Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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Deutschen Nationalbibliografie;
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1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-144-8
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Seroprävalenz von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis beim kleinen Wiederkäuer in Deutschland
und zur Impfung gegen Paratuberkulose bei Milchziegen
– DISSERTATION INAUGURAL
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Angelika Stau Heidelberg
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin Ganter Klinik für kleine Klauentiere Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter Klinik für kleine Klauentiere Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Ralph Goethe Institut für Mikrobiologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 01. Februar 2013
Meiner Familie
Teile dieser Arbeit wurden in den folgenden Fachzeitschriften veröffentlicht:
Small Ruminant Research (2012) Volume 105, Issue 1-3, Seiten 361-365
Tierärztliche Praxis, Ausgabe Großtiere/Nutztiere (2012) Volume 40 , Issue 1, Seiten 14-20
Desweiteren wurden folgende Teile der Arbeit bereits veröffentlicht:
Untersuchungen zur Verbreitung und Diagnostik von Paratuberkulose bei kleinen Wiederkäuern
Ganter, Martin; Schröder, Carsten; Stau, Angelika; Seelig, Björn; Walter, Dirk; Kuks, Ants
Vortrag
Internationale Tagung Krankheiten kleiner Wiederkäuer, Freiburg im Breisgau 11.-12. Mai 2011
Untersuchungen zur Verbreitung und Diagnostik von Paratuberkulose bei kleinen Wiederkäuern
Ganter, Martin; Stau, Angelika; Schröder, Carsten; Walter, Dirk; Kuks, Ants; Seelig, Björn
Vortrag
52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch Patenkirchen,
27.-30. September 2011
Erfahrungen mit der Impfung gegen Paratuberkulose bei Ziegen mit Gudair® Stau, Angelika; Ganter, Martin
Posterpräsentation
Internationale Tagung Krankheiten kleiner Wiederkäuer, Freiburg im Breisgau 11.-12. Mai 2011
Erfahrungen mit der Impfung gegen Paratuberkulose bei Ziegen mit Gudair® Stau, Angelika; Ganter, Martin
Posterpräsentation
52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch Patenkirchen
27.-30. September 2011
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Zielsetzung ... 1
2. Literaturübersicht ... 3
2.1. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ... 3
2.1.1. Taxonomie ... 3
2.1.2. Erregereigenschaften/Pathogenitätsfaktoren ... 3
2.1.3. Wirtsspektrum ... 3
2.2. Paratuberkulose ... 4
2.2.1. Pathogenese ... 4
2.2.2. Pathologische Veränderungen ... 6
2.2.3. Klinik ... 8
2.2.4. Verbreitung und Epidemiologie ... 9
2.2.5. Diagnostische Verfahren ... 11
2.2.5.1. Nachweis der Immunantwort ... 11
2.2.5.1.1. Nachweis der humoralen Immunantwort: ELISA ... 11
2.2.5.1.2. Nachweis der humoralen Immunantwort: Agar Gel Immuno- diffusionstest (AGID) ... 11
2.2.5.1.3. Nachweis der humoralen Immunantwort: Komplementbindungs- reaktion (KBR) ... 11
2.2.5.1.4. Nachweis der zellulären Immunantwort: Hauttests ... 12
2.2.5.1.5. Nachweis der zellulären Immunantwort: Interferon-gamma-Test (IFN-γ-Test) 12 2.2.5.2. Erregernachweis ... 12
2.2.5.2.1. Kultur ... 12
2.2.5.2.2. Radiometrische Kultur (BACTEC) ... 12
2.2.5.2.3. PCR ... 13
2.2.5.2.4. Mikroskopischer Nachweis ... 13
2.2.5.2.5. Fleischbeschau ... 13
2.2.6. Bekämpfung ... 14
2.2.7. Impfung ... 15
2.2.8. Behandlung ... 16
2.2.9. Wirtschaftliche Relevanz ... 17
3. Material und Methoden ... 19
3.1. Seroprevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in small ruminants in Germany ... 19
Seroprävalenz von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis bei kleinen
Wiederkäuern in Deutschland ... 19
3.1.1. Herden und Tiere ... 19
3.1.2. Blutprobenentnahme und Serologie ... 19
3.1.3. Body Condition Score, Alter, Herdengröße ... 20
3.1.4. Statistische Methoden ... 20
3.2. Impfreaktionen und Nebenwirkungen einer Vakzinierung gegen Paratuberkulose bei Milchziegen ... 20
3.2.1. Tiere ... 20
3.2.2. Impfung ... 21
3.2.3. Untersuchung der Impfstoffverträglichkeit ... 21
3.2.4. Blutprobenentnahme und Serologie ... 22
3.2.5. Statistische Auswertung ... 22
4. Manuskripte ... 23
4.1. Seroprevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in small ruminants in Germany ... 23
4.1.1. Abstract ... 23
4.2. Impfreaktionen und Nebenwirkungen einer Vakzination gegen Paratuberkulose bei Milchziegen ... 24
Reactions to a vaccination against paratuberculosis and its side-effects on milk goats ... 24
4.2.1. Zusammenfassung ... 24
4.2.2. Summary ... 24
5. Diskussion ... 26
6. Zusammenfassung... 31
7. Summary ... 33
8. Literaturverzeichnis ... 35
Abkürzungen
µm Mikrometer
°C Grad Celsius
% Prozent
® engl.: registered trademark (eingetragenes Warenzeichen) AGID Agar Gel Immunodiffusionstest
Anon. Anonymus
BCS Body Condition Score bzw. beziehungsweise
ca. zirka
CAEV Caprines-Arthritis-Encephalitis-Virus CD cluster of differentiation
CFT Komplement Fixations Test DNA Desoxyribonukleinsäure DTH delayed type hypersensitivity
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay et al. et alii
g Erdbeschleunigung
h Stunde (lat. hora)
i.d.R. in der Regel IFN-γ Interferon gamma
IL Interleukin
IS Insertionssequenz
JD Johne’s disease
k.A. keine Angaben
M Mycobacterium
MAP Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
MC Morbus Crohn
MHC Major Histocompatibility Complex
min Minute(n)
ml Milliliter
OD Optische Dichte
p-Wert Signifikanzwert
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
s Sekunde(n)
subsp. Subspezies
T-Zellen T-Lymphozyten
TGF Transforming Growth Factor TNF-α Tumornekrosefaktor Alpha TMB Tetramethylbenzidin
v.a. vor allem
z.B. zum Beispiel
1. Einleitung und Zielsetzung
Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete Erkrankung, die sowohl Haus- als auch Wildwiederkäuer betrifft (AYELE et al. 2001). In Deutschland besteht Meldepflicht für diese Erkrankung. Sie zählt zu den bedeutendsten Infektionskrankheiten bei Schaf und Ziege. Beim kleinen Wiederkäuer besteht das klinische Bild in der Regel aus chronischer Abmagerung bei gleichbleibender oder gesteigerter Futteraufnahme und Leistungsrückgang. Histopathologisch ist Paratuberkulose gekennzeichnet durch eine granulomatöse Enteritis und Lymphangitis. Betroffen sind vornehmlich das distale Jejunum, Caecum und Ileum sowie die zugehörigen Mesenteriallymphknoten (CORPA et al. 2000b; PÉREZ et al. 1996).
