Genomische DNA-Sequenz des PDI-Gens von A. caninum

Zur Identifizierung der genomischen DNA des PDI-Gens von A. caninum erfolgte ihre Isolierung aus 10 Würmern. Sie wurde in verschiedenen PCRs als Template einge-setzt. Für diese PCRs wurden sieben spezifische Primerpaare anhand der zuvor identifizierten cDNA-Sequenz ausgewählt. Dabei waren die Rückwärtsprimer des vorangehenden Primerpaares C-terminal des Vorwärtsprimers des folgenden Pri-merpaares lokalisiert, sodass sie eine überlappende Sequenz einschlossen. Er-schien bei den Gelelektrophoresen der PCRs, in denen genomische DNA als Template eingesetzt wurde, eine höhere Bande, als aus den Produktlängen mit cDNA als Template erwartet werden konnte, so ließ dieses auf das Vorhandensein eines oder mehrerer Introns in diesem Sequenz-Bereich schließen. Nach Klonierung, Sequenzierung und Bearbeitung der Sequenzen konnte die genomische DNA-Sequenz zusammengesetzt werden. Sie besteht aus 2914 bp.

Der Vorwärtsprimer des ersten Primerpaares beginnt an Position 21 und der Rück-wärtsprimer des letzten Primerpaares beginnt an Position 1717 (5´→3´-Richtung) der cDNA-Sequenz. Da sich in dem 20 bp-Bereich am 5´-Ende und dem 37 bp-Bereich am 3´-Ende vor der Poly A-Sequenz keine Primer auffinden ließen, ist es nicht aus-zuschließen, dass sich in diesen Sequenz-Abschnitten weitere Introns befinden.

Aufgrund der Kürze der Abschnitte ist das Vorhandensein von Introns jedoch eher unwahrscheinlich.

Ein Alignment der cDNA- und der genomischen DNA-Sequenz zeigte die Positionen der Exons und Introns auf. Die Sequenzen der Exons stimmten dabei zu 100% mit der cDNA-Sequenz überein. Die Exon-Intron-Grenzen wurden durch den Sequenz-Vergleich jedoch nicht genau definiert, da die Introns nicht gemäß der GT/AG-Regel am 5´-Ende ein GT und am 3´-Ende ein AG aufwiesen. Um der GT/AG-Regel zu

entsprechen, wurden die Exon-Intron-Grenzen um ein bis zwei Nukleotide verscho-ben. Die genomische DNA besteht somit aus fünf Exons der Länge 102 bp, 78 bp, 306 bp, 807 bp und 491 bp und vier Introns der Länge 431 bp, 104 bp, 425 bp und 170 bp.

Zur Absicherung der zusammengesetzten genomischen DNA-Sequenz wäre es hilfreich gewesen, die gesamte 2914 bp lange DNA-Sequenz zu amplifizieren, in einen Vektor zu klonieren und in einem Schritt zu sequenzieren. Für diese PCRs wurden mehrere Primerpaare an den terminalen Sequenzbereichen der genomi-schen DNA aufgefunden. Trotz verschiedener Primer-Kombinationen und Annealing-temperaturen konnten keine Produkte der gewünschten Länge amplifiziert werden.

Auch eine Verifizierung der Exon-Intron-Struktur durch einen Vergleich mit genomi-schen Sequenzen von PDIs anderer Organismen war nicht möglich, da in der Gen-Bank (NCBI) keine weiteren genomischen PDI-Sequenzen publiziert sind.

