ersten Immunisierungsversuch gemacht werden. Die Impfgruppen, in denen jeweils das gleiche Adjuvans eingesetzt wurde, wiesen annähernd gleiche Gesamtlarvenzahlen auf. Hierbei wurden in den Al(OH)3-Impfgruppen mit 25446 und

162 Diskussion

25943 etwa doppelt so viele Larven ausgeschieden, wie in den Quil A-Gruppen, bei denen insgesamt 11537 bzw. 12500 Larven vorhanden waren. Die Kontrollgruppe wies mit 32716 eine Gesamtlarvenausscheidung im Bereich der Al(OH)3 -Impfgruppen auf. Ob es sich bei diesen Beobachtungen um zufällige Ergebnisse oder um den Ausdruck einer Adjuvans-abhängigen Stimulation der Immunantwort mit unterschiedlichen Effekten auf die Fekundität der Würmer handelt, kann nicht beurteilt werden. Möglich wäre, dass der beobachtete Effekt auf einer unspezifischen Stimulierung des Immunsystems beruht. Diese Eigenschaft ist bei Quil A, jedoch nicht bei Al(OH)3 vorhanden. Dass die ermittelten Unterschiede in den Gesamtlarvenzahlen nicht auf eine unterschiedlich starke Etablierung der Würmer in den Lungen zurückzuführen waren, zeigten die nach der Sektion ermittelten Wurmzahlen. Hierbei zeigte sich, dass sowohl die Kombi-Gruppen, als auch die PDI-Gruppen untereinander ähnliche mittlere Befallsstärken aufwiesen. In den Kombi-Gruppen waren im Mittel 376 (Al(OH)3) bzw. 353 (Quil A), in den PDI-Gruppen 607 (Al(OH)3) bzw. 520 (Quil A) Würmer vorhanden.

Insgesamt betrachtet konnten bei den Befallsstärken keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Die beiden Kombi-Gruppen des ersten Immunisierungsversuchs zeigten mit mittleren Befallsstärken von 376 und 353 Würmern tendenziell eine geringere Wurmbürde als die Kontrollgruppe, deren Tiere eine mittlere Wurmbürde von 557 aufwiesen. Sollte es sich hierbei um einen Effekt der Immunisierung handeln, so ist dieser nicht auf die PDI-Komponente im Kombi-Impfstoff zurückzuführen, da die immunisierten Gruppen, die ausschließlich die PDI-Vakzine erhielten, mit 607 (PDI Al(OH)3) und 520 (PDI Quil A) Würmern pro Tier Befallsstärken im Rahmen der Kontrollgruppe aufwiesen. Betrachtet man jedoch die mittleren Wurmbürden aus Sicht der Etablierung der Infektion, so befinden sich auch die Kombi-Gruppen mit einer Etablierungsrate von 3,8% bis 25,3% in einem Bereich der standardmäßig bei experimentellen Infektionen erreicht wird. Weiterhin war im zweiten Immunisierungsversuch der Unterschied in der mittleren Befallsstärke zwischen der Kombi-Impfgruppe und der Kontrollgruppe wesentlich geringer als im ersten Versuch. Hier waren bei der Kontrollgruppe im Mittel 614 und bei den immunisierten Tieren 548 Würmer vorhanden. Dies zeigt, dass die im ersten Versuch

Diskussion 163

beobachteten geringeren Befallsstärken der Kombi-Impfgruppen vorsichtig zu beurteilen sind.

Eine Beobachtung, die konstant bei allen Versuchstieren gemacht werden konnte, war, dass grundsätzlich mehr weibliche als männliche Würmer vorhanden waren.

Das Verhältnis weiblich zu männlich schwankte hierbei zwischen 1,3:1 und 2,0:1 bei den Kontrolltieren und zwischen 1,1:1 und 2,4:1 bei den immunisierten Tieren. Dieser Sachverhalt wurde auch von PFEIFFER (1971) beschrieben. Hier fanden sich bei sechs experimentell infizierten Rindern Verhältnisse von weiblichen zu männlichen Würmern zwischen 1,1:1 und 1,4:1. Hieran zeigt sich, dass die Immunisierung keinen unterschiedlichen Effekt auf weibliche und männliche Würmer hatte, wie dies etwa für Darmoberflächenantigene bei verschiedenen blutsaugenden Nematoden beschrieben wurde. Ein derartiger Effekt war auch aufgrund der anderen Biologie von D. viviparus und vermuteten Lokalisation des Impfproteins nicht zu erwarten.