Verursacht wird Paratuberkulose, auch Johnesche Krankheit genannt, durch Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). MAP ist ein grampositives, aerobes und säurefestes Stäbchen mit hoher Umwelttenazität (GIERKE und KOEHLER 2009).
Eine Infektion der Tiere erfolgt in der Regel in den ersten Lebenstagen über den fäkal-oralen Infektionsweg. Eine Übertragung von MAP über Kolostrum, Milch und intrauterin sind ebenfalls möglich (SWEENEY 1996).
Die Kontrolle und Prävention von Paratuberkulose wird durch die lange Inkubationszeit erschwert. Subklinisch kranke Tiere bleiben oft lange unerkannt und die in-vivo-Diagnostik ist schwierig (VAN METRE et al. 2000). Alle üblichen Nachweismethoden, wie z.B. ELISA, AGID, PCR und kulturelle Anzucht haben gerade bei der Einzeltierdiagnostik eine eingeschränkte Sensitivität.
Maßnahmen zur Paratuberkuloseprävention sind reine Hygienemaßnahmen, getrennte Haltung nach Altersgruppen, mutterlose Aufzucht und Verwendung von MAP-negativem Kolostrum. Zudem sollten MAP-ausscheidende Tiere die Herde verlassen, Zukäufe auf ein Minimum beschränkt und regelmäßige Herdenscreenings durchgeführt werden (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ, ERNÄHRUNG UND LANDWIRTSCHAFT 2005). Ein Impfstoff ist in Deutschland nicht zugelassen. In anderen Ländern ist die Impfung von Schafen ein wichtiger Bestandteil der Paratuberkuloseprophylaxe. Eine Impfung verhindert keine Infektion mit MAP, sie reduziert jedoch die Anzahl der ausgeschiedenen Erreger, mildert die Ausprägung der klinischen Symptome und senkt die Mortalität (JUSTE und PEREZ 2011).
Paratuberkulose ist eine wirtschaftlich bedeutsame Erkrankung (OTT et al. 1999;
HASONOVA und PAVLIK 2006). Die ökonomischen Einbußen resultieren in der Schaf- und Ziegenhaltung v.a. aus höheren Remontierungsraten, verminderter Milchleistung, geringerer Fruchtbarkeit sowie Kosten für Diagnostik und gegebenenfalls Impfung.
Es wird zudem eine Beteiligung von MAP an der Humanerkrankung Morbus Crohn diskutiert (SINGH et al. 2008; VAN KRUININGEN 1999). Sollte diese in Zukunft belegt werden, so werden die wirtschaftlichen Einbußen bei der Vermarktung von Schaf- und Ziegenmilchprodukten evtl. erheblich zunehmen.
Die vorgelegte Arbeit besteht aus zwei Teilstudien. Ziel der Studie 1 war es, die derzeitige Prävalenz von MAP in deutschen Schaf- und Ziegenbeständen zu evaluieren. Hierzu sollte ein kommerzieller MAP-ELISA verwendet werden, da sich
ELISAs in der Vergangenheit als sinnvolles Instrument bei Prävalenzuntersuchungen und Herdenscreenings erwiesen hatten (COELHO et al. 2007). Desweiteren sollte untersucht werden, inwieweit ein Zusammenhang zwischen MAP-Prävalenz und Body Condition Score (BCS) eines Tieres, Alter eines Tieres sowie der Herdengröße besteht. Die Studie sollte dazu dienen, das Ausmaß des Problems Paratuberkulose bei kleinen Wiederkäuern näher einzugrenzen.
In der Studie 2 sollten nach einer Impfung von Ziegen mit dem Impfstoff Gudair® die lokalen und systemischen Effekte auf den Organismus untersucht werden. Im Einzelnen sollten Veränderungen folgender Parameter untersucht werden:
- Rektale Körpertemperatur, - Hautdicke an der Injektionsstelle, - Schmerzreaktion an der Injektionsstelle, - Futteraufnahme,
- Milchleistung und
- MAP-Antikörperaktivität im Serum (mittels ELISA gemessen).
Diese Untersuchung sollte als Vorstufe zum Versuch einer Sanierung einer mit Paratuberkulose verseuchten Milchziegenherde dienen. Aufgrund der hohen Seroprävalenz von Paratuberkulose in dieser Herde erschien eine Sanierung, die allein auf Hygienemaßnahmen und der Unterbrechung der Infektketten beruht nicht möglich. Deshalb soll versucht werden mit Hilfe der Gudair®-Impfung die Inzidenz klinischer Paratuberkulose-Erkrankungen sowie die MAP Ausscheidung zu reduzieren um dann eine Sanierung einleiten zu können.