5.3 Expression des PDI-Gens von A. caninum

Für die Expression des PDI-Gens von A. caninum wurde ein prokaryotisches Ex-pressionssystem gewählt. Zunächst erfolgte die Herstellung eines Entry-Klons, wofür der ORF der cDNA in einen passenden Vektor (pENTR™ 3C) kloniert wurde. Der Entry-Klon wurde daraufhin mit einem Destinations-Vektor (pET160-DEST) rekombi-niert, woraus der gewünschte Expressions-Klon entstand. Das rekombinante Protein wurde von E. coli nach Induktion der Expression durch IPTG produziert. Zur Visuali-sierung des Proteins im SDS-Gel wurde durch die Lumio™-Technologie ein fluores-zierendes Lumio™-tag an das Protein gehängt, was eine spezifische Detektion des Proteins direkt im Gel erlaubt. Nach erfolgter SDS-PAGE konnte unter UV-Licht eine fluoreszierende Bande auf der Höhe von ca. 65 kDa nachgewiesen werden.

Das Molekulargewicht, das durch die SDS-PAGE ermittelt wurde (ca. 65 kDa), liegt höher als das durch das Programm ProtParam errechnete Molekulargewicht von 54,7831 kDa. Das beruht einerseits auf dem Vorhandensein eines N-terminalen tags des pET160-DEST-Vektors (4 kDa) und kann weiterhin durch posttranslationale Modifikationen hervorgerufen werden, auf die im Rahmen dieser Diskussion später genauer eingegangen wird.

Die PDI soll in folgenden Studien in Immunisierungsversuchen von Mäusen einge-setzt werden. Dadurch soll ihre Eignung als Vakzine-Kandidat geprüft werden. Für die Immunisierungsversuche ist die Herstellung der rekombinanten PDI in großen Mengen erforderlich. Zusätzlich muss das rekombinante Protein biologisch aktiv sein, um in den Impftieren eine erwünschte Immunantwort hervorrufen zu können. Dafür scheint E. coli als Expressionssystem ungeeignet zu sein. So führte in Vakzine-Experimenten mit Schafen zum Schutz vor H. contortus-Infektionen sowie in Vakzi-ne-Experimenten mit Mäusen zum Schutz vor A. caninum-Infektionen der Einsatz rekombinanter Proteine, die von E. coli produziert wurden, zu Problemen. Es wurde beobachtet, dass die Proteine ihre Aktivität verlieren und eine geringere Protektivität als natürliche Antigene hervorrufen. Dieses ist auf den Verlust der Epitop-Anordnung während der E. coli-Expression zurückzuführen, die aus der falschen Anordnung der Disulfidbindungen resultiert. Das Unvermögen von E. coli korrekt gefaltete Antigene für Vakzinierungs-Versuche zu produzieren wurde für die ASPs von dritten H. contor-tus- und A. caninum-Larven (ZHAN et al. 2003) sowie für Komponenten des H-gal-GP-Komplexes (KNOX et al. 2001) beobachtet. Ein weiteres Problem ist die Bildung von sog. Einschlusskörperchen („inclusion bodies“), in denen die meisten rekombi-nanten Proteine exprimiert wurden. Diese sind häufig stark mit anderen bakteriellen Bestandteilen kontaminiert. In einigen Fällen konnte die Expression in einem eukary-otischen Expressionsvektor die Epitop-Anordnung wieder herstellen. Dieses wurde für in Baculovirus-exprimiertes ASP von H. contortus (SHARP u. WAGLAND 1998) sowie für Hefe-exprimiertes Ac-ASP-1 (ZHAN et al. 2003) aufgezeigt. Als eukaryoti-sche Vektoren, die Vakzine-Antigene von Nematoden produzierten, wurden Baculo-viren, Insektenzellen und Hefen vewendet. Welches Vektor-System dabei am effi-zientesten arbeitet, konnte bisher nicht festgelegt werden (HOTEZ et al. 2003a).