Die Bestimmung der Wurmgröße zeigte, dass in allen immunisierten Gruppen des ersten Versuchs sowohl weibliche als auch männliche Würmer eine geringere Körperlänge aufwiesen als die der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse waren jedoch nicht signifikant. Im zweiten Immunisierungsversuch waren die Würmer der Kombi-Impfgruppe ebenfalls kürzer als die der Kontrollgruppe, jedoch zeigte sich in diesem Versuch, dass die Würmer grundsätzlich kleiner waren, als im ersten Versuch. So hatten etwa die männlichen Würmer der Kontrollgruppe im zweiten Versuch etwa die gleiche Länge wie die männlichen Würmer der PDI-Quil-A-Impfgruppe im ersten Versuch. Insgesamt konnte beobachtet werden, dass die Wurmgrößen innerhalb eines Versuchstieres wenig schwankten, jedoch zwischen den Rindern deutliche Unterschiede vorhanden waren. So existierte beispielsweise in der Kontrollgruppe des zweiten Versuchs eine Differenz der mittleren Wurmlängen von annähernd 15 mm zwischen dem Rind mit den kürzesten und dem mit den längsten weiblichen Würmern. Es war in beiden Versuchen eine positive Korrelation zwischen der Wurmlänge und der Wurmbürde vorhanden. Allerdings konnte kein konstanter Zusammenhang zwischen Wurmlänge/Wurmbürde und Körpergewicht des Versuchstieres festgestellt werden. Während diese Parameter im ersten Versuch negativ korreliert waren, zeigte sich im zweiten Versuch, dass die schwersten Tiere

164 Diskussion

die meisten und längsten Würmer beherbergten. Die Beobachtung einer vom Körpergewicht unabhängigen Etablierung der Lungenwürmer wurde bereits von PFEIFFER (1971) gemacht und zeigt auf, welche starken individuellen Unterschiede bei einer Infektion vorhanden sind. Weiterhin konnte kein konstanter Zusammenhang zwischen Befallsstärke und Schwere der klinischen Symptome festgestellt werden.

Sowohl Tiere mit einer hohen Wurmbürde als auch Tiere, die geringere Befallsraten aufwiesen, zeigten ein klinisches Bild, dass einer medikamentösen Behandlung bedurfte. Dies ist wahrscheinlich auf eine individuell unterschiedliche Empfänglichkeit für Sekundärinfektionen, die zu einer Verkomplizierung des Krankheitsbildes führten, zurückzuführen und spiegelte sich auch in den pathologisch-anatomischen Befunden an den Lungen wieder. Zum Teil wiesen auch Tiere mit einer geringeren Wurmbürde ausgedehnte Lungenveränderungen auf.

Die Bestimmung des Differentialblutbildes erwies sich als wenig aussagekräftig. Eine absolute Eosinophilie konnte nur bei vier Tieren beobachtet werden. Da allerdings erst drei Wochen nach der Infektion eine Bestimmung des Differentialblutbildes erfolgte, ist möglicherweise ein vorher vorhandener Anstieg unentdeckt geblieben.

PFEIFFER (1971) beobachtete einen ersten Anstieg der eosinophilen Granulozyten in der zweiten Woche p.i.. Danach sanken die Werte teilweise wieder ab und stiegen erst fünf bis sechs Wochen später wieder an. Weiterhin wird von einem Fehlen der Eosinophilie bei wenig abwehrkräftigen Tieren und von einem Absinken oder Verschwinden der Zellen in schweren Krankheitsphasen berichtet. Welche Ursache für eine fehlende Eosinophilie in den hier durchgeführten Versuchen zugrunde liegt, kann aufgrund der wenigen Zeitpunkte der Bestimmung des Blutbildes nicht ermittelt werden. Die übrigen Parameter des weißen Blutbildes zeigten keine Veränderungen, die konstant mit der Infektion in Zusammenhang gebracht werden könnten. Eine von PFEIFFER (1971) beobachtete Neutropenie konnte nur relativ und unregelmäßig beobachtet werden.

5.4.4 Ergebnisse der serologischen Untersuchungen

Die Rolle der humoralen Immunität bei der Immunantwort auf eine Infektion mit D.

viviparus wurde noch nicht vollständig geklärt. Während nachgewiesen werden konnte, dass eine passive Immunisierung mit dem Serum infizierter Rinder möglich

Diskussion 165

ist (JARRETT et al. 1957), konnten KOOYMAN et al. (2002) keinen Zusammenhang zwischen Protektion und der Höhe an IgA, IgG1, IgG2 und IgM ermitteln. Die Autoren fanden jedoch eine Korrelation zwischen dem Gesamt-IgE-Titer und der Protektion bei Reinfektion.

Mittels ELISA wurde die Bildung von Anti-PDI-Antikörpern der Klassen IgG, IgG1, IgG2, IgA und IgM untersucht. Eine Untersuchung auf IgE-Antikörper konnte nicht durchgeführt werden, da ein Rinder Anti-IgE-Konjugat nicht kommerziell erhältlich war. Alle Tiere zeigten zwischen dem vierten und elften Tag nach der ersten Immunisierung einen Titeranstieg bei allen untersuchten Antikörperklassen. Die Titer blieben während des gesamten Versuchs gleichbleibend hoch. Da es nicht gelang, reine PDI ohne GST und bakterielle Kontaminanten zu gewinnen, wurde im ELISA das Impfprotein eingesetzt. Es ist also nicht auszuschließen, dass ein Teil des Titeranstiegs auf einer Serokonversion auf GST oder bakterielle Kontaminanten beruhte. Dass der Titeranstieg nicht ausschließlich auf nicht-PDI-Proteine zurückzuführen war, wurde im Western-Blot überprüft. Anhand von D. viviparus Rohantigen zeigte sich, dass die Seren vakzinierter Rinder spezifisch eine Bande auf Höhe der PDI erkannten. Auf einen ELISA mit reinem GST wurde verzichtet, da ein Vergleich mit dem Impfprotein-ELISA und eine quantitative Aussage bezüglich des Anteils am Titeranstieg nicht möglich gewesen wäre. Ein Vorhandensein GST-spezifischer Antikörper bei den Tieren der Kombigruppe wurde von VON HOLTUM (persönliche Mitteilung) nachgewiesen. Der Nachweis PDI-spezifischer Antikörper zeigte, dass die in E. coli rekombinant hergestellte PDI zumindest teilweise in ihrer Konformation dem nativen Protein entsprechen muss und antigene Determinanten vorhanden sind. Bezüglich der Höhe der Antikörperspiegel konnten keine Unterschiede zwischen den Gruppen, die Al(OH)3 als Adjuvans und denen, die Quil A erhalten hatten, festgestellt werden. Dies und der in allen Gruppen ähnlich frühe Anstieg der Antikörper sprechen dafür, dass beide Adjuvantien die Immunabwehr in gleichem Maße positiv beeinflusst haben. Ein Antikörperanstieg in den Kontrollgruppen als Reaktion auf das natürliche Antigen nach der Infektion war wesentlich geringer und nur bei IgG und IgG1 vorhanden. Bei IgG1 zeigten beide Kontrollgruppen, bei IgG die Kontrollgruppe des ersten Versuchs ab Tag 91 (28 dpi)

166 Diskussion

eine Immunantwort. Bei der Kontrollgruppe des zweiten Versuchs waren bereits sieben Tage nach der Infektion IgG-Antikörper vorhanden. Die geringen Titer an PDI-spezifischen Antikörpern in den Kontrollgruppe nach der experimentellen Infektion können unterschiedlich interpretiert werden. Möglich wäre, dass die native PDI doch weitere Epitope besitzt, die immunogen wirken und die hierauf gebildeten Antikörper nicht anhand des rekombinanten Proteins detektiert werden können. Dies hieße, dass ein prokaryotisches Expressionssystem für die PDI nicht geeignet ist.

Eine andere Erklärung wäre, dass das Protein während der Infektion nicht zugänglich ist und damit dem Immunsystem nicht präsentiert werden kann. Der Anstieg der Antikörper in den Kontrollgruppen könnte hierbei auf das Freiwerden des Proteins aus toten Larven oder Adulten zurückgeführt werden. Hauptgrundlage des Einsatzes der PDI als Vakzinekandidat war die von verschiedenen Autoren bei anderen Helminthen nachgewiesene Immunogenität und extrazelluläre Lokalisation des Proteins. So konnte die PDI bei O. ostertagi in ES-Produkten von vierten Larven und Adulten detektiert werden. Das Protein wurde ferner vom Serum Ostertagia-infizierter Rinder erkannt (GELDHOF et al. 2003). Eine Lokalisation im ES-Material von Larven und Adulten wurde des Weiteren für Dirofilaria immitis beschrieben (CHANDRASHEKAR et al. 1998) und auch in ES-Produkten des Trematoden F.

hepatica konnte die PDI nachgewiesen werden (SALAZAR-CALDERON et al. 2003).

Da keine Möglichkeit zur Gewinnung von ES-Produkten bestand, erfolgte im Vorfeld keine Überprüfung, ob die PDI hierin vorhanden ist, sondern es wurde lediglich überprüft, ob das rekombinante Protein vom Serum D. viviparus-infizierter Rinder erkannt wird. Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass die PDI von D.

viviparus nicht sezerniert wird.