Ontogenese der Mechanismen des Phosphor-Haushaltes beim kleinen Wiederkäuer

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der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Ontogenese der Mechanismen des Phosphor-Haushaltes beim kleinen

Wiederkäuer

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Julia Hattendorf

aus Kösching

Hannover 2004

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. G. Breves

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. G. Breves 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Ganter

Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2004

Die Anfertigung dieser Arbeit wurde mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt.

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Meinen Eltern

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Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG...1

1.1 DIE P-HOMÖOSTASE ADULTER WIEDERKÄUER...1

1.1.1 P-Homöostase bei adäquater P-Versorgung...1

1.1.2 P-Homöostase bei P-Überversorgung...2

1.2 DIE P-HOMÖOSTASE PRÄRUMINIERENDER WIEDERKÄUER...3

1.2.1 P-Homöostase bei adäquater P-Versorgung...3

1.2.2 P-Homöostase bei P-Überversorgung...4

1.3 PI-TRANSPORTSYSTEME...5

1.4 ZIELSETZUNGEN DIESER ARBEIT...6

2. MATERIAL UND METHODEN...7

2.1 1. VERSUCHSDURCHGANG: EINFLUSS DES ABSETZZEITPUNKTES UND DER P- VERSORGUNG AUF DEN EPITHELIALEN PI-TRANSPORT BEI WACHSENDEN ZIEGEN...7

2.1.1 Tiere: Haltung und Fütterung ...7

2.1.2 Probenentnahme...10

2.2.2 Probenentnahme...12

2.3 2. VERSUCHSDURCHGANG: NIERENFUNKTIONSTESTS ZUR UNTERSUCHUNG DER ALTERSABHÄNGIGEN ENTWICKLUNG DER NIERENSCHWELLE FÜR PI...13

2.3.2 Infusionslösungen ...13

2.3.2.1 Phosphatlösung...13

2.3.2.2 NaCl-Lösung...14

2.3.3 Versuchsdurchführung...14

2.3.3.1 Dauerinfusion ...15

2.3.3.2 Probenentnahme ...16

Blut ...16

Speichel ...16

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Harn...16

2.3.3.3 Auswertungen ...17

Glomeruläre Filtrationsrate (GFR)...17

Glomeruläre Filtrationsrate des Phosphates (GFP)...17

Tubuläre Resorptionsrate des Phosphates (TRP)...18

Zunahme des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens (EZFV) ...18

2.4 CHEMISCHE ANALYSEN...19

2.4.1 Anorganisches Phosphat ...19

2.4.2 Calcium...19

2.4.3 Kreatinin...19

2.5 PRÄPARATION DER BÜRSTENSAUMMEMBRANVESIKEL (BSMV) ...20

2.5.1 Renale BSMV...21

2.5.2 Jejunale BSMV ...22

2.6 TRANSPORTUNTERSUCHUNGEN...25

2.6.1 Schnellfiltrationstechnik ...25

2.6.2 Zur Messung der Pi-Aufnahme verwendete Inkubationsansätze ...25

a) Zeitabhängige Pi-Aufnahme in renale und jejunale BSMV ...26

b) Konzentrationsabhängige Pi-Aufnahme in renale und jejunale BSMV ...26

c) Glucoseaufnahme in BSMV...26

2.3.6 Berechnungen der Pi- und Glucoseaufnahmen ...27

a) Aufnahmeraten ...27

b) Kinetische Parameter...28

2.7 PROTEIN- UND ENZYMBESTIMMUNGEN...29

2.7.1 Proteinbestimmung...29

2.7.2 Aktivität der alkalischen Phosphatase...29

2.7.3 Aktivität der Na⁺-K⁺-ATPase ...30

2.8 CHEMIKALIEN...30

2.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG...30

3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION ...32

3.1.1 Tierdaten...32

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3.1.2.1 Gruppe IoP...34

Tier Nr. 1 (IoP)...34

3.1.2.2 Gruppe IdP...44

Tier Nr. 5 (IdP)...44

3.1.2.3 Gruppe IIoP ...54

Tier Nr. 9 (IIoP) ...54

3.1.2.4 Gruppe IIdP ...62

Tier Nr. 14 (IIdP) ...62

Tier Nr. 16 (IIdP) ...64

3.1.3 Parameter in Plasma und Speichel vor dem Schlachtzeitpunkt ...67

3.1.4 Pi-Transportstudien ...69

3.1.4.1 Anreicherungen der BSMV ...69

3.1.4.2 Vesikelintegrität...72

Glucoseaufnahmen ...72

Zeitabhängige Pi-Aufnahme...73

3.1.4.3 Charakterisierung der Na⁺-abhängigen Pi-Aufnahme in die BSMV ...75

Initiale Pi-Aufnahme ...75

Pi-Aufnahme als Funktion der Pi-Konzentration ...76

Kinetische Parameter des renalen Pi-Transportes ...77

Kinetische Parameter des jejunalen Pi-Transports ...80

3.1.5 Zusammenfassende Bewertung des 1. Versuchsdurchganges ...83

3.2.1 Tierdaten...85

(8)

3.2.2 Verschiedene Parameter der P- und Ca-Homöostase im zeitlichen Verlauf ...86

a) P-Aufnahme ...86

b) P-Ausscheidung ...88

c) Pi-Konzentrationen im Speichel...90

d) Pi-Konzentrationen im Plasma...92

e) Verhältnis der Pi-Konzentrationen im Plasma zu den Pi-Konzentrationen im Speichel...93

f) Ca-Konzentrationen im Plasma...95

3.3 2. VERSUCHSDURCHGANG: NIERENFUNKTIONSTESTS ZUR UNTERSUCHUNG DER ALTERSABHÄNGIGEN ENTWICKLUNG DER NIERENSCHWELLE FÜR PI...96

3.3.1 Zunahme des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens (EZFV) ...96

3.3.2 Pi-Konzentrationen in Plasma und Speichel während der Dauerinfusionen ...98

a) 1. Infusionsversuch...98

b) 2. Infusionsversuch...101

c) 3. Infusionsversuch...102

3.3.3 Clearancestudien ...104

a) Pi-Konzentrationen im Plasma ...104

b) Glomeruläre Filtrationsrate (GFR)...104

c) Glomeruläre Filtrationsrate des Phosphates (GFP) ...105

d) Pi-Ausscheidung im Harn...107

e) Tubuläre Pi-Resorption (TRP)...108

3.3.4 Einfluss der Pi-Konzentrationen im Plasma auf die Pi-Konzentrationen im Speichel...109

4. ZUSAMMENFASSUNG...111

5. SUMMARY...114

6. LITERATURVERZEICHNIS ...117

7. ERKLÄRUNG...128

8. DANKSAGUNGEN...129

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Abkürzungsverzeichnis

A Arteria

A Unspezifische Substrataufnahme

Abb. Abbildung

ANOVA Analysis of variance (Varianzanalyse)

APS Ammoniumpersulfat

A. bidest. Zweifach destilliertes Wasser

ATP Adenosintriphosphat

AZ Aktenzeichen

BSMV Bürstensaummembranvesikel

°C Grad Celcius

cpm counts per minute (Zerfallsrate pro Minute) d Tag(e)

d.h. das heisst

E Energiegehalt

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylene Glycol-bis-(β-Aminoethylether)-N,N,N’,N’-Tetraacetic Acid EZFV Extrazelluläres Flüssigkeitsvolumen

g Gramm

g Erdbeschleunigung

GFP Glomeruläre Filtrationsrate des Phosphates GFR Glomeruläre Filtrationsrate

Gll. Glandullae

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-ethansulfonsäure

HRP Horse-Raddish-Peroxidase

IgG Immunglobulin G

kDa Kilodalton

KF Kraftfutter

Km Substratkonzentration in mmol^.l^-1, bei der das Transportsystem halb- maximal gesättigt ist

l Liter

LM Lebendmasse

LW Lebenswoche

mA Milliampere

MAT Milchaustauscher

MBq Megabequerel

MES M-Morpholinoethansulfonsäure

min Minute

MJ Megajoule

mol Mol

N Anzahl der Versuchstiere

n Anzahl der Stichprobenmessungen

nm Nanometer

p Irrtumswahrscheinlichkeit

pg Picogramm

P Phosphor

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Pi anorganisches Phosphat PMSF Phenylmethylsulfonylfluoride

PTH Parathormon

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

r² Bestimmtheitsmaß

s Sekunde

SD Standardabweichung

Tab. Tabelle

T Trockensubstanz

Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan TRP Tubuläre Resorptionsrate des Phosphates

V Vena

V Harnzeitvolumen

VB Versuchsbeginn

VD Versuchsdauer

Vmax Maximale Transportrate

Vs Gesamtaufnahmerate des Substrats

xL Rohfett

xP Rohprotein

µCi Mikrocurie

Chemische Elemente werden nach den Regeln der internationalen Nomenklatur (IUPAC) abgekürzt.

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1. EINLEITUNG

1.1 Die P-Homöostase adulter Wiederkäuer

1.1.1 P-Homöostase bei adäquater P-Versorgung

Die wichtige Rolle, die Phosphor (P) für den Wiederkäuer spielt, ist schon seit langem bekannt: zum einen ist P, wie beim monogastrischen Tier, u.a. am Knochenaufbau und Energie- Stoffwechsel beteiligt, ist Bestandteil von Zellmembranen und Nukleinsäuren und nimmt im Säuren-Basen-Haushalt eine wichtige Funktion als Puffer ein. Zum anderen ist P essentiell für Wachstums- und Syntheseleistungen der Vormagenmikroben (KOMISARCZUK et al. 1978).

Der P-Haushalt beim Wiederkäuer ist, verglichen mit monogastrischen Spezies, durch verschiedene Besonderheiten gekennzeichnet. Es werden täglich große Mengen an anorgani- schem Phosphat (Pi) mit dem Speichel in die Vormägen sezerniert (POTTHAST et al. 1987, BREVES 1991). Dies beruht auf den hohen Flussraten eines Pi-reichen Speichels bei adulten Wiederkäuern (KAY 1960, TOMAS 1973). Die Konzentrationen an Pi im Speichel erreichten bis zu 40 mmol·l^-1 (WRIGHT et al. 1984, GONZALES und GROVUM 1994, WIDIYONO 1995). Diese lagen deutlich über den Plasma-Pi-Konzentrationen, welche bei adäquater P- Versorgung Werte zwischen 1,4 bis 2,3 mmol·l^-1 aufwiesen (MAÑAS-ALMENDROS et al.

1982, SCHRÖDER et al. 1995, SCHRÖDER und BREVES 1996). Das verdeutlicht die enorme Konzentrierungsfähigkeit der Speicheldrüsen und unterstreicht die wichtige Rolle, die diese beim endogenen Phosphat-Kreislauf des adulten Wiederkäuers spielen. Vom endogenen Phosphat-Kreislauf wird aufgrund der Tatsache gesprochen, dass der größte Teil des mit dem Speichel sezernierten Phosphats im Dünndarm resorbiert und - ebenso wie das in der Niere resorbierte Pi - auf dem Blutweg wieder den Speicheldrüsen zugeführt wird.

Während beim monogastrischen Tier der Hauptanteil des überschüssig aufgenommenen Phosphors über die Niere ausgeschieden wird, spielte dieses Organ beim Wiederkäuer bei physiologischen Plasma-Pi-Konzentrationen quantitativ keine bedeutende Rolle in der P- Ausscheidung (BREVES 1991, BREVES und SCHRÖDER 1991, WIDIYONO 1995, WALTER 1999). Bei diesen Tieren wurde unter adäquater P-Versorgung nahezu der gesamte

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überschüssige P über die Faeces exkretiert. Es wurden jedoch vereinzelt Individuen beschrieben, bei denen die renale P-Ausscheidung im gleichen Größenbereich wie bei monogastrischen Tieren lag, sogenannte „Ausscheider“ (BOXEBELT et al. 1983, SCOTT et al. 1984). Die Ursachen für diese Ausnahmen sind bisher weitgehend ungeklärt.

1.1.2 P-Homöostase bei P-Überversorgung

In der Vergangenheit wurden viele Untersuchungen zum P-Haushalt adulter Wiederkäuer bei diätetischer P-Überversorgung durchgeführt. Es konnte sowohl hierbei als auch in P- Depletionsstudien gezeigt werden, dass der Plasma-Pi-Spiegel positiv mit der P-Aufnahme korreliert ist (LUEKER und LOFGREEN 1961, PRESTON und PFANDER 1964, BREVES 1985, CHALLA und BRAITHWAITE 1987). In Infusionsstudien führten Pi-Dauerinfusionen ebenfalls zu einer Erhöhung der Plasma-Pi-Konzentrationen, wobei die auch in Fütterungs- versuchen beobachtete direkte Abhängigkeit der Speichel-Pi-Konzentrationen von den Pi- Konzentrationen im Plasma nachgewiesen werden konnte (CLARK et al. 1973, SCOTT und BEASTALL 1977, MAÑAS-ALMENDROS et al. 1982, CHALLA und BRAITHWAITE 1988, WIDIYONO 1995).

Mit der zunehmenden Plasma-Pi-Konzentration steigt auch die renale und faecale P- Ausscheidung an. CLARK et al. (1973) zeigten bei Pi-Infusionsstudien an adulten Schafen, dass, verglichen mit der erhöhten P-Ausscheidung über die Faeces, deren renale P- Ausscheidung nur geringfügig anstieg. 12 Stunden nach der Pi-Infusion war die P-Exkretion mit dem Harn wieder vernachlässigbar und der größte Anteil des überschüssigen Phosphors wurde in den folgenden Tagen faecal ausgeschieden. Die faecale P-Exkretion scheint eng mit der Menge der endogenen Pi-Sekretion korreliert zu sein. Die intestinale P-Ausscheidung überwiegt die renale offensichtlich so lange, bis die Höhe der Speichelflussrate und die Konzentrierungsfähigkeit der Speicheldrüsen für Pi erschöpft sind. Zu diesem Zeitpunkt beginnt die renale P-Ausscheidung quantitativ an Bedeutung zu gewinnen. Die Plasma-Pi- Konzentration, bei der überschüssiges Pi zunehmend über die Nieren ausgeschieden wird, wird als die Nierenschwelle für Pi bezeichnet. Sie wurde von SCOTT et al. (1984) für adulte Schafe, denen eine Gras-Diät verabreicht wurde, auf ca. 2 mmol·l^-1 geschätzt und sollte bei raufutterernährten Schafen höher liegen. WIDIYONO (1995) ermittelte in Clearance-Studien

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1.2 Die P-Homöostase präruminierender Wiederkäuer

1.2.1 P-Homöostase bei adäquater P-Versorgung

Der junge, milchernährte Wiederkäuer wird als funktionell monogastrisches Tier bezeichnet, weil er sich von den Speichel-Pi-Konzentrationen und dem P-Ausscheidungsverhalten her wie ein Tier mit einhöhligem Magen verhält. Das bedeutet, dass präruminierende Wiederkäuer nur wenig Speichel mit geringen Pi-Konzentrationen sezernierten (KAY 1958, 1960b, WILSON und TRIBE 1961) und überschüssigen P nahezu ausschließlich renal ausschieden (CHALLA und BRAITHWAITE 1989). Als präruminierend werden Tiere bezeichnet, die im Gegensatz zum adulten Wiederkäuer ihre Energie noch nicht aus den Endprodukten des ruminalen Mikrobenstoffwechsels beziehen.

Bei Milchernährung wurden durch den Schlundrinnenreflex die Vormägen umgangen, so dass deren Entwicklung und Besiedlung mit Mikroorganismen erst mit der Aufnahme von festem Futter erfolgte (SWAN und GROENEWALD 2000). Diese Entwicklungsphase erstreckte sich physiologischerweise über den Zeitraum zwischen der 3. und der 8. Lebenswoche (WARDROP und COOMBE 1961). Nahezu zeitgleich entwickelte sich die Pi- Sekretionskapazität der Speicheldrüsen, die bei grasenden Schaflämmern zwischen der 7. und der 10. LW die adulter Schafe erreichte (WILSON und TRIBE 1961) und entscheidend durch die mechanische Stimulation bei der Festfutteraufnahme beeinflusst wurde (WILSON 1963).

So konnte folglich die Entwicklung vom präruminierenden zum ruminierenden Wiederkäuer durch ausschließliche Milchernährung verzögert werden (BOEHNCKE 1975, SHIRAZI- BEECHEY et al. 1989).

Im Gegensatz zum adulten Wiederkäuer schied der präruminierende Pi überwiegend mit dem Harn aus (WALKER 1972, HODGE 1973, BOEHNCKE et al. 1976, 1981), was sich mit den Ausscheidungsverhältnissen bei monogastrischen Tieren vergleichen ließ (WILKINSON 1976). Aus der Tatsache, dass die immaturen Speicheldrüsen junger Wiederkäuer nur sehr wenig Speichel mit niedrigen Pi-Konzentrationen produzierten (KAY 1958, 1960b, WILSON und TRIBE 1961), leiteten BOEHNCKE et al. (1981) die These ab, dass die Höhe der endogenen Pi-Sekretion darüber entscheidet, ob P vornehmlich über den Harn oder über die Faeces ausgeschieden wird.

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1.2.2 P-Homöostase bei P-Überversorgung

P-Zulage-Versuche an präruminierenden Lämmern zeigten, dass trotz unveränderter Effizienz der intestinalen P-Absorption die Plasma-Pi-Konzentrationen signifikant erhöht waren (WAN ZAHARI et al. 1994). Die P-Absorption im Darm, die P-Retention im Körper und die P- Ausscheidung, sowohl renal als auch intestinal, waren ebenfalls deutlich erhöht. In Unter- suchungen von CHALLA und BRAITHWAITE (1989) an milchernährten Kälbern führte eine P-Zulage ebenfalls zu einer erhöhten P-Absorption im Darm und zu einer vermehrten renalen P-Ausscheidung, wobei allerdings unter hoher P-Versorgung keine Zunahme der P-Exkretion mit den Faeces beobachtet werden konnte. Auch kam es in dieser Studie trotz der hohen P- Aufnahme zu keiner signifikanten Veränderung der Plasma-Pi-Konzentrationen und die P- Retention im Körper war im Gegensatz zu der erstgenannten Studie sogar vermindert. Die Autoren versuchten, die verminderte Retention als Folge der erhöhten unvermeidlichen P- Verluste zu erklären, die die intestinale P-Absorption überschritten.

Bei P-Zulage-Versuchen an milchernährten Ziegenlämmern (ROESLER 2002) kam es zu einer signifikanten Reduktion der Transportkapazität (Vmax) des renalen und zu einer tendenziellen Verringerung der Vmax des jejunalen Na⁺-abhängigen Pi-Transportes. Die dadurch verminderte Pi-Absorption im proximalen Tubulus und Jejunum hatten erhöhte renale und intestinale P-Ausscheidungen zur Folge.

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1.3 P

i

-Transportsysteme

Es ist bekannt, dass die geringe renale P-Ausscheidung beim adulten Wiederkäuer auf eine nahezu komplette tubuläre Pi-Resorption aus dem Ultrafiltrat zurückzuführen ist. WALTER (1999) wies mithilfe der Vesikeltechnik und mittels RT-PCR bei Schweinen, Schafen und Ziegen das Na⁺-abhängige Pi-Transportsystem NaPi IIa in der Niere nach. ROESLER (2002) gelang der funktionelle und strukturelle Nachweis dieses Transporters bei milchernährten Ziegenlämmern.

Für monogastrische Tiere wurde gezeigt, dass ein wichtiger Pi-Transport-Mechanismus im Darm Na⁺-abhängig ist und über den NaPi IIb-Kotransporter vermittelt wird (HILFIKER et al. 1998). Beim Wiederkäuer scheint sowohl ein Na⁺- als auch ein H⁺-abhängiges Pi- Transportsystem im Dünndarm zu existieren (SCHRÖDER et al. 1995, SCHRÖDER und BREVES 1996, SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991, SHIRAZI-BEECHEY et al. 1996). HU- BER et al. (2002) wiesen ebenfalls mittels Vesikeltechnik den Na⁺-abhängigen Pi- Transporters im Jejunum von adulten Ziegen nach und konnten auch auf struktureller Ebene das NaPi IIb-Transporterprotein zeigen. ROESLER (2002) demonstrierte dies bei milcher- nährten Ziegenlämmern. Sowohl beim Kaninchen (TAUFIQ et al. 1997), als auch bei adulten und milchernährten Ziegen (HUBER et al. 2002, ROESLER 2002) konnte eine Korrelation zwischen der Transportermenge und der Transportkapazität nachgewiesen werden.

Sowohl für die Transportkapazität des renalen als auch für die des jejunalen Na⁺-abhängigen Pi-Transportsystems konnte in den meisten bisherigen Untersuchungen eine Abhängigkeit von der diätetischen P-Versorgung gezeigt werden. So führte eine P-Depletion zu einer Steigerung der Vmax des renalen Na⁺-/Pi-Kotransportes bei adulten Schweinen, Schafen und Ziegen (WALTER 1999), eine P-Zulage bewirkte eine Reduktion der Transportkapazität dieses Sys- tems bei milchernährten Ziegenlämmern (ROESLER 2002).

Auch im Jejunum adulter Ziegen hatte eine P-Depletion eine signifikant erhöhte Transport- kapazität für Pi zur Folge (SCHRÖDER et al. 1995, HUBER 2002). Milchernährte Ziegen- lämmer reagierten hingegen nur mit einer tendenziellen Erhöhung der Vmax bei P-Depletion und entsprechend mit einer tendenziellen Reduktion derselben bei P-Zulage (ROESLER 2002).

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1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit

Im Rahmen eines gemeinsamen DFG-Projekts mit dem Institut für Tierernährung, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, sollten die Einflüsse einer P-Zulage und der Futterauf- nahme auf die P-Homöostase frisch abgesetzter Ziegenlämmer untersucht werden.

Das Adaptationsvermögen der an der P-Homöostase beteiligten Organe an unterschiedliche P- Versorgungen bei milchernährten Lämmern und adulten Ziegen ist in der Vergangenheit Ge- genstand zahlreicher Untersuchungen gewesen. Daher richtete sich in der vorliegenden Arbeit das Interesse insbesondere auf den Zeitraum der Entwicklung vom milchernährten zum ruminierenden Wiederkäuer.

Durch zwei unterschiedliche „Absetzregimes“ und eine milchernährte Kontrollgruppe sollte der Einfluss der Festfutteraufnahme auf den endogenen Pi-Kreislauf und auf die Entwicklung der daran beteiligten Organe gezeigt werden. Deren Adaptationsvermögen sollte mithilfe der unterschiedlichen P-Versorgungen untersucht werden.

Aus unveröffentlichten Ergebnissen aus dem Institut für Tierernährung der Universität Bonn war bekannt, dass 6 Monate alte Ziegen unter doppelter P-Zufuhr nur durchschnittlich 5,5 % des gesamten ausgeschiedenen Phosphors mit dem Harn ausschieden. Man konnte folglich davon ausgehen, dass zu diesem Zeitpunkt die Vormagen- und Speicheldrüsenentwicklung der Tiere abgeschlossen war.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Veränderungen an den die P-Homöostase regulieren- den Organen während der Entwicklung vom funktionellen Monogastrier zum Wiederkäuer aufzuzeigen. Die vorrangigen Zielorgane waren dabei die Nieren, das Jejunum und die Speicheldrüsen, wobei nur bei den beiden erstgenannten Organen der Na⁺-abhängige Pi- Transport untersucht worden ist. Zur Untersuchung der Funktion der Speicheldrüsen wurden die Pi-Konzentrationen des Speichels erfasst.

In Clearance-Versuchen im zweiten Versuchsdurchgang sollte die Nierenschwelle für Pi bei frisch abgesetzten Ziegen ermittelt werden.

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2. MATERIAL UND METHODEN

2.1 1. Versuchsdurchgang: Einfluss des Absetzzeitpunktes und der P-Versorgung auf den epithelialen P

i

-Transport bei

wachsenden Ziegen

2.1.1 Tiere: Haltung und Fütterung

Für die Untersuchungen wurden 24 Ziegenlämmer der Rasse „Weiße Deutsche Edelziege“ in fünf Gruppen aufgeteilt. Die acht Lämmer der Kontrollgruppe wurden ab der ersten Lebenswoche zu zweit auf Stroh gehalten. Sie sollten bis Versuchsende milchernährt bleiben.

16 Tiere wurden in vier „Phosphor (P)-Gruppen“ eingeteilt und ab dem zweiten Lebenstag in Stoffwechselkäfigen aufgestallt. Ihnen wurde von Versuchsbeginn an Kraftfutter und Heu im Verhältnis 4:1 ad libitum angeboten, wobei die tatsächlich aufgenommene Futtermenge wöchentlich erfasst wurde.

Die Lämmer der Kontrollgruppe erhielten zweimal täglich Ziegenmilch bis zur Sättigung. Die Versuchstränke, die den Lämmern des Phosphor-Versuchs verabreicht wurde, bestand aus einem Gemisch aus Ziegenmilch und einem handelsüblichen Milchaustauscher (MAT), da die benötigte Milchmenge zeitweise nicht ausreichend durch die Milchleistung der Ziegenherde gedeckt wurde. Sie wies einen „originalen“ (o) P-Gehalt für die Tiere der oP-Gruppen (s. Tab.

2.1.) auf, während der Versuchstränke der dP - Gruppen P in Form von NaH2PO4 zugelegt wurde. Die Menge des Salzes wurde dabei so gewählt, dass es zu einer Verdopplung des P- Gehaltes in der Tränke kam (d = doppelt). Den oP-Gruppen wurde Kraftfutter mit einem P- Gehalt von 4 g/kg T angeboten (s. Tabelle 2.2.), die dP-Gruppen erhielten Kraftfutter mit doppeltem P-Gehalt (s. Tabelle 2.3.). Die tatsächlich aufgenommenen P-Mengen sind in Kapitel 3.1.2 aufgeführt.

Es wurden vier Gruppen nach dem P-Gehalt der Versuchstränke bzw. des Kraftfutters und folgendem Absetzregime unterschieden: Das Ziel, acht Lämmer relativ zügig auf festes Futter umzustellen, sollte erreicht werden, indem diesen Tieren von Versuchsbeginn an zweimal täglich 500 g Milch zugeteilt wurde. Ab einer Lebendmasse (LM) von 7 kg wurde die Trän-

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kemenge auf 400 g und ab einer LM von 8 kg auf 300 g pro Mahlzeit reduziert. Ab einer LM von 9 kg erhielten die Lämmer keine Tränke mehr. Die zwei Gruppen der früh abgesetzten Lämmer wurden als IoP (originaler P-Gehalt in Tränke und Kraftfutter) und IdP (doppelter P- Gehalt in Tränke und Kraftfutter) bezeichnet.

Die anderen acht Lämmer des P-Versuches erhielten bis zu einer Lebendmasse (LM) von 10 kg zweimal täglich 1000 g Milch, die anschließend auf 800 g pro Mahlzeit reduziert wurde.

Bei Erreichen einer LM von 11 kg wurde die Tränke auf 600 g pro Mahlzeit reduziert, ab 12 kg LM erhielten die Lämmer keine Tränke mehr. So sollte erreicht werden, dass diese Tiere zu einem späteren Zeitpunkt vollständig auf festes Futter umgestellt waren als die Tiere der I- Gruppen. Nach dem P-Gehalt in Tränke und Kraftfutter wurden diese Gruppen als IIoP und IIdP bezeichnet. Die aufgenommene Tränke- bzw. Futtermenge wurde bei jeder Fütterung erfasst.

Die tägliche Harn- und Kotausscheidung wurde mengenmäßig erfasst und von einer repräsentativen Sammelprobe wöchentlich der P-Gehalt bestimmt.

Die Tiere verblieben bis zu einer LM von ca. 15 kg in den Stoffwechselkäfigen. Zu diesem Zeitpunkt war jedes Tier seit mindestens einer Woche vollständig umgestellt. Der Versuchszeitraum erstreckte sich über die Zeit von Anfang März bis Mitte Mai 2002. Die Versuchswochen sind annähernd mit den Lebenswochen der Lämmer identisch, so dass diese zum Versuchsende 12 Wochen alt waren.

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Tabelle 2.1: Zusammensetzung und Gehalte des MAT laut Herstellerangaben

Bezeichnung Bergin Milch L (Fa. Bergophor)

Zusammensetzung des MAT

Sprühmagermilchpulver,

Molkenpulver, Pflanzenfett raffiniert, Weizenquellstärke, Vormischung, Molkenpulver teilentzuckert, Weizenkleber, Lecithin

Inhaltsstoffe Gehalte (%)

Rohprotein Lysin Rohfaser

Rohfett Rohasche

Ca P

21,0 1,7 0,2 20,0

8,0 1,2 0,8

Der MAT wurde mit 100 g/kg angesetzt, so dass die Versuchstränke der oP- Tiere zur Ziegenmilch identische Ca- und P- Gehalte aufwies.

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Tabelle 2.2: Weender Analyse und Ca-und P-Gehalte des Kraftfutters der oP- und dP- Gruppen (Institut für Tierernährung, Universität Bonn)

Gehalte(g/kg T) Inhaltsstoffe

oP dP

Rohprotein Rohfaser

Rohfett Rohasche

Ca P

184,0 64,0 21,7 85,2 5,6 4,1

178,0 60,2 24,7 102,0

5,6 8,7

2.1.2 Probenentnahme

Den Tieren der Phosphor-Gruppen wurden zweimal wöchentlich, den Tieren der Kontroll- gruppe einmal wöchentlich ab der vierten Versuchswoche Plasma- und Speichelproben entnommen. Das Blut wurde aus der V. jugularis entnommen und in lithiumheparinisierten Probenröhrchen (Monovette^, Sarstedt, Nümbrecht) bei 2000 rpm (1499 g) und 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Das so gewonnene Plasma wurde bei -20 °C eingefroren. Der Speichel wurde mit Hilfe eines Tupfers gewonnen, der mittels einer Arterienklemme zwei Minuten lang in die Backentasche vor die Mündung des Parotisspeicheldrüsenganges eingebracht wurde. Über diese mechanische Stimulation der Speichelsekretion gewinnt man überwiegend den serösen Speichel der Glandula parotis (BOEHNCKE et al. 1981). Der Tupfer wurde anschließend von Hand in ein Probengefäß ausgedrückt und der Speichel bei 2000 rpm (1499 g) und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde ebenfalls bei -20 °C eingefroren.

Zweimal wöchentlich wurde aus dem quantitativ im Stoffwechselkäfig gesammelten Harn eines jeden Tieres eine repräsentative Probe entnommen und deren pH-Wert gemessen. Bei Erreichen einer LM von ca. 15 kg wurden die Lämmer durch einen Bolzenschuss betäubt und

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durch Eröffnung beider Aa. carotides communes entblutet. Anschließend wurde sofort die Bauchhöhle eröffnet und es wurden die Nieren und ein Teil des Jejunums entnommen. Die Nierencortices wurden präpariert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das Jejunum wurde mit eiskalter 0,9%-iger NaCl-Lösung gespült, der Länge nach aufgeschnitten und ebenfalls in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die spätere Organ-Lagerung erfolgte bei -80 °C.

2.2 2. Versuchsdurchgang: Einfluss des Absetzzeitpunktes und der P-Versorgung auf den epithelialen P

i

-Transport bei

wachsenden Ziegen

Im zweiten Jahr wurde der Versuchszeitraum auf sechs Monate ausgedehnt, da die Tiere im ersten Versuchsdurchgang auch nach der vollständigen Umstellung auf festes noch einen ent- scheidenden Teil des überschüssigen Phosphors über die Nieren ausschieden. Die Bilanzver- suche wurden an 12 männlichen Ziegenlämmern der Rasse „Weiße Deutsche Edelziege“

durchgeführt, die ab der dritten Lebenswoche in Stoffwechselkäfigen aufgestallt waren.

Die sechs Lämmer der Gruppe A wurden nach dem zuvor beschriebenen Fütterungsregime der Gruppen I relativ zügig auf festes Futter umgestellt. Bis zur vollständigen Umstellung erhielten diese Tiere die unten aufgeführte Versuchstränke. Kraftfutter und Heu wurden wieder im Verhältnis 4:1 ad libitum angeboten, die aufgenommenen Mengen wöchentlich erfasst.

Die sechs Lämmer der Gruppe B erhielten eine dem jeweils aufgenommenen Futter energe- tisch äquivalente Menge an Versuchstränke und aus Gründen der artgerechten Haltung Stroh ad libitum.

Die Versuchstränke beider Gruppen bestand aus Ziegenmilch, der P in Form von NaH2PO4

zugesetzt wurde. Aufgrund der Annahme, eine langzeitig verabreichte doppelte P-Zufuhr stelle eine zu hohe Belastung für die Nieren dar, wurde die Menge des Salzes so gewählt, dass der P-Gehalt der Tränke 1,5 mal so hoch war wie der Gehalt in originaler Ziegenmilch (s.

Tabelle 2.3.). Das Kraftfutter, das die Lämmer der Gruppe A erhielten, wies, bezogen auf die

(22)

umsetzbare Energie, die gleiche P-Konzentration auf (s. Tabelle 2.4). Die tatsächlich aufgenommenen P-Mengen sind in Kapitel 3.2.2 aufgeführt.

Die tägliche Harn- und Kotausscheidung wurde wieder mengenmäßig erfasst und von einer repräsentativen Sammelprobe wöchentlich der P-Gehalt bestimmt. Der Stoffwechselversuch erstreckte sich über den Zeitraum von Anfang März bis Ende Juli 2003 und war beendet, als die Lämmer ca. 6 Monate alt waren.

Tab. 2.3: Weender Analyse und Ca- und P-Gehalte der Versuchstränke

T (g/kg) xP (g/kg) E (MJ/kg) xL (g/kg) Ca (g/kg) P (g/kg)

937,0 2,3 270,0 265,5 1,2 1,4

Tab. 2.4: Weender Analyse und Ca-und P-Gehalte des Kraftfutters

T (g/kg) xP (g/kg) E (MJ/kg) xL (g/kg) Ca (g/kg) P (g/kg)

894,0 12,3 191,7 33,6 6,2 7,5

2.2.2 Probenentnahme

Ab dem dritten Lebensmonat der Lämmer wurden wie im vorangegangenen Jahr zweimal pro Woche Plasma- und Speichelproben nach den zuvor beschriebenen Methoden entnommen und aufbereitet.

(23)

2.3 2. Versuchsdurchgang: Nierenfunktionstests zur Untersuchung der altersabhängigen Entwicklung der Nierenschwelle für P

i

Die Infusionsversuche wurden von der Bezirksregierung Köln genehmigt (AZ: 50.203.2- BN17, 2/03).

Für die Nierenfunktionstests standen vier weibliche Ziegen der Rasse „Weiße Deutsche Edelziege“ zur Verfügung. Alle Tiere waren während des gesamten Versuchszeitraums klinisch gesund. Vor dem ersten Infusionsversuch waren die Lämmer auf Stroh einzeln aufgestallt, während sie nach dem in Kap. 2.2.1 beschriebenen Fütterungsregime der Gruppe I bzw. A abgesetzt wurden. Nach der vollständigen Umstellung auf festes Futter in der 11. LW wurden die Tiere in der Gruppe gehalten. Sie erhielten bis zum Absetzen Ziegenmilch und von der ersten Lebenswoche an zweimal täglich Kraftfutter mit originalem P-Gehalt bis zur Sättigung. Heu stand ad libitum zur Verfügung.

2.3.2 Infusionslösungen

Für die intravenösen Dauerinfusionen wurden folgende Lösungen verwendet, die mit sterilem, pyrogenfreiem Aqua ad injectabilia (Ampuwa^®) hergestellt wurden:

2.3.2.1 Phosphatlösung

Die Phosphatlösung für die Dauerinfusionen wurde durch Mischen der beiden Stammlösungen (800 ml Lösung 1 + 130 ml Lösung 2) hergestellt. Die so entstandene Lösung wies eine Pi-Konzentration von 107 mmol·l^-1 auf und wurde mit 2,17 g NaCl auf einen pH- Wert von 7,4 und eine Osmolarität von 300 mosmol·l^-1 eingestellt.

(24)

Stammlösungen :

Na2HPO4 · 2H2O 100 mmol·l^-1 (Lösung 1) Na2HPO4 · H2O 150 mmol·l^-1 (Lösung 2)

2.3.2.2 NaCl-Lösung

Für die Dauerinfusionen bei den Kontrollversuchen sowie für die Blasenspülungen wurde isotone NaCl-Lösung verwendet.

Die Lösungen wurden vor der Verwendung autoklaviert (120 °C, 122 kPa, 40 Minuten) und unmittelbar vor den Infusionen auf 39 °C erwärmt.

2.3.3 Versuchsdurchführung

Zwischen der 12. und der 22. LW wurden an den Tieren drei Infusionsversuche zur Erfassung der Nierenclearance für Pi bei frisch abgesetzten Ziegen durchgeführt.

24 Stunden vor Beginn eines Versuches wurden die Tiere in Stoffwechselkäfigen aufgestallt, so dass zur Bestimmung des Harnzeitvolumens eine quantitative Harnsammlung über diesen Zeitraum erfolgen konnte.

Während der Infusionen wurden die Tiere ebenfalls fünf Stunden in Stoffwechselkäfigen gehalten, wobei die letzten beiden Stunden der Infusion und eine Stunde nach deren Ende fraktioniert und quantitativ Spontanharn gesammelt wurde. Es musste mit Spontanharn gearbeitet werden, da bei den jungen Ziegenlämmern ein Einführen von Harnkathetern unmöglich war.

Vor Beginn und während der Infusionen wurden in regelmäßigen Abständen Blut- und Speichelproben entnommen. In der Abb. 2.1 wird der genaue Zeitplan der Probenentnahme dargestellt.

(25)

Speichelprobenentnahme

Blutprobenentnahme

Dauerinfusion

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 (min)

Harnsammlung

Abb. 2.1: Zeitplan der Blut- und Speichelprobenentnahme und der Harnsammlung während der Infusionsversuche

2.3.3.1 Dauerinfusion

Vor Beginn des Infusionsversuches wurden beidseitig aseptisch Venenverweilkanülen ( Vygonüle T, G 18) in die Vv. jugulares gelegt. Diese wurden mittels Klebeband am Hals fixiert und mit physiologischer NaCl- oder Heparin-Lösung gespült. Ein Venenkatheter diente zur Infusion, der andere zur Blutprobenentnahme, um eine Kontamination der entnommenen Blutproben mit Infusionslösung zu vermeiden. Am ersten Tag wurde bei jedem Tier mit NaCl-Lösung infundiert, am darauffolgenden Tag mit Pi-Lösung, so dass eine Beeinflussung der renalen P-Ausscheidung durch die Vergrößerung des extrazellulären Flüssigkeits- volumens (EZFV) ausgeschlossen werden konnte. Vor Infusionsbeginn wurden Nullproben (Blut und Speichel) entnommen. Mittels einer Infusionspumpe (Perfusor 5, B. Braun, Melsungen, bzw. Ismatec BVP-MS/CA8-6, Wertheim) wurden vierstündige Infusionen mit Infusionsraten von 60 ml/h (erster Infusionsversuch), 120 ml/h (zweiter Versuch) und 275 bzw. 285 ml/h (dritter Versuch) vorgenommen, so dass eine Flüssigkeitsmenge infundiert wurde, die im Mittel 11% des Extrazellulärvolumens entsprach.

(26)

2.3.3.2 Probenentnahme

Blut

Die Blutproben wurden in den oben genannten Zeitabständen durch den Venenverweil- katheter, der nicht der Infusion diente, entnommen. Es wurden wieder heparinisierte Probenröhrchen (Monovette^, Sarstedt) verwendet, die zur Plasma-Gewinnung wie zuvor beschrieben zentrifugiert wurden. Das Plasma wurde wieder in Reagenzgefäße (Eppendorf) pipettiert und bis zur Analyse von Pi und Kreatinin bei –20 °C aufbewahrt.

Speichel

Die Speichel-Gewinnung erfolgte nach der zuvor beschriebenen Methode vor Beginn der Dauerinfusion und anschließend alle 60 Minuten.

Harn

Der Spontanharn wurde über den gesamten Zeitraum der Dauerinfusion und eine Stunde nach Versuchsende stundenweise quantitativ im Stoffwechselkäfig gesammelt. Für die Analyse von Pi und Kreatinin wurden Proben des Harns genommen, der in der vierten Stunde der In- fusion abgesetzt wurde. Setzten die Tiere in diesem Zeitraum keinen Spontanharn ab, so wurde dafür der in der Stunde nach Infusionsende gesammelte Harn herangezogen. Diese Proben wurden 10 Minuten lang bei 2000 rpm (1499 g) und 4 °C zentrifugiert. Die partikelfreien Überstände wurden in Reagenzgefäße überführt und bei –20 °C gelagert.

(27)

2.3.3.3 Auswertungen

Glomeruläre Filtrationsrate (GFR)

Die GFR ist das Volumen an Primärharn, das pro Zeiteinheit über die Gesamtheit der Glo- meruli filtriert wird. In den durchgeführten Versuchen wurde sie über die endogene Kreatinin- Clearance nach folgender Gleichung ermittelt. Das Harnzeitvolumen wurde hierfür aus dem Mittelwert des 24 h Harnvolumens des Vortages und des Infusionstages berechnet.

Uk·V

GFR = (ml·min^-1) Pk

Uk = Kreatininkonzentration im Harn (mmol·l^-1) V = Harnzeitvolumen (ml·min^-1)

Pk = Kreatininkonzentration im Plasma (mmol·l^-1)

Glomeruläre Filtrationsrate des Phosphates (GFP)

Die GFP wurde aus der GFR und dem Mittelwert der Pi-Konzentrationen im Plasma während der letzten Stunde der Dauerinfusion berechnet.

GFP = GFR·Pi im Plasma (µmol·min^-1)

(28)

Tubuläre Resorptionsrate des Phosphates (TRP)

Das Harnzeitvolumen ergab, multipliziert mit der Pi-Konzentration im Harn der letzten Stunde der Dauerinfusion, die Pi-Ausscheidungsrate für diesen Zeitraum. Die TRP wurde aus der Differenz zwischen GFP und Pi-Ausscheidungsrate ermittelt. Setzten die Tiere in der letzten Stunde keinen Harn ab, so wurde der in der Stunde nach Infusionsende abgesetzte Harn zur Berechnung der TRP herangezogen.

TRP = GFP – Up·V (µmol·min^-1)

Up = P_i-Konzentration im Harn (µ^mol·ml^-1⁾ V = Harnzeitvolumen (ml·min^-1)

Zunahme des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens (EZFV)

Die Beeinflussung des EZFV durch Art und Volumina der Infusionslösungen wurde an zwei Ziegen je Infusionsversuch überprüft, indem eine Veränderung des EZFVs indirekt durch die Abnahme der Plasmaproteinkonzentration geschätzt wurde. Diese prozentuale Veränderung wurde nach folgender Formel berechnet (Widiyono 1995).

(Pprot)i

EZFV-Veränderung = ( - 1)·100 (%) (Pprot)t

(Pprot)i = Extinktion bei 280 nm vor Infusionsbeginn

(Pprot)_t = Extinktion bei 280 nm zu willkürlich gewählten Zeitpunkten während der Infusion

(29)

2.4 Chemische Analysen

2.4.1 Anorganisches Phosphat

Die Pi-Bestimmung in Plasma, Speichel und Harn erfolgte mit der Molybdat-Vanadat- Methode (KRUSE-JARREZ, 1979). Ammonium-Molybdat und Ammonium-Vanadat bilden in einer salpetersauren Lösung einen gelben Farbkomplex, der bei einer Wellenlänge von 405 nm photometrisch gemessen werden kann. Die Farbintensität verhält sich proportional zur Pi- Konzentration.

2.4.2 Calcium

Die Ca-Konzentrationen im Plasma wurden mittels der o-Kresolphtalein-Komplex-Methode bestimmt (RAY SARKER und CHAUNAN 1967).

Calcium reagiert in alkalischer Lösung mit o-Kresolphtalein unter Bildung eines violetten Farbkomplexes, der bei 570 nm photometrisch erfasst wird. Die Farbintensität ist wiederum zur Ca-Konzentration in der Plasmaprobe proportional.

2.4.3 Kreatinin

Die Kreatininkonzentrationen in Harn und Plasma wurden mit einem enzymatischen Farbtest (Creatinin-PAP, Eberhard Lehmann, Berlin) bestimmt. Dieser Test beruht auf folgender Reaktionskette:

(30)

Kreatininase

A: Kreatinin + H2O Kreatin

Kreatinase

B: Kreatin + H2O Sarkosin + Harnstoff

Sarkosinoxidase

C: Sarkosin + H2O + O2 Glycin + H2CO + H2O2

Peroxidase

D: H2O2 Chinonimin-Farbstoff

+ 4-NH2-phenazon + 2H2O + HBr

+ 2,4,6-Tri-Br-3-OH-Benzoesäure

Die Intensität des gebildeten Farbstoffs ist der Kreatininkonzentration in der Probe proportional und kann photometrisch gemessen werden.

2.5 Präparation der Bürstensaummembranvesikel (BSMV)

Die Präparation der Bürstensaummembranvesikel beruht auf dem Prinzip der Mg²⁺-EDTA- Präzipitation.

In Anwesenheit von Magnesiumionen werden Zellbestandteile aggregiert, was mit Hilfe der anschließenden Differentialzentrifugation zu einer selektiven Anreicherung der Bürsten- saummembranfraktion führt.

Die Präparation der renalen BSMV wurde nach der von HILDEN et al. (1989) beschriebenen und von PENNY (1991) modifizierten Methode durchgeführt.

Die gesamte Präparation erfolgte bei einer Temperatur von 4 °C.

(31)

2.5.1 Renale BSMV

Zusammensetzung der bei der Präparation renaler BSMV verwendeten Puffer:

Homogenisierungspuffer 1

300 mmol·l^-1 Mannit 1 mmol·l^-1 EDTA 0,1 mmol·l^-1 PMSF

20 mmol·l^-1 MES/Tris, pH 6,0

300 mmol·l^-1 Mannit 1 mmol·l^-1 EDTA 0,1 mmol·l^-1 PMSF

20 mmol·l^-1 MES/Tris, pH 6,0

Vesikelpuffer

100 mmol·l^-1 Mannit 100 mmol·l^-1 KCl

10 mmol·l^-1 HEPES/Tris, pH 7,4

Zu Beginn der Präparation wurden die bei -80 °C gelagerten Nierenrinden gewogen und in der 4-fachen Menge Homogenisierungspuffer 1 aufgetaut. Anschließend wurden sie zusammen mit dem Puffer 3 x 10 s mit dem Ultraturrax (Heidolph DIAX 900, Stufe 5) zerkleinert (nach jedem Schritt 30 s Pause). Danach wurde der Schaum mithilfe einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Aus dem entstandenen Homogenat wurden 3 x 250 µl für die Enzym- und Proteinbestimmung entnommen und bei -20 °C eingefroren. Entsprechend dem Homogenatsvolumen wurde soviel einer 1 molaren MgCl2-Stammlösung zugegeben, dass die Endkonzentration 10 mmol·l^-1 betrug. Das Ganze inkubierte anschließend 20 min auf Eis.

(32)

Alle nun folgenden Zentrifugationsschritte wurden mittels einer Sorvall RC-5C-Zentrifuge in 35 ml - GSA-Rotorgefäßen durchgeführt. Der erste Zentrifugationsschritt erfolgte 10 min bei 1993 g (entspr. 4000 rpm, SS 34 Rotor). Mit dem Überstand wurde die Zentrifugation 6 x wiederholt, bis sich zum Schluss kein sichtbares Pellet mehr bildete. Der Überstand wurde nun 30 min bei 34540 g (entspr. 17000 rpm, SS 34 Rotor) zentrifugiert, das Pellet in 35 ml Homogenisierungspuffer 2 resuspendiert und in einem Elvehjem-Potter (Braun, Melsungen) homogenisiert (10 Schübe, 1500 rpm). Anschließend wurde das Homogenat wiederum 30 min bei 34540 g (entspr. 17000 rpm, SS 34 Rotor) zentrifugiert und das entstandene Pellet je nach Größe in 1,7 bis 2 ml Vesikelpuffer aufgenommen. Durch mehrmaliges Aufziehen von Pellet und Puffer in einer 1 ml Spritze mit einer 0,45 x 12 mm Kanüle entstand eine milchige Suspension. Hiervon wurden 3 x 100 µl für die Enzym- und Proteinbestimmung entnommen und bei -20 °C eingefroren. Die restliche Vesikelsuspension wurde portionsweise in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu den Aufnahmestudien bei -80 °C gelagert.

2.5.2 Jejunale BSMV

Die Präparation der jejunalen BSMV erfolgte in Anlehnung an die von BIBER et al. (1981) und BINDER und MURER (1986) beschriebenen Methode.

Die gesamte Präparation erfolgte bei einer Temperatur von 4 °C.

(33)

Zusammensetzung der bei der Präparation jejunaler BSMV verwendeten Puffer:

300 mmol·l^-1 Mannit 12 mmol·l^-1 Tris 5 mmol·l^-1 EGTA 1 mmol·l^-1 HCl, pH 7,4

60 mmol·l^-1 Mannit 5 mmol·l^-1 EGTA 1 mmol·l^-1 HCl, pH 7,4

Vesikelpuffer

100 mmol·l^-1 Mannit 100 mmol·l^-1 KCl

10 mmol·l^-1 HEPES/Tris, pH 7,4

Zu Beginn wurde das bis dahin bei -80 °C eingefrorene Jejunum gewogen und mit der gleichen Menge an Homogenisierungspuffer 1 auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden mit einem Vibro-Mixer (Chemap, Volketswil, Schweiz) 10 min lang die Enterozyten von der Darmwand abgeschüttelt. Die enterozytenhaltige Flüssigkeit wurde mit der vierfachen Menge an destilliertem Wasser, bezogen auf den Homogenisierungspuffer 1, durch ein Haushaltssieb geseiht und die Suspension 2 x 30 s (dazwischen 30 s Pause) im Ultraturrax (Heidolph DIAX 900, Stufe 5) homogenisiert. Anschließend wurde der Schaum mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, vom Homogenat 100 µl zur Enzym- und Proteinbestimmung entnommen und diese bei -80 °C eingefroren.

Entsprechend dem Homogenatvolumen wurde eine solche Menge einer 1 molaren MgCl2- Stammlösung zugegeben, dass die Endkonzentration 10 mmol·l^-1 betrug. Nach einer 15- minütigen Inkubation auf Eis erfolgte der erste Zentrifugationsschritt für 18 min bei 5019 g

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(entspr. 8000 rpm, SS 34 Rotor). Der Überstand wurde daraufhin 40 min bei 14740 rpm (entspr. 14000 rpm, SS 34 Rotor) zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 35 ml Homogenisierungspuffer 2 resuspendiert und in einem Elvehjem-Potter (Braun, Melsungen) homogenisiert (10 Schübe, 1500 rpm). Es folgte eine zweite MgCl2-Fällung, woraufhin das Homogenat für 18 min bei 5019 g (entspr. 8000 rpm, SS 34 Rotor) und der dabei entstandene Überstand für 40 min bei 14740 rpm (entspr. 14000 rpm, SS 34 Rotor) zentrifugiert wurde.

Danach wurde das Pellet in 35 ml Vesikelpuffer aufgenommen und durch 10 Schübe bei 1500 rpm im Elvehjem-Potter (Braun, Melsungen) homogenisiert. Anschließend erfolgte der letzte Zentrifugationsschritt für 45 min bei 19950 rpm (entspr. 16000 rpm, SS 34 Rotor).

Das entstandene Pellet wurde je nach Größe in 0,8 bis 2 ml Vesikelpuffer aufgenommen und durch mehrmaliges Aufziehen von Pellet und Puffer in einer 1 ml Spritze mit einer 0,45 x 12 mm Kanüle entstand eine milchige Suspension. Hiervon wurden 2 x 100 µl für die Enzym- und Proteinbestimmung entnommen und bei -20 °C und 1 x 100 µl für Western-Blot- Analysen eingefroren. Die restliche Vesikelsuspension wurde portionsweise in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu den Aufnahmestudien bei -80 °C gelagert.

(35)

2.6 Transportuntersuchungen

2.6.1 Schnellfiltrationstechnik

Die Untersuchung der Aufnahme von Pi in die BSMV wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt: Um die Substrataufnahme zu starten, wurden 20 µl der Vesikelsuspension zu 80 µl des Inkubationspuffers gegeben und das Ganze eine dem Versuchsansatz entsprechend lange Zeit inkubiert.

Die Substrataufnahme wurde durch Zugabe von 1 ml einer 4 °C kalten Stopplösung (150 mmol·l^-1 KCl, 10 mmol·l^-1 Mannit, 10 mmol·l^-1 HEPES, 1 mmol·l^-1 KH2PO4, pH 7,4) abge- brochen. Die Vesikel wurden mithilfe der Schnellfiltration von der Lösung getrennt. Die auf dem Filter (Cellulose-Nitrat, Porengröße 0,65 µm, Sartorius, Göttingen) verbliebenen Vesikel wurden zur Entfernung von anhaftendem Tracer mit 2 x 5 ml Stopplösung nachgewaschen.

Der Filter wurde anschließend mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit (Lumasafe Plus, Groningen, NL) in Minivals gegeben und die Aktivität 10 min in einem Flüssigkeitsszintillationszähler (2000 CA Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer , United Technologies Packard) gemessen, wobei der Zählfehler maximal 2 % betrug.

Zur Bestimmung der Leerwerte wurde zu 80 µl Inkubationspuffer nur die Stopplösung wie zuvor beschrieben zugegeben und die Filter anschließend wie bei den Proben behandelt.

Um die Gesamtaktivität im einzelnen Ansatz zu bestimmen, wurden jeweils 10 µl des Inkubationspuffers direkt in die Szintillationsflüssigkeit pipettiert und anschließend gezählt.

2.6.2 Zur Messung der Pi-Aufnahme verwendete Inkubationsansätze

Die Versuche zur Messung der Phosphataufnahme wurden als 2- oder 3-facher Ansatz durchgeführt. Die ³²P-Radioaktivität betrug jeweils 1 µCi pro 100 µmol Ansatz. Als ³²P wurde ortho-Phosphat der Firma PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA, eingesetzt. Vor jedem Versuch wurde die entsprechend mit unmarkiertem Phosphat gemischte ³²P[Pi]-Lösung durch einen Minisart-Filter (0,20 µl) der Firma Sartorius (Göttingen) sterilfiltriert, um die

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Pyrophosphate aus der Lösung zu entfernen und damit die unspezifische Bindung an die Filter zu verringern.

Um die Integrität der Vesikel zu überprüfen, wurden zeitabhängige Pi-Aufnahmen durch- geführt und dabei die Na⁺-abhängige Pi-Akkumulation dargestellt.

a) Zeitabhängige Pi-Aufnahme in renale und jejunale BSMV

Bei den Versuchen zur zeitabhängigen Pi-Aufnahme betrugen die Inkubationszeiten 5-25 s bei den schnellen Aufnahmen und 5 s bis 180 min bei den langen Aufnahmen in renale BSMV bzw. 10 s bis 240 min bei den langen Aufnahmen in jejunale BSMV, wobei letztere bei 37 °C durchgeführt wurden, um sicherzugehen, dass ein Ausgleichswert zwischen Na⁺-abhängiger und Na⁺-unabhängiger Pi-Aufnahme erreicht wird. Bei den Aufnahmen mit den kurzen Inkubationszeiten bzw. bei den Transportuntersuchungen an renalen BSMV betrug die Tem- peratur 21 °C.

Die Inkubationspuffer bestanden aus 100 mmol·l^-1 NaCl bzw. 100 mmol·l^-1 KCl, 100 mmol·l^-1 Mannit und 10 mmol·l^-1 HEPES-Tris, pH 7,4. Die ³²Pi/Pi-Konzentration betrug jeweils 0,1 mmol·l^-1.

b) Konzentrationsabhängige Pi-Aufnahme in renale und jejunale BSMV

Die Versuche zur Kinetik der Pi-Aufnahme wurden bei einer Temperatur von 21 °C und einer Inkubationszeit von 10 Sekunden durchgeführt. Die Inkubationspuffer bestanden aus 100 mmol·l^-1 NaCl bzw. 100 mmol·l^-1 KCl, 100 mmol·l^-1 Mannit und 10 mmol·l^-1 HEPES-Tris, pH 7,4 und steigenden ³²Pi/Pi-Konzentrationen von 0,01 bis 1,0 mmol·l^-1.

c) Glucoseaufnahme in BSMV

Um zu überprüfen, ob die präparierten Vesikel intakt waren, wurde neben der zeitabhängigen Pi-Aufnahme auch die Glucoseaufnahme als Einpunktmessung bestimmt. Die Glucose- aufnahme sollte zudem zeigen, ob die basalen Membraneigenschaften durch die unter-

(37)

schiedliche Fütterung beeinflusst worden sind. Dies wurde nur an den renalen BSMV durchgeführt, da nur hier genügend Vesikelsuspension zur Verfügung stand.

Die Na⁺-abhängige Glucoseaufnahme wurde bei einer Temperatur von 21 °C und einer Inkubationszeit von 5 min geprüft. Die Inkubationspuffer setzten sich aus 100 mmol·l^-1 NaCl bzw. 100 mmol·l^-1 KCl, 100 mmol·l^-1 Mannit und 10 mmol·l^-1 HEPES-Tris, pH 7,4 und 0,5 mmol·l^-1 Glucose/³H-Glucose zusammen. Die ³H-Radioaktivität betrug 10 µCi/100µl Puffer.

Es wurde D-[1-³H (N)]-Glucose der Firma PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA, verwendet. Für jeden Messpunkt wurden 3-fach Bestimmungen durchgeführt.

2.3.6 Berechnungen der Pi- und Glucoseaufnahmen

a) Aufnahmeraten

Die Aufnahmeraten [nmol/mg Protein] für Phosphat und Glucose in die BSMV wurden nach folgender Formel berechnet:

(cpmP-cpmL)·[s] (nmol/l) [s] (nmol) =

cpmT·[Protein] (mg/l) Protein (mg)

cpmP = cpm in der Probe cpm = cpm im Leerwert

cpmT = Gesamtaktivität (cpm) im Ansatz [s] = Konzentration des P_i/der Glucose

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b) Kinetische Parameter

Die Aufnahmen bei unterschiedlichen Pi-Konzentrationen wurden durchgeführt, um über die Michaelis-Menten-Gleichung die kinetischen Parameter des Pi-Transportes zu ermitteln.

Dieses sind die Transportkapazität (Vmax) und die halbmaximale Transportersättigung (Km) als Maß für die Transporteraffinität.

Die Michaelis-Menten-Gleichung beinhaltet die unspezifische, also Na⁺-unabhängige, Aufnahme (A) von Pi in die BSMV, die als vom Programm kalkulierte Größe von der Gesamt-Pi-Aufnahme abgezogen wird. Wurde A negativ kalkuliert, so musste stattdessen ein konstanter Wert eingesetzt werden, der dem Mittelwert der übrigen kalkulierten A-Werte entsprach.

Vmax [S]

Vs = + A·[S]

Km + [S]

Vs = Aufnahme des Substrats in nmol·mg Protein^-1·10 s^-1

V_max = Maximale Aufnahmerate in nmol·mg Protein^-1·10 s^-1 (Transportkapazität) Km = Substratkonzentration bei halbmaximaler Sättigung in mmol·l^-1

[S] = Substratkonzentration in mmol·l^-1

A = unspezifische Aufnahme in (nmol·mg Protein^-1·10 s^-1)/( mmol·l^-1)

Die Berechnung der kinetischen Parameter wurde mit Hilfe der Graph Pad^TMSoftware (San Diego, USA, www.graphpad.com) durchgeführt.

Bei jedem Versuch wurde die Pi-Aufnahme in Abwesenheit von Na⁺ (K⁺-Puffer) gemessen, um zu zeigen, dass diese unter solchen Bedingungen deutlich vermindert war. Dieser gemessene A-Wert diente anschließend der Überprüfung des vom Programm kalkulierten A- Wertes.

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2.7 Protein- und Enzymbestimmungen

2.7.1 Proteinbestimmung

Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen in Ausgangshomogenat und Vesikelsuspension erfolgte mittels eines Standardassays der Firma BioRad, München.

Das Messprinzip beruht darauf, dass sich das Absorptionsmaximum einer sauren Lösung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G250 von 465 nm auf 595 nm ändert, nachdem dieser an das Protein gebunden hat. Die Eichkurve wurde mit bovinem γ-Globulin als Standard erstellt.

Zunächst wurden je 50 µl Probe bzw. Standard mit je 50 µl des Detergenz Saponin (1%) bei Raumtemperatur 20 min vorinkubiert, um alle Proteinbindungsstellen für das Farbreagenz zugänglich zu machen. Anschließend wurde das entsprechend verdünnte Farbreagenz (je 2,5 ml) zugegeben und das Ganze nach einer Inkubationsdauer von 20 min bei einer Wellenlänge von 595 nm photometrisch gemessen.

2.7.2 Aktivität der alkalischen Phosphatase

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde ebenfalls photometrisch bestimmt. Dabei wurden zunächst 50 µl Probe mit 3 ml Reagenz (1 mmol·l^-1 Diethanolamin, 0,5 mmol·l^-1 MgCl2, pH 9,8, mit 10 mmol·l^-1 Na-p-Nitrophenolphosphat) zusammenpipettiert und anschließend die Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 405 nm nach 1, 2 und 3 min gemessen (Kinetikmessung).

Das Prinzip dieser Methode beruht auf der hydrolytischen Spaltung von p-Nitrophenol und Phosphat durch die alkalische Phosphatase. Die Reaktionsgeschwindigkeit des entstehenden p-Nitrophenols ist proportional zur Phosphatase-Aktivität.

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2.7.3 Aktivität der Na⁺-K⁺-ATPase

Die Aktivität der Na⁺-K⁺-ATPase wurde photometrisch mit Hilfe der von MIRCHEFF und WRIGHT (1976) beschriebenen Methode bestimmt. Dabei wird die Differenz der Na⁺-K⁺- ATPase-Aktivität mit und ohne Ouabainzusatz gemessen (Endpunktmessung). Das Prinzip dieser Methode beruht auf einer spezifischen Hemmung der Na⁺-K⁺-ATPase durch Ouabain.

Es wurden zunächst 20 µl Probe mit 0,5 ml Inkubationspuffer bei 37 °C für 30 min inkubiert.

Der Inkubationspuffer besteht aus 5 mmol·l^-1MgCl, 100 mmol·l^-1 NaCl, 10 mmol·l^-1 KCl, 2 mmol·l^-1ATP, 3 mmol·l^-1EDTA und 100 mmol·l^-1Tris/HCl, pH 7,4. Die Reaktion wurde mit 0,5 ml 5 %iger Trichloressigsäure gestoppt und anschließend erfolgte eine 30minütige Inku- bation der Messansätze mit je 1 ml Farbreagenz bei Raumtemperatur. Das Farbreagenz besteht aus 40 mg FeSO4·7 H2O/ml und 1 %igem Ammoniumheptamolybdat in 1,15 M H2SO4. Frei werdendes Pi bildet in saurer Lösung mit Molybdat komplexe Phosphomolybdänsäure, die zu Molybdänblau reduziert wird. Dieser blaue Farbkomplex kann bei einer Wellenlänge von 690 nm photometrisch erfasst werden, wobei die Farbintensität der Aktivität der Na⁺-K⁺- ATPase in der Probe proportional ist.

2.8 Chemikalien

Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien wurden von der Firma Sigma-Aldrich, Taufkirchen, bezogen.

2.9 Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden als arithmetischer Mittelwert mit Standardabweichung angegeben.

Der Stichprobenumfang „n“ bezeichnete die jeweilige Anzahl der Versuchstiere.

Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Statistikpaket der Graph Pad^TMSoftware (San Diego, USA, www.graphpad.com), wobei die Signifikanz unter Annahme normal verteilter Daten entweder mithilfe eines t-Tests oder mit einer Ein-Weg ANOVA mit Tukey’s Nachfolgetest überprüft wurde. Aufgrund des niedrigen Stichprobenumfangs pro Gruppe

(41)

auf die Arbeit von ROESLER (2002) verwiesen. Dort erfolgte die Überprüfung der Normalverteilung der Vesikeldaten durch das gemeinsame Testen aller Gruppen mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test. Da es sich in der vorliegenden Arbeit um ähnliche Unter- suchungen an genetisch vergleichbarem Tiermaterial handelte, konnte auch hier eine Normal- verteilung der Werte angenommen werden.

Bei den Infusionsversuchen wurde die Plasmaschwelle für die renale Pi-Ausscheidung (xs) aus den Messwerten der Pi-Ausscheidungsrate (µmol·min^-1) und der Plasma-Pi-Konzentration (mmol·l^-1) errechnet. Dies geschah mit Hilfe von zwei linearen Regressionsanalysen mit folgenden Gleichungen (Widiyono 1995):

yx = b1·x für x < Schwellenwert (xs)

yx = a + b2·x für x > Schwellenwert (xs)

Durch Gleichsetzen der beiden Funktionsteile ließ sich die Plasmaschwelle für die renale Pi- Ausscheidung nach folgender Formel berechnen:

a

(xs) = (mmol·l^-1) b1 – b2

y_x = renale Ausscheidungsrate (µmol·min^-1)zur Plasma-P_i-Konzentration „x“

x = Plasma-P_i-Konzentration (mmol·l^-1)

b₁ = Zunahmekonstante (Steigung) der renalen P_i-Ausscheidungsrate unterhalb des Schwellenwertes b₂ = Zunahmekonstante (Steigung) der renalen P_i-Ausscheidungsrate oberhalb des Schwellenwertes a = zugehöriger Ordinatenabschnitt

Die graphischen Darstellungen wurden entweder mit der Graph Pad^TMSoftware oder mit Hilfe von Microsoft Excel 97 ausgeführt.

(42)

3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.1 1. Versuchsdurchgang: Einfluss des Absetzzeitpunktes und der P-Versorgung auf den epithelialen P

i

-Transport bei

wachsenden Ziegen

3.1.1 Tierdaten

In Tab. 3.1 sind Geschlecht, Alter und Gewicht der Lämmer am Schlachttag aufgelistet. Es befanden sich männliche, weibliche und Zwitter-Tiere im Versuch, da bisher keine Hinweise auf Geschlechtsunterschiede bezüglich der P-Homöostase zwischen nicht laktierenden weiblichen und männlichen Ziegen existieren und selbiges auch für Zwitter postuliert wurde.

Aufgrund der Annahme, dass die kinetischen Parameter der am endogenen Pi-Kreislauf beteiligten Organe in erster Linie von deren Größe und nicht vom Alter der Tiere abhängen, wurden die Lämmer bei Erreichen des erwünschten Endgewichtes geschlachtet. Auch andere Autoren nahmen an, dass es für die Beurteilung des Entwicklungszustandes der jeweiligen Organe wichtiger war, Gruppen gleichen Gewichts als Gruppen gleichen Alters zu haben (WILSON 1963). Infolgedessen kam es zu einer gewissen Streuung im Alter der Ziegen am Schlachttag, wobei es jedoch keinen signifikanten Unterschied bei den Tieren des Phosphor- Versuchs gab. Die Lämmer der Kontrollgruppe waren bei der Schlachtung etwas jünger als die übrigen, was an der hohen scheinbaren Verdaulichkeit der Milchration gelegen haben konnte, die zweimal täglich bis zur Sättigung verabreicht wurde.

In der Gruppe IIdP verstarben zwei Tiere in der dritten und fünften Versuchswoche, so dass diese Gruppe im weiteren Versuchsverlauf nur noch aus zwei Lämmern bestand. Es wird ein Zusammenhang der Todesfälle mit der langzeitigen hohen P-Versorgung der Tiere vermutet:

Auch bei schon normaler P-Versorgung kam es bei Versuchen an Schaflämmern zu einem Todesfall durch Nierenversagen aufgrund von Harnsteinen (FIELD et al. 1982).

(43)

Tabelle 3.1: Geschlecht der Lämmer; Alter und Gewicht am Schlachttag

Gewicht Tier Gruppe Geschlecht Alter (d)

kg MW ± SD

1 w 81 14,7

2 m 67 13,9

3 z 57 8,7

4

IoP

z 77 12,2 12,4 ± 2,7

5 w 81 9,3

6 m 80 11,1

7 m 81 11,1

8

IdP

m 68 9,1

10,2 ± 1,1

9 w 81 13,0

10 z 66 13,4

11 m 67 14,6

12

IIoP

m 67 14,5 13,9 ± 0,8

14 m 81 11,9

16 IIdP

m 67 12,9 12,4 ± 0,7

17 w 50 14,9

18 w 45 13,8

19 w 57 10,7

20 w 57 10,4

21 m 56 14,4

22 m 38 14,8

23 m 47 14,7

24

Kontrolle

m 46 13,4 13,4 ± 1,8

w : weiblich m : männlich z : Zwitter

(44)

3.1.2 Verschiedene Parameter der P- und Ca-Homöostase im zeitlichen Verlauf

In den Abbildungen 3.1 bis 3.112 sind die Verläufe der in Plasma, Speichel und Harn der Tiere des Phosphor-Versuchs gemessenen Parameter während der Entwicklung vom präruminierenden zum ruminierenden Wiederkäuer dargestellt.

Zu den in den Körperflüssigkeiten bestimmten Parametern zählten die Pi-Konzentrationen im Speichel, Pi- und Ca-Konzentrationen im Plasma, das Verhältnis der Pi-Konzentrationen in Plasma und Speichel zueinander und die pH-Werte im Harn. Diese waren abhängig von Absetzregime und P-Zulage, so dass zusätzlich die im Institut für Tierernährung der Universität Bonn ermittelten Parameter Futteraufnahme, P-Aufnahme und -Ausscheidung dargestellt sind. Es wird bewusst die Form der Einzeltierdarstellung gewählt, da die Ontogenese keine lineare Entwicklung, sondern einen eher sprunghaften Prozess darstellt (PACHA 2000). Somit war mit großen individuellen Unterschieden in der Festfutteraufnahme und folglich dem ruminierenden Status der einzelnen Tiere zu rechnen, so dass im Anschluss an die Einzeltierdarstellung lediglich der Versuch einer Zusammenfassung der Gruppen- unterschiede und -gemeinsamkeiten vorgenommen wird.

3.1.2.1 Gruppe IoP

Tier Nr. 1 (IoP)

Abb. 3.1: Futteraufnahme (Institut für Tierernährung, Universität Bonn)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Versuchswoche

Futteraufnahme (%)

Milch KF Heu

0 5 10 15 20 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Versuchswoche

P- Aufnahme (g)

fest (g) flüssig (g)

Abb. 3.2: P-Aufnahme aus Milch (flüssig) bzw.

Festfutter (fest); (Analyse Institut für Tierernärung, Universität Bonn)