In denletzten Jahren wurden die führenden Antigene in prokaryotischen und eukary-otischen Systemen exprimiert. Zu den exprimierten larvalen Proteinen gehören das ASP-1 und ASP-2 von N. americanus (Na-ASP-1 und Na-ASP-2) und A. ceylanicum (Ay-ASP-1 und Ay-ASP-2) sowie das ASP-2 und MTP-1 von A. caninum (Ac-ASP-2 und Ac-MTP-1). Die Expression des Na-ASP-1 sowie des Ac-ASP-2 und Ac-MTP-1 in E. coli resultierte in der Produktion rekombinanter Proteine, die weder löslich noch

korrekt gefaltet waren. Zudem wies rekombinantes Na-ASP-1 nicht die Epitop-Anordnung des nativen Proteins auf und polyklonale Antikörper, die gegen Na-ASP-1 hergestellt wurden, präzipitierten nicht mit dem nativen Protein aus löslichen L3-Extrakten. Auch rekombinantes Ac-MTP-1 zeigte keine enzymatische Aktivität. Zu den rekombinanten Proteinen, die erfolgreich in P. pastoris exprimiert werden konn-ten, gehören Na-ASP-1, Na-ASP-2, Ay-ASP-1 und Ay-ASP-2. Ac-TMP-1 und Ac-ASP-2 konnten dagegen bisher nicht Hefen, jedoch in Baculovirus-Systemen in ihrer katalytisch aktiven Form exprimiert werden. Von den Antigenen adulter A. cani-num wurden Ac-TMP und AcAP in löslicher Form in E. coli, Ac-MEP-1 und AcCP-1 als bioaktive, lösliche Proteine in viralen und nicht-viralen Insektenzellen und AcCP-2 in der biologisch aktiven Form in P. pastoris exprimiert.

Zurzeit werden zwei Labortier-Systeme für die Entwicklung eines Impfstoffs gegen Hakenwürmer eingesetzt: Hamster werden mit dritten Larven von A. ceylanicum und Hunde werden mit A. caninum-L3 infiziert. Bisherige Studien mit beiden Labortier-Arten zeigten, dass rekombinante Fusionsproteine von E. coli stärker immunogen waren als rekombinante Proteine, die in Baculoviren, Insektenzellen oder Hefen exprimiert wurden. In diesen Fällen richtete sich die Antikörper-Antwort gegen bakte-rielle Lipopolysaccharide oder Proteinkontaminanten (HOTEZ et al. 2003a). Für das Hervorrufen einer möglichst hohen Immunogenität des rekombinanten Proteins, spielt auch die Wahl des richtigen Adjuvans eine wichtige Rolle (HOTEZ et al. 2003a).

Der Einsatz von Aluminium-basierenden Adjuvantien, wie Alum und Alhydrogel, resultierte in einer vergleichsweisen niedrigen Immunogenität. Vakzinierungsversu-che von Hamstern mit P. pastoris-exprimiertem Ay-ASP-2, in denen QuilA, das er-folgreich als Adjuvans für rekombinante Proteine von Schistosomen in Mäusen und Wasserbüffeln eingesetzt wurde (ZHOU et al. 1999;MCMANUS et al. 2001), und Mon-tanid ISA-720, das als Adjuvans in humanen Malaria-Vakzinen eingesetzt wird (SAUL

et al. 1999; GENTON et al. 2000), getestet wird, sind in Arbeit (GOUD et al. 2004).

Für die durchzuführenden Immunisierungsversuche sollte die PDI von A. caninum auch in einem eukaryotischen Expressionssystem produziert werden. Dadurch kann dem Verlust der biologischen Aktivität, einer unkorrekten Faltung, einer falschen Anordnung der Epitope und einer Ansammlung des rekombinanten Proteins in

Ein-schlusskörperchen vorgebeugt werden. Das Hefe-Expressionssystem P. pastoris produziert das Protein in großen Mengen und ist im Vergleich zu anderen eukaryoti-schen Systemen preiswert (HOTEZ et al. 2003a). Daher wäre es auch für die Expres-sion der PDI geeignet.

Zu den Geweben, in denen die PDI exprimiert wird, gehören vor allem die Hypoder-mis und der Darm. Diese Lokalisationen werden für die PDI-1 (PAGE 1997), die PDI-2 (VEIJOLA et al. 1996) und die PDI-3 (ESCHENLAUER u. PAGE 2003) von C. elegans sowie für die PDI von A. caninum (EPE et al. 1998) und die PDI-2 von O. ostertagi (GELDHOF et al. 2003) beschrieben. Aufgrund dieser Lokalisationen, wird auf eine Funktion bei der Anordnung der ECM geschlossen und eine Rolle in einem Li-pidtransportsystem im Darm erwägt. Von der A. caninum-PDI wird außerdem ange-nommen, dass sie von dritten Larven während der Einwanderung in die Haut und während der Gewebeinvasion freigesetzt wird (EPE et al. 1998). Da diese PDI ver-mutlich ein Vorläufer-Molekül der in dieser Arbeit identifizierten PDI darstellt, wäre es interessant aufzuzeigen, ob sie in den gleichen Geweben exprimiert wird.

5.4 Bioinformatik

Unter dem Begriff „Bioinformatik“ versteht man den Einsatz von Computern zur Un-terstützung der Forschung in der Genomik, die das Sammeln von Sequenzdaten beinhaltet, und in der Postgenomik, die die Analyse einer Genomsequenz darstellt (BROWN 2002). Dazu gehören neben den Methoden, die in diesem Kapitel beschrie-ben werden, auch die bereits diskutierten Programme Align™ Plus 4.0, BLASTN, BLASTP und RPSBLAST.

Es wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt, um weitere bioinformatische Infor-mationen über die PDI von A. caninum zu erhalten. Zum einen wurde die Aminosäu-re-Sequenz der PDI durch Vorhersage-Methoden des ExPASy-servers auf posstranslationale Modifikationen überprüft. Desweiteren wurde diese Sequenz per e-mail dem PredictProtein-server zugesandt, der Informationen zur PDI durch Me-thoden zur Datenbanksuche, zur Suche nach Sequenzmotiven und zur Vorhersage der Proteinstruktur angab. Das Ziel der bioinformatischen Analyse stellte die Ermitt-lung möglicher Funktionen der PDI von A. caninum durch Aufzeigen

posttranslationa-ler Modifikationen, Datenbankvergleiche und Angaben zur Proteinstruktur dar. Bei den beiden gewählten Ansätzen handelt es sich um zwei mögliche Vorgehenswei-sen, die Hinweise auf Funktionen eines Proteins geben.

Zu den ausgewählten Programmen des ExPASy-servers gehören SignalP 3.0, TMHMM 2.0, NetNGlyc 1.0, NetOGlyc 3.1, YinOYang 1.2, Myristoylator, NetPhos 2.0, Sulfinator und ProtParam. Mit Ausnahme von ProtParam beruhen alle auf Vor-hersage-Methoden. Diese basieren auf einem neural network oder einem hidden Markov model. Für die Programme wird eine Durchschnitts-Genauigkeit angegeben, die meist zwischen 72% und 82% liegt. Aus diesem Grund sind die Ergebnisse vor-sichtig zu beurteilen und nicht als bestätigt anzusehen. Zur Absicherung der Richtig-keit der Ergebnisse müssten alle Vorhersagen durch weitere Programme sowie durch experimentelle Untersuchungen überprüft werden.

Durch das Programm SignalP 3.0 werden Signalpeptid-Schnittstellen in Proteinen berechnet. Diese befinden sich zwischen einer Signalsequenz und dem eigentlichen Protein. Für die AS-Sequenz der PDI von A. caninum wurde sowohl durch ein NN als auch durch ein HMM eine Schnittstelle zwischen den Positionen 16 und 17 vorher-gesagt. Proteine, die eine Signalsequenz enthalten, sind sekretorische Proteine. Sie werden von einem Signalerkennungspartikel (SRP) erkannt, der an die Signalse-quenz bindet. Dadurch kommt es zu einer vorübergehenden Unterbrechung der Translation und zur Adressierung dieses Komplexes an das ER, wo er von einem SRP-Rezeptor und einem Ribosomen-Rezeptor gebunden wird. Die beiden Rezepto-ren bilden zusammen mit mehreRezepto-ren Membranproteinen eine komplexe Pore. Beim Wiederbeginn der Proteinsynthese dissoziieren das SRP und sein Rezeptor vom Ribosom und die wachsende Polypeptidkette passiert die Pore und gelangt in das Lumen des ER. Nach kurzer Zeit im ER werden die Proteine über Vesike-labknospung und -fusion zum Golgi-Apparat transportiert und von dort zur Zellober-fläche, zu Sekretgranula oder zu den Lysosomen geleitet (ZUBAY 2000, S. 422).

Durch den Besitz einer Signalsequenz kann die PDI als sekretorisches Protein klas-sifiziert werden.

Von dem Programm TMHMM 2.0 wurden keine alpha-Helices in der PDI identifiziert.

Alpha-Helices sind in integralen Membranproteinen anzutreffen und bestehen aus Ketten von 20 hydrophoben AS, die durch Ketten hydrophiler AS voneinander ge-trennt sind. Integrale Membranproteine durchqueren die Phospholipid-Doppelschicht biologischer Membranen und sind somit auf der extrazellulären Seite sowie auf der intrazellulären Seite von Membranen exponiert (ZUBAY 2000, S. 452). Da die PDI der Vorhersage nach keine alpha-Helices enthält und zudem eine Signalsequenz an seinem N-terminalen Ende aufweist, ist es sehr unwahrscheinlich, dass es sich bei der PDI um ein Transmembranprotein handelt.

Mögliche Glykosylierungsstellen in Proteinen lassen sich durch die Programme NetNGlyc 1.0, NetOGlyc 3.1 und YinOYang 1.2 berechnen. Die Glykosylierungen finden im ER und im Golgi-Apparat statt und sind häufige Modifikationen sekretori-scher Proteine. Durch sie kann das Protein stabilisiert werden, seine richtige Faltung kann erleichtert werden oder es kann Teil eines Lipidankers zur Bindung des Prote-ins an eine Membran sein. Es gibt zwei Typen glykosidischer Bindungen: die O-glykosidische Bindung eines Kohlenhydrats an eine Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threonin-Restes und eine N-glykosidische Bindung an die Amidgruppe eines Asparagin-Restes. Während Glykoproteine im Zytoplasma nur einfach modifiziert sind, tragen die meisten sezernierten oder membrangebundenen Glykoproteine komplexer aufgebaute Kohlenhydrate (ZUBAY 2000, S. 412). Durch das NetNGlyc-Programm wurden für die PDI von A. caninum keine N-Glykosylierungsstellen vor-hergesagt. Da diese Methode auf Proteine des Menschen trainiert wurde und ihre Durchschnitts-Genauigkeit bei ca. 76% liegt, kann jedoch nicht ausgeschlossen wer-den, dass in der PDI N-Glykosylierungsstellen auftreten. Eine Glykosylierung der PDI würde das höhere Molekulargewicht von ca. 65 kDa, das durch die SDS-PAGE er-mittelt wurde, im Vergleich zu dem von dem Programm ProtParam errechneten Mo-lekulargewicht von 54,7831 kDa erklären. In der AS-Sequenz der PDI wird durch das Programm NetOGlyc für den Threonin-Rest an Position 491 eine O-GalNAc-Glykosylierungsstelle angegeben. Diese Methode wurde nur auf Proteine von Säuge-tieren trainiert. Deshalb sowie aufgrund des niedrigen G-scores ist die Wahrschein-lichkeit für die Richtigkeit dieser Vorhersage sehr gering. Von dem Programm

YinOYang, das O-ß-Glykosylierungsstellen in eukaryotischen Proteinen vorhersagt, wurde bei der Überprüfung der PDI eine Warnung angegeben, da diese eine Signal-sequenz aufweist. Für sekretorische Proteine ist eine intrazelluläre O-ß-Glykosylie-rung sehr unwahrscheinlich.

Das Programm Myristoylator gibt Auskunft über Myristoylierungen an N-terminalen Glycinen. Die Myristoylierung ist eine irreversible posttranslationale Modifikation von Proteinen niederer und höherer Eukaryoten, bei der ein Myristat (eine C14-gesättigte Fettsäure) kovalent an die Aminogruppe des N-terminalen Glycin-Rests gebunden wird. Diese Reaktion wird durch die N-Myristoyltransferase katalysiert und erfolgt im Allgemeinen an Glycin-Resten, die während der co-translationalen N-terminalen Entfernung des Methionins exponiert werden. Die Myristoylierung findet auch posstranslational statt, wenn interne Glycine durch Abspaltungen anderer Reste an die Oberfläche gelangen (PODELL u. GRIBSKOVI 2004). Da die PDI von A. caninum an ihrem N-terminalen Ende einen Methionin-Rest aufweist, ist sie für eine Analyse durch dieses Programm ungeeignet.

Die Vorhersage von Phosphorylierungsstellen an Serin-, Threonin- und Tyrosin-Resten wird von dem Programm NetPhos 2.0 durchgeführt. Die Phosphorylierung ist eine reversible Reaktion, bei der die Einführung einer Phosphatgruppe von verschie-denen Enzymen katalysiert wird. In eukaryotischen Organismen wird sie genutzt, um die Aktivität vieler Enzyme zu kontrollieren. Diese werden als Antwort auf extrazellu-läre Signale, wie Hormone oder Wachstumsfaktoren, phosphoryliert (ZUBAY 2000, S. 215-216). In der PDI wurden für zwölf Serin-, acht Threonin- und vier Tyrosin-Reste potentielle Phosphorylierungsstellen berechnet. Dabei wurde für acht Tyrosin-Reste ein score über 0,9, für zwölf Reste ein score zwischen 0,6 und 0,9 und für vier Reste ein score unter 0,6 angegeben. Je höher dieser score liegt, desto höher ist die Wahr-scheinlichkeit für die Richtigkeit der Vorhersage. Da das Programm auf eukaryoti-sche Proteine trainiert wurde und seine Durchschnitts-Genauigkeit ca. 82% beträgt, ist es sehr wahrscheinlich, dass die acht Reste mit dem hohen score eine Phospho-rylierungsstelle besitzen. Eine Absicherung dieser Vorhersagen wurde durch die Suche nach Motiven in der PROSITE-Datenbank durchgeführt. Die Ergebnisse wer-den dort diskutiert.

Durch das Sulfinator-Programm werden Sulfatierungsstellen an Tyrosin-Resten an-gegeben. Die Sulfatierung stellt eine generelle posttranslationale Modifikation sekre-torischer Proteine dar. Ihre genaue biologische Funktion ist nicht bekannt. Es wurde jedoch aufgezeigt, dass die Tyrosin-Sulfatierung die hämolytische Aktivität des Kom-plement C4 steigert, eine Rolle bei der Rezeptor-Bindung des Peptidhormons Chole-cystokinin spielt und sowohl die Wechselwirkungen zwischen dem von Willebrand-Faktor und Willebrand-Faktor VIII als auch zwischen Hirudin und Thrombin verstärkt (MONIGATTI

et al. 2002). Für die zwölf in der PDI von A. caninum vorhandenen Tyrosin-Reste wurden keine Sulfatierungsstellen berechnet. Das Auftreten von Sulfatierungen hel-minthischer Proteine konnte nicht belegt werden.

Die physiko-chemischen Parameter, die durch das Programm ProtParam angegeben werden, beruhen nicht auf Vorhersage-Methoden sondern sind errechnete Werte, die sich aus der Primärstruktur der PDI ergeben. Sie werden deshalb als festgelegt be-trachtet.

Von dem PredictProtein-server wurden Informationen zur PDI angegeben, die auf Datenbanksuchen (MaxHom und PSI-BLAST), Suchen nach Sequenz-Motiven (PROSITE, SEG und ProDom) sowie auf Vorhersage-Methoden der Proteinstruktur (DISULFIND, PHD, GLOBE, ASP und PROF) beruhen.

Für die PDI von A. caninum ergab die Suche nach Sequenz-Motiven in der PROSI-TE-Datenbank fünf verschiedene Motive, die unterschiedlich oft in der Sequenz vor-handen sind. Dazu gehören eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstelle, vier Proteinkinase C-Phosphorylierungsstellen, elf Kasein-kinase II-Phosphorylierungsstellen, zwei N-Myristoylierungsstellen und zwei Thiore-doxin-Aktivseiten. cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinasen scheinen eine Phosphorylierung von Serin- und Threonin-Resten zu bevorzugen, die sich in der Nähe von mindestens zwei aufeinander folgenden N-terminalen basischen (positiv geladenen) Resten wie Lysin, Arginin und Histidin befinden. Von dieser Regel wer-den aber auch Ausnahmen beobachtet (GLASS u. SMITH 1983). In der AS-Sequenz der PDI befinden sich N-terminal dieser Threonin-Phosphorylierungsstelle drei Lysin-Reste, die basische Seitenketten tragen. Durch das Programm NetPhos 2.0 wurde

keine Phosphorylierungsstelle für diesen Threonin-Rest an Position 129 vorherge-sagt. Nach meiner Einschätzung ist das Vorhandensein eines Motivs in der PROSI-TE-Datenbank aussagekräftiger als die Vorhersage durch das NetPhos-Programm, sodass von einer Phosphorylierungsstelle dieses Threonin-Restes ausgegangen werden kann. Die Proteinkinasen C bevorzugen eine Phosphorylierung von Serin- und Threonin-Resten, die in der Nähe eines C-terminalen basischen Restes lokali-siert sind (WOODGET et al. 1986). Den Threonin-Resten in der PDI, die eine Protein-kinase C-Phosphorylierungsstelle aufweisen, folgen Leucin-, Isoleucin- oder Aspara-gin-Reste. Für die Threonin-Reste an den Positionen 100 und 135 sowie für den Serin-Rest an Position 446 wird auch durch das NetPhos-Programm eine Phospho-rylierungsstelle vorhergesagt. Die PROSITE-Angaben sichern diese Vorhersage ab.

Kaseinkinasen II sind von zyklischen Nukleotiden und von Kalzium unabhängige Enzyme. Durch sie werden viele verschiedene Proteine phosphoryliert. Zusammen-fassend kann erläutert werden, dass Kaseinkinasen II die Phosphorylierung von Serin gegenüber Threonin vorziehen, dass ein saurer Rest (Aspartat oder Glutamat) drei Reste vom C-terminalen Endes des Serin-/Threonin-Restes entfernt auftreten muss und dass zusätzliche am C-terminalen Ende folgende saure Reste die Phosphorylierungsrate steigern, wobei Aspartat dem Glutamat vorgezogen wird (PINNA 1990). In der PDI sind zwei von den drei der den Serin- bzw. Threonin-Resten mit der Phosphorylierungsstelle folgenden Resten ein Aspartat oder ein Glutamat.

Für neun dieser Serin- und Threonin-Reste, die sich an den Positionen 18, 138, 144, 183, 262, 289, 315, 341 und 476 befinden, wird auch durch das NetPhos-Programm eine Phoshorylierungsstelle angegeben. Die Myristoylierung wurde bereits bei dem Programm Myristoylator beschrieben. Die N-Myristoylierungsstellen in der PDI, die durch die PROSITE-Suche aufgefunden wurden, liegen intern und nicht am

Für neun dieser Serin- und Threonin-Reste, die sich an den Positionen 18, 138, 144, 183, 262, 289, 315, 341 und 476 befinden, wird auch durch das NetPhos-Programm eine Phoshorylierungsstelle angegeben. Die Myristoylierung wurde bereits bei dem Programm Myristoylator beschrieben. Die N-Myristoylierungsstellen in der PDI, die durch die PROSITE-Suche aufgefunden wurden, liegen intern und nicht am