Tierärztliche Hochschule Hannover
Leitung: Prof. Dr. G. Breves
Molekulare Grundlagen der Phosphor-Homöostase beim kleinen Wiederkäuer
HABILITATIONSSCHRIFT
Zur Erlangung der Venia legendi der Tierärztlichen Hochschule Hannover
vorgelegt von
KORINNA HUBER
Dr. med. vet.
Hannover 2003
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung 3-4
2. Literaturübersicht
2.1 Der endogene Phosphat-Kreislauf beim Wiederkäuer 5-15 2.2 Die Molekularbiologie der Pi-Transporter 16-29 2.3 Die Bedeutung des Pi im Intermediärstoffwechsel 29-35
3. Zielsetzung 36-37
4. Tiere, Material und Methoden
4.1 Tiere 38-39
4.2 Material und Methoden 39-40
4.3 Übersichten Projekte 41-44
5. Ergebnisse und Diskussion
5.1 Charakterisierung der molekularen Struktur und Funktion der epithelialen Pi- Transporter in Niere, Darm und
Speicheldrüse bei Schafen und Ziegen 45-55 5.2 Molekulare und funktionelle Entwicklung der
epithelialen Pi-Transporter während der Ontogenese bei
Ziegen 56-66
5.3 Beeinflussung der P-Homöostase und des endogenen
Pi-Kreislaufes über die diätetische P und/oder Ca-Versorgung bei Ziegen
5.3.1 Nicht-ruminierende Ziegen 67-75
5.3.2 Ruminierende Ziegen 76-83
5.4 Auswirkung einer diätetischen P-Restriktion auf den
Intermediärstoffwechsel 84-99
5.4.1 Diätetische P-Restriktion: Intermediärstoffwechsel
bei Ratten 85-91 5.4.2 Diätetische P-Restriktion: Energie- und Intermediär-
Stoffwechsel bei Schafen 92-96 5.4.3 Diätetische N-Restriktion: Wechselwirkung mit dem P-
Haushalt bei Schafen 96-99
6. Zusammenfassung 100-101
7. Literaturverzeichnis 102-116
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ALAT Alanin-Aminotransferase
ANP Atriales Natriuretisches Peptid ASAT Aspartat-Aminotransferase BSM Bürstensaummembran BSMV Bürstensaummembranvesikel Ca Calcium
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CaCo-Zellen Humane Colon-Carzinomzellen CaR Calcium Rezeptor
cDNA copy oder complementary Desoxyribonukleinsäure cGPDH cytosolische Glycerol-3P-Dehydrogenase cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat CrP Creatinphosphat
DAG Diacylglycerol 2,3-DPG 2,3-Diphosphoglycerat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF Epidermal Growth Factor
EL Extrazelluläre Schleife (loop) EZFV extrazelluläres Flüssigkeitsvolumen FDPase Fruktose-1,6-Diphosphatase GAPDH Glycerinaldehyd-3P-Dehydrogenase GFR Glomeruläre Filtrationsrate
GFP Glomeruläre Filtrationsrate für Phosphat GLDH Glutamat-Dehydrogenase GlvR-1 Gibbon ape leukemia virus receptor
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-Ethansulfonsäure IGF Insulin like growth factor
IL Intrazelluläre Schleife (loop) IP3 Inositoltriphosphat
Jnet Transepitheliale Netto-Fluxraten Km Halbmaximale Sättigung des Transporters MES 2-(N-Morpholino)Äthansulfonsäure MMuLV Moloney mouse leukemia virus
N Stickstoff
NBL-1 bovine epitheliale Nierenzelllinie NHE Na+/H+ exchanger
NHERF Na+/H+ exchanger related factor OK-Zellen Opossum Kidney –Zellen OS Organische Substanz
P Phosphor
PDG Phosphat-abhängige Glutaminase Pi Phosphat
PK Pyruvatkinase
PMSF Phenylmethansulfonylfluorid PTH Parathormon
RAM-1 amphotropic murine retrovirus receptor SCFA Short chain fatty acids
SGLT 1 Sodium linked glucose transporter 1
Stc Stanniocalcin
STH Somatotropes Hormon
RT-PCR Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion T Trockenmasse
TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphine TD Transmembrandomäne TGFa Transforming growth factor a
TRP Tubuläre Resorptionskapazität U Unit
Vmax Maximale Transportkapazität W Lebendmasse
1. EINLEITUNG
Die Phosphor(P)homöostase ist für den Wiederkäuer essentiell für Wachstum und Leistungen wie Milch, Wolle und Nachkommenschaft. Einen großen Teil des dafür bestehenden Energiebedarfes deckt er durch die in den Vormägen als Stoffwechselendprodukte der symbiotisch dort lebenden Mikroorganismen entstehenden kurzkettigen Fettsäuren (SCFA, short chain fatty acids). Wegen der sich daraus ableitenden hohen Anforderungen an die Pansenmikroorganismen muss auch die P-Versorgung der Mikroorganismen und die Stabilisierung des Pansenmilieus durch die Puffereigenschaften des anorganischen Phosphates (Pi) für optimales mikrobielles Wachstum und ausreichende Stoffwechselleistungen permanent gewährleistet sein. Über die Sekretion großer Mengen an Pi mit dem Speichel in die Vormägen, eine hohe intestinale Pi-Absorption und eine nahezu vollständige tubuläre Resorption von Pi in der Niere wird die ausreichende Versorgung der Symbiosepartner gewährleistet. Dieser für den Wiederkäuer einzigartige endogene Pi-Kreislauf wird ständig im Rahmen der P-Homöostase reguliert.
Ein großer Teil des epithelialen Pi-Transportes in Niere und Darm des Wiederkäuers wird über Na+-abhängige Transportprozesse moduliert, deren molekulare Grundlage und Eigenschaften aber noch unbekannt sind. Bei verschiedenen monogastrischen Tierarten sind bisher eine Reihe von vorwiegend Na+-abhängigen Pi-Transportsystemen in renalen und intestinalen Epithelien beschrieben worden. Deren Strukturen lassen eine Einteilung in drei Familien von Na+/Pi-Transportern zu, deren Auftreten nicht nur auf Säugetiere begrenzt ist.
Die evolutionsgeschichtlich weit verbreitete Familie der Na+/Pi-Transporter vom Typ II scheint hauptverantwortlich für den regulierbaren Anteil des epithelialen Pi-Transportes zu sein.
Die Adaptationsfähigkeit des endogenen Kreislaufs an diätetisch erhöhte oder reduzierte Zufuhr von P und/oder Ca wurde sowohl bei milchernährten als auch bei wiederkäuergerecht
gefütterten Ziegen und Schafen nachgewiesen. Die Struktur des Futters ist für den endogenen Kreislauf von großer Bedeutung, da erst bei raufutterversorgten Tieren die mechanisch stimulierte Speichelsekretion für eine quantitativ bedeutende Verschiebung von Speichel-Pi in den Pansen ausreichend ist. Der endogene Pi-Kreislauf ist also erst ab einem bestimmten Entwicklungsstadium voll funktionstüchtig. Speicheldrüse, Darm, Niere und Knochen sind theoretisch gleichermaßen in der Lage, durch Erhöhung oder Einschränkung ihrer Pi- Transportkapazität aktiv zur Anpassung des endogenen Pi-Kreislaufes an Änderungen in der P-Zufuhr beizutragen.
Eine grenzwertige diätetische Versorgung mit Pi führt primär zu einer Einschränkung der Futteraufnahme und zu einer Reduktion des Wachstums. Die Wachstumsreduktion ist nur partiell über die verminderte Futteraufnahme zu erklären: Pair fed Versuche haben gezeigt, dass trotz gleicher aufgenommener Futtermenge in beiden Versuchsgruppen die P- Mangelgruppe signifikant niedrigere Lebendmassezunahmen aufweisen. Kausal wird dafür eine Reduktion der mikrobiellen Stoffwechselleistungen - Produktion und Bereitstellung von kurzkettigen Fettsäuren als energiereiches Substrat und von mikrobiellem Protein für das Wirtstier - aufgrund des P-Mangels verantwortlich gemacht. Da aber die Wachstumsverzögerung durch einen P-Mangel in ähnlicher Weise auch beim monogastrischen Tier zu beobachten ist, muss auch eine intermediäre Wirkung des Pi- Mangels angenommen werden.
Durch die Erfassung von in vivo erhobenen Daten am lebenden Tier in Kombination mit in vitro Messungen von Organfunktionen, epithelialen Pi-Transporteigenschaften und - kapazitäten auf funktioneller und struktureller Ebene und intermediären Stoffwechselabläufen soll versucht werden, die komplexe homöostatische Regulation des P-Haushaltes bei Wiederkäuern auf molekularer Ebene zu charakterisieren.
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Der endogene Phosphatkreislauf beim Wiederkäuer
Der endogene Pi-Kreislauf manifestiert sich mit dem Beginn des Speichelflusses und der damit verbundenen steigenden Pi-Sekretion in den Pansen. Bereits vor über 40 Jahren war die große Bedeutung der Pi-Sekretion über den Speichel beim großen und kleinen Wiederkäuer bekannt. Im Vordergund steht dabei die Glandula parotis, die kontinuierlich große Mengen an serösem, isotonischem, HCO3-- und Pi -reichem Speichel in den Pansen abgibt (Kay 1960a). Die hohen Pi-Konzentrationen im Parotisspeichel, der etwa 50 % des gesamten Speichels ausmacht, werden auch bei stark gesteigerter Sekretionsrate nach der Futteraufnahme beibehalten (Cook 1995). Die gesamte endogene Pi-Sekretion mit dem Speichel wird mit Werten zwischen 2 und 10 g P/Tag in Abhängigkeit von der eingesetzten Meßmethode bei einer Speichelflussrate zwischen 6 und 16 l /Tag für das Schaf angegeben (Kay 1960a, Breves & Schröder 1991). Wurde bei erwachsenen Schafen der endogene Pi- Kreislauf durch Ligation der Parotisausführungsgänge (Tomas & Somers 1974) oder durch Reduktion des Speichelflusses aufgrund der feinen Struktur von zermahlenem Futter unterbrochen bzw. eingeschränkt (Tomas 1974a), stieg der Plasma-Pi-Spiegel an. Gleichzeitig erhöhte sich die renale Pi-Exkretion bei unveränderter glomerulärer Filtrationsrate (GFR) auf die Menge an Pi, die mit dem Speichel sezerniert worden wäre. Dieser Anstieg der renalen Pi- Exkretion sollte eine Folge der erhöhten Plasma-Pi-Werte und einer Einschränkung der Pi- Resorptionskapazität in der Niere sein (Tomas 1974b). Als weitere Folge der eingeschränkten Speichel-Pi-Sekretion sanken der pH-Wert und die Pi-Konzentrationen im Panseninhalt ab (Tomas 1974a) und die fäkale Pi-Ausscheidung verringerte sich, wobei aber die P- Gesamtbilanz unverändert ausgeglichen blieb (Tomas 1974b, Sato 1975). Diese
Zusammenhänge unterstreichen das Zusammenspiel von Darm, Niere und Speicheldrüse im Hinblick auf den P-Haushalt von Wirtstier und Pansenmikroorganismen.
Bei fortschreitender Reduktion der Pi-Konzentrationen im Pansen verschlechterten sich die mikrobiellen Verdauungsleistungen (Milton & Ternouth 1984). Dies äußerte sich in einer Reduktion der Verdaulichkeit der organischen Substanz und der SCFA-Produktion (bei Pi- Konzentrationen im Pansensaft von < 0,1 mmol/l; in vitro) und einer Verringerung der mikrobiellen Proteinsynthese (bei Pi-Konzentrationen im Pansensaft von < 0,03 mmol/l; in vitro) (Breves & Schröder 1991). Der Minimalbedarf für die Pansenmikroorganismen wird mit 0,7 - 2,6 mmol/l Pi unter in vivo Bedingungen angegeben (Breves & Schröder 1991, Milton & Ternouth 1985), unter adäquater diätetischer P-Versorgung liegen die Pi- Konzentrationen im Pansensaft bei 8,5 - 20,9 mmol/l (Tomas 1973, Breves & Höller 1987b, Breves et al. 1987, Petri et al. 1988).
Aus den Vormägen gelangen etwa 10-20 l Pi-reiche Flüssigkeit/Tag in den Darm des kleinen Wiederkäuers. Die Pi-Absorption der endogen sezernierten Menge, die die mit dem Futter aufgenommene P-Menge um das 5 - 10fache überstieg, war bis zum terminalen Ileum abgeschlossen (Kay & Pfeffer 1969, Pfeffer et al.1970, Grace et al. 1974, Poppi & Ternouth 1979). Die fäkale Ausscheidung von P setzt sich aus nicht resorbierbarem P aus der Nahrung, den unvermeidlichen P-Verlusten und dem Anteil der P-Exkretion zur Regulation der P- Homöostase zusammen, wobei der größte Teil endogenen Ursprungs ist (Spiekers et al.
1993). Der Erhaltungsbedarf an Pi für den erwachsenen Wiederkäuer ergibt sich somit aus der Höhe der endogenen, unvermeidlichen fäkalen P-Verluste ermittelt unter reduzierter diätetischer P-Versorgung (= keine homöostatisch wirksame P-Ausscheidung nötig) und der Annahme, dass der Futter-P zu 100 % verdaulich ist. Diese Verluste betragen unter Bezug auf die Lebendmasse 12 - 34 mg/kg Lebensmasse/Tag (Agricultural Research Council 1980, National Research Council 1985, Spiekers et al. 1993) oder 1,0 - 1,2 g pro kg aufgenommene Trockenmasse für Mastbullen und Rinder (Spiekers et al. 1993, Klosch et al. 1997). Unter
physiologischen Fütterungsbedingungen bestehen die Verluste aus im Darm über Verdauungsflüssigkeiten wie Galle und Pankreas sezerniertem P, nicht verdaulichem Futter-P (Field et al. 1982) und P aus abgeschilferten Epithelzellen. Die P-Sekretion aus Galle und Pankreas beträgt etwa 0,2 - 0,6 g/Tag (Pfeffer et al. 1966, Scott & McLean 1981).
Die renale Pi-Resorptionskapazität bei Wiederkäuern ist unter physiologischen Bedingungen sehr hoch, so dass weniger als 200 mg P/Tag (Breves 1991) oder < 1% der täglich aufgenommenen P-Menge (Tomas 1975) ausgeschieden werden. Wurde der Plasma-Pi- Spiegel durch intravenöse Infusion von Pi artifiziell angehoben, stieg ab einem bestimmten Niveau die Pi-Auscheidung mit dem Harn drastisch an. Unter Verwendung von Inulin oder endogenem Kreatinin als Marker zur Ermittlung der Höhe der glomerulär filtrierten Flüssigkeitsmenge (GFR) konnte über die glomeruläre Filtrationsrate für Pi (GFP = GFR x Plasma-Pi-Konzentration (mg/ml)) eine tubuläre Resorptionskapazität für Pi (TRP = GFP - Harn-Pi-Konzentration (mg/ml)) ermittelt werden, deren Maximalwert für den Wiederkäuer deutlich über dem der monogastrischen Tiere liegt (Symonds & Manston 1974, Tomas 1975, Boencke 1975). Die Nierenschwelle, d.h. die Plasma-Pi-Konzentration, bei der die maximale TRP überschritten wird, lag bei erwachsenen Rindern bei etwa 2,3 mmol/l (Symonds &
Manston 1974) und bei Schafen bei 2,1 mmol/l (Field & Kamphues 1983). Während für die meisten erwachsenen Wiederkäuer die Niere keine Rolle für die Pi-Exkretion spielt, traten immer wieder sogenannte Ausscheidertiere auf. Bei vergleichbaren, normalen Plasma-Pi- Spiegeln wurde über die Niere verstärkt Pi ausgeschieden; die gesamte P-Bilanz war aber unverändert durch eine gleichzeitige Reduktion der fäkalen Ausscheidung um die renal ausgeschiedene Menge (Meyer 1972). Der Mechanismus dieses Phänomens ist unklar, möglicherweise ist eine genetische Disposition vorhanden (Field & Kamphues 1983).
Ontogenese des endogenen Pi-Kreislaufes: Die Entwicklung der Fähigkeit der Speicheldrüse zur Sekretion von Speichel in den Pansen ist verbunden mit der Zunahme des
Drüsengewebes in Abhängigkeit vom Körpergewicht und vom Beginn der Raufutteraufnahme. Ziegen im Alter von 2 - 487 Tagen nahmen unter annähernd physiologischen Fütterungsbedingungen (auf Stroh gehalten, ab 3. Woche zusätzlich zur Milch Angebot von Heu und Konzentrat) schon ab der 1. Lebenswoche Stroh und ab der 3.
Lebenswoche Heu und Konzentrat auf, so dass der Pansen ab der 3. Lebenswoche mit Strukturfutter gefüllt war. Die Wiederkauaktivität setzte ebenfalls in der 3. Lebenswoche ein.
Die unstimulierte Speichelsekretion entwickelte sich bei intakter vagaler Innervierung ab der 4. Lebenswoche, reflektorisch (über die Dehnung des Ösophagus) oder elektrisch stimulierte Speicheldrüsen zeigten schon in den ersten 3 Lebenswochen hohe Flussraten (Kay 1960b).
Die Durchtrennung der nervalen Versorgung der Speicheldrüse hatte ein komplettes Sistieren der Speichelsekretion zur Folge (Kay 1958). Die Speichel-Pi-Konzentrationen lagen bei bis zu 3 Wochen alten Ziegen unter dem Niveau älterer Tiere und zeigten eine positive Korrelation mit der Speichelflussrate. Die Organreife ist physiologisch und histologisch erst im dritten Lebensmonat erreicht (Kay 1960b). Die Regulation der P-Homöostase vor der Ausreifung der Speicheldrüse muss also in dieser frühen Lebensphase anderen Gesetzmäßigkeiten unterliegen. In Bilanzversuchen bei milchernährten Lämmern wurde eine hohe intestinale Verdaulichkeit des Milch-P (98 %) und -Ca (88 %) festgestellt (Ergebnisse aus dem Institut für Tierernährung, Universität Bonn, mündliche Mitteilung). Eine Verdopplung der diätetischen P-Versorgung bei präruminierenden Kälbern führte zu einer eingeschränkten intestinalen Absorptionseffizienz und 10fach höherer fäkaler Pi-Ausscheidung. Die Pi- Ausscheidung über die Niere stieg auf das 3fache der schon vorhandenen hohen basalen Pi- Exkretion der unsupplementierten Kontrolltiere. Da aufgrund der hohen P-Verdaulichkeit unter adäquater Versorgung und der offensichtlichen Sättigbarkeit der intestinalen Pi- Aufnahme eine unregulierbare Pi-Absorption im Darm stattfindet, wurde gefolgert, dass die Niere als Ausscheidungsorgan eine größere Bedeutung hat als der Darm (Walker 1972, Challa
& Braithwaite 1989). Es ist aber unklar, ob diese erhöhte Pi-Ausscheidung auf der
Überschreitung der maximalen tubulären Resorptionskapazität, also der Nierenschwelle (Boencke 1975, Challa & Braithwaite 1989) beruht oder ein regulatorischer Mechanismus zugrunde liegt. Für das Überschreiten der Nierenschwelle spräche, dass junge Wiederkäuer einen wesentlichen höheren Plasma-Pi-Spiegel haben als erwachsene, was auf den Einfluss des Somatotropen Hormones (STH; Pi-Retention ) und der noch fehlenden Geschlechtshormone (Androgene, Östrogene; Plasma-Pi-Spiegel ) beim Jungtier zurückgeführt wurde (Unshelm & Flock 1967). Ein weiterer homöostatisch-regulatorischer Mechanismus könnte im Säure-Basen-Status der Jungtiere zu suchen sein: Im Gegensatz zu adulten ruminierenden Wiederkäuern liegt der pH-Wert im Harn (pH 8-9) beim präruminierenden Wiederkäuer mit etwa pH 6 deutlich tiefer. Da unter diätetischer Versorgung mit azidogenen, proteinreichen Futtermitteln, wie Soja oder Fischmehl, bei gleichen Plasma-Pi-Konzentrationen die renale Pi-Ausscheidung anstieg, wurde davon ausgegangen, dass der niedrige pH die TRP hemmt, so dass Pi verstärkt renal ausgeschieden wurde. Eine Erhöhung des Harn-pH durch orale NaHCO3-Gaben verringerte aber die Pi- Ausscheidung nicht (Boencke 1975, Boencke et al. 1976, Boencke et al. 1981). Welche Säuren für die niedrige Harn-pH-Reaktion beim milchernährten Wiederkäuer verantwortlich sind, ist unklar. Sato (1975) stellte fest, dass der Anteil an titrierbaren Säuren im Harn zunahm und der pH-Wert im Harn bei unverändertem Blut-pH sank, nachdem durch Ligation der beiden Parotisgänge die renale Pi-Ausscheidung erhöht worden war.
Beeinflussung des endogenen Pi-Kreislaufs durch die diätetische P-Versorgung: Neben einer individuellen, möglicherweise genetisch bedingten Veranlagung über das Zusammenspiel der Pi-Sekretion in den Darm, der Resorption von Pi aus dem Darm und der Exkretion von Pi über die Niere hat die Höhe der diätetischen P-Versorgung einen entscheidenden Einfluss auf die P-Homöostase des erwachsenen Wiederkäuers (Scott et al.
1984a). Die hohe interindividuelle Schwankung in der Effizienz des endogenen Pi-Kreislaufes
kommt vor allem in den sehr unterschiedlichen Plasma- und Speichel-Pi-Konzentrationen und in der Variation der renalen Pi-Ausscheidung trotz gleicher adäquater, aber auch reduzierter oder erhöhter diätetischer P-Versorgung zum Ausdruck (Scott et al. 1984b). Unklar ist aber bis heute, welches der beteiligten Organe die führende Rolle in der Regulation des P- Haushaltes innehat. Während Tomas (1974a,b) und Sato (1975) der Pi-Sekretion mit dem Speichel die wichtigste Funktion zuschrieben, belegten Scott et al. (1984b) die Bedeutung der intestinalen Pi-Absorption. Unter reduzierter bzw. überhöhter P-Versorgung wurde gezeigt, dass die intestinale Pi-Absorptionseffizienz entscheidend für die endogene Rezirkulierung des Pi war. So konnte auch unter Mangelbedingungen eine ausreichende Versorgung der Pansenmikroorganismen sichergestellt werden.
Eine diätetische Unterversorgung mit P über längere Zeit (P-Depletion) resultierte bei Rindern und Schafen in Gewichtsverlust, schlechtem Haarkleid, abnormalen Haltungen, Lahmheiten, verringertem Ossifikationsgrad der Knochen, Knochenbrüchen, gestörter Reproduktions- leistung und Verhaltensanomalien wie z.B. Fressen von Knochen (Breves & Prokop 1990, Blair-West et al. 1992). Bei Schafen fielen etwa 8 - 10 Tage nach Depletionsbeginn (Reduktion der täglichen P-Zufuhr von 4,5 g auf ungefähr 1,0 g) die Plasma-Pi- Konzentrationen von etwa 2 mmol/l auf Werte um 0,8 mmol/l ab bei gleichzeitigem Anstieg der Plasma-Ca-Konzentrationen von etwa 2,3 auf etwa 3,0 mmol/l. Die Hypophosphatämie führte zu deutlich geringeren Speichel-Pi-Konzentrationen bei unveränderten Speichelflussraten, so dass die Pi-Konzentrationen im Pansensaft auf Werte um 1,0 mmol/l abfielen. Da das Konzentrationsverhältnis zwischen Speichel-Pi und Plasma-Pi auch in der P- Depletion etwa 7:1 betrug, ergaben sich keine Hinweise, dass das Konzentrierungsvermögen der Speicheldrüsen vom P-Status beeinflusst wurde. Die Reduktion der P-Versorgung der Pansenmikroorganismen führte zu einer um 30 % geringeren mikrobiellen Proteinsynthese und einer Abnahme der Verdaulichkeit der Trockenmasse beziehungsweise der organischen Substanz um etwa 10 %. Ebenso reduzierte sich der P-Fluss durch den Darm. Trotz erhöhter
intestinaler Pi-Absorptionseffizienz und sinkender fäkaler P-Ausscheidung entwickelte sich eine negative P-Bilanz (Scott et al. 1984b, Breves et al. 1985, Breves et al.1987, Breves &
Höller 1987a). Ein reduzierender - wenngleich auch sehr geringer - Effekt der P-Depletion auf die renale Pi-Ausscheidung war bei Schafen und Ziegen zu erkennen (Ternouth & Sevilla 1990, Pfeffer et al. 1993, 1995). Die Unterschiede in P-Versorgung, Plasma Pi- Konzentrationen und renaler Pi-Ausscheidung sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Mittlere diätetische P-Aufnahme/Tag, Plasma-Pi-Konzentrationen und Harn-Pi- Ausscheidung/Tag unter adäquater (P+) und P-defizienter Versorgung (P-)
Tierart Alter,
Gewicht P-Aufnahme (g/Tag) P+ P-
Plasma-Pi
(mmol/l) P+ P-
Harn-Pi
(g/Tag) P+ P-
Autor
Schafe 2-6 Monate,
22,1-33,0 kg 3,9 0,4 2,4 1,2 0,2 0,002 Ternouth &
Sevilla 1990
Milchziegen 3-7 Jahre
37-47 kg
4,3 1,9 2,5 0,7 0,4 0,01 Pfeffer et al.
1993 Junge Ziegen 3-4 Monate
12,5 kg 3,1 1,1 2,5 0,9 0,04 0,015 Pfeffer et al.
1995
Aus den Daten geht hervor, dass die Einschränkung der renalen Pi-Ausscheidung in der P- Depletion quantitativ keine Rolle spielt. Der größte dem Organismus vor allem in Mangelsituationen zur Verfügung stehende P-Pool sind die Knochen. Etwa 80 % des gesamten P ist dort in Form von Hydroxylapatit (Ca3(PO4)2Ca(OH)2) als Strukturbestandteil verankert. In der P-Depletion verringerten sich die Knochengewichte und die spezifische Dichte aufgrund der Demineralisation (Field et al. 1975, Blair-West et al. 1992). Vor allem in den langen Röhrenknochen wurde eine geringere Dicke der Kortikalis als auch eine verringerte Dichte der trabekulären Strukturen festgestellt (Breves & Prokop 1990). Die P- und Ca-Gehalte in der Knochenasche waren um etwa 50 % reduziert (Pfeffer et al. 1996). Die Freisetzung von P aus dem Knochen füllt somit die dem endogenen Pi-Kreislauf zu Verfügung stehenden Mengen in der P-Depletion permanent auf. Erstreckt sich die P- Unterversorgung über lange Zeit, treten als pathophysiologische Folgen Lahmheiten und Frakturen aufgrund der Weichheit und der osteoporotischen Veränderungen der Knochen auf.
Beeinflussung des endogenen Pi-Kreislaufs durch Laktation und Trächtigkeit: P- Depletionen bei laktierenden Ziegen und Rindern verliefen wesentlich dramatischer. Da die Pi-Gehalte in der Milch nicht durch die P-Versorgung beeinflusst wurden, sanken die Plasma- Pi-Konzentrationen trotz teilweise reduzierter Milchleistung aufgrund der verringerten Trockenmasseaufnahme auf Werte unter 0,4 mmol/l (Müschen et al. 1988, Bintrup et al.
1993, Deitert & Pfeffer 1993, Pfeffer et al. 1993, Rodehutscord et al. 1994a,b). Die der Hypophosphatämie folgende Absenkung von Speichel- und damit Pansensaft-Pi- Konzentrationen verringerte über die Reduktion der mikrobiellen Proteinsynthese im Pansen den Anteil an mikrobiellem Protein in der Milch (Petri et al. 1988). Auch die Deposition von P in den Feten war unter Depletionsbedingungen ebenso hoch wie unter adäquater P- Versorgung (Deitert & Pfeffer 1993). Aufgrund der fehlenden Einschränkung der Verschiebung von Pi in Milch und Feten bei reduzierter Versorgung sanken die P-Gehalte in den Knochen als auch im Weichgewebe (Pfeffer et al. 1994). Dies belegt eindrucksvoll, dass unter diesen Extrembedingungen die Grenzen der Adaptationsfähigkeit des endogenen Pi- Kreislaufs erreicht sind.
Beeinflussung des endogenen Pi-Kreislaufs durch die Calcium(Ca)-Versorgung: Die Verbindung von Ca- und P-Haushalt wurde schon aus der sich unter P-Depletion entwickelnden Hypercalcämie deutlich. Trotz geringerer intestinaler Ca-Absorption war der Ca-Spiegel im Plasma höher, während die Ca-Ausscheidung in der Niere unverändert blieb.
Die Ursache der Hypercalcämie wurde in der unter P-Mangelbedingungen vorherrschenden verstärkten Freisetzung von P und Ca aus den Knochen gesehen (Breves et al. 1985). Ob das weite Ca:P-Verhältnis in der Nahrung unter reduzierter P-Versorgung sich auf die Schwere der Folgen der P-Depletion auswirkt, ist unklar (Breves et al. 1985, Pfeffer et al. 1993).
Diätetische Restriktionen von Ca und P ohne Veränderung des Ca:P-Verhältnisses im Vergleich mit der Restriktion von nur P bei adäquater Ca-Versorgung (= Veränderung des
Ca:P-Verhältnisses) ergaben signifikante Verringerungen der Lebendmassezunahme und der Futteraufnahme in der P-Depletion unabhängig vom Ca:P-Verhältnis bei wachsenden, ruminierenden Ziegen. Die Tiere zeigten die typische Hypophosphatämie mit begleitender Hypercalcämie bei reduzierter P-Versorgung unabhängig von der Ca-Versorgung, eine alleinige Restriktion der Ca-Versorgung hatte keine Auswirkung auf die Plasma-Pi- und -Ca- Werte. Die fäkale wie auch die renale Pi-Ausscheidung waren unabhängig von der Ca- Versorgung bei P-Depletion reduziert. Da aber mit reduzierter Ca-Versorgung die renale Pi- Ausscheidung anstieg, muss hier von einem Einfluss der Ca-Versorgung auf den Pi-Haushalt ausgegangen werden (Pfeffer et al. 1995, Pfeffer et al. 1996).
Die hormonelle Beeinflussung des endogenen Pi-Kreislaufes durch die klassischen regulatorischen Hormone des Pi- und Ca-Haushaltes, Parathormon (PTH), Calcitriol und Calcitonin, ist beim Wiederkäuer nicht so eindeutig zu belegen wie beim monogastrischen Tier. Bei diesen entwickelt sich bei Absinken des Plasma-Pi-Spiegels eine Hypercalcämie, die zur Absenkung der zirkulierenden PTH-Konzentrationen und damit zu einer geringeren renalen Pi-Ausscheidung führt. Außerdem stimuliert die Hypophosphatämie die renale 1a- Hydroxylase, welche für die Bildung des stoffwechselaktiven Vitamin D3-Metaboliten Calcitriol (1,25-Dihydroxycholecalciferol) verantwortlich ist. Dies wiederum stimuliert die intestinale Pi-Absorption als auch die Freisetzung aus Knochen und Weichgeweben mit dem Ziel, den Plasma-Pi-Spiegel wieder anzuheben. In umgekehrter Weise verhält es sich bei Auftreten einer Hyperphosphatämie (Breves & Schröder 1991). Bei Wiederkäuern führte eine Reduktion der diätetischen P-Zufuhr trotz Einstellung einer Hypophosphatämie und einer nachfolgend auftretenden Hypercalcämie nicht zu einer Änderung im Plasma-Calcitriol oder - PTH (Schröder & Breves 1996). Trotzdem führte eine diätetische Reduktion der P-Zufuhr zu erhöhter intestinaler Pi-Absorption (Maunder et al. 1986, Schröder et al. 1995). Intravenöse Applikation von PTH bei Schafen ohne oder mit Parathyroidektomie hatte keinen Effekt auf
die Pi-Sekretion mit dem Speichel (Scott & Beastall 1978, Manas-Almendros et al. 1982).
Diskutiert wurde außerdem ein indirekt steigernder Effekt des PTH auf die Pi-Sekretion mit dem Speichel durch eine PTH-abhängige Erhöhung der Speicheldrüsendurchblutung (Wright et al. 1984). Die Wirkung der genannten Hormone an Darm, Niere und Speicheldrüse sind bisher beim Wiederkäuer nicht ausreichend definiert, um gültige Aussagen für die Regulation des P-Haushaltes beim Wiederkäuer treffen zu können.
Pi-Transportmechanismen im endogenen Pi-Kreislauf:
Speicheldrüse: Die hohe Pi-Konzentrierungsfähigkeit der Speicheldrüsen über die Plasma-Pi- Konzentration und die Sättigbarkeit der Konzentrierung bei steigenden Pi-Konzentrationen im Plasma weisen auf einen aktiven Transportmechanismus in diesem Organ hin (Boencke et al.
1981, Field et al. 1982, Breves et al. 1987). Aufgrund von Mikropunktionsstudien scheint der Pi-Transport in der Gl. parotis eher in den Endstücken des Drüsenepithels als im Gangsystem stattzufinden, da die Pi-Konzentrationen im Primärspeichel gleich denen im Endspeichel waren (Compton et al. 1980). In isolierten basolateralen Membranen der Ohrspeicheldrüse des Schafes wurde ein Na+-abhängiger Pi-Transportmechanismus beschrieben, der nicht durch die diätetische P-Versorgung beeinflusst wurde (Varyo et al. 1991, Shirazy-Beechey et al. 1991).
Wurde die Konzentration des Cosubstrates dieses Transportes durch eine Na+-Depletion, die über die Ableitung des Na+-reichen Parotisspeichels mittels Speichelgangskanüle eingestellt wurde, vermindert, führte dies ebenfalls nicht zu einer Veränderung der Pi-Ionen- Konzentration im Speichel, die fehlenden Kationen wurden durch eine entsprechende Erhöhung der Konzentration der K+-Ionen im Speichel kompensiert (Kay 1960a).
Magen-Darm-Trakt: Auch im Darm wies die Reduktion der Pi-Absorptionseffizienz bei steigender diätetischer P-Zufuhr auf eine Sättigung der Aufnahme und damit auf einen Carrier-vermittelten Prozess hin (Challa & Braithwaite 1989). Im Dünndarm, der Hauptlokalisation der Pi-Resorption (Pfeffer et al. 1970, Breves 1991), wurden verschiedene
Pi-Transportmechanismen beschrieben. Im Duodenum von Schafen wurde gezeigt, dass Pi H+- abhängig transportiert wird (Shirazy-Beechey et al. 1989, 1991), was aufgrund des im Duodenum vorherrschenden niedrigen pH-Milieus von 2 - 4 sinnvoll erscheint ( Kay &
Pfeffer 1969). Bei jungen Wiederkäuern gab es indirekte Hinweise auf eine Na+-Abhängigkeit des intestinalen Pi-Transportes, da durch ein erhöhtes luminales Glukoseangebot der Pi- Transport kompetitiv gehemmt wurde. Der Glukosetransport über den sodium linked glucose transporter (SGLT1) konkurriert dabei um das gleiche Cosubstrat (Scharrer 1985).
Funktionelle Studien im mittleren Jejunum von ruminierenden Schafen und Ziegen bestätigten den Na+-abhängigen Pi-Transport (Schröder et al. 1995, Schröder & Breves 1996).
Auch im Pansen wäre eine Pi-Aufnahme vorstellbar. Der zwischen Pansenlumen und Extrazellulärflüssigkeit bestehende elektrochemische Gradient für Pi könnte eine Triebkraft für einen passiven Transport über das Pansenepithel darstellen (Breves et al. 1988). Ebenso gab es Hinweise für eine Pi-Absorption als auch -sekretion im Blättermagen (Breves 1991).
Die quantitative Bedeutung des möglichen Pi-Transportes über das Vormagenepithel für den P-Haushalt ist aber unklar. Im Dickdarm wurden sowohl Pi-Nettoabsorptionen als auch Pi- Nettosekretionen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Versorgung festgestellt (Breves 1991).
Niere: Auch in diesem Organ existiert eine maximale tubuläre Transportrate bei steigenden Plasma-Pi-Spiegeln für die Pi-Resorption (Tomas 1975, Scott et al. 1984b). Eine erhöhte Pi- Ausscheidung bei reduzierter Pi-Resorption bei jungen milchernährten Lämmern und Kälbern, bei kraftfutterreich gefütterten ruminierenden Tieren (Boencke 1975) und bei Tieren, deren Speichel-Pi-Sekretion behindert war (Sato 1975) war immer verbunden mit einem Abfall der Harn-pH-Werte, so dass dies auf eine Protonensensitivität des Pi-Transportes hinweisen könnte.
2.2 Die Molekularbiologie der Phosphattransporter
Die Pi-Transporter-Familien und ihre Phylogenese: Über das gesamte Tierreich ist die Pi- Aufnahme in die Zelle beziehungsweise in den Organismus und die regulatorische Ausscheidung essentiell für Wachstum und Stoffwechsel. P ist ein Schlüsselelement biologischer Funktionen als Bestandteil von Zellmembranen und Proteinen, von genetischer Substanz und als Strukturelement im Knochen. In Form von energiereichen Verbindungen wie ATP hat es Einfluss auf den Energiestoffwechsel und spielt eine wichtige Rolle in hormonkontrollierten Prozessen und Signalkaskaden (Protein-Phosphorylierung, cAMP, cGMP, IP3). Alle Körperflüssigkeiten enthalten Pi im millimolaren Bereich, welches aufgrund seiner Ladung nicht frei über die Membran aufgenommen werden kann. Im Rahmen einer homöostatischen Regulation muss es aber in ausreichenden Mengen aufgenommen, zwischen den Körperkompartimenten verschoben und überschüssiges Pi ausgeschieden werden. Für die Vermittlung dieser Vorgänge sind mittlerweile mehrere Familien von Pi-Transportern bei Pro- und Eukaryonten bekannt. Diese können in sogenannte house keeping -Pi-Transporter und induzierbare Pi-Transporter unterteilt werden. Alle bisher untersuchten Organismen besitzen beide Arten für die P-Homöostase und deren Anpassung an endogene Bedürfnisse oder exogene Veränderungen der P-Versorgung (Werner et al. 1998). Schon früh war bekannt, dass für die Pi-Aufnahme über die apikale Membran in die Epithelzellen von Darm und Niere bei monogastrischen Säugetieren vor allem Na+-abhängige, sekundär aktive, sättigbare und zum Teil regulierbare als auch Na+-unabhängige Prozesse verantwortlich waren.
Hauptmodulatoren dieser Transportprozesse waren die Höhe der diätetischen P-Aufnahme, der luminale pH-Wert, PTH und 1,25-Dihydroxycholecalciferol. Die basolaterale Ausschleusung von Pi ist noch weitgehend unklar (Quamme 1990a,b, Danisi & Murer 1991).
Von Werner et al. (1998) und Werner & Kinne (2001) wurde die Evolution der Na+/Pi- Cotransportsysteme beschrieben: Bei Säugetieren existieren drei bisher bekannte Na+/Pi-
Cotransportfamilien, NaPi Typ I, II und III. Bei Prokaryonten wurden entsprechende Transportsysteme gefunden, die trotz struktureller Ähnlichkeit funktionell in Bezug auf den Mechanismus der Pi-Translokation von denen der Säugetiere differieren. In der Niere, dem für monogastrische Tiere und Mensch wichtigsten homöostatisch-regulativen Organ, wurde mittels Expressionsklonierung ein Na+-gekoppelter Pi-Transporter vom Typ I (Kaninchen) gefunden. Dieser konnte ebenfalls bei Mensch, Ratte und Maus nicht nur in der Niere, sondern auch in Gehirn und Leber nachgewiesen werden. Neben seiner Pi-Transportfunktion wies dieser Transporter eine Cl--Kanalfunktion auf. Die physiologische Bedeutung dieses Typ I-Transporters ist unklar. NaPi I wird in den apikalen Membranen der proximalen Tubuli der superfiziellen und tiefen Nephrone der Niere exprimiert (Biber et al. 1996) und unterliegt keinen regulatorischen Einflüssen. Strukturverwandte des NaPi I finden sich auch bei dem Nematoden Caenorhabditis elegans (Murer et al. 2000).
Ebenfalls in der Niere wurde ein zweites Na+/Pi-Cotransportsystem (NaPi Typ IIa) kloniert, welches durch viele physiologische und pathophysiologische Einflüsse reguliert wird. Die Expression des NaPi II ist auf die apikalen Membranen der proximalen Tubuli der superfiziellen und tiefen Nephrone der Niere beschränkt und stellt das für die Pi-Homöostase wichtigste Pi-Transportsystem dar. Eine Isoform des Na+/Pi-Cotransporters Typ II (NaPi IIb) wurde in den apikalen Membranen der Dünndarmenterozyten gefunden (Hilfiker et al. 1998), aber auch in Typ II-Pneumozyten in der Lunge (Traebert et al. 1999a), im Pankreas und in der Prostata. Auch dieser „intestinale“ Typ II-Pi-Transporter unterliegt endogenen und exogenen regulatorischen Einflüssen (Hattenhauer et al. 1999). In den resorptiv tätigen Osteoklasten des Knochengewebes konnte ein Na+/Pi-Transporter vom Typ II in der basolateralen Membran identifiziert werden (Hisano et al. 1997, Gupta et al. 1997). Diese basolaterale Sortierung des NaPi Typ II (Isoform b) wurde auch bei der Flunder gefunden, deren Niere als anatomische Besonderheit ein sekretorisches Segment besitzt, in dem der NaPi IIb basolateral die Aufnahme von Pi aus dem Blut moduliert (Werner et al. 1998). Auch in der laktierenden
Milchdrüse wurde ein basolateral lokalisiertes, sezernierendes Na+/Pi-Cotransportsystem diskutiert, ohne dass bisher die Struktur dieses Transporters charakterisiert wurde (Shillingford et al. 1996). Im resorbierenden Sammelrohr der Flunderniere, welches dem distalen Tubulus der Säugetiere entspricht, und im Darm war der NaPi IIb apikal lokalisiert (Werner et al. 1998). Während der NaPi Typ IIb bei Säugern (Darm), Fischen und Vögeln (Darm und Niere) gefunden wurde, ist das Auftreten des NaPi Typ IIa auf die Niere der Säuger und Vögel beschränkt. Beim Huhn ist die anatomische Struktur der Niere zweigeteilt:
ein Teil ist noch reptilienspezifisch, der andere Teil, in dem der NaPi IIa exprimiert wird, ähnelt dem der Säuger. Da nur bei Säugern eine konstante GFR in der Niere aufrecht erhalten wird, musste über ein effektives, schnell regulierbares Transportprotein die Resorptionskapazität für Pi adaptiert werden. Aufgrund dieser Verteilung und Funktion der NaPi II-Isoformen im Tierreich stellt der Typ IIb den phylogenetisch älteren Na+/Pi- Transporter dar, der vor allem verantwortlich für die Aufnahme und Verteilung von Pi im Körper zuständig zu sein scheint, während der neuzeitlichere NaPi IIa eine weit entwickelte Nierenstruktur braucht (Abb. 1, Werner & Kinne 2001).
Auffällig ist dabei der aus einer bovinen Nierenzelllinie (NBL-1) klonierte NaPi IIb- Transporter (Helps et al. 1995). Dessen komplette cDNA (2,2 kb) ist nur etwa halb so groß wie die der intestinalen NaPi IIb-Isoform (4,0 kb) und auch das entsprechende Protein war mit 55 kDa (Helps & McGivan 1991) nur etwa halb so groß wie das der intestinalen Isoform (108 kDa) (Hattenhauer et al. 1999). Die Expression dieses Pi-Transporters in den NBL-1 Zellen wurde an die P-Versorgung über das Medium adaptiert (Helps & McGivan 1991). Solche
„halbierten“ NaPi II-Moleküle ergaben sich auch bei Western Blot-Untersuchungen unter reduzierenden Bedingungen für den NaPi IIa, was indizierte, dass die Na+/Pi-Transporter als Homomultimere (die funktionelle Einheit des NaPi IIa wurde mit einer Größe von 170 - 200 kDa angegeben) oder Heteromultimere (NaPi IIa-Protein in Verbindung mit akzessorischen Hilfsproteinen) vorliegen (Murer et al. 2000). Für das Auftreten von Homomultimeren spricht
die 1-2-4-Regel der Genentwicklung: Für viele eukaryontische Gene gilt während ihrer phylogenetischen Entwicklung, dass sie mehrfach dupliziert werden (Werner & Kinne 2001).
Niere, Maus Niere, Ratte Niere, Mensch Niere, Kaninchen Niere, Schaf
Nierenzelllinie, Opossum Niere, Huhn
Niere, Forelle Niere, Hai Niere, Rochen Darm, Xenopus Darm, Huhn Darm, Mensch Darm, Maus
Nierenzelllinie, Rind Niere, Karpfen Niere, Zebrafisch Darm, Forelle
Niere u. Darm, Flunder Darm, Zebrafisch Darm, Hai Darm, Rochen
Abbildung 1: Stammbaum der NaPi II-Transporter (nach Werner & Kinne 2001)
Die kleinere Variante der NaPi IIb-Isoform könnte also durch fehlende Duplikation des Genes oder durch Variationen im mRNA splicing entstanden sein. Unabhängig davon erscheint auch das Auftreten von Heteromultimeren möglich. Sowohl NaPi Typ IIa als auch IIb besitzen PDZ-Domänen am C-terminalen Ende, die die Bindung an akzessorische Proteine ermöglichen. Diese konservierten Sequenzelemente wurden nach den ersten drei Proteinen benannt, in denen sie gefunden wurden, das postsynaptic density protein (PSD95/SAP90), das
Drosophila tumor suppressor dlgA und das tight junction protein ZO-1 (Fanning & Anderson 1999). Die genaue Funktion dieser Proteine ist noch weitgehend unklar, die interagierenden Proteine könnten eine Bedeutung für die Fixation an die Zellmatrix in den richtigen Lokalisationen haben und für die Beweglichkeit des Transportermoleküls verantwortlich sein.
Dies spielt eine wichtige Rolle in der apikalen Sortierung, der endozytotischen Internalisierung und lysosomalen Degradierung der Transporter im Rahmen von regulatorischen Einflüssen (Murer et al. 2000, Gisler et al. 2000). Ein mit der PDZ-Domäne des NaPi IIa verbundenes Protein mit der Bezeichung Diphor-1 wurde mit dem NaPi IIa coexprimiert und stimulierte die Pi-Aufnahme im proximalen Tubulus der Niere (Custer et al.
1997).
Eine dritte Familie von Na+/Pi-Transportern mit etwa 60 % Proteinhomologie zur NaPi II- Familie wurde entdeckt, als Virusrezeptorproteine (GlvR-1, Ram-1) in Oozyten exprimiert wurden, um deren physiologische Funktion zu identifizieren. Diese Typ III-Pi-Transporter stellen bei den Säugern die house keeping Pi-Transporter der Zellen dar, sind in polarisierten Zellen basolateral lokalisiert und vermitteln die Aufnahme von Pi für die Grundbedürfnisse der Zelle. Sie sind ubiquitär in allen Geweben exprimiert (Kavanaugh & Kabat 1996). Auch diese Transporter konnten über eine Erhöhung ihrer mRNA-Stabilität und damit höherer Proteinexpression die Pi-Aufnahmekapazität an eine reduzierte P-Versorgung anpassen (Werner et al. 1998).
Die molekulare Struktur des NaPi II: Nach der Klonierung der NaPi IIa-cDNA konnte die Primärstruktur (Aminosäuresequenz mit 637 Aminosäuren (Magagnin et al. 1993) des zugehörigen Transportproteins abgeleitet werden. Die Sequenz wurde für die Generierung antigener Peptide zur Herstellung polyklonaler Antikörper eingesetzt, mit denen im Western Blot für das glykosylierte NaPi IIa-Protein ein spezifisches Signal bei 85 - 90 kDa zu detektieren ist. Dieses Protein ist die monomere funktionelle Einheit des NaPi IIa (Köhler et
al. 2000). Mittels computergestützter Hydrophobizitätsanalyse (Abb. 2) konnten Modelle für die Sekundärstruktur (Abb. 3) dieses Membranproteins entwickelt werden.
Abbildung 2 : Hydrophobizitätsplot der Aminosäuresequenz des NaPi IIa (nach Lambert et
al. 1999). Hydrophobe Bereiche können Transmembrandurchgänge bilden.
Abbildung 3: Sekundärstruktur-Modell des NaPi IIa (nach Lambert 1999). Die FLAG- Epitope sind durch Fähnchen, die Glykosylierungsstellen mit grauen Kreisen gekennzeichnet (nähere Angaben im Text).
Für den NaPi IIa werden in den Bereichen mit hohem Anteil von hydrophoben Aminosäuren 8 Transmembrandomänen (TD) angenommen. Dies gilt aufgrund der hohen Proteinhomologie
auch für den NaPi IIb. Über die Insertion von FLAG-Epitopen (mittels site directed mutagenesis in die Transporter-cDNA eingeführte DNA-Fragmente, die für spezifische antigene FLAG-Peptide kodieren und nach Expression in Oozyten mittels Antikörper nachgewiesen werden können) konnten die mutmaßliche intrazelluläre Lokalisation des N- und C-terminalen Endes des Proteins und 3 kleine intrazelluläre Schleifen (intracellular loop, IL) zwischen TD 2 und 3, TD 4 und 5 und zwischen TD 6 und 7 detektiert werden. Neben 3 kleinen extrazellulären Schleifen (extracellular loop, EL)(zwischen TD 1+2, TD 5+6, TD 7+8) lag zwischen TD 3 und 4 eine große, doppelt glykosylierte (Hayes 1994) extrazelluläre Schleife. Die Insertion der FLAG-DNA-Fragmente in IL1, IL3, EL3 und EL4 hatten einen Funktionsverlust zur Folge (Abb. 3, weiße Fähnchen, Lambert et al. 1999). Die durch reduzierende Agentien wie Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) herbeigeführte Spaltung von Disulfidbrücken, die in Transporterproteinen zwischen Cysteinen entstehen können, führte zur Inaktivierung, Internalisierung und Degradation des in Oozyten exprimierten NaPi IIa, aber nicht des NaPi IIb. Die für die transportkompetente Molekülkonformation des NaPi IIa wichtigen S-S-Brücken existieren offenbar nicht in Typ IIb (Lambert et al. 2000a). Mit Hilfe von Cystein-modifizierenden Agentien (Methanethiosulfonat, MTS-Reagentien) konnten zwei Disulfidbrücken (C306-C334, C225-C520) identifiziert werden, die die N- und C-terminale Hälfte miteinander verbinden und für die stabile Oberflächenexpression des Transporters wichtig zu sein scheinen (Abb. 4).
Abbildung 4: Sekundärstruktur-Modell des NaPi IIa (nach Lambert et al. 2000b). Die mutmaßlichen S-S-Brücken sind angegeben. Die hell- und dunkelgrau unterlegten sich wiederholenden Sequenzabschnitte könnten für die Bildung der „Permeationspore“
verantwortlich sein (Köhler 2002, Murer 2002).
Sequenzähnlichkeiten im IL1 und EL3 und der Nachweis von weiteren funktionell wichtigen Aminosäureresten führten zu einem ersten dreidimensionalen Strukturmodell einer Pi- Permeationspore, die aus TD 2,3,5 und 6 in Kombination mit dem IL1 und EL3 gebildet werden könnte (Abb. 4). Im EL3 befindet sich außerdem eine Domäne in der Struktur des NaPi IIa, die aus 3 geladenen Aminosäuren (REK, Arg-Glu-Lys) besteht und mit für die pH- Sensitivität (Inhibition bei niedrigem pH-Wert) dieses Transporters verantwortlich zu sein scheint. Im pH-insensitiven NaPi IIb ist REK gegen GNT (Gly-Asn-Thr) ausgetauscht. Die Expression von Chimären zwischen NaPi IIa und IIb, d.h. Einführung der REK in IIb und GNT in IIa, führte zur entsprechenden Einführung einer pH-Sensitivität bei IIb und der
Entfernung der pH-Sensitivität bei IIa (De la Horra et al. 2000). Die Na+-Interaktion des NaPi II wird vermutlich über Domänen im IL2, TD5 und EL3 determiniert. Die Unterschiede in der Na+-Affinität von NaPi IIa und IIb könnten auf einem Aminosäurerest in der TD5 beruhen:
Der wechselseitige Austausch des Phenylalanins F402 (vorhanden im Wildtyp IIa, dieser besitzt eine niedrige Na+-Affinität) gegen das Leucin L418 (vorhanden im Wildtyp IIb, dieser besitzt eine hohe Na+-Affinität) führte zu einem entsprechenden Wechsel der Na+-Affinität (De la Horra et al. 2001). Der korrekte Einbau der Transportermoleküle in die apikale Membran ist essentiell für die Funktionalität. Mutationen in den Tyrosylreste Y402 und Y509 zerstörten nach Expression der Mutanten in Oozyten die Pi-Aufnahme aufgrund unterschiedlicher Mechanismen. Die Mutation des Y402 verhinderte die Oberflächenexpression des Transporters, während die Mutation von Y509 zu einer Zerstörung der Funktionalität des in die Membran intergrierten Transporters führte (Hernando et al.
1999). Für die exakte Sortierung des NaPi IIb in die apikale Membran von humanen Colonkarzinom (CaCo2)-Zellen waren das Leucin L691 (muriner NaPi IIb) bzw. L689 (humaner NaPi IIb) im C-terminalen Ende des Transporters wichtig. Die Deletionsmutanten verblieben in intrazellulären endosomalen oder lysosomalen Kompartimenten (Karim- Jimenez et al. 2000). Expressionsstudien von NaPi IIa und IIb in Opossum kidney (OK)- Zellen und CaCo2-Zellen zeigten aber, dass neben den molekularen Sortierungsdomänen auch zelluläre Signale für den Transportereinbau in die apikale Membran existierten (Hernando et al. 2000, Karim-Jimenez 2001). Neben dem C-terminalen Leucin als Determinante für die apikalen Sortierung bildeten die letzten drei Aminosäuren der NaPi II-Transporter PDZ- Domänen, die an zelluläre PDZ-Proteine binden. PDZ-Proteine, wie z.B. der Na+/H+ exchanger related factor (NHERF) für den NaPi IIa, stellen anchor -Proteine für die Verbindung mit dem Zytoskelett dar und könnten im Zusammenwirken mit anderen Proteinen des Zytoskeletts (Ezrin) wichtig für den apikalen Einbau der Transporter sein. Auch die Endozytose (transporter retrieval) und die lysosomale Degradation der NaPi IIa-Transporter
im Rahmen von regulatorischen Prozessen z.B. nach PTH-Einwirkung beruht auf molekularen Domänen in der Aminosäuresequenz des Transporters für die entsprechende Sortierung/Transport in der Zelle (Hernando et al. 2001).
Der molekulare Mechanismus des Cotransportes von Na+ und Pi über den NaPi IIa (nach Murer et al. 2000): Aus Pi-Aufnahmestudien in intestinale und renale Bürstensaum- membranvesikel (BSMV) und in mit NaPi II-mRNA injizierten Oozyten wurden die Substratspezifität, die pH-Sensitivität, die kinetischen Parameter und die Stöchiometrie von Pi
und Na+ abgeleitet. Für den durch den NaPi IIa modulierten Prozess ergab sich ein pH- sensitiver, im Verhältnis 3:1 (Na+:Pi) mit Na+ gekoppelter Transport, dessen Affinität (beschrieben über den Km-Wert = halbmaximale Sättigung des Transporters) für Pi bei 0,1-0,2 mmol/l und für Na+ bei 50-70 mmol/l lag. Für den NaPi IIb fehlte die pH-Sensitivität bei gleicher Stöchiometrie, die Affinität für Pi und Na+ lag höher mit einem Km-Wert von 0,05 mmol/l bzw. bei 33 mmol/l. Beide Transportprozesse zeigten sich aufgrund von In-vivo (perfundierte Tubuli) und In-vitro-Untersuchungen (BSMV) elektrogen, so dass die Transportprozesse nach Expression der NaPi II in Oozyten elektrophysiologisch charakterisiert werden konnten. Die 3:1 Na+:Pi Stöchiometrie, d.h. der Transport von drei positiven und einer negativen Ladung in die Zelle, erklärte den einwärts gerichteten Strom.
Bei Hemmung des renalen Transporters mit Arsenat, einem kompetitiven Hemmstoff der Pi- Aufnahme in BSMV und Oozyten, konnte ein Reststrom (slippage current) von etwa 10 % des Gesamtstromes bei voll beladenem Transporter gemessen werden. Aus diesen und anderen elektrophysiologischen Messungen konnte ein Modellschema für die Kinetik des Transportvorganges der Ionen über den NaPi IIa entwickelt werden. Der leere, translozierte Transporter interagiert spannungsabhängig an der extrazellulären Seite mit 1 Na+. Dieser mit einem Na+ beladene Transporter kann elektroneutral translozieren (slippage). Außerdem ermöglicht die Bindung des ersten Na+ die Bindung des Pi-Ions. Dann kann der Transporter
mit 2 weiteren Na+-Ionen voll beladen werden. Die Translokation des voll beladenen Transporters ist ein elektroneutraler Vorgang. Die intrazellulären Vorgänge der Entladung sind unklar, wahrscheinlich erfolgt die Entladung spiegelverkehrt. Der leere Transporter transloziert wieder spannungsabhängig in seine Ausgangsposition. Diese Reorientierung kann wahrscheinlich durch eine Interaktion des leeren Transporters mit H+ gehemmt werden.
Die molekulare Regulation des NaPi IIa (und b): Monogastrische Tiere haben eine tubuläre Pi-Resorptionskapazität von etwa 80 %. Eine Fülle von physiologischen, aber auch pathophysiologischen Parametern können diese Resorptionskapazität beeinflussen. Nicht alle betreffen die Aktivität des NaPi IIa. Dass dieser Transporter aber eine führende Rolle für die tubuläre Resorptionskapazität hat, wurde anhand der pathophysiologischen Auswirkungen bei NaPi IIa-knock out-Mäusen deutlich: Die Zerstörung des Npt2-Gens führte zu einem kompletten Verlust des nierenspezifischen NaPi IIa-Transkriptes und des -Proteins, die tubuläre Na+-abhängige Pi-Resorptionskapazität sank um 70 - 80 %. Dies hatte eine gesteigerte Pi-Ausscheidung mit dem Harn und eine damit verbundene Hypophosphatämie zur Folge (Beck et al. 1998). Hauptfaktoren der Beeinflussung für die physiologische Regulation der NaPi II-Expression in Niere und Darm sind die diätetische P-Versorgung, PTH und Calcitriol, wobei für das letztere eine direkte Wirkung in der Niere unklar, im Darm aber nachgewiesen ist (Hattenhauer et al. 1999, Murer et al. 2000). Auf diese drei Faktoren soll im Folgenden näher eingegangen werden; andere hormonelle und nicht-hormonelle Faktoren, die die tubuläre Pi-Resorption beeinflussen können, sind in Tabelle 2 angegeben. Da für den intestinalen NaPi IIb wenig Untersuchungen der molekularen Regulation vorliegen, wird diese vorwiegend für den NaPi IIa zusammengefasst. Die Regulation der Na+/Pi- Cotransportkapazität wird vorwiegend über Einbau und Ausbau des NaPi IIa an der apikalen Membran gesteuert. Die zugrundeliegenden zellulären Mechanismen sind für den NaPi IIa vor allem unter PTH-Einfluss als auch bei unterschiedlicher diätetischer P-Versorgung sehr
genau untersucht worden (Murer et al. 2000). PTH reduziert die intrinsische Aktivität des Transporters in der Membran (Pfister et al. 1997) und führt zur Internalisierung und Degradation der Transporterproteine. Etwa 15 Minuten nach der i.v. Injektion von PTH wurde das NaPi IIa-Protein nahezu komplett aus der apikalen Membran ausgebaut (membrane retrieval) und in endosomalen subapikalen Kompartimenten gelagert. Die vollständige Degradation der Transporter in Lysosomen konnte nach etwa 60 Minuten beobachtet werden.
Der intestinale NaPi IIb wird nicht über PTH reguliert. Die molekularen Determinanten für die Regulierbarkeit durch PTH liegen vermutlich im IL3 (Lötscher et al. 1999, Hernando et al.
2001). Die Clathrin-vermittelte Endozytose wird nach Bindung des PTH an die basolateral und apikal vorhandenen Rezeptoren über verschiedene Signalkaskaden ausgelöst:
Adenylatcyclase (cAMP)/ Proteinkinase A und Phospholipase C (DAG, IP3)/ Proteinkinase C (Lederer et al. 1998, Traebert et al. 2000). Während der Ausbau der Transportermoleküle aus der apikalen Membran Mikrotubulus-unabhängig ist, ist ein intaktes und flexibles Mikrotubulinetz (rearrangement) essentiell für den intrazellulären Transport der Endosomen zum lysosomalen System für die Degradation der internalisierten Transporterproteine (Lötscher et al. 1999). Das die internalisierten Transporter vollständig nach PTH-Einwirkung degradiert werden, konnte mittels der Hemmung der De-novo-Synthese der Proteine mit Cycloheximid gezeigt werden. Gehemmte OK-Zellen konnten keinen NaPi IIa nach Abklingen der PTH-Wirkung in die apikale Membran einbauen (Pfister et al. 1997). Der in kurzer Zeit erfolgende Wiedereinbau von NaPi IIa-Transportern in die apikale Membran der Rattenniere erfolgte Mikrotubulus-abhängig ohne De-novo-Proteinsynthese, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die Tubuluszelle eine gewisse Menge vorgefertigter Transportmoleküle für die akute Adaptation speichern kann (Lötscher et al. 1997).
Tabelle 2: Hormonelle und nicht-hormonelle Faktoren, die die Pi-Resorption im proximalen Tubulus (TRP) beeinflussen (Murer et al. 2000 und wie angegeben).
Faktor TRP Mechanismus Autor
Hormonelle Faktoren
Insulin Stimulation des Na+/Pi-Cotransportes
Hemmung der phosphaturischen Wirkung des PTH
Growth hormone
IGF-1 Stimulation des Na+/Pi-Cotransportes über die Aktivierung der Phospholipase C
EGF ¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes Xu et al. 2001 TGF-a ¯ Hemmung der Pi-Aufnahme in OK-Zellen
Schilddrüsen-
hormon Stimulation des Na+/Pi-Cotransportes über die de novo -Synthese von NaPi IIa, v.a. während der Ontogenese
Euzet et al. 1995
Calcitonin ¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes Glukokortikoide ¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes, evtl.
Mediator der Phosphaturie bei metabolischer Azidose (siehe unten)
Atriales Natriuretisches
Peptid (ANP)
¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes über
Aktivierung der Proteinkinase G (cGMP) Bacic et al. 2001 PTH-related peptide ¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes über
Aktivierung der Proteinkinase A und C (cAMP und Phospholipase C)
Phosphatonin
(humoraler Faktor) ¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes
Glukagon ¯ Indirekte Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes durch erhöhtes cAMPPlasma aus der Leber Stanniocalcin 1+2 ¯ Stimulation (Stc1) und Hemmung (Stc 2) des
Na+/Pi-Cotransportes (parakrine Beeinflg.) White et al. 1998 Prostaglandine Antagonisiert Phosphaturien unterschied-
licher Genese
Nervale Transmitter ¯ Dopamin hemmt, Serotonin stimuliert Na+/Pi- Cotransport
Nicht-hormonelle Faktoren
Hungern ¯ Mechanismus unklar, PTH-unabhängig Beck et al. 1979 Plasma-Ca Stimulation des Na+/Pi-Cotransportes über
PTH-Wirkung, aber auch direkter Einfluss Säure-Basen-Status ¯ Chronische metabolische Azidose/ intra-
tubuläre Ansäuerung hemmt Na+/Pi-Co- transport, evtl. Glukokortikoidwirkung
Volumenexpansion ¯ Hemmung des Na+/Pi-Cotransportes, indirekter Effekt über ANP und/oder Dopamin
Die beschriebenen Mechanismen werden durch PTH, aber auch durch den Wechsel von niedriger (low Pi) zu hoher (high Pi) diätetischer P-Versorgung ausgelöst. Hierbei führen die durch die P-Versorgung eingestellten Plasma-Pi- und Ca-Spiegel zu Veränderungen der PTH- Konzentrationen im Blut, sodass PTH sekundär regulatorisch wirksam wird. Aber auch eine Pi-eigene Wirksamkeit für die Adaptation an die P-Depletion oder P-Überversorgung (Pi
sensing) existiert (Murer et al. 2000). Chronisch thyreoparathyroidektomierte Ratten zeigten unter high Pi-Versorgung eine deutliche Einschränkung der TRP und erhöhte Pi- Ausscheidung im Harn, unter low Pi stieg die TRP auf 99 % (Steele & DeLuca 1976). Die Verteilung der NaPi IIa-Proteinexpression über die superfiziellen, mittleren cortikalen und juxtamedullären Nephrone änderte sich mit der diätetischen P-Zufuhr (Ritthaler et al. 1999).
Eventuell spielt auch der u.a. im proximalen Tubulus apikal exprimierte Ca-Rezeptor (CaR) eine Rolle. Unter P-Depletionsbedingungen wurde der CaR im proximalen Tubulus zusammen mit dem NaPi IIa hochreguliert bzw. unter high Pi oder PTH-Einwirkung herunterreguliert (Riccardi et al. 2000). Veränderungen im NaPi IIa-mRNA-Spiegel spielten für den Adaptationsprozess nur eine sekundäre Rolle außer bei chronischer P-Depletion und Einwirkung von Schilddrüsenhormonen (Murer et al. 2000).
2.3 Die Bedeutung des Phosphates im Intermediärstoffwechsel
Häufig führte eine diätetische P-Depletion zu einer Reduktion der Futteraufnahme, welche aber nur partiell für die sich entwickelnde Verlangsamung des Wachstums verantwortlich war (Little 1970, Milton & Ternouth 1985, Ternouth & Sevilla 1990). Denn selbst bei Aufnahme gleicher Futtermengen im pair fed Ansatz konnten unter P-Mangel-Bedingungen gegenüber der Kontrolle deutlich geringere Zuwachsraten festgestellt werden (Milton & Ternouth 1985, Blair-West et al. 1992). Als Erklärung hierfür wurde eine intermediäre Wirkung des Pi
angenommen. Sicher ist, dass der Plasma Pi-Spiegel den intrazellulären Spiegel an Gesamt-
oder freiem Pi beeinflusst (Fuller et al. 1976, Sestoft 1979, Hörl et al. 1981, Brautbar et al.
1982, Kemp 1993, Thompson & Kemp 1995, Radda 1996, Brazy & Chobanian 1996). Wie genau reflektiert aber der Plasma-Pi-Spiegel den intrazellulären Pi-Spiegel? Sogenannte Typ I-Störungen des P-Haushaltes mit Veränderung des Gesamtkörper-P-Gehaltes können zu steady-state-Zuständen führen, bei denen die Plasma-Pi-Spiegel den intrazellulären Pi- Spiegeln entsprechen. Bei homöostatischen Störungen vom Typ II, d.h. beim Vorliegen eines Pi-shifts zwischen extrazellulärer Flüssigkeit und Geweben (Muskeln, Leber) durch metabolische oder Pi-transportbedingte Einflüsse, können transiente Zustände entstehen, bei denen die Pi-Konzentrationen der beiden Kompartimente nicht mehr direkt miteinander korreliert waren (Kemp 1993). Schon früh wurden die Zusammenhänge zwischen Pi und Störungen im intermediären Stoffwechsel erkannt. Lardy & Wellman (1952) zeigten über die Abhängigkeit des O2-Verbrauches von der Pi-Konzentration in isolierten Leberzell- Mitochondrien, dass Pi und Pi-Akzeptor-Systeme (ADP, Creatin + Creatinkinase, Glukose + Hexokinase) basale stimulierende Faktoren für Glykolyse und oxidativen Metabolismus darstellen. Aus dem Zusammenhang zwischen den Plasma-Pi-Konzentrationen und dem O2- Verbrauch wurde abgeleitet, dass der Energiegrundumsatz eine Funktion des extrazellulären Pi-Spiegels ist. Dies wird unterstützt durch die Feststellung, dass Lebewesen mit hoher Stoffwechselrate wie kleine Tiere oder Jungtiere einen hohen O2-Verbrauch bei höheren Plasma-Pi-Konzentrationen hatten als große oder alte Tiere (Sestoft 1979). Ausserdem stieg die Plasma-Pi-Konzentration mit sinkendem Körpergewicht beim Menschen (Lindgärde &
Trell 1977), ein Zusammenhang, der ebenso für den Energiegrundumsatz, bezogen auf das Körpergewicht, gilt.
Veränderungen in den intrazellulären Pi-Konzentrationen können intermediäre Prozesse durch folgende zentrale Mechanismen beeinflussen:
1. in den Erythrozyten: Veränderungen der 2,3-Diphosphoglyceratsynthese (2,3-DPG), diese beeinflussen die O2-Bindungsaffinität des Hämoglobins und damit die aerobe Stoffwechselkapazität der Organe und Gewebe.
2. in den Organen/Geweben: Veränderungen des Phosphorylierungspotentials [ATP]/ [ADP] [Pi] im extramitochondrialen Kompartiment der Zellen und damit der ATP- Syntheserate über die mitochondriale Oxidation.
3. in den Organen/Geweben: Konkurrenz von Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung um gemeinsame Intermediate wie Pi vor allem bei limitiertem Pi- Angebot und damit Veränderungen in der ATP-Syntheserate über Glykolyse oder mitochondriale Oxidation (Crabtree-Effekt).
4. in Herz- und Skelettmuskel: Veränderung der bioenergetischen Abläufe bei der Muskelkontraktion durch Beeinflussung von ATP- und Creatinphosphatsyntheserate (Creatinphosphat-Shuttle, Energietransfer-Shuttle)
1. Pi und 2,3-Diphosphoglycerat: Ein intrazellulärer P-Mangel reduzierte die Konzentrationen an ATP und 2,3-DPG, sodass neben einer generell geringeren Verfügbarkeit an energiereichen Substraten auch die O2-Affinität des Hämoglobins in den Erythrozyten durch das Fehlen des Modulators 2,3-DPG anstieg. Die dadurch bedingte Hypoxie und der Energiemangel könnte in allen Organen und Geweben zu Schäden und Einschränkungen der Funktion führen. So konnten bei klinisch manifesten Hypophosphatämien unterschiedlicher Genese beim Menschen Erythrozyten- und Leukozytendysfunktionen, Immunschwäche, Rhabdomyolysis in der Skelettmuskulatur, gestörte Leber- und Nierenfunktionen, Störungen der Herzleistung, Kardiomyopathien und zentralnervöse Störungen festgestellt werden (Knochel 1977). Der ATP-Gehalt von Erythrozyten und Leukozyten bei Hunden mit Hypophosphatämie war direkt korreliert mit dem Serum-Pi-Spiegel, die Membranrigidität der Zellen nahm zu (durch eine reduzierte Phospholipidsynthese (Fuller et al. 1976)) und die
