cDNA-Sequenz des PDI-Gens von A. caninum

Den Anfang der Identifizierung der cDNA-Sequenz des PDI-Gens stellte die Anzüch-tung von in einer vorherigen Arbeit angefertigten Klonen dar. Nach der Sequenzie-rung ihrer Plasmid-DNAs konnte durch ein Alignment dieser Sequenzen eine über-einstimmende Sequenz bei sieben Klonen festgestellt werden, die eine Länge von 548 bp aufwies. Eine BLASTN-Suche zeigte Ähnlichkeiten dieser Sequenz zu den PDIs von O. ostertagi und C. elegans auf. Durch ein Alignment mit den cDNA-Sequenzen der PDI 2-Gene von O. ostertagi und C. elegans ergaben sich 30%ige bzw. 26%ige Identitäten. In einem Bereich von 554 bp lag die Identität der A. cani-num-Sequenz zu dem PDI 2-Gen von O. ostertagi sogar bei 82% und in einem 548 bp langen des PDI 2-Gens von C. elegans bei 72%. Diese Beobachtung ließ darauf schließen, dass die identifizierte 548 bp lange Sequenz ein Teil des PDI-Gens von A. caninum darstellte.

Zur Generierung des 5´- als auch des 3´-Endes der cDNA wurden eine 5´- und eine 3´-RACE durchgeführt. Da die im Herstellerprotokoll des BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit angegebene Anzahl an Zyklen für die Elongationsphase für eine Amplifikation der Produkte nicht ausreichend war, wurde in einer folgenden RACE-PCR die Zyklenzahl um 10 erhöht, sodass die Elongation letztendlich 30 Zyklen einschloss. Damit konnten die erwünschten Produkte im Agarosegel nachgewiesen werden. Die 5´-RACE, bei der ein genspezifischer Rückwärtsprimer eingesetzt wur-de, generierte weitere Nukleotide des 5´-Endes. Das Auffinden des Startcodons (ATG) sowie ein Vergleich mit dem 5´-Ende des PDI 2-Gens von O. ostertagi deutete daraufhin, dass das vollständige 5´-Ende der cDNA in diesem einen Schritt bereits identifiziert werden konnte. Die bisher 548 bp umfassende Sequenz von A. caninum konnte somit an ihrem 5´-Ende um 77 bp verlängert werden. Durch die 3´-RACE, für die ein genspezifischer Vorwärtsprimer eingesetzt wurde, konnten 525 neue

Nukleo-tide des 3´-Endes identifiziert werden. Dass diese Sequenz noch nicht das gesamte 3´-Ende darstellte, ließ sich daraus folgern, dass sie weder ein Stoppcodon noch das Polyadenylierungssignal aufwies. Bei dem Polyadenylierungssignal handelt es sich um eine hochkonservierte mRNA-Sequenz (5´- AAUAA -3´), welches bei mehr als 88% der mRNAs die Vorraussetzung für das Anhängen der Poly A-Sequenz schafft (WELSH et al. 1990; SCHÄFER 1992). Für die Amplifikation des kompletten 3´-Endes waren zwei weitere PCRs mit spezifischen Primern nötig. Durch diese wurden 604 bzw. 30 neue Nukleotide identifiziert. Die Zusammensetzung der fünf Teilsequenzen ergab eine Sequenz von insgesamt 1784 bp. Diese beinhaltete das Stoppcodon TAA sowie das Polyadenylierungssignal und die Poly A-Sequenz, wodurch die Vollstän-digkeit der cDNA-Sequenz belegt werden konnte.

Zur Verifizierung der zusammengesetzten cDNA-Sequenz, wurde die gesamte cDNA in einen Vektor kloniert und sequenziert. Dafür wurde eine PCR mit Primern, die an den terminalen Abschnitten der zusammengesetzten Sequenz lokalisiert waren, durchgeführt. Ein Alignment von vier Klonen, in die die gesamte cDNA des PDI-Gens einkloniert wurde, ergab eine 100%ige Übereinstimmung mit der zusammengesetz-ten Sequenz.

Im Anschluss wurde die cDNA-Sequenz des PDI-Gens in die Aminosäure-Sequenz umgeschrieben, wobei drei Nukleotide für eine AS kodieren. Der kodierende Bereich des Gens, dessen Anfang das Startcodon (ATG) und dessen Ende das Stoppcodon (TAA) darstellt, besteht aus 1482 bp. Er kodiert für ein Protein, das aus 493 AS be-steht. Auch die PDIs von O. ostertagi (PDI 2), D. viviparus und C. elegans (PDI 2) besitzen einen ORF von 1482 bp und bestehen aus 493 AS. Der ORF der B. malayi-PDI dagegen umfasst 1512 bp und kodiert für ein aus 503 AS bestehendes Protein.

Um zu belegen, dass es sich bei der identifizierten Sequenz um das PDI-Gen von A. caninum handelt, wurde sie in ein Alignment mit kodierenden cDNA-Sequenzen der PDIs von O. ostertagi (PDI 2), D. viviparus, C. elegans (PDI 2) und B. malayi eingefügt. Es ergaben sich eine 87%ige Identität zur PDI 2 von O. ostertagi, eine 80%ige Identität zur PDI von D. viviparus, eine 77%ige zur PDI 2 von C. elegans und eine 65%ige Identität zur PDI von B. malayi. Auf Proteinebene stellten sich 92%ige

(O. ostertagi), 94%ige (D. viviparus), 82%ige (C. elegans) und 74%ige (B. malayi) Identitäten heraus. Durch diese Ähnlichkeiten konnte die Identifizierung der PDI von A. caninum bestätigt werden. Ob es sich bei ihr, wie bei O. ostertagi und C. elegans, um eine Isoform einer PDI-1 handelt, müsste durch weitere Versuche abgeklärt wer-den.