2. Literaturübersicht
2.1. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 2.1.1. Taxonomie
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gehört wie alle Mykobakterien zur Ordnung der Actinomycetales. Es existieren vier Subspezies von Mycobakterium avium:
- Mycobacterium avium subsp. hominisuis, - Mycobacterium avium subsp. avium, - Mycobacterium avium subsp. silvaticum und
- Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (ALEXANDER et al. 2009).
Die Unterteilung in Subgruppen erfolgt aufgrund ihrer spezifischen Insertionssequenzen. Die für MAP spezifische Insertionssequenz IS900 wurde nur bei dieser Subspezies nachgewiesen und jeder MAP-Organismus enthält 15-20 Kopien. Der Nachweis von IS900 mittels PCR ermöglicht eine schnelle und sichere Erregeridentifizierung (GREEN et al. 1989; THORESEN und OLSAKER 1994). MAP wird weiter unterteilt in zwei Genotypen:
- Typ I, der auch Sheep type oder Genotyp S genannt wird und
- Typ II, auch Cattle type oder Genotyp C genannt. Dieser Genotyp wird auch bei anderen Wiederkäuern als Rindern, z.B. Schafen nachgewiesen (BAUERFEIND et al. 1996).
Eine Differenzierung dieser beiden Genotypen kann mittels PCR aufgrund eines Polymorphismus der Insertionssequenz IS1311 durchgeführt werden (MARSH et al.
1999).
2.1.2. Erregereigenschaften/Pathogenitätsfaktoren
Bei MAP handelt es sich um ein nicht sporenbildendes und schwach grampositives Stäbchen von 0,5-1,5 µm Länge. Aufgrund seiner lipidreichen Zellwand ist dieses Bakterium säurefest, wenig permeabel und resistent gegen Austrocknung, saure Umgebung und einige Desinfektionsmittel (GIERKE und KOEHLER 2009). Zudem weist MAP eine hohe Resistenz gegen Hitze und Kälte auf (GIERKE und KOEHLER 2009). Im Boden, in Fäzes und in Wasser kann es mehrere Monate überleben (CHIODINI et al. 1984a). Der Erregernachweis mittels Ziehl-Neelsen-Färbung beruht auf der Säurefestigkeit des Bakteriums.
Der Erreger wächst in Kultur langsam, es dauert 8-12 Wochen bis Kolonien sichtbar sind und MAP benötigt wie andere Mykobakterien das Siderophor Mykobaktin zum Wachstum (FRANCIS et al. 1953; BARCLAY et al. 1985). Die Abhängigkeit von exogenem Mykobaktin in der Kultur kann auch zur Klassifizierung genutzt werden, allerdings existiert sie bis zu einem gewissen Grad auch bei Mycobakterium avium subsp. silvaticum (CLARKE 1997). Zur Anzucht werden üblicherweise eidotterhaltige Nährmedien mit Mykobaktinzusatz verwendet (MERKAL und CURRAN 1974). Bei den verschiedenen Erregerstämmen von MAP variiert das Vorkommen einer gelb- orangenen Pigmentierung im Nährboden der kulturellen Isolate.
2.1.3. Wirtsspektrum
Üblicherweise sind Haus- und Wildwiederkäuer von Paratuberkulose betroffen, Nicht- Wiederkäuer können sich mit MAP infizieren, allerdings nicht an Paratuberkulose
erkranken. Bei vielen Monogastriern wie Fuchs, Kaninchen, Stumpfschwanzmakaken und Hermelin wurde MAP nachgewiesen (AYELE et al. 2001). Schweine, Pferde und Hühner können ebenfalls infiziert werden, es treten aber keinen granulomatösen Läsionen und keine klinischen Symptome einer Paratuberkulose auf (LARSEN et al.
1971, 1972; LARSEN und MOON 1972).
Die Maus dient häufig als Modelltier in der Paratuberkuloseforschung. Bei experimenteller Infektion immundefizienter Mäuse treten granulomatöse Läsionen mit säurefesten Stäbchen auf (MUTWIRI et al. 1992; BLOOM 1994). Bei gesunden Mäusen treten nach oraler Infektion nur kleine Läsionen auf, wohingegen bei parenteraler Infektion ausgedehnte Veränderungen in Magen-Darm-Trakt, Leber, Milz und mesenterialen Lymphknoten sichtbar sind (VEAZEY et al. 1995; TANAKA et al. 1994). Auch bei Kaninchen wurden nach experimenteller und natürlicher Infektion typische Läsionen nachgewiesen (RANKIN 1958; MOKRESH et al. 1989; ANGUS 1990).
MAP steht zudem im Verdacht, Auslöser der Humanerkrankung Morbus Crohn (MC) zu sein. Hierbei handelt es sich um eine granulomatöse Enteritis. CHIODINI und Kollegen (1984b) wiesen erstmals MAP bei Patienten mit MC nach. Nachweislich ist eine Pasteurisierung von Milch nicht ausreichend für eine Erregerabtötung, womit eine Übertragung durch die Nahrung möglich wäre (CHIODINI und HERMON- TAYLOR 1993). Die Koch’schen Postulate für MAP als Auslöser von MC sind jedoch nicht erfüllt: Bei vielen MC-Patienten kann kein MAP isoliert werden und nicht alle Patienten haben einen erhöhten MAP-Antikörpertiter. SINGH und Mitarbeiter (2008) fanden bei 100% aller untersuchten MC-Patienten MAP-Antikörper, jedoch auch bei 75% aller Gesunden, die mit MAP-infizierten Tieren Kontakt hatten und 38 % aller Gesunden ohne Tierkontakt. Im Tierexperiment konnte durch Inokulation von MC- Gewebe bei Kaninchen, Meerschweinchen und Hühnern keine Paratuberkulose ausgelöst werden (VAN KRUININGEN 1999).
VAN KRUININGEN (1999) weist darauf hin, dass trotz vieler Gemeinsamkeiten der beiden Krankheitsbilder auch deutliche Unterschiede zwischen Paratuberkulose und MC bestehen. Sowohl bei MC als auch bei Paratuberkulose handelt es sich um Krankheiten mit langer Inkubationszeit und einem langen Krankheitsverlauf. Neben einem ausgeprägten Darmtropismus sind in beiden Fällen tuberkuloide Granulome, Lymphangitis und fokale Ulzerationen der Peyerschen Platten typische Merkmale.
Jedoch ist MC im Gegensatz zur Paratuberkulose nicht auf den Darm beschränkt, auch extraintestinale Merkmale wir Arthritis, Spondylitis, Stomatitis u.a. gehören häufig zum Krankheitsbild. Das Zoonosepotential von MAP und ein Kausalzusammenhang mit MC bleiben weiterhin umstritten (WADDELL et al. 2008).
2.2. Paratuberkulose 2.2.1. Pathogenese
Der Hauptinfektionsweg bei Paratuberkulose ist die orale Aufnahme von Fäzes bzw.
von fäkal kontaminierter Milch oder Kolostrum. Seltener ist eine direkte Infektion mit Erregern aus Milch, Kolostrum oder durch eine intrauterine Übertragung (COCITO et al. 1994; MERKAL und CURRAN 1974). Makrophagen sind für MAP die Targetzellen, selten werden in vitro auch Erreger in Enterozyten nachgewiesen
(BERMUDEZ und YOUNG 1994). Das Mykobakterium wird durch die Darmmukosa transloziert, indem es per Endozytose durch die M-Zellen der Peyerschen Platten des Ileums hindurch gelangt (MOMOTANI et al. 1988). Anschließend wird MAP von den sub- und intraepithelialen Makrophagen phagozytiert (VALENTIN-WEIGAND und GOETHE 1999). Experimentell oral verabreichtes MAP ist nach wenigen Stunden in Darmmakrophagen nachweisbar (VALENTIN-WEIGAND und GOETHE 1999).
Mehrere Mechanismen ermöglichen es MAP, die Makrophagenaktivierung zu hemmen und die Abwehrmechanismen der Zelle zu umgehen und so im Makrophagen zu überleben.
- Mit MAP-infizierte Makrophagen von Ziegen exprimieren weniger Complement-Rezeptor 3 sowie weniger MHC-I und MHC-II, wodurch die Antigen-Präsentation und somit die T-Zell-Antwort gehemmt wird (VALHEIM et al. 2004).
- Der Erreger ist darüber hinaus in der Lage, die Expression des Antigen- präsentierenden Moleküls CD1 auf T- Zellen zu reduzieren (STENGER et al.
1998; REDDACLIFF et al. 2004). Durch diesen „Escape“-Mechanismus wird die Erkennung von MAP durch das Immunsystem gehemmt.
- Intrazellulär im Makrophagen verbleibt MAP hauptsächlich in Phagosomen und ist mehrere Wochen lebensfähig. Wie der Erreger in den Phagosomen in einem Milieu von sauren pH, Proteasen und antibakteriellen Substanzen, wie z.B. Sauerstoffradikalen überlebt, ist nicht vollständig geklärt. Nach einer Infektion kommt es nachweislich zu einer deutlich reduzierten Phagosom- Lysosom-Fusion in Monozyten und einer geringeren Ansäuerung der Phagosomen (WEISS et al. 2004; WOO et al. 2007). Andere Mykobakterien modifizieren ebenfalls die Ansäuerung der Phagosomen, die lysosomale Enzymaktivität und supprimieren die Antwort der Makrophagen auf aktivierende Zytokine (STURGILL-KOSZYCKI et al. 1994; CLEMENS 1995).
- Eine MAP-Infektion resultiert außerdem in einem erhöhten Level von IL-10, welches die aktivierten Makrophagen hemmt (KHALIFEH und STABEL 2004;
WEISS et al. 2002).
- Zudem wird die Makrophagenaktivierung durch einen Anstieg von TGF-ß verhindert. MUNOZ und Kollegen (2009) belegen den Anstieg von TGF-ß in Geweben mit fortgeschrittenen pathohistologischen Läsionen.
- Da die T-Zellen gehemmt werden, wird auch weniger IFN-γ freigesetzt, welches für die Aktivierung von Makrophagen zuständig ist (STABEL 2000;
WEISS et al. 2002).
- LEI und Mitarbeiter (2008) wiesen zudem nach, dass dendritische Zellen in MAP-induzierten Läsionen häufig nicht ausgereift sind und daher zur Antigen- Präsentation nicht in der Lage sind.
Wie genau es dem Erreger gelingt, in den Makrophagen lange Zeit zu überleben und sich zu replizieren, bedarf noch weiterer Untersuchungen und ist Gegenstand vielfältiger Spekulationen (WOO und CZUPRYNSKI 2008). Zu Beginn der Infektion ist der Wirt vermutlich noch in der Lage, eine massive intrazelluläre Vermehrung von MAP zu verhindern, was die lange Inkubationszeit von Paratuberkulose beweist (WOO und CZUPRYNSKI 2008).
Die Infektion beginnt bei Schaf und Ziege in den Peyerschen Platten von Jejunum, Ileum und Zäkum und es entsteht nach einer langen Inkubationszeit eine chronische Enteritis. Eine solche Infektion kann sich durch wiederholte Aufnahme des Erregers oder durch langsame Vermehrung einmal aufgenommener Mykobakterien ausweiten. Erste granulomatöse Läsionen in Peyerschen Platten und Lymphknoten sind bei Schaflämmern und Kälbern 1,5-3 Monate nach Infektion nachweisbar (VALENTIN-WEIGAND und GOETHE 1999). Von dort breiten sich die Läsionen v.a.
ins terminale Ileum aus. Die genaue Pathogenese dieser Entzündungsreaktion bei MAP muss noch eingehender untersucht werden.
2.2.2. Pathologische Veränderungen
Bei der Paratuberkulose handelt es sich um eine sich langsam-entwickelnde Infektionskrankheit, charakterisiert durch chronische granulomatöse Enterokolitis, regionale Lymphangitis und Lymphadenitis (CLARKE 1997). Mehrere Autoren haben bereits eine Einteilung in verschiedene Formen der pathologischen und histologischen Veränderungen beschrieben. Es werden beim Schaf zwei Hauptformen der Darmveränderungen unterschieden (CLARKE und LITTLE 1996):
- Eine multibazilläre, auch leproid genannte Form. Hier sind mit Mykobakterien gefüllte Makrophagen die Hauptentzündungszellen.
- Eine paucibazilläre, auch tuberkuloid genannte Form. In diesem Fall besteht das Entzündungsinfiltrat v.a. aus Lymphozyten und einigen Makrophagen mit wenigen oder keinen Bakterien. Bei Schafen ohne klinische Symptome finden sich auch kleine tuberkuloide Granulome in den Peyerschen Platten.
COPRA und Mitarbeiter (2000b) klassifizieren die Formen der natürlich auftretenden Paratuberkulose bei Ziegen und unterscheiden fokale Läsionen, diffuse multibazilläre Läsionen, diffuse lymphozytäre Läsionen und eine gemischte Form.
- Fokale Läsionen treten bei 11,7% der untersuchten Ziegen auf. Es finden sich kleine Granulome bestehend aus Makrophagen. Diese Granulome sind zu wenige an der Zahl, um eine Enteritis auszulösen und befinden sich im ileocaecalen lymphatischen Gewebe und bei einigen Tieren auch in der Mukosa der ileocaecalen Klappe sowie sporadisch auch in der Lamina Propria des Ileums. Ebenfalls betroffen sind Cortex und Paracortex von Mesenterial- und Ileocaecallymphknoten. Nicht immer können Mykobakterien nachgewiesen werden.
Fokale Läsionen sind möglicherweise die Anfangsstadien der Erkrankung, sie wurden bei experimenteller Infektion von Schaf und Ziege in der Anfangsphase gefunden. Es ist denkbar, dass sie auch latente persistierende Läsionen repräsentieren. Diese Form der fokalen Läsionen ist beim Schaf häufiger als bei der Ziege.
- Diffuse multibazilläre Läsionen finden sich bei 25% der untersuchten Ziegen.
Es tritt diffuse granulomatöse Enteritis auf, histologisch nachweisbar sind Gruppen von Makrophagen, Lymphozyten und Langerhansschen Riesenzellen, die diffus in der Mukosa von Ileum und Jejunum verteilt sind. In den Peyerschen Platten treten sie entweder als gut begrenzte Granulome auf oder diffus das lymphatischen Gewebe infiltrierend. Die Entzündung verursacht hier eine Verdickung der Lamina Propria, häufig einhergehend mit
Nekrosen in der Submukosa, Lymphangitis und -angiektasie sowie einer diffusen oder multifokalen granulomatösen Lymphadenitis. Bei einem Teil der Tiere treten auch verkäsende Nekrosen mit Kalzifizierungen in den Lymphknoten auf. Ein Nachweis von Mykobakterien gelingt immer. Es handelt sich um die am häufigsten auftretende Form der Paratuberkulose.
- Diffuse lymphozytäre Läsionen werden bei 7,4% der Ziegen festgestellt. Es zeigt sich eine diffuse granulomatöse Enteritis mit anderen Zelltypen als bei der multibazillären Form. In der Darmmukosa finden sich v.a. Lymphozyten und in der Lamina Propria einige Makrophagen und Langerhanssche Riesenzellen. In den anderen Darmschichten und in den Mesenteriallymphknoten ist der histologische Befund wie bei einer multibazilläre Form, es treten Nekrosen mit und ohne Kalzifizierung auf. Oft sind keine Mykobakterien nachweisbar. Diese Form ist vergleichbar mit der paucibazillären Form beim Schaf.
- Die diffuse gemischte Form tritt bei 5,9% der Ziegen auf und zeigt sich als diffuse granulomatöse Enteritis mit vielen Lymphozyten und Makrophagen.
Mykobakterien sind nicht immer nachweisbar.
Die restlichen 50% der teils gesunden teils kranken Ziegen wiesen gar keine Läsionen auf.
TAFTI und RASHIDI (2000) untersuchten ebenfalls pathologische Veränderungen bei Ziegen. Den Autoren zufolge treten Verkäsungen und Kalzifizierungen nur in den Lymphknoten auf und ein Mykobakteriennachweis gelingt v.a. in Darmmakrophagen, selten in den Makrophagen der Mesenteriallymphknoten. Allgemein finden sich vergrößerte und ödematisierte Mesenteriallymphknoten, insbesondere betroffen sind die ileocaecalen Lymphknoten, und eine verdickte Darmmukosa. Unterteilt wird hier in eine milde, eine moderate und eine schwerwiegende Form.
- Bei der milden Form finden sich histologisch fokale Ansammlungen von Makrophagen mit säurefesten Stäbchen in der Ziehl-Neelsen-Färbung in der Lamina Propria insbesondere des Ileums und in den Lymphknoten.
- Die moderate Form ist charakterisiert durch Makrophagen (mit säurefesten Stäbchen), Lymphozyten, eosinophile Granulozyten und Plasmazellen in oberer und tiefer Lamina Propria und Lymphknoten. Die Villi sind häufig atrophiert.
- Bei der schwerwiegenden Form treten Aggregate mit vielen Makrophagen, einigen Langerhansschen Riesenzellen, vielen Lymphozyten und Plasmazellen sowie eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der gesamte Lamina Propria auf. Häufig kommt es zur granulomatösen Lymphangitis und in den Lymphknoten finden sich Ansammlungen von Makrophagen und Langerhansschen Riesenzellen zudem verkäsende Nekrosen und Kalzifizierungen.
MEYER (2011) beschrieb die klinischen und pathologischen Befunde bei Ziegenlämmern ein Jahr nach experimenteller, oraler Inokulation mit MAP. Bei 5 der 27 untersuchten Ziegen war eine granulomatöse Lymphangitis bereits makroskopisch zu erkennen. 23 Ziegen hatten histologisch sichtbare granulomatöse Veränderungen in den Lymphknoten und 20 der 27 Ziegen entsprechende Veränderungen im Darm. Hauptlokalisation dieser Läsionen waren Jejunum, die Peyerschen Platten im Jejunum, im Lymphgewebe des Ileozäkaleingangs und im
proximalen Kolon. Die Läsionen der experimentell infizierten Ziegen waren zumeist multifokale granulomatöse Infiltrate während bei den Ziegen mit Feldinfektionen aus der Vergleichsgruppe zumeist diffuse granulomatöse Infiltrate auftraten (MEYER 2011).
2.2.3. Klinik
JOHNE und FROTHINGHAM (1895) beschreiben erstmals Paratuberkulose bei einem Rind mit chronischer Enteritis und verdickter, gewellter Darmschleimhaut sowie säurefesten Bakterien in den Läsionen. Sie bezeichnen dies als „sonderbaren Fall von Tuberkulose“. BANG (1906) stellt wenige Jahre später fest, dass es sich bei der neubeschriebenen Krankheit nicht um Tuberkulose handelt und benennt sie um in Johnesche Krankheit und Pseudotuberkulose. Wenig später wird die Bezeichnung Paratuberkulose geprägt.
Beim kleinen Wiederkäuer besteht das klinische Bild der Paratuberkulose vor allem aus chronisch progressivem Gewichtsverlust bei weiterbestehender Futteraufnahme (CLARKE 1997). Weitere Symptome sind ungeformter Kot, selten Diarrhoe, normochrome Anämie, Hypoproteinämie, Fell- und Hautveränderungen, Abnahme der Milchleistung, Lethargie und Festliegen.
Die Abmagerung der klinisch kranken Tiere erfolgt aufgrund von Proteinmalabsorption und Proteinverlusten über den entzündlich veränderten Darm (ALLEN et al. 1974). Die Tiere nehmen weiterhin normale Mengen Futter auf und in einem Großteil der Fälle bleibt der Kot unverändert. Im Gegensatz zu an Paratuberkulose erkrankten Rindern, die im klinischen Stadium meist unter einer wässrig, schaumigen Diarrhoe leiden, treten bei kleinen Wiederkäuern sehr viel seltener Durchfälle auf. Vermutlich ist dies der Fähigkeit der kleinen Wiederkäuer geschuldet, große Mengen Wasser im Dickdarm reabsorbieren zu können. Nur bei 10-20% der Tiere tritt chronische Diarrhoe im fortgeschrittenen Stadium auf (GREIG 2000; STEHMAN 1996). Der Kot wird in diesen Fällen weicher und ungeformt, anfangs mit wechselnder Konsistenz, selten gegen Ende dünnflüssig. Es handelt sich hierbei um eine nicht-hämorrhagische und nicht-mukoide Diarrhoe (CLARKE 1997). CLARKE und LITTLE (1996) vermuten, dass eine chronische Diarrhoe v.a. in Fällen mit Läsionen im Dickdarm auftritt, durch welche die Wasserresorption beeinträchtigt wird. Häufig leiden die Tiere auch unter einer Koinfektion mit Endoparasiten, welche ebenfalls Diarrhoe verursachen können (SCHROEDER et al.
2001). CLARKE (1997) stellte fest, dass der Grad der intestinalen Läsionen häufig nicht mit dem Vorkommen klinischer Symptome korreliert und einige Fälle mit ernsthaften klinischen Symptomen nur geringgradige makroskopische Veränderungen des Darmes aufwiesen.
An Paratuberkulose erkrankte Schafe und Ziegen entwickeln eine normochrome Anämie und Hypoproteinämie. Totalprotein und Serumalbumin sind verringert, während Serumglobulin meist normale Werte aufweist (SCOTT et al. 1995). Die Hypoproteinämie entsteht durch den Verlust von Plasmaprotein über die Darmmukosa. Einige Tiere entwickeln hierdurch auch submandibuläre Ödeme. In einer Untersuchung von MEYER (2011) erwiesen sich die hämatologischen Befunde des weißen Blutbildes bei experimentell mit MAP infizierten Ziegenlämmern als ungeeignet um während der Inkubationszeit eine Infektion zu erkennen.
Tiere mit einer klinischen Paratuberkulose fallen zudem durch glanzloses und trockenes Fell bzw. Wolle, Alopezie, schuppige Haut bei Ziegen sowie selten durch eine Depigmentierung der Haut auf (RADOSTITS und ARUNDEL 2000).
Die klinischen Symptome können durch Stress wie z.B. Ablammen, Transport oder den Wechsel in eine neue Herde verstärkt werden (GREIG 2000). Sie treten bei Schaf und Ziege erst im Alter von 2-7 Jahren, sehr selten bereits innerhalb des ersten Lebensjahres auf (PUGH 2002). Somit beginnt der Krankheitsverlauf beim
kleinen Wiederkäuer i.d.R. früher als beim Rind.
COCITO (1994) teilt den Krankheitsverlauf in drei klinische Stadien ein.
- Stadium 1: Subklinisch und ohne nachweisbare Erregerausscheidung - Stadium 2: Subklinisch, aber Erreger vermehrt in Darmmukosa und -lumen
nachweisbar sowie Ausscheidung von MAP
- Stadium 3: Klinisch und Ausscheidung von MAP, Symptome wie Abmagerung, geringere Milchleistung, Ödeme und Anämie selten Aborte und Alopezie, schließlich Festliegen
Werden die Tiere nicht schon vorher getötet, so verenden sie durch Kachexie (COCITO et al. 1994).
Durch die unspezifischen Symptome ist die Diagnosefindung schwierig. Zudem sind asymptomatische Träger in einer Herde weitaus zahlreicher als Tiere mit klinischen Symptomen (VAN METRE et al. 2000).
Zu den Differentialdiagnosen zählen alle Erkrankungen, die zu einer chronisch- progressiven Abmagerung führen: Zahnprobleme, Endoparasitosen, Mangelernährung, Leberegelbefall, Caprines-Arthritis-Encephalitis-Virus (CAEV) bei der Ziege, Scrapie, Pneumonien sowie chronische renale oder hepatische Erkrankungen (VAN METRE et al. 2000).
2.2.4. Verbreitung und Epidemiologie
Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete Erkrankung und weist in einigen Ländern mit intensiver Haltung von Rindern und kleinen Wiederkäuern eine steigende Prävalenz auf (AYELE et al. 2001). In Europa gibt es verhältnismäßig wenige Studien zur Prävalenz von MAP bei Schaf und Ziege. Aufgrund der langen Inkubationszeit, des großen Anteils infizierter Tiere ohne klinische Symptome und der schwierigen Diagnostik wird die Prävalenz tendenziell unterschätzt (WHITTINGTON und SERGEANT 2001).
In Tabelle 1 ist ein Teil der Studien zu Herden- und Einzeltierprävalenz aufgeführt.
Durch die begrenzte Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig zu Verfügung stehenden diagnostischen Verfahren weichen die ermittelten Prävalenzen stets von den wahren Prävalenzen ab (NIELSEN und TOFT 2009).
Tab. 1: Herden- und Einzeltierprävalenzen in verschieden europäischen Ländern
Spezies Land Herden-
prävalenz
Einzeltier- prävalenz
Literaturquelle
Schaf Deutschland
(Nordrhein-Westfalen)
54% 3% (VOGEL et al.
2005)
Ziege Frankreich 55,20% 2,90% (MERCIER et al.
2010)
Ziege Großbritannien 1% K.A. (NIELSEN und
TOFT 2009)
Schaf Großbritannien 0% K.A. (NIELSEN und
TOFT 2009)
Schaf Kroatien K.A. 0,60% (NIELSEN und
TOFT 2009)
Ziege Norwegen K.A. 1,10% (NIELSEN und
TOFT 2009)
Schaf Norwegen K.A. 0,30% (NIELSEN und
TOFT 2009)
Schaf Österreich K.A. 0,60% (NIELSEN und
TOFT 2009) Schaf und Ziege
gemischt
Portugal (Region Lissabon)
27% 1,70% (NIELSEN und
TOFT 2009)
Schaf Portugal (Region
Nord-Osten)
46,70% 3,70% (COELHO et al.
2007)
Ziege Schweiz 23% K.A. (NIELSEN und
TOFT 2009)
Schaf Schweiz 24% K.A. (NIELSEN und
TOFT 2009) Schaf und Ziege
gemischt
Slowenien 12% 3,50% (NIELSEN und
TOFT 2009)
Ziege Zypern 50,00% K.A. (LIAPI et al.
2011)
Schaf Zypern 52,00% K.A. (LIAPI et al.
2011)
Die Tiere infizieren sich in der Regel kurz nach der Geburt mit MAP. Die Hauptinfektionsroute ist die orale Aufnahme von Kot infizierter Tiere, bzw. der Kontakt mit fäkal kontaminierten Zitzen oder Milch (SWEENEY 1996). Der Erreger wird ebenfalls über Milch, Kolostrum und Sperma ausgeschieden, daher können sich Lämmer auch über die Aufnahme infizierten Kolostrums oder Milch anstecken (SWEENEY 1996). Eine Übertragung durch den Deckakt wurde nie nachgewiesen.
Intrauterine Infektionen sind möglich, aber sehr selten und kommen meist nur bei klinisch kranken Muttertieren mit ebenfalls starker fäkaler Erregerausscheidung vor (SWEENEY et al. 1992).
Risikofaktoren für eine Infektion mit MAP sind neben jungem Lebensalter eine hohe Bakterienanzahl, eine intensive Haltung, saure Böden, Mangelernährung, Stress
aufgrund von Transport, Laktation oder Ablammen und Immunsuppression durch Co- Infektionen (GIERKE und KOEHLER 2009; CHIODINI et al. 1984a; CLARKE 1997;
RADOSTITS und ARUNDEL 2000).
2.2.5. Diagnostische Verfahren 2.2.5.1. Nachweis der Immunantwort
Da die zellvermittelte Immunantwort und die fäkale Ausscheidung stets der humoralen Immunantwort vorrausgehen, werden mithilfe von serologischen Tests nur Tiere in späteren Infektionsverlauf erkannt (STEHMAN 1996).
2.2.5.1.1. Nachweis der humoralen Immunantwort: ELISA
Beim ELISA handelt es sich um die am weitetesten verbreitete Nachweismethode in der Paratuberkulose-Diagnostik. Meist wird dieses Nachweisverfahren in der Herdendiagnostik eingesetzt, bei der Einzeltierdiagnostik sollte eine Nachuntersuchung mittels Kotkultur erfolgen (ROBBE-AUSTERMAN 2011).
Der positive Nachweis infizierter Tiere im ELISA ist offenbar abhängig vom Krankheitsstadium, bei klinischen Fällen ist die Sensitivität mit 85% deutlich höher als bei subklinischen (15%) (AYELE et al. 2001). Um unspezifische Antikörper gegen andere Mykobakterien, Nocardien und andere verwandte Bakterien zu binden und so Kreuzreaktionen zu vermeiden, wird Mycobacterium phlei verwendet (NIELSEN et al.
2001).
Beim Schaf beträgt die Spezifität von Serum-ELISA 0,95-1,0 und die Sensitivität 0,16-0,85. Bei der Ziege liegen die Spezifität bei 0,79-1,0 und die Sensitivität bei 0,54-1,0 (NIELSEN und TOFT 2008).
2.2.5.1.2. Nachweis der humoralen Immunantwort: Agar Gel Immuno- diffusionstest (AGID)
Der AGID hat eine geringere Sensitivität als ELISA und CFT (NIELSEN et al. 2001;
HILBINK et al. 1994). Er wird in der Regel zur Bestätigung der Diagnose Paratuberkulose bei klinisch kranken Tieren verwendet und hat eine hohe Spezifität von über 0,9 bei Rindern mit fortgeschrittener Erkrankung, d.h. mit klinischen Symptomen (AYELE et al. 2001).
Beim Schaf beträgt die Spezifität 0,97-1,0 und die Sensitivität 0,87-1,0 (HILBINK et al. 1994). Bei der Ziege hat der AGID eine Sensitivität von 0,86 (STEHMAN 1996).
2.2.5.1.3. Nachweis der humoralen Immunantwort: Komplementbindungs- reaktion (KBR)
Die KBR erkennt MAP-spezifische Antikörper ca. 1-5 Monate später als der ELISA und wird wegen ihrer mittleren Sensitivität und Spezifität nicht mehr für die Routinediagnostik empfohlen (AYELE et al. 2001). Sie weist allgemein eine geringere Genauigkeit als ELISA und AGID auf (RIDGE et al. 1991). In einigen Ländern ist die KBR jedoch für Tierimporte und -exporte erforderlich. Die hierbei verwendeten Antigene für die Assays unterscheiden sich je nach Land (AYELE et al.
2001).
Die Spezifität bei Schafen liegt bei 0,96-1,0 und die Sensitivität bei klinisch kranken Schafen bei 0,87-1,0 (HILBINK et al. 1994).
2.2.5.1.4. Nachweis der zellulären Immunantwort: Hauttests
Hauttests, auch Tests für delayed type hypersensitivity (DTH) genannt, werden häufig zur Diagnostik der Bovinen Tuberkulose verwendet. Ähnlich zum Tuberkulin Test wird bei der Paratuberkulose-Diagnostik interdermal MAP inokuliert. Oft wird Johnin (MAP-Extrakt) auch durch aviäres Tuberkulin von Mycobacterium avium subsp. avium ersetzt. Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn die Hautdicke innerhalb von 24-72 Stunden um über 4mm zunimmt. Dieses Verfahren wird wegen der geringen Spezifität nicht für die Routinediagnostik empfohlen (CHIODINI et al.
1984a; COCITO et al. 1994; COLLINS 1996). Die Spezifität liegt bei 0,79 und die Sensitivtät bei 0,54 (SOHAL et al. 2007). Es liegt keine Speziesspezifität vor.
2.2.5.1.5. Nachweis der zellulären Immunantwort: Interferon-gamma-Test (IFN-γ-Test)
Das Prinzip des Interferon-gamma-Nachweises ist ähnlich dem des Hauttests, er wird allerdings in vitro durchgeführt. INF-γ wird von den Lymphozyten bereits infizierter Tiere freigesetzt, wenn diese mit MAP-Antigenen stimuliert werden. Der Nutzen dieses Nachweisverfahrens ist aufgrund der unspezifischen Reaktionen und der schwierigen Interpretation begrenzt (COLLINS und ZHAO 1995; MCDONALD et al. 1999). Es wird daher und aufgrund des erhöhten Zeitaufwandes v.a. in der Forschung verwendet und weniger in der Routinediagnostik (MANNING und COLLINS 2001).
Weitere Diagnostische Verfahren zur zellulären Immunantwort sind der Lymphozyten-Transformationstest und der Migration Inhibition Test (AYELE et al.
2001).
2.2.5.2. Erregernachweis 2.2.5.2.1. Kultur
Der kulturelle Nachweis von MAP gilt als „Goldstandard“ der Diagnostik und ist die am weitesten verbreitete Nachweismethode (NIELSEN et al. 2001). In der Regel werden Kot- oder Gewebeproben von Darm oder mesenterialen Lymphknoten verwendet, aber auch die Kultur aus Milch- oder Blutproben ist möglich. Die Anzucht erfolgt auf Medien mit Mykobaktin, am häufigsten verwendet werden Herrold’s Egg Medium oder modifiziertes Löwenstein-Jensen-Medium (WHIPPLE et al. 1991;
JØRGENSEN 1982). Ein Dekontaminierungsschritt ist notwendig, um Darmflora u.a.
aus dem Probenmaterial zu eliminieren (RIDGE 1993; de LISLE et al. 1980).
Die Nachteile des kulturellen Nachweises sind die hohen Kosten und das langsame Wachstum von MAP (5-16 Wochen). Jedoch ist dieser Test zu 100% spezifisch. Die Sensitivität ist bei Gewebeproben höher als bei Kotkulturen, da gerade Tiere mit der paucibazillären Form der Paratuberkulose wenig Erreger ausscheiden. Auch bei der Blutkultur ist der Nachweis im frühem Krankheitsstadium und paucibazillären Läsionen schwierig, da eine Bakteriämie meist nur intermittierend ist (BOWER et al.
2011).
2.2.5.2.2. Radiometrische Kultur (BACTEC)
Das Testprinzip wurde adaptiert vom Mycobacterium tuberculosis-Nachweis beim Menschen und kann nach Modifikation für den MAP-Nachweis verwendet werden
(COLLINS et al. 1990). Stoffwechselprodukte des Bakterienstoffwechsels werden mit
14Cäsium markiert, hierdurch ist eine schnellere Erkennung als mit konventioneller Kultur möglich.
Mittels der radiometrischen Kultur kann MAP in geringeren Mengen und schneller erkannt werden, nachteilig sind jedoch die höheren Kosten und der Umgang mit Radioisotopen im Labor (COLLINS et al. 1990; SOCKETT et al. 1992).
2.2.5.2.3. PCR
Bei der MAP-PCR wird die spezifische Insertