Identifizierung, Expression und Charakterisierung der Protein Disulfid Isomerase von
Ancylostoma caninum
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Stefanie Pohl aus Hannover
Hannover 2006
Identifizierung, Expression und Charakterisierung der Protein Disulfid Isomerase von
Ancylostoma caninum
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Stefanie Pohl aus Hannover
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder
2: Gutachter: Univ. Prof. Dr. rer.nat. Dr. med.habil. E. Töpfer-Petersen
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2006
Für meine Eltern, Christian und Jonas
Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
C.EPE,S.POHL,C.STRUBE,G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA,T.SCHNIEDER (2005):
„Identification, expression and characterisation of protein disulfide isomerase of Ancylostoma caninum“
Keystone Symposium of Molecular Helminthology, Coppermountain, USA, 9.-13.04.2005
C.EPE,S.POHL,C.STRUBE,G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA,T.SCHNIEDER (2005):
„Identifikation, Expression und Charakterisierung einer Protein Disulfid Isomerase von Ancylostoma caninum“
Tagung der DVG-Fachgruppe „Epidemiologie und Bekämpfung von Parasitosen“, Potsdam, 22.-24.06.2005
C.EPE,S.POHL,C.STRUBE,G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA,T.SCHNIEDER (2005):
„Identification, expression and characterisation of protein disulfide isomerase of Ancylostoma caninum“
Proceedings of the 20th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology,
Christchurch, New Zealand, 16.-20. 10.2005
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT... 3
2.1 Hakenwürmer (Ancylostomatidae) ... 3
2.1.1 Ancylostoma caninum... 3
2.1.1.1 Morphologie... 3
2.1.1.2 Entwicklung und Epidemiologie... 4
2.1.1.3 Klinik, Pathogenese und Pathologie ... 6
2.1.1.4 Immunität... 7
2.1.1.5 Diagnose ... 8
2.1.1.6 Therapie und Prophylaxe ... 8
2.1.1.7 A. caninum-Infektion des Menschen... 9
2.2 Impfstoffe gegen tiermedizinisch relevante Helminthen... 11
2.2.1 Proteine als Kandidaten für einen Impfstoff... 12
2.2.2 Kohlenhydrate als Kandidaten für einen Impfstoff... 14
2.3 Entwicklung eines Impfstoffes gegen Hakenwürmer ... 15
2.3.1 Gründe für die Entwicklung eines Impfstoffes gegen Hakenwürmer ... 15
2.3.2 Vakzinierung mit lebenden infektiösen Larven, Ösophagus-Extrakten adulter A. caninum und röntgenbestrahlten Larven... 16
2.3.3 Gentechnisch hergestellte Vakzinen ... 19
2.3.3.1 Von infektiösen dritten Larven sezernierte Antigene ... 20
2.3.3.2 Antigene adulter A. caninum... 24
2.3.3.3 Vakzinierungsversuche mit rekombinanten Proteinen... 34
2.4 Protein Disulfid Isomerase (PDI)... 36
2.4.1 Struktur der PDI ... 36
2.4.2 Funktionen der PDI ... 38
2.4.2.1 Die Redox-Isomerase-Funktion der PDI... 38
2.4.2.2 Die Chaperon-Funktion der PDI ... 39
2.4.2.3 Die PDI als ß-Untereinheit der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase... 40
2.4.2.4 Die PDI als Untereinheit des mikrosomalen Triglycerid-Transfer-
Proteins ... 41
2.4.2.5 Weitere Funktionen der PDI ... 41
2.4.3 PDIs der Nematoden... 42
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN ... 47
3.1 Material ... 47
3.1.1 Medien und Platten ... 47
3.1.2 Lösungen und Puffer... 47
3.1.3 Vektoren und Bakterien... 48
3.1.4 Enzyme ... 48
3.1.5 Geräte ... 48
3.1.6 Reaktions-Kits ... 49
3.1.7 Reagenzien ... 50
3.1.8 Einwegartikel... 50
3.2 Methoden... 51
3.2.1 Anzüchtung der Klone in einer Flüssigkultur ... 51
3.2.2 Isolierung der Plasmid-DNA ... 51
3.2.2.1 Miniprep... 51
3.2.2.2 Midiprep... 52
3.2.2.3 Konzentrationsmessung der Plasmid-DNA ... 52
3.2.3 Sequenzierung ... 53
3.2.3.1 Automatische Sequenzierung des Inserts ... 53
3.2.3.2 Sequenzbearbeitung und Sequenzvergleich ... 53
3.2.4 mRNA-Isolierung... 54
3.2.5 Isolierung genomischer DNA... 55
3.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)... 56
3.2.6.1 5´- und 3´-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ... 57
3.2.6.2 Klonierung der gesamten cDNA in einen Vektor ... 61
3.2.6.3 PCR mit genomischer DNA und spezifischen Primerpaaren... 62
3.2.7 Agarosegelelektrophorese zur Darstellung von Nukleinsäuren... 63
3.2.8 Isolierung von PCR-Fragmenten aus Agarosegelen ... 64
3.2.9 Klonierung der PCR-Produkte... 64
3.2.9.1 Ligation des PCR-Produkts in den Plasmidvektor ... 65
3.2.9.2 Transformation ... 65
3.2.9.3 Analyse mittels Plattenkultur ... 65
3.2.9.4 Anlegen der Flüssigkulturen ... 66
3.2.10 cDNA-Synthese... 66
3.2.10.1 Erststrang-cDNA-Synthese ... 66
3.2.10.2 Zweitstrang-cDNA-Synthese mittels Long Distance (LD)-PCR ... 67
3.2.11 Expression des PDI-Gens ... 68
3.2.11.1 Gateway® Technologie ... 68
3.2.11.2 PCR zur Klonierung der cDNA des PDI-Gens in den Entry-Vektor ... 68
3.2.11.3 Herstellung des Entry-Klons ... 70
3.2.11.4 LR-Rekombinations-Reaktion... 70
3.2.11.5 pET160-DEST-Vektor und Lumio™-Technologie... 71
3.2.11.6 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE) ... 73
3.2.12 Bioinformatik ... 74
3.2.12.1 Vorhersage-Methoden des ExPASy-servers ... 76
3.2.12.1.1 SignalP 3.0...76
3.2.12.1.2 TMHMM 2.0 ...77
3.2.12.1.3 NetNGlyc 1.0...77
3.2.12.1.4 NetOGlyc 3.1...78
3.2.12.1.5 YinOYang 1.2...79
3.2.12.1.6 Myristoylator...79
3.2.12.1.7 NetPhos 2.0 ...80
3.2.12.1.8 Sulfinator ...80
3.2.12.1.9 ProtParam ...80
3.2.12.2 Sequenzanalyse- und Vorhersage-Methoden des PredictProtein- servers... 82
3.2.12.2.1 PROSITE ...82
3.2.12.2.2 SEG...82
3.2.12.2.3 ProDom ...82
3.2.12.2.4 PSI-BLAST...83
3.2.12.2.5 MaxHom...83
3.2.12.2.6 DISULFIND ...84
3.2.12.2.7 PHD...84
3.2.12.2.8 GLOBE...85
3.2.12.2.9 ASP ...85
3.2.12.2.10 PROF ...85
4 EIGENE ERGEBNISSE... 87
4.1 Identifizierung der cDNA des PDI-Gens von A. caninum... 87
4.1.1 Überprüfung verschiedener Klone... 87
4.1.2 5´- und 3´-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ... 88
4.1.3 Identifizierung des 3´-Endes der cDNA ... 91
4.1.4 Klonierung der gesamten cDNA in einen Vektor ... 95
4.1.5 Alignment der cDNA- und der Aminosäure-Sequenz der PDI mit PDIs anderer Spezies ... 96
4.1.6 Suche nach konservierten Domänen ... 98
4.1.7 Herstellung weiterer Klone, die die gesamte cDNA-Sequenz enthalten ... 98
4.2 Identifizierung der genomischen DNA des PDI-Gens von A. caninum... 99
4.3 Expression des PDI-Gens von A. caninum... 104
4.3.1 PCR zur Klonierung der cDNA des PDI-Gens in den Entry-Vektor ... 104
4.3.2 Herstellung des Entry-Klons... 105
4.3.3 LR-Rekombinations-Reaktion ... 106
4.3.4 Visualisierung des Proteins mit der Lumio™ Technologie ... 107
4.4 Bioinformatik ... 108
4.4.1 Ergebnisse des ExPASy-servers ... 108
4.4.2 Ergebnisse des PredictProtein-servers ... 112
4.4.3 Übersicht der Bioinformatik-Ergebnisse ... 117
5 DISKUSSION ... 119
5.1 cDNA-Sequenz des PDI-Gens von A. caninum... 120
5.2 Genomische DNA-Sequenz des PDI-Gens von A. caninum... 124
5.3 Expression des PDI-Gens von A. caninum... 125
5.4 Bioinformatik ... 128
5.5 Schlussfolgerung und Ausblick ... 135
6 ZUSAMMENFASSUNG... 137
7 SUMMARY ... 139
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 141
A. ANHANG ... 177
A.1. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 177
A.2. PRIMERPAARE DER GENOMISCHEN DNA ... 180
A.3. SYMBOLE DER AMINOSÄUREN... 181
A.4. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 182
A.5. TABELLENVERZEICHNIS... 184
EINLEITUNG
1 Einleitung
Hakenwürmer der Gattungen Uncinaria und Ancylostoma zählen neben den Nema- toden der Gattungen Toxocara und Toxascaris zu den häufigsten Helminthen des Hundes. Während Uncinaria stenocephala in unseren Breitengraden am häufigsten auftritt, kommt Ancylostoma caninum hauptsächlich in den Tropen und Subtropen, vereinzelt aber auch in Europa vor. Infektionen mit dritten A. caninum-Larven können perkutan, per os oder galaktogen erfolgen. Perkutan in die Haut eingedrungene Lar- ven führen im Wirt eine Blut-Lungen-Wanderung durch, an dessen Ende sie sich im Dünndarm ansiedeln und sich zum Adultstadium häuten. Nach oraler Infektion ge- langen die meisten Larven direkt in den Magen-Darm-Kanal. Eine wichtige Rolle spielt die galaktogene Übertragung dritter Larven auf die Welpen. Durch hormonelle Veränderungen erfolgt deren Reaktivierung in der Hündin. Sie führen eine transso- matische Wanderung in die Milchdrüse durch und gelangen in die Muttermilch. Bei den Welpen zeigen sich eine verzögerte Entwicklung, Durchfall, Husten und Anämie.
Nach akutem oder perakutem Verlauf können Todesfälle auftreten. Die Therapie der Ancylostomose erfolgt durch wiederholte Behandlungen mit Anthelminthika verschie- dener Wirkstoffgruppen.
Dritte Larven von A. caninum sind zudem humanpathogen. Sie können beim Men- schen ein Syndrom, genannt „ground itch“ hervorrufen, das mit lokalem Juckreiz, Rötung und Ödematisierung der Haut einhergeht. Weiterhin sind sie Auslöser der eosinophilen Enteritis, die sich in unspezifischen Symptomen wie Abdomi- nalschmerz, Appetitlosigkeit, Übelkeit und Durchfall äußert. Dabei handelt es sich um eine Hypersensibilitätsreaktion, die durch ein von den Hakenwürmern in die Mukosa des Darms injiziertes Allergen verursacht wird.
Infektionen mit den Hakenwürmern Necator americanus und Ancylostoma duodenale treten beim Menschen in Ländern der Subtropen und Tropen auf. Bei Erwachsenen können diese asymptomatisch verlaufen oder mit Bauchschmerzen, Dyspnoe, Ge- lenk- und Kopfschmerzen einhergehen. Besonders Frauen und Kinder sind für den aus der Hakenwurm-Infektion resultierenden Blutverlust mit folgender Eisenmangel- Anämie anfällig. Aufgrund der Ausbildung einer unzureichenden Immunität gegen
Hakenwürmer, der hohen Reinfektionsrate nach anthelminthischer Behandlung so- wie der Gefahr von Benzimidazol-Restistenzen wurde nach alternativen Möglichkei- ten zur Eindämmung der Hakenwurm-Infektion gesucht. Eine solche Möglichkeit stellt die Entwicklung eines Impfstoffes dar. Da sich die A. caninum-Infektion des Hundes und die A. duodenale-Infektion des Menschen sehr ähneln, das Genom beider Würmer hohe Identitäten aufweist und A. caninum jederzeit aus zu Versuchs- zwecken infizierten Hunden zur Verfügung steht, wurden verschiedene Proteine dieses Hakenwurms identifiziert, die in rekombinanter Form in Immunisierungsversu- chen mit Mäusen und Hunden eingesetzt werden. Durch die Versuche soll überprüft werden, ob die Antigene einen Schutz vor Hakenwurm-Infektionen verleihen und sich als Bestandteil eines Impfstoffes eignen. Da die Gefahr einer Resistenzentwicklung der Würmer ebenso gegen beim Hund eingesetzte Anthelminthika existiert, bietet auch hier die Vakzine-Entwicklung eine alternative Methode zur Kontrolle der Ha- kenwurm-Infektion.
Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung der Protein Disulfid Isomerase (PDI) von A. caninum, die ein potentielles Vakzine-Antigen darstellt. Es soll die cDNA- sowie die genomische DNA-Sequenz des PDI-Gens identifiziert werden. Desweiteren soll die PDI als rekombinantes Protein von einem prokaryotischen Expressionsvektor produziert und bioinformatische Daten sollen durch verschiedene Methoden zur Berechnung posttranslationaler Modifikationen, physiko-chemischer Parameter, Sequenz-Identitäten und Sekundärstruktur-Merkmalen aufgezeigt werden.
LITERATURÜBERSICHT
2 Literaturübersicht
2.1 Hakenwürmer (Ancylostomatidae)
Hakenwürmer (Ancylostomatidae) gehören zum Stamm der Nematoda (Rundwür- mer), zur Klasse der Chromadorea und zur Ordnung der Rhabditida. Das weltweite Vorkommen der verschiedenen Hakenwurmarten ist stark klimaabhängig. Beim Hund und anderen Kaniden sind in Europa Uncinaria stenocephala RAILLET 1884 und Ancylostoma caninum ERCOLANI 1859 anzutreffen. Aufgrund seiner Anpassung an gemäßigtes und subarktisches Klima kommt U. stenocephala in unseren Breitengra- den am häufigsten vor, während A. caninum hauptsächlich in den Tropen und Sub- tropen anzutreffen ist. Das Vorkommen von A. ceylanicum LOOSS 1911 ist dagegen vollkommen auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Die Katze ist welt- weit Wirt des Hakenwurms A. tubaeforme ZEDER 1800 und zum Teil auch von U. stenocephala. Infektionen mit A. braziliense GOMEZ DE FARIA 1910 und A. ceylanicum treten dagegen wieder nur in den Tropen und Subtropen auf. Haken- wurm-Infektionen bei Rindern werden in Mitteleuropa durch Bunostomum phleboto- mum RAILLET 1900 und bei Schaf und Ziege durch B. trigonocephalum RUDOLPHI
1808 hervorgerufen. Necator americanus und A. duodenale sind die Hakenwürmer des Menschen. Während N. americanus weltweit auftritt, ist A. duodenale sehr geo- graphisch begrenzt. Die drei Spezies A. caninum, A. braziliense und A. ceylanicum besitzen zoonotisches Potential und können somit auch den Menschen infizieren.
2.1.1 Ancylostoma caninum 2.1.1.1 Morphologie
Bei dem Hakenwurm des Hundes, A. caninum, handelt es sich um einen kleinen durchsichtigen Nematoden. Die Männchen werden 5-14 mm lang, während weibliche Würmer 15-21 mm lang werden können. Spezifisch für diese Hakenwurmart ist das nach dorsal abgebogene Vorderende mit einer großen Mundkapsel in der ebenfalls nach dorsal gerichteten Mundöffnung. Die Mundkapsel besitzt am ventralen Rand ein Paar Schneidplatten, deren Ränder sägeartig geformt sind und je drei zahnartige
Gebilde tragen (HARTWICH 1994). Die ovalen dünnschaligen Eier sind 52-79 x 25-58 µm groß und enthalten in frischem Zustand 4 bis 8 Furchungszellen.
2.1.1.2 Entwicklung und Epidemiologie
Zu den definitiven Wirten von A. caninum gehören neben dem Hund auch der Fuchs, der Wolf, der Kojote und andere Wildkaniden (ANDERSON 1992).
Eine Infektion mit dritten Larven (L3) von A. caninum kann perkutan, per os oder galaktogen erfolgen. Diese entwickeln sich in der Außenwelt aus Eiern, die mit dem Kot ausgeschieden werden. Bei einem Temperaturoptimum von 25-30°C ist die Ent- wicklung zur L3 innerhalb von 4-5 Tagen abgeschlossen. Neben der passiven oralen Aufnahme der infektiösen L3 ist diese auch befähigt, aktiv aus dem Kot auszuwan- dern. Während der Migration bis zum Eindringen in die Haut des Wirtes muss sie ununterbrochen von einem Feuchtigkeitsfilm umgeben sein. Weitere äußere Reize, wie Vibration, Wärme und Kohlendioxid spielen eine bedeutende Rolle bei der Wirts- findung (ANDERSON 1992). Bei der folgenden perkutanen Infektion dringen die Larven in die intakte Haut ein (LOOSS 1903, 1904, 1905, 1911). Es wurde vermutet, dass dieser Vorgang durch eine Hyaluronidase (OSHIO u. FURATA 1955) und/oder eine Kollagenase (LEWERT u. LEE 1954, 1956) vermittelt wird. Nach MATTHEWS (1975) soll es allerdings ein rein mechanischer Vorgang sein, was durch die Isolierung der Hya- luronidase (HOTEZ et al. 1994) und der Cystein-Proteinasen (DOWD et al. 1994) wider- legt werden konnte. Über die Haarwurzelscheiden und Anhangdrüsen gelangen die dritten Larven von der Epidermis in die Subkutis, wo sie in die Lymphgefäße und venöse Kapillaren übertreten. Von dort aus führen sie eine Blut-Lungen-Wanderung durch (LOOSS 1905, 1911), d.h. sie erreichen mit dem venösen Blut das rechte Herz und anschließend die Lunge. Nach Übertritt ins Bronchialsystem führt ihr weiterer Weg über Trachea, Pharynx, Larynx und Ösophagus in den Magen-Darm-Kanal, wo sie sich vornehmlich im Jejunum ansiedeln. Dort wird die Häutung zum Adultstadium vollzogen, nachdem sie sich bereits in den Drüsen von Magen oder Dünndarm zum Stadium 4 gehäutet haben (STOYE 1983). Einige Larven führen nach der perkutanen Infektion eine somatische Wanderung durch verschiedene Gewebe durch, an dessen Ende sie sich hauptsächlich in der quergestreiften Muskulatur und im Fettgewebe
befinden. Als hypobiotische L3 können sie dort mehrere Jahre verbleiben, um später bei der galaktogenen Infektion eine wichtige Rolle zu spielen.
Nach oraler Infektion mit frei lebenden L3 gelangen diese meist direkt in den Magen- Darm-Kanal und nur wenige führen die oben beschriebene Blut-Lungen-Wanderung durch. Dieses führt zu einem wesentlich stärkeren intestinalen Befall als nach perku- taner Infektion (STOYE 1983). Die Larven wandern dabei in die Magendrüsen oder Lieberkühnschen Krypten des Dünndarms ein, von wo sie nach ein paar Tagen in das Darmlumen zurückkehren, sich zum Stadium 4 häuten und zum adulten Haken- wurm entwickeln (STOYE 1983; ANDERSON 1992).
Ein weiterer Infektionsweg ist die Aufnahme der dritten Larven mit der Muttermilch (galaktogene oder transmammäre Infektion). Dabei führen die durch hormonelle Veränderungen reaktivierten hypobiotischen Larven oder auch gerade erst die Hün- din infizierte L3 eine transsomatische Wanderung in die Milchdrüse durch. Die Lar- venausscheidung mit der Milch ist in der ersten Woche nach der Geburt der Welpen am höchsten, je nach Infektionsdosis können aber bis zum Ende der Säugeperiode Larven ausgeschieden werden (GEISER et al. 1992). Selbst in späteren Trächtigkeiten können die noch in der Muskulatur bzw. im Fettgewebe verharrenden Larven reakti- viert und post partum mit der Milch ausgeschieden werden, ohne dass eine erneute Infektion des Muttertieres stattgefunden haben muss. Die Stärke und die Dauer der Larvenausscheidung nehmen allerdings mit steigender Laktationszahl ab. Die durch die Milch auf die Welpen übertragenen Larven führen meist keine Blut-Lungen- Wanderung durch, sondern erreichen direkt den Intestinaltrakt. Nicht alle reaktivier- ten Larven in der Hündin wandern in die Milchdrüse ein, einige erreichen erneut über die Lunge, Trachea, Pharynx, Larynx und Ösophagus den Magen-Darm-Kanal. So kann es nach jeder Geburt zu einer endogenen Autoinfektion kommen (GEISER et al.
1992).
Neben der oralen Infektion mit frei lebenden L3 oder L3 mit der Muttermilch können diese auch mit paratenischen Wirten, wie Nagetieren, vom definitiven Wirt aufge- nommen werden (MILLER 1970). Die Präpatenz von A. caninum wird von verschiede- nen Autoren ähnlich angegeben. Sie liegt bei Welpen zwischen 14-16 (SARLES 1929),
15-18 (HERRICK 1928), 12-16 (STONE et al. 1970), bzw. 15-17 (STOYE 1973) Tagen und bei adulten Tieren zwischen 15-26 Tagen (HERRICK 1928). In Abb. 1 ist der Ent- wicklungszyklus von A. caninum mit den möglichen Infektionswegen dargestellt.
Abb. 1: Entwicklungszyklus von A. caninum (nach PROCIV u. CROESE 1996) 2.1.1.3 Klinik, Pathogenese und Pathologie
Die Klinik, Pathogenese und Pathologie der Ancylostomose sind vom Infektions- druck, von der Infektionsart, vom Alter und Geschlecht des Wirtstieres und von des- sen Resistenz- und Immunitätslage abhängig. (MCCOY 1931; MATSUSAKI 1950;
MILLER 1965d). Patente Infektionen mit Krankheitserscheinungen kommen daher fast nur bei Welpen in den ersten Lebenswochen und –monaten vor. Pathologisch sind vor allem die Schadwirkungen der Larven auf der Haut und in der Lunge sowie die der adulten Würmer im Bereich des Darmes kennzeichnend für eine Hakenwurm- Infektion. Nach akutem oder perakutem Verlauf können sogar Todesfälle auftreten.
Bei sensibilisierten Tieren führt eine erneute perkutane Infektion zu Juckreiz mit Hyperämie und Ödematisierung besonders im Bereich der Schenkelinnenflächen,
der Interdigitalspalten sowie der Bauchwand. Unter unhygienischen Haltungsbedin- gungen kann es leicht zu bakteriellen Sekundärinfektionen kommen, was zum Krank- heitsbild des feuchten Sommerekzems (STOYE 1983; MILLER 1987) sowie zu Defor- mationen der Interphalangealgelenke und Krallen führen kann (BAKER u. GRIMES
1970). In der Lunge rufen die wandernden Larven vor allem pneumonische Verände- rungen hervor, die klinisch mit leichter Dyspnoe und Husten einhergehen. Bakterielle Sekundärinfektionen können auch hier zu schweren Lungenaffektionen führen. Im Vordergrund des Krankheitsgeschehens steht jedoch die Anämie, die zunächst nor- mozytär und normochrom, im späteren Verlauf dagegen mikrozytär und hypochrom wird (BOSSE et al. 1980). Sie beruht auf dem chronischen Eisenverlust, der aus der Blutaufnahme der adulten Würmer im Dünndarm resultiert. Die pro Tag und pro Wurm aufgenommene Blutmenge wird dabei mit ca. 80-200 µl angegeben (SCHIMMEL
u. DORN 1998). Der permanente Blutverlust kann eine metabolische Azidose mit anschließender Herzdilatation und Herzinsuffizienz zur Folge haben. Im Darm kommt es zudem durch die Atrophie der Dünndarmzotten zur intestinalen Malabsorption mit Durchfall und Wasserverlusten.
2.1.1.4 Immunität
Die mit A. caninum infizierten Hunde scheiden den größten Teil der Wurmbürde in den ersten sechs Lebensmonaten wieder aus und nur wenige Würmer persistieren im Dünndarm älterer Hunde (SARLES 1929). Dieser Vorgang beruht auf einer immu- nologischen Reaktion des Wirtes (MCCOY 1931), wodurch eine Reinfektion schneller überwunden werden kann als die Erstinfektion. Eine völlige Wurmfreiheit des Wirtes wird aber nicht hervorgerufen (OTTO 1941). Der Hund verfügt zusätzlich über eine Altersresistenz gegen A. caninum, die bei Rüden ab dem 8. und bei Hündinnen ab dem 11. Lebensmonat einsetzt (MILLER 1965d).
Die Immunität wird durch zirkulierende Antikörper hervorgerufen, die die Besiedlung des Darms mit adulten Würmern und die Eiausscheidung der Weibchen verringern können und einen Schutz vor der Erkrankung verleihen. Vor der Reaktivierung hypo- biotischer Larven in den Geweben schützt diese Immunität nicht, wohl aber vor einer neuen Ansiedlung von Larven in Muskulatur und Fettgewebe (MILLER 1987).
Mit infektiösen dritten Larven, röntgenbestrahlten L3 und rekombinanten Antigenen kann eine schützende Immunität gegen eine A. caninum-Infektion aufgebaut werden.
Auf die Möglichkeiten der Immunisierung wird in dieser Arbeit später genauer einge- gangen.
2.1.1.5 Diagnose
Eine Infektion mit A. caninum lässt sich bei Welpen nach galaktogener Übertragung dritter Larven anhand der klinischen Symptome wie Entwicklungsverzögerung, bluti- gem Durchfall und Anämie diagnostizieren. Ein koproskopischer Nachweis der Eier mit dem Flotationsverfahren gibt Aufschluss über eine patente Infektion. Impatente Infektionen können dagegen nur mit einem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder einem IFAT (Indirekter-Fluoreszenz-Antikörper-Test) nachgewiesen werden (STOYE 1992).
2.1.1.6 Therapie und Prophylaxe
Die Therapie der Ancylostomose ist mit einer Reihe gut verträglicher Anthelminthika möglich. Zu der Wirkstoffgruppe der Benzimidazole gehören Fenbendazol (Pana- cur®, INTERVET, Unterschleissheim), Flubendazol (Flubenol®, JANSSEN, Neuss), Me- bendazol (Telmin®, JANSSEN,Neuss) und Febantel. Bei Febantel handelt es sich um ein Probenzimidazol, das in Kombination mit dem zu den zyklischen Amidinen gehö- renden Pyrantel (Drontal plus®, BAYER, Leverkusen). eingesetzt wird. Erstmalig soll- ten Welpen im Alter von zwei Wochen mit diesen Präparaten behandelt werden. Da die Gefahr weiterer transmammärer Infektionen besteht, sollten bis zur 12. Lebens- woche alle zwei Wochen Wiederholungsbehandlungen erfolgen (EPE et al. 1996).
Auch die Muttertiere sind zwei und vier Wochen post partum zu behandeln, da in dieser Zeit die Gefahr endogener Autoinfektionen besteht. Bei über 12 Wochen alten Hunden sollten mindestens vier Anthelminthika-Gaben pro Jahr erfolgen. Neben den Benzimidazolen kann bei ihnen auch Nitroscanat (Lopatol®, NOVARTIS, München), ein neueres Breitspektrumanthelminthikum, in den gleichen Intervallen eingesetzt werden. Das zur Prophylaxe gegen den Herzwurm Dirofilaria immitis eingesetzten Milbemycinoxim (Program plus®, NOVARTIS, München), ist auch gegen A. caninum zugelassen. Über vier Wochen alte Hunde können mit diesem Mittel sowie mit Pyran-
telpamoat (Banminth®, PFIZER,Karlsruhe) behandelt werden. Diese Präparate besit- zen eine Wirksamkeit von vier Wochen, sodass von dem anfänglichen Zwei-Wochen- Intervall abgewichen werden kann. Die aufgeführten Antiparasitika wirken hauptsäch- lich auf intestinale Hakenwurm-Stadien. Gegen somatische Stadien kann z.B. Fen- bendazol in speziellen Dosierungen angewandt werden (ECKERT 2000; UNGEMACH
2002). Um Hakenwurminfektionen in gefährdeten Zwingern ausschließen zu können, sind, neben der prophylaktischen Behandlung der trächtigen Hündinnen und Welpen, Hygienemaßnahmen von größter Bedeutung (ECKERT 2000).
2.1.1.7 A. caninum-Infektion des Menschen
Dritte Larven von A. caninum sind in der Lage beim Menschen zwei verschiedene Krankheitsbilder hervorzurufen. Sie können sowohl nach perkutaner Infektion direkt in der Haut zu einem Syndrom führen, das „ground itch“ genannt wird, als auch nach Ansiedlung und Häutung zum Adultstadium im Darm die Ursache für die „eosinophile Enteritis“ sein. Die meisten Infektionen erfolgen in den Küstenregionen Afrikas, Süd- ost-Asiens, Mittel- und Südamerikas und der Karibik, wo die Larven in sandigem Boden migrieren können und optimale Bedingungen für ihre Überlebensfähigkeit gegeben sind (BLACKWELL u. VEGA-LOPEZ 2001). Erst der wiederholte Kontakt zu den L3 löst einen lokalen Juckreiz mit Rötung und Ödematisierung der Infektionsstelle, den „ground itch“ aus, der hauptsächlich an den Händen und Füßen auftritt. Durch Sekundärinfektionen können aus der lokalen Entzündungsreaktion eitrige Ekzeme entstehen. Eine Infektion mit dritten Larven des Hakenwurms A. braziliense ruft beim Menschen die „Larva migrans cutanea“ (LMC) oder „creeping eruption“ hervor. Diese weist die Symtome des „ground itch“ auf, ist aber zusätzlich durch stark gewundene, 1-5 cm lange linienartige Hautveränderungen gekennzeichnet, die die Bohrgänge der Larven in der Haut darstellen. In einer Studie mit 44 Fällen von LMC traten 39% der Symptome an den Füßen, 18% am Gesäß und 16% am Abdomen auf. Beine, Arme und Gesicht waren ebenfalls in die Hautsymptomatik einbezogen (BLACKWELL u.
VEGA-LOPEZ 2001). Ob A. caninum und U. stenocephala ebenfalls die „Larva migrans cutanea“ auslösen können ist nicht geklärt (BROOKER et al. 2004). Eine zweite Form der LMC, die mit einer Follikulitis in Zusammenhang steht, wird ebenfalls beschrie-
ben (CAUMES et al. 2002). Eine Therapie des „ground itch“ und der LMC ist mit Al- bendazol und Thiabendazol möglich (BLACKWELL u. VEGA-LOPEZ 2001).
Ein Zusammenhang zwischen der eosinophilen Enteritis (EE) und einer A. caninum- Infektion beim Menschen wurde erstmals hergestellt, nachdem ein zoonotischer Hakenwurm in einer histologischen Probe eines von 33 Patienten mit EE in Townsvil- le, einer Küstenstadt mit 115.000 Einwohnern im nördlichen Queensland in Austra- lien, aufgefunden wurde (CROESE 1988). Die Infektion des Menschen mit A. caninum hängt, neben den oben genannten klimatischen Bedingungen, auch von der Verbreitung der Würmer in Hunden und einem die Übertragung ermöglichenden Verhalten zwischen Mensch und Hund ab. Dazu gehört das Barfußlaufen über Gras- flächen, auf denen Hunde Auslauf haben (MURRAY 1991). Die klinischen Symptome der EE sind unterschiedlich und sehr unspezifisch (CROESE 1988; CROESE et al.
1994a, 1994b). Das Hauptsymptom ist Abdominalschmerz. Hinzu kommen Appetitlo- sigkeit, Übelkeit und Durchfall. In seltenen Fällen treten intestinale Blutungen auf (CROESE et al. 1990). Obwohl davon ausgegangen wird, dass die Infektionen perku- tan erfolgt sind, wurde von keinem Patienten „ground itch“ oder die Hautform der Larva migrans beschrieben. Dies ist damit zu erklären, dass sich die Patienten wahr- scheinlich nur mit wenigen infektiösen Larven infiziert hatten und sich eine ausge- prägte Hautsymptomatik nur nach Invasion einer großen Anzahl an Larven zeigt (HUNTER u. WORTH 1945; MILLER et al. 1991). In Versuchen stellte sich heraus, dass perkutane Infektionen weder abdominale Symptome noch Eosinophilie des Blutes oder Antikörperproduktion hervorriefen. Aus diesem Grund wurde von LANDMANN und PROCIV (2003) eine Studie durchgeführt, in der die Symptome und Blutwerte nach oraler und perkutaner Infektion des Menschen mit L3 von A. caninum verglichen wurden. Eine orale Infektion hatte einen signifikanten Anstieg der eosinophilen Gra- nulozyten im Blut zur Folge. Dieser blieb nach perkutaner Infektion aus, dafür zeigten sich an der Infektionsstelle Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Nässen. Auch wenn durch diesen Versuch das Hervorrufen der EE durch perkutane Infektionen mit A. caninum-Larven nicht ausgeschlossen werden konnte, wurde aufgezeigt, dass die orale Infektion eine höhere Pathogenität besitzt. Dieses hängt wahrscheinlich mit der direkten Entwicklung der Larven zum adulten Wurm im Darm und der daraus resul-
tierenden eosinophilen Entzündung ab. Mögliche orale Infektionswege sind die Auf- nahme von Larven mit durch Erde kontaminiertem Wasser oder Gemüse sowie mit nicht durchgekochtem Fleisch von Weidetieren (LANDMANN u. PROCIV 2003). Eine Diagnose der EE ist aufgrund der unspezifischen Symptome schwierig. Bei Endo- skopien des Darms zeigten sich oft aphthöse Ulzerationen des terminalen Ileums, des Zäkums und des Kolons, wobei es sich vermutlich um die Anheftungsstellen der adulten Würmer handelte (CROESE et al. 1996). Serologisch können ein indirekter ELISA oder ein Western Blot Aufschluss geben. Die Behandlung der EE erfolgt übli- cherweise mit Mebendazol. Viele Patienten erleiden jedoch Wochen oder Monate später einen Rückfall, ohne dass eine Reinfektion stattgefunden hat. Eine Erklärung dafür ist die sporadische Reaktivierung von hypobiotischen L3, die sich in den Mus- kelfasern angesiedelt haben und nicht durch eine Behandlung mit Mebendazol abge- tötet werden konnten (PROCIV u. CROESE 1996). Bei der EE handelt es sich vermut- lich um eine Hypersensibilitätsreaktion, die durch ein Allergen hervorgerufen wird, das bei der Nahrungsaufnahme der L4 oder der adulten Würmer in die Mukosa des Darms injiziert wird. Hakenwürmer sezernieren eine Reihe von Proteinen, die eine Rolle als potentielle Allergene spielen und mögliche Vakzine-Kandidaten darstellen (PROCIV u. CROESE 1996). Auf die verschiedenen Proteine wird im Rahmen dieser Arbeit später detaillierter eingegangen.
2.2 Impfstoffe gegen tiermedizinisch relevante Helminthen
Als rohe und einfache Impfstoffe wurden in den 50er Jahren des letzten Jahrhunderts ganze bestrahlte Nematoden-Larven genutzt, die effektiv vor einer Infektion mit Dic- tyocaulus viviparus schützten (PLOEGER 2002). Auch gegen den Lungenwurm des Schafes D. filaria (SHARMA et al. 1988) war eine solche Vakzine erfolgreich. Gegen A. caninum wurde erstmals 1973 in Florida, USA, ein Impfstoff (Canine Hookworm Vaccine, Jensen-Salsbery Laboratories) eingesetzt, der aus röntgenbestrahlten drit- ten Larven bestand. Anfang 1975 war er in den ganzen USA erhältlich. Der Verkauf des Impfstoffs entsprach jedoch nicht den Erwartungen der Hersteller, da die Tierärz- te ihn nur widerwillig in ihre Routineprogramme aufnahmen. Die meisten Tierärzte waren der Meinung, dass es ausreicht, Hakenwurm-Infektionen mit anthelminthi-
schen Mitteln zu behandeln (MILLER 1978). Eine weitere Rolle für die geringe Akzep- tanz spielte die Tatsache, dass Entwurmungen zu den Haupt-Einkommensquellen der Tierärzte gehörten. Aufgrund steigender Produktionskosten, begrenzter Lagerfä- higkeit und geringer Verkaufszahlen wurde der Impfstoff 1975 wieder vom Markt genommen (MILLER 1978).
Einen großen Fortschritt in der Vakzine-Entwicklung brachte ein rekombinantes Anti- gen, aus dem ein Impfstoff hergestellt wurde, der Schutz gegen den parasitischen Zestoden Taenia ovis verlieh. Ähnliche Strategien wurden zur Entwicklung rekombi- nanter Vakzine gegen T. saginata und Echinococcus granulosus verwendet (LIGH- TOWLERS et al. 2003). Rekombinante Impfstoffe gegen Lungenwürmer konnten keine vergleichbare Wirksamkeit zu den ganzen bestrahlten Nematoden-Larven erzielen (MATTHEWS et al. 2001) und trotz der Anstrengungen vieler Forschergruppen konnte der Erfolg des rekombinanten Impfstoffes gegen Zestoden bei Nematoden bislang nicht erzielt werden (KNOX 2000; KNOX et al. 2001, 2003; NEWTON u. MEEUSEN 2003).
Im Gegensatz zu den wenigen erfolgreichen Versuchen gab es viele nicht aussichts- reiche Experimente in der Impfstoffentwicklung gegen Helminthen. Einige Protein- Antigene, wie das H11 von Haemonchus contortus, sind nur in ihrer nativen Form sehr wirksam. In der rekombinanten Form scheinen sie aber ein wichtiges strukturel- les Merkmal nicht aufzuweisen, das für die Immunogenität bedeutsam ist.
2.2.1 Proteine als Kandidaten für einen Impfstoff
Die bevorzugten Moleküle als Kandidaten für einen Impfstoff sind Proteine. Diese Tatsache beruht einerseits auf ihrer relativ einfachen molekularbiologischen Identifi- zierung, Modifizierung und Produktion in großen Mengen, was die Basis für eine kommerzielle Vakzine darstellt, sowie auf ihren Schlüsselfunktionen im Stoffwechsel der Parasiten. Der bisherige nicht sehr erfolgreiche Einsatz rekombinanter Proteine ist auf die durch noch lückenhaftes Grundwissen bedingte mangelhafte Auswahl biologisch relevanter Proteine, die unangemessene Expression rekombinanter Prote- ine und die fehlenden Kenntnisse über die Verabreichung des Impfstoffes zurückzu- führen, um im Tier eine schützende Immunantwort zu induzieren (HEIN u. HARRISON
2005).
Die Proteine von im Gastrointestinaltrakt ihres Wirtes lebenden Nematoden werden in sieben verschiedene Antigen-Typen eingeteilt. Dabei handelt es sich um drei Anti- gene, die in den exkretorisch-sekretorischen (ES)-Produkten zu finden sind und um vier somatische Antigene, die sich auf der äußeren und inneren Oberfläche oder im Innern der Parasiten befinden. Die ES-Antigene sind für die Lymphozyten der Darmmukosa (GALT, gut associated lymphoid tissue) zugänglich, während die eben- falls zu dieser Gruppe gehörenden Antigene auf der Oberfläche parasitärer Entwick- lungsstadien über die Zirkulation von den Lymphknoten erreichbar sind. Da ange- nommen wird, dass diese Moleküle eine schnelle Immunantwort hervorrufen, werden sie als „Nags“ (Natural antigens) bezeichnet. Eine Gruppe der somatischen Antigene ist ebenfalls den Lymphozyten der Mukosa ausgesetzt und wird somit zu den Nags gezählt. Zwei andere Typen können nur durch das GALT erreicht werden, wenn der Wurm zerstört wird oder wenn sie mit dem Blut bzw. mit der Lymphe des Wirtes in Berührung kommen. Diese potentiellen Antigene sind vor dem Immunsystem verbor- gen und induzieren daher keine natürliche Immunantwort. Sie werden als „Hags“
(Hidden antigens) bezeichnet. Zu den Hags gehört eine weitere Gruppe fester Anti- gene, die zwar für Antikörper, jedoch nicht für Lymphozyten zugänglich ist. Ob die Hags eine antigene Wirkung besitzen ist nicht bekannt. Sie sind insofern interessant, als dass auf sie kein Evolutionsdruck in Bezug auf die Umgehung der Immunantwort der Parasiten ausgeübt wurde. Für die Entwicklung eines Impfstoffes ist es notwen- dig herauszufinden, welche Antigene sich als Bestandteile dafür eignen (MUNN 1997).
Die eingeschränkte natürliche Immunität gegen gastrointestinale Nematoden, die mit zunehmendem Alter und mit kontinuierlichem Kontakt zu den infektiösen Larven ausgebildet wird, ist auf die Immunantwort gegen Nags, insbesondere gegen ES- Antigene, zurückzuführen. Es werden viele Antikörper gegen diese Nags gebildet, die jedoch keinen schützenden Effekt haben. Sowohl ES- als auch somatische Anti- gene wurden eingesetzt, um gegen parasitische Nematoden zu impfen. Auch Hags sind in der Lage eine Stimulation der natürlichen Immunität auszulösen (MUNN 1997).
Dieses wurde durch Versuche mit dem integralen Membranprotein H11 von H. con- tortus (MUNN 1981; MUNN u. GREENWOOD 1983, 1984), dem O12 von Ostertagia ostertagi und Teladorsagia circumcincta (MCMICHAEL-PHILLIPS et al. 1995), dem H-
gal-gp von Haemonchus und O-gal-gp von Ostertagia (SMITH et al. 1994) sowie mit dem H4.5 von Haemonchus bestätigt (MUNN et al. 1993).
2.2.2 Kohlenhydrate als Kandidaten für einen Impfstoff
Aufgrund der Schwierigkeiten Protein-Antigene für eine erfolgreiche Vakzinierung gegen parasitische Helminthen zu identifizieren wird neuerdings die Aufmerksamkeit auch auf Kohlenhydrat-Antigene gerichtet. Es wurde erkannt, dass die Antikörper gegen Kohlenhydrat-Strukturen in Glykanen und Glykoproteinen bei der Entwicklung eines Schutzes gegen die Infektion eine Rolle spielen, was auf ihr Potential als Impf- stoff-Kandidaten schließen lässt. Durch die Kombination verschiedener Methoden ist eine genaue strukturelle Analyse der Kohlenhydrate möglich geworden (DELL 1987;
DELL et al. 1994; HASLAM et al. 2001; NYAME et al. 2004). Die Strukturen der Kohlen- hydrate der Würmer sind denen der Säugetier-Glykane ähnlich, enthalten aber auch Parasiten-spezifische Modifikationen (KHOO u. DELL 2001; HASLAM et al. 2001; NYAME
et al. 2004). Gegen diese richten sich die spezifischen Antikörper (KHOO u. DELL
2001). Obwohl nah verwandte Nematoden ähnliche Glykan-Strukturen aufweisen, die die Bildung kreuzreaktiver Antikörper stimulieren, sind schützende Antikörper meist Parasiten-spezifisch. Diese Beobachtung wurde für den Nematoden H. contor- tus beschrieben (REDMOND et al. 2004).
Bei Zestoden sind Kohlenhydrate des Metazestoden von T. solium als diagnostische Antige der Zystizerkose des Menschen von großer Bedeutung (HASLAM et al. 2003).
Auch Glykoprotein-Antigene von Echinococcus ssp. wurden auf ihre Funktion in der Diagnose und in der Immunität untersucht (KHOO et al. 1997). Für den Leberegel Fasciola hepatica werden verschiedene Glykolipide beschrieben, die diagnostischen Wert besitzen (WUHRER et al. 2003, 2004). Auch die Kohlenhydrat-Strukturen von Antigenen einiger Nemtoden wurden erforscht, wobei eine große Anzahl an N- und O-Glykoproteinen, Glykolipiden und anderen Glykanen charakterisiert wurde (DELL et al. 2001; HASLAM et al. 2001; NYAME et al. 2004). Dazu gehören ein Komplex an N-Glykanen von D. viviparus, der auch in humanen Leukozyten und Schistosomen gefunden wurde (CUMMINGS u. NYAME 1996; HASLAM et al. 2000), Oberflächen- Glykane infektiöser Larvenstadien von Trichinella spiralis (WISNEWSKI et al. 1993),
Glykan-Antigene von H. contortus, die in ES-Antigen-Präparationen adulter Würmer gefunden wurden (VERVELDE et al. 2003), Glykoproteine von D. immitis (KANG et al.
1993) und speziell methylierte Zucker von Toxocara canis (KHOO et al. 1991).
2.3 Entwicklung eines Impfstoffes gegen Hakenwürmer
2.3.1 Gründe für die Entwicklung eines Impfstoffes gegen Hakenwürmer Parasitische Helminthen haben einen großen Einfluss auf die Gesundheit von Tieren und ihre Produktivität. Derzeit werden sie durch den Gebrauch von Anthelminthika überwacht. So lange diese Methode effektiv und ökonomisch ist, wird sie beibehalten werden. Das einseitige Vertrauen auf die chemische Kontrolle ist jedoch riskant, da die Parasiten gegen Komponenten der Anthelminthika resistent werden können und diese plötzlich nicht mehr wirksam und wirtschaftlich sind. Diese Aussicht führte zu einer Suche nach alternativen Möglichkeiten zur Kontrolle parasitischer Helminthen (HEIN u. HARRISON 2005).
Auch wenn das Thema der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der Protein Disulfid Isomerase (PDI) als potentiellen Vakzine-Kandidaten gegen die A. caninum- Infektion des Hundes ist, steht sie mit der Tatsache in Verbindung, dass das Ziel der meisten Forschungen nach Vakzinen die Eindämmung der menschlichen Haken- wurm-Infektion ist, die durch die Nematoden N. americanus und A. duodenale her- vorgerufen wird. Sie ist eine der am meisten verbreiteten chronischen Infektionen mit geschätzten 740 Millionen Fällen in Gebieten ländlicher Armut in den Tropen und Subtropen. Die meisten Infektionen finden in Asien statt, gefolgt von den afrikani- schen Staaten südlich der Sahara (DE SILVA et al. 2003). Der Gebrauch der „disabili- ty-adjusted life years“ (DALYs) als quantitatives Maß für die Schwere dieser Krank- heit deckt auf, dass die Anzahl an Hakenwurm-Infektionen Krankheiten wie Trypanosomose, Dengue, Chagas-Krankheit, Schistosomose und Lepra übertrifft (HOTEZ et al. 2003a). Wiederholter Kontakt mit dritten Larven von N. americanus und A. duodenale führt zu dem beschriebenen Syndrom „ground itch“. Leichte Haken- wurm-Infektionen verlaufen meist asymptomatisch, während mäßige und schwere Infektionen mit periodisch auftretenden Bauchschmerzen, Übelkeit, Dyspnoe, Ge- lenk- und Kopfschmerzen sowie Müdigkeit einhergehen (ANYAEZE 2003). Hinzu
kommt bei Erwachsenen die Beeinträchtigung der Arbeitsfähigkeit (GUYATT 2000). Da Frauen und kleine Kinder die niedrigsten Eisen-Werte besitzen, sind sie besonders anfällig für den chronischen Blutverlust, der aus der Hakenwurm-Infektion resultiert (STOLTZFUS et al. 1997). Auf diesen sind auch das physische, intellektuelle und kogni- tive Zurückbleiben infizierter Kinder und ihre Anfälligkeit für virale und bakterielle Infektionen zurückzuführen (HOTEZ 1989). Eine Besonderheit der Hakenwurm- Infektion ist die zunehmende Intensität mit steigendem Alter (HORTON 2003). Diese Beobachtung legt nahe, dass sich die Hakenwürmer der Immunantwort des Wirtes entziehen oder zumindest in der Lage sind, diese zu unterdrücken (LOUKAS u. PROCIV
2001). Der Grund dafür kann der für Hakenwürmer einzigartige Mechanismus der Umgehung der Immunantwort des Menschen sein, wobei der Hakenwurm an seiner Anheftungsstelle im Darm immunsuppressive Moleküle freisetzt (MOYLE et al. 1994).
Weitere Probleme sind die Reinfektionen, die in den meisten Fällen nur wenige Mo- nate nach einer anthelminthischen Behandlung auftreten (HOTEZ u. PRITCHARD 1995) und die steigende Rate an Resistenzen in menschlichen Hakenwürmern. Einige Nematoden haben bereits Benzimidazol-Resistenzen entwickelt, die auf eine Punkt- mutation im Tubulin-Allel zurückzuführen sind (CONDER u. CAMPBELL 1995). Aufgrund der immunsuppressiven Fähigkeiten der Hakenwürmer, der hohen Reinfektionsrate und ihrem Potential, Resistenzen gegen Bestandteile der Antiparasitika zu entwi- ckeln, ist es sinnvoll, nach weiteren Möglichkeiten zur Eindämmung der Hakenwurm- Infektion zu forschen. Die Entwicklung eines Impfstoffes stellt eine solche Möglichkeit dar (HOTEZ et al. 2003a).
2.3.2 Vakzinierung mit lebenden infektiösen Larven, Ösophagus-Extrakten adulter A. caninum und röntgenbestrahlten Larven
Die A. caninum-Infektion des Hundes und die A. duodenale-Infektion des Menschen ähneln sich sehr. Die Larven beider Spezies können ihren Wirt oral und perkutan infizieren und eine hypobiotische Phase in Geweben durchführen (HOAGLAND u.
SCHAD 1978). Deshalb wurden schon in den Anfängen der Immunitätsforschung Modell-Versuche mit Hunden durchgeführt, die mit A. caninum infiziert wurden (HER- RICK 1928; SCOTT 1928, 1929). Erstmals konnte in den 30er Jahren festgestellt wer-
den, dass infektiöse A. caninum-Larven eine antigene Wirkung besitzen (STUMBERG
1930) und dass eine protektive Immunität hervorgerufen werden kann, wenn sie wiederholt verabreicht werden (MCCOY 1931; FOSTER 1935). Diese Arbeiten folgten früheren Beobachtungen von Immunität gegen Larven von Strongyloides stercoralis (SANDGROUND 1928), Haemonchus contortus (STOLL 1929) und Nippostrongylus muris (SCHWARTZ et al. 1931). Die Immunität durch die Verabreichung mehrerer Do- sen an infektiösen Larven über Monate hinweg zeigte sich dadurch, dass die Hunde nach einer sog. „Krise“ (Zeit der höchsten Eiproduktion und des größten Blutverlus- tes) Dosen von 8000 bis 50000 Larven tolerierten, ohne eine Anämie zu entwickeln.
Bis allerdings eine reproduzierbare und verlässliche Immunität gegen Larven herge- stellt wurde, vergingen nochmals mehrere Jahre (OTTO u. KERR 1939; OTTO 1941).
Auch diese Immunität war nicht absolut, jedoch konnte immerhin eine verminderte Intensität der Infektion festgestellt werden. Dieses zeigte sich in der Reduktion der Wurmbürde, der Entwicklungsverzögerung, der verminderten Anzahl sich entwi- ckelnder Würmer und der geringeren Eiausscheidung (OTTO 1941). Gleichzeitig wurde in den ersten Versuchen zum Verständnis der Mechanismen der Immunant- wort gegen A. caninum ermittelt, dass sich die humorale Immunität gegen sezernier- te Antigene richtet, die sich im Bereich der Mundöffnung der infektiösen Larve 3 befinden (SARLES 1938; OTTO 1940).
1956 führte THORSON einen Versuch durch, in dem er die proteolytische Aktivität von Ösophagus-Extrakten adulter A. caninum überprüfte. Er setzte den Extrakten Casein zu und konnte eine proteolytische Aktivität bei einem pH-Optimum von annähernd 6,0 nachweisen. Zudem stellte er fest, dass das Serum eines mit A. caninum- infizierten Hundes diese proteolytische Aktivität um 88% reduzierte (THORSON
1956a). Ein weiterer Versuch wurde von THORSON (1956b) zur Klärung des Mecha- nismus zur Verhinderung der Blutkoagulation gemacht, nachdem in verschiedenen Nematoden Substanzen nachgewiesen wurden, die die Blutkoagulation inhibierten (LOEB u. SMITH 1904; LOEB u. FLEISCHER 1910; SCHWARTZ 1921). Dabei stellte sich heraus, dass Extrakte aus dem Ösophagus und den Zephal- und Zervikaldrüsen von adulten A. caninum die Koagulation nicht verzögerten, wenn Thrombin und Fibrino- gen in den Gerinnungsversuchen eingesetzt wurden. Deshalb wurde anschließend
überprüft, ob die oben genannten Exktrakte Auswirkungen auf die Prothrombin-Zeit haben, wobei sich herausstellte, dass nur die Extrakte der Zephaldrüsen die Prothrombin-Zeit im Plasma von Hunden verlängerten und dass der Thrombus, der sich in dieser Reaktion bildete, nicht vollendet war. Normales und Immunserum ho- ben die Verzögerung der Prothrombin-Zeit wieder auf. Aufgrund seines ersten Ver- suches injizierte THORSON (1956c) den Hunden die oben genannten Ösophagus- Extrakte, um zu beobachten, ob eine Antikörperproduktion stattfindet. Da in diesen Hunden weniger und kleinere Würmer als in der Kontrollgruppe aufgefunden wurden, konnte davon ausgegangen werden, dass Antikörper gegen bestimmte Enzyme in den Extrakten gebildet wurden. Diese Antikörper inhibierten die Enzyme, so dass die Würmer nicht in der Lage waren ihre volle Größe zu erreichen und im Darm der Wirte zu persistieren.
Basierend auf dem Erfolg, dass lebende A. caninum-Larven eine Immunität hervor- riefen, wurden von MILLER (1964, 1965a, 1965b, 1965c) Immunitätsversuche mit röntgenbestrahlten Larven durchgeführt. In diesen zeigte sich, dass eine Bestrahlung der infektiösen Larven mit 40 kiloroentgen (kr) (heute: 40 kr = 70,22 Coulomb/kg) zu einer charakteristischen Reduktion ihrer Infektiösität führte. Eine einzige subkutane Vakzinierung von drei Monate alten Welpen mit 1000 bestrahlten Larven verlieh einen signifikanten Schutz gegen eine Infektion mit normalen infektiösen Larven im Alter von 4 Monaten (MILLER 1964). Eine zweifache subkutane Vakzinierung mit der gleichen Anzahl an bestrahlten Larven war mehr als doppelt so effektiv, als die ein- zelne Vakzinierung. Es kam dabei zu einer 90%igen Reduktion der Wurmbürde mit kompletter Abwesenheit von hämatologischen und klinischen Symptomen im Ver- gleich zur Kontrollgruppe (MILLER 1965a). Durch die doppelte subkutane Vakzinie- rung konnte eine besonders hohe Protektivität erzielt werden, wenn sie innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt der Welpen stattfand (MILLER 1965b). Weitere Versuche zeigten, dass eine zweifache subkutane Vakzinierung mit 1000 bestrahlten Larven effektiver ist als eine zweifache orale Vakzinierung mit der gleichen Anzahl an abge- schwächten Larven. Diese Beobachtung ist auf das Verharren der röntgen- attenuierten Larven im Gewebe während ihrer Wanderung zurückzuführen, die nur nach perkutaner Infektion stattfindet und eine bessere Stimulation der Immunantwort
des Wirtes hervorruft als die direkte Ansiedlung der Würmer im Darm nach oraler Infektion (MILLER 1965c). Desweiteren wurde ein Versuch durchgeführt, in dem die Resistenzen verglichen wurden, die durch Vakzinierungen mit röntgenbestrahlten Larven und normalen infektiösen Larven stimuliert wurden. Bei der Vakzinierung mit 1000 normalen infektiösen Larven zeigte sich im Gegensatz zu der Vakzinierung mit röntgenbestrahlten Larven kein Unterschied in der Resistenz nach oraler und subku- taner Applikation. Die Immunität nach Vakzinierung mit normalen infektiösen Larven war vergleichbar mit der nach oraler Vakzinierung mit röntgen-geschwächten Larven.
Der Unterschied in der Immunantwort nach Vakzinierung mit den verschiedenen Larven lag darin, dass nur 30% der normalen und über 80% der röntgenbestrahlten Larven nicht den Magen-Darm-Trakt erreichten bzw. dort nicht voll ausreiften. Somit zeigte auch dieser Versuch, dass die verlängerte Exposition zu den Larven während der Körperwanderung eine bessere Immunantwort hervorruft (MILLER 1966). Zusätz- lich wurde eine Resistenz gegen den Hakenwurm A. braziliense bei Hunden festge- stellt, wenn diese zuvor mit röntgen-attenuierten A. caninum-Larven immunisiert wurden. Die praktische Relevanz dieser Beobachtung liegt in der Verminderung des Schweregrades der „creeping eruption“ beim Menschen (MILLER 1967). Neben den röntgenbestrahlten Larven bieten auch solche, die ein- bzw. zweimal ultrageschallt oder mit 5-Fluorouracil behandelt wurden, einen guten Schutz gegen eine Haken- wurm-Infektion (VINAYAK et al. 1981).
2.3.3 Gentechnisch hergestellte Vakzinen
Nach dem heutigen Forschungsstand sollte der optimale Impfstoff gegen eine Ha- kenwurm-Infektion einerseits die Entwicklung der L3 zu adulten blutaufnehmenden Hakenwürmern verhindern und andererseits die Ansiedlung, das Überleben und die Eiausscheidung der adulten Würmer im Darm blockieren. Deshalb muss nach HOTEZ
et al. (2005) und LOUKAS et al. (2005b) der Impfstoff aus zwei Antigenen bestehen:
einem Antigen, das von den L3 sezerniert wird, und einem Antigen, das von adulten Hakenwürmern produziert wird. Da diese Antigene für Vakzinierungsversuche oder für den kommerziellen Einsatz als Impfstoff nicht in gewünschter Menge und Reinheit aus den Hakenwürmern isoliert werden können, werden sie mit gentechnologischen
Methoden hergestellt. Zur Bekämpfung der Hakenwurm-Infektion des Menschen wird hauptsächlich nach Antigenen von A. caninum geforscht. Gründe dafür sind seine enge genetische Verwandtschaft zu den anthropophilen Hakenwürmern und seine leichte Verfügbarkeit aus zu Versuchszwecken infizierten Hunden. Die gentechnolo- gisch hergestellten rekombinanten Antigene sind natürlich ebenso für einen Impfstoff gegen die kanine Hakenwurm-Infektion relevant.
2.3.3.1 Von infektiösen dritten Larven sezernierte Antigene
Infektiöse dritte A. caninum-Larven sezernieren verschiedene Moleküle, die vermut- lich beim Eindringen der Larven in die Haut, bei der Gewebemigration, beim Häu- tungsprozess, bei der Unterdrückung der Immunantwort des Wirtes und als Allergen eine Rolle spielen.
Erstmals wurde 1990 von HOTEZ et al. eine Protease-Aktivität bei den L3 von A. caninum und A. duodenale festgestellt. Die Proteasen spalteten Casein und hu- manes Fibronektin in kleinere Peptide, konnten bovines Elastin und humanes Lami- nin jedoch nicht abbauen. Durch ο-Phenanthrolin konnte die Protease-Aktivität inhi- biert werden, was die Proteasen als Metalloproteasen charakterisierte. Ihre Molekulargewichte wurden durch eine Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- elektrophorese (SDS-PAGE) ermittelt und liegen bei 68 und 38 kDa. Die Funktion dieser Metalloproteasen ist unklar. Wahrscheinlich spielen sie eine Rolle beim Ein- dringen der Larven ins Gewebe. Möglich ist auch, dass sie in den Häutungsprozess involviert sind oder dass sie zwischen der Nahrungsaufnahme und der Verdauung vermitteln, wenn die Nahrungsaufnahme nach der Hautpenetration fortgesetzt wird (HOTEZ et al. 1990).
Weitere Forschungen zur Aufklärung der Funktion der Metalloproteasen wurden 1995 von HAWDON et al. unternommen. Dabei wurden dritte A. caninum-Larven mit Wirts-Serum und Glutathion inkubiert und so zur Fortsetzung der Nahrungsaufnahme stimuliert, was als frühes Ereignis im Infektionsprozess gilt (HAWDON u. SCHAD 1990).
Die unter diesen Bedingungen inkubierten Larven sezernierten Proteasen mit Mole- kulargewichten von annähernd 50 und 90 kDa, wobei die 50 kDa-Protease ein Ab- spaltungsprodukt der 90 kDa-Protease darstellen könnte. Ein Zusammenhang zwi-
schen diesen und den 1990 von HOTEZ et al. beschriebenen Metalloproteasen konn- te nicht festgestellt werden. Da bei H. contortus eine 44 kDa-Metalloprotease den Häutungprozess vermittelt (GAMBLE et al. 1989) und bei B. malayi und D. immitis ebenfalls eine Metalloprotease mit der Häutung in Verbindung gebracht wird (RICH- TER et al. 1992; HONG et al. 1993), könnten die Metalloproteasen von A. caninum eine ähnliche Funktion haben. Zudem wird auch eine Rolle bei der Haut- und Gewe- bepenetration angenommen, da die Inhibition einer 50 kDa-Metalloprotease bei den L3 von S. stercoralis ihr Eindringen in die Haut verhindert (MCKERROW et al. 1990).
Letztendlich könnten die Metalloproteasen auch als Verdauungsenzyme fungieren oder dazu dienen, die humorale Immunantwort des Wirtes gegen die L3 zu zerstö- ren. In jedem Fall scheinen sie eine wesentliche Funktion beim Übergang von der frei lebenden Larve zum Parasitismus zu übernehmen (HAWDON et al. 1995).
2002 wurde von ZHAN et al. eine cDNA aus einer L3-Expressions-Bibliothek isoliert, die für eine Zink-Metalloprotease (Ac-MTP-1) kodiert, die der Astacin-Familie ange- hört. Diese könnte für die oben beschriebene proteolytische Aktivität der aktivierten ES-Produkte (HAWDON et al. 1995) verantwortlich sein. Ac-MTP-1 besitzt ein errech- netes Molekulargewicht von 61,730 kDa und zeigt die höchste Homologie zu einer Familie der Astacin-ähnlichen Proteasen des frei lebenden Nematoden Caenorhabdi- tis elegans. Ihre Funktion ist bisher unbekannt. Der Ac-MTP-1 wird eine regulatori- sche Rolle während der Übergänge zwischen den Entwicklungsstufen in Zusam- menhang mit der Aktivierung zum Parasitismus und der folgenden Häutung zur L4 zugesprochen. Mögliche Funktionen der Ac-MTP-1 könnten auch die Aktivierung von TGF (tissue growth factor)-ß-Molekülen des Wirts oder die Erleichterung der Hautpe- netration und der Gewebemigration sein. Letztendlich könnte sie auch ein Enzym des Häutungsvorgangs darstellen (ZHAN et al. 2002a).
Neben den Metalloproteasen sezernieren Hakenwurm-Larven ein weiteres Enzym, die Hyaluronidase. In den L3 von A. caninum, A. braziliense und A. tubaeforme konn- te eine Hyaluronidase-Aktivität nachgewiesen werden, wobei die höchste Aktivität in den A. braziliense-Larven ermittelt wurde. Eine SDS-PAGE identifizierte zwei For- men der Hyaluronidase, eine 87 kDa- und eine 49 kDa-Form, wobei die Form mit dem geringeren Molekulargewicht wiederum ein Abspaltungsprodukt der 87 kDa-
Form darstellen könnte. Die Hyaluronsäure ist für den Zusammenhalt der Keratinozy- ten in der tiefen Epidermis-Schicht und für die Anheftung der Keratinozyten an die Basalmembran verantwortlich (ALHO u. UNDERHILL 1989). Die Hyaluronidase der L3 könnte somit ihre Passage zwischen diesen Zellen sowie ihren Zugang zu der Ba- salmembran erleichtern. Die Beobachtung, dass A. braziliense-Larven die höchste Hyaluronidase-Aktivität besitzen, hängt wahrscheinlich mit ihrer Wanderung in tiefe- ren Schichten der Epidermis zusammen, wodurch die Hautform der Larva migrans hervorrufen wird (HOTEZ et al. 1992).
Die initialen Ereignisse des infektiösen Prozesses können in vitro nachgestellt wer- den, wenn die Wiederaufnahme der Nahrungsaufnahme als Marker für den Über- gang von der frei lebenden L3 zur parasitischen L3 dient (HAWDON u. SCHAD 1992).
Wenn dritte A. caninum-Larven zur Fortsetzung ihrer Nahrungsaufnahme stimuliert werden, sezernieren sie verschiedene Moleküle, wie die oben erwähnte Zink- Metalloprotease (HAWDON et al. 1995). Als Hauptprotein gilt das Ancylostoma- secreted protein (ASP). Ein Datenbankvergleich zeigt eine signifikante Ähnlichkeit zwischen den 230 C-terminalen Aminosäuren des ASP und der Antigen5/Antigen3- Familie der Hymenopteren-Gifte (FANG et al. 1988; HOFFMAN 1993) sowie zu einer Familie von Cystein-reichen sekretorischen Proteinen (cysteine-rich secretory prote- ins, CRISPs; MIZUKI u. KASANHARA 1992; HAENDLER et al. 1993) und zu Pathogenese- angehörigen Proteinen von Pflanzen (pathogenesis related proteins, PRPs, CORNE- LISSEN et al. 1987). Die restlichen 194 aminoterminalen AS wiesen keine Ähnlichkei- ten zu Proteinen in der Datenbank auf. ASP wird innerhalb der ersten 30 Minuten nach der Stimulation freigesetzt und ist nach vier Stunden nahezu vollständig sezer- niert (HAWDON u. SCHAD 1990). Diese schnelle Sekretion legt eine wichtige Funktion früh im Infektionsprozess, wie z.B. die Modulation der Immunantwort des Wirtes, nahe. Aufgrund der Homologie zu dem Gift Ag5 der Hymenopteren, kann ASP auch als Allergen fungieren (HAWDON et al. 1996).
Ein zweites Ancylostoma-secreted protein (Ac-ASP-2) wurde in ES-Produkten dritter Larven aufgefunden. Es ist nur etwa halb so lang ist, wie das zuvor beschriebene ASP (umbenannt in Ac-ASP-1, HAWDON et al. 1996). Daher scheint es zwei Formen von ASP-Molekülen zu geben: eine kurze Form, die aus einer Domäne besteht und
eine lange aus zwei Domänen bestehende Form. Die kurze Form wird von Ac-ASP-2, dem homologen „venom allergen“ von Filarien, Hc24 von H. contortus (SCHALLIG et al. 1997) und den 17 oder mehr Ac-ASP-2-Homologen von C. elegans repräsentiert, während die lange Form von Ac-ASP-1 von A. caninum, A. duodenale und N. americanus (ZHAN et al. 1999), Hc40 von H. contortus und vom Cosmid F11C7.3 repräsentiert wird. Alignments der N- und C-terminalen Domänen der lan- gen Form zeigten untereinander sowie zu der kurzen Form Homologien auf, was dafür spricht, dass es sich bei dem ASP-2 um das ursprüngliche Molekül handelt und ASP-1 aus einer Gen-Duplikation hervorgegangen ist. Ein Proteindatenbank- Vergleich ergab Ähnlichkeiten des Ac-ASP-2 zu einer Gruppe evolutionär verwandter sekretorischer Proteine, der SCP/Tpx-1/Ag5/Pr-1/Sc-Familie der PROSITE- Datenbank bzw. zu der Ag5/Tpx-1-Familie der BLOCKS-Datenbank. Aufgrund der relativ geringen Identitäten zwischen diesen Molekülen (25-28%) und des Fehlens klar definierter Funktionen, konnte aus diesem Datenbank-Vergleich nicht auf eine Funktion des Ac-ASP-2 geschlossen werden. Da die Ac-ASP-2-Sekretion jedoch durch wirtsspezifische Signale ausgelöst wird, scheint es eine Rolle im Infektionspro- zess zu spielen. Eine Kombination der beiden ASP-Moleküle in einem Vakzine-
„Cocktail“ könnte einen guten Schutz gegen eine Hakenwurm-Infektion bieten (HAW- DON et al. 1999).
Das A. caninum surface-associated antigen (Ac-SAA-1) wurde von ZHAN et al. 2004 identifiziert. Das aus 162 AS bestehende Protein weist eine Transmembran-Domäne am C-Terminus zwischen den AS-Resten 145 und 161 auf, woraus sich schließen lässt, dass das reife Protein (nach der Entfernung des Signalpeptids) extrazellulär, aber am C-Terminus mit der Zelloberfläche verbunden ist. Ac-SAA-1 wird von den L3 sowie von adulten Würmern exprimiert und weist eine 31%ige AS-Identität zu Ov-103, dem Oberflächen-assoziierten Antigen von Onchocerca volvulus- Mikrofilarien (LUSTIGMAN et al. 1992) auf. Dieses ist, ebenso wie Ac-SAA-1, in der Basalmembran der Kutikula und in der Hypodermis adulter Würmer lokalisiert.
Rekombinantes Ac-SAA-1 weist folgende Merkmale auf, die es zu einem vielver- sprechenden Vakzine-Antigen machen: 1. Es wird auf der Oberfläche von adulten Hakenwürmern exprimiert. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass es auch auf der
Oberfläche der L3 lokalisiert ist und damit direkt in der Wirt-Parasit- Wechselbeziehung steht. 2. Eine Immunisierung mit Oberflächen-Antigenen konnte einen Schutz gegen Infektionen bei H. contortus (TURNBULL et al. 1992; JACOBS et al.
1999), T. circumcincta (WEDRYCHOWICZ et al. 1992, 1995) und T. spiralis (ORTEGA- PIERRES et al. 1989; APPLETON u. USACK 1993) verleihen. 3. Anti-Ac-SAA-1- Antikörper verhindern in vitro partiell das Einwandern der Larven in die Haut (ZHAN et al. 2004).
2.3.3.2 Antigene adulter A. caninum
Auch in den ES-Produkten adulter A. caninum können eine Reihe von Proteinen nachgewiesen werden, die potentielle Vakzine-Kandidaten darstellen. Von Bedeu- tung sind vor allem die Proteine, die in Zusammenhang mit der Blutaufnahme und mit der Unterdrückung der Immunantwort des Wirtes stehen.
1983 wurde erstmals von HOTEZ u. CERAMI eine Protease beschrieben, die von adul- ten A. caninum sezerniert wird. Diese katalysiert die Hydrolyse mehrerer Plasmapro- teine und scheint essentiell für die Adaption an die parasitische Lebensweise zu sein.
Später wurde herausgefunden, dass diese Protease ein Molekulargewicht von 37 kDa besitzt und durch den Metall-Chelator EDTA inhibiert werden kann. Aus die- ser Eigenschaft lässt sich schließen, dass sie zu den Metalloproteasen gehört. Sie besitzt außerdem elastinolytische Fähigkeiten, da sie in der Lage ist Elastin zu lysie- ren. Die Protease wird von den adulten Hakenwürmern vermutlich zum Abbau des Mukosa-Bolus in der Mundkapsel genutzt. Weiterhin könnte sie eine Rolle bei der Zerstörung der Kapillaren in der Lamina propria spielen, wodurch es zum Blutaustritt kommt. Auch eine Funktion als Antikoagulans ist möglich, da Elastasen mit verschie- denen gerinnungshemmenden Fähigkeiten, wie dem Abbau von Fibrinogen und Fibrin (BROWER u. HARPEL 1982) und die Umwandlung von Plasminogen in Mi- niplasminogen (MOROZ 1981), in Verbindung gebracht werden. Durch ein Immu- noblot mit Antiserum gegen die aufgereinigte Protease konnte das Enzym auch in infektiösen A. caninum-Larven nachgewiesen werden. In diesen hat sie wahrschein- lich eine Bedeutung bei dem Eindringen in die Haut oder bei der Immunantwort des Wirtes (HOTEZ et al. 1985).
Nach der Entdeckung eines proteolytischen Enzyms (HOTEZ et al. 1985) und einer Hyaluronidase, die von dritten Larven sezerniert wird (HOTEZ et al. 1992), wurde auch eine Hyaluronidase in adulten A. caninum und Anisakis simplex aufgefunden. Beide Parasiten rufen Zoonosen bei Menschen hervor, die mit Ulzerationen im Magen- Darm-Kanal einhergehen. Die Hyaluronidase von A. caninum hat ein Molekularge- wicht von 65 kDa, ihre Funktion aber ist unbekannt. Eine Freisetzung in vivo könnte die Diffusion von biologisch aktiven Faktoren, wie Antikoagulantien, vasoaktiven Komponenten oder immunmodulatorischen Peptiden, beschleunigen. Wahrscheinlich aber spielt sie eine Rolle beim Eindringen der Würmer in die Mukosa des Gastroin- testinaltraktes. Da Hyaluronsäure reichlich in der Lamina propria vorkommt und dort als Barriere gegen die Einwanderung in die Mukosa fungiert, würde ihre Auflösung durch eine Hyaluronidase die Gewebeinvasion der Parasiten stark erleichtern (HOTEZ
et al. 1994).
Das Überleben der Endoparasiten ist von ihren Fähigkeiten, die Immunantwort des Wirtes zu umgehen, abhängig. So wurde in adulten A. caninum ein Glykoprotein (Neutrophil inhibitory factor, NIF) entdeckt, das die Adhäsion von aktivierten neutrophilen Granulozyten an Endothelzellen von Blutgefäßen und deren Freiset- zung von Wasserstoffperoxid inhibiert. NIF scheint mit großer Affinität an das Integrin CD11b/CD18 zu binden, das für die normale Zirkulation der Neutrophilen und ihre entzündlichen Funktionen verantwortlich ist. Da keine signifikante Sequenz- Homologie zu einem vorher beschriebenen Protein festgestellt werden konnte, ist es möglich, dass NIF zu einer neuen Klasse von Inhibitoren der Leukozyten-Funktion gehört (MOYLE et al. 1994).
In löslichen Proteinextrakten adulter A. caninum konnte von CAPPELLO et al. (1993) eine antikoagulatorische Aktivität nachgewiesen werden, die die Prothrombin-Zeit sowie die partielle Thromboplastin-Zeit deutlich verlängert. Diese Aktivität wurde dem AcAP, einem spezifischen Inhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa, zugeschrieben, der das Hauptkoagulans adulter A. caninum zu sein scheint. Seine ersten 30 N-terminalen AS weisen keinerlei Ähnlichkeiten zu Serin-Protease-Inhibitoren oder antikoagulatorischen Molekülen auf. Es ist möglich, dass es zwei oder mehr Isofor- men des AcAP gibt (CAPPELLO et al. 1995). Trotz der begrenzten AS-Ähnlichkeiten
konnte aufgrund der Anzahl und Positionen von zehn Cystein-Resten auf eine Zuge- hörigkeit des AcAP zu Mitgliedern der Ascaris-Familie der stark bindenden Serin- Protease-Inhibitoren (members of the Ascaris family of tight-binding serine protease inhibitors) schließen (CAPPELLO et al. 1996). Kurz darauf wurden drei weiteren AcAPs identifiziert: AcAP5, AcAP6 und AcAPc2. Diese unterscheiden sich sowohl in ihrer Länge als auch in ihren antikoagulatorischen Fähigkeiten. Während AcAP5 und AcAP6 direkt die katalytische Aktivität des Blutgerinnungsfaktors Xa inhibieren, blo- ckiert AcAPc2 vorwiegend die katalytische Aktivität eines Komplexes, der aus dem Blutgerinnungsfaktor VIIa und dem Gewebefaktor besteht (STANSSENS et al. 1996).
Bei der Suche nach weiteren Proteasen, die neben der Protease (HOTEZ u. CERAMI
1983) als Auslöser für die Hypersensibilitätsreaktion bei der eosinophilen Enteritis des Menschen anzusehen sind, wurden 1995 von HARROP et al. zwei Cystein- Proteinasen (AcCP-1 und AcCP-2) identifiziert. Ein Datenbankvergleich zeigt eine 60,7%ige Identität des AcCP-1 zu einem H. contortus Cystein-Proteinase-Gen und eine 59,5%ige Identität zu einem Gen, das für das Cathepsin B der menschlichen Leber kodiert. AcCP-2 weist eine 58,4%ige Ähnlichkeit zum bovinen Cathepsin B und eine 56,6%ige Ähnlichkeit zum Cathepsin B der menschlichen Leber auf. Unterein- ander sind AcCP-1 und AcCP-2 zu 86,2% identisch. Auf ihre Funktionen lässt sich durch die Beschreibung der Cystein-Proteinasen anderer parasitischer Würmer schließen. Diese beinhalten die Gewebemigration, die Umgehung der Immunantwort des Wirtes sowie die Verdauung von Hämoglobin (Hb) und anderen Nährstoffen.
Außerdem scheinen die Cystein-Proteinasen allergen zu sein somit die segmentale Entzündung des Darms hervorzurufen, die charakteristisch für die EE ist (HARROP et al. 1995).
Unter den gleichen Aspekten, die zur Auffindung der Cystein-Proteinasen führten, konnte eine Aspartyl-Protease (Acasp) identifiziert werden. Ein Datenbank-Vergleich mit dem aus 442 AS bestehenden Protein ergab eine 47%ige Identität zu der lyso- somalen Aspartyl-Protease von Aedes egypti (CHO u. RAIKHEL 1992), eine 46%ige Identität zu der Cathepsin D-ähnlichen Aspartyl-Protease (Sjpasp) von Schistosoma japonicum (BECKER et al. 1995) und 47-50%ige Identitäten zu Cathepsin Ds ver- schiedener Säugetiere (BALDWIN et al. 1993). Aspartyl-Proteasen werden durch Säu-