Für die 1998 von EPE et al. beschriebene 1782 bp lange PDI von A. caninum wird angenommen, dass sie von dritten Larven während der Einwanderung in die Haut und während der Gewebeinvasion freigesetzt wird. Die vorliegende Arbeit beruht auf einer 548 bp langen Teilsequenz dieser PDI. Durch ein Alignment stellte sich eine 70%ige Identität der beiden PDIs heraus, wobei die in dieser Arbeit beschriebene PDI an ihrem 5´-Ende zusätzliche 78 bp aufweist. Die anschließenden 983 bp sind identisch, während die 3´-Enden nur noch eine Identität von 41% aufweisen. Auf-grund der hohen Übereinstimmung beider PDIs in dem 983 bp umfassenden Bereich kann davon ausgegangen werden, dass es sich um das gleiche Molekül handelt.

Somit stellt die 1998 beschriebene PDI ein Vorläufer-Molekül der in dieser Arbeit identifizierten PDI dar.

Da die humane PDI die Bildung von Disulfidbindungen katalysiert und die ß-Untereinheit der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase darstellt, die die Bildung von 4-Hydroxyprolinen in Kollagenen katalysiert, wird für die PDIs von C. elegans und O. ostertagi eine Funktion bei der Biosynthese der kutikulären extrazellulären Matrix angegeben (WINTER u. PAGE 2000; GELDHOF et al. 2003). Ob die PDI-2 von O. ostertagi eine Rolle in einem Lipidtransportsystem im Darm spielt, ähnlich der humanen PDI, die eine Untereinheit des mikrosomalen Triglycerid-Transfer-Proteins ist, ist nicht belegt. Für C. elegans wird jedoch ein solches Lipidtransportsystem beschrieben (BAKER 1988). Es liegt nahe, dass auch die PDI von A. caninum in die Synthese der Kutikula involviert ist. Da für den Hakenwurm kein intestinales Li-pidtransportsystem dokumentiert ist, kann eine Funktion der PDI in diesem nicht bestätigt, aber auch nicht ausgeschlossen werden.

Die AS-Sequenz der PDI wurde mittels RPSBLAST auf das Vorliegen konservierter Domänen überprüft. Dabei wurden zwei Thioredoxin-Domänen aufgefunden, die

jeweils 106 AS umfassen und an den Positionen 25 bis 130 und 362 bis 467 lokali-siert sind. Sie beinhalten jeweils eine WCGHCK-Sequenz, die bei den PDIs von O. ostertagi, D. viviparus, C. elegans und B. malayi die gleichen Positionen einneh-men (51 bis 56 und 392 bis 397). Diese hoch konservierten Sequenzen stellen bei der humanen PDI die aktiven Seiten für die Protein-Disulfid-Isomerase-Aktivität dar (FREEDMAN et al. 1994).

Die humane PDI besteht aus den fünf Domänen a, b, b´, a´ und c, wobei die a- und die a´-Domäne homolog zu Thioredoxin sind. Der zentrale Abschnitt des Moleküls besteht aus der b- und b´-Domäne, die ebenfalls eine begrenzte Homologie zueinan-der aufweisen. Auch für die b-Domäne wurde eine Thioredoxin-ähnliche Struktur aufgezeigt, sodass die PDI des Menschen aus zwei aktiven und zwei inaktiven Thio-redoxin-Elementen besteht (KEMMINK et al. 1997). Die isolierten a- und a´-Domänen sind weniger effiziente Katalysatoren als das intakte PDI-Molekül (DARBY et al. 1996), woraus zu schließen ist, dass auch die b- und b´-Domänen wichtig für Funktion der PDI sind (KEMMINK et al. 1997). Da die PDI von A. caninum ebenfalls zwei Thioredo-xin-Domänen aufweist, die die Sequenzen der aktiven Seiten beinhalten, scheinen auch diese essentiell für ihre Funktion zu sein. Ein Alignment der zentralen Abschnit-te der A. caninum-PDI zeigAbschnit-te jedoch nur eine 17%ige Übereinstimmung. Dadurch kann das Vorhandensein bedingt homologer b- und b´-Domänen nicht belegt wer-den. Es wäre interessant zu überprüfen, ob der zentrale Abschnitt auch für die volle Aktivität der PDI von A. caninum notwendig ist.

Der ORF der PDI enthält an seinem C-terminalen Ende eine HTEL-Sequenz, bei der es sich um eine modifizierte Form des Standard-ER-Retentionssignals KDEL han-delt, die ebenso effektiv bei der Zurückhaltung eines Proteins im endoplasmatischen Retikulum ist (ANDRES et al. 1990). Dieses lässt vermuten, dass die PDI von A. cani-num im Lumen des ER lokalisiert ist. Da die PDI 2 von O. ostertagi durch ein Wes-tern Blot eindeutig in exkretorisch-sekretorischem Material von vierten Larven und von adulten Stadien nachgewiesen konnte (GELDHOF et al. 2003), ist es wahrschein-lich, dass auch die PDI von A. caninum sezerniert wird. Obwohl die H/KDEL-Sequenz für die Zurückhaltung der Proteine im ER essentiell ist, ist es möglich, dass sie alleine für diese Funktion nicht ausreichend ist. Viele KDEL-enthaltenden

Protei-ne konnten außerhalb des ER nachgewiesen werden (XIAO et al. 1999; OKAMOTO et al. 2001). Auch die PDIs von O. ostertagi (PDI 2), D. viviparus, C. elegans (PDI 2) und B. malayi besitzen an ihrem C-Terminus eine HTEL-Sequenz. S. mansoni dage-gen weist eine KDEL-Sequenz auf und bei O. volvulus fehlt ein solches ER-Retentionssignal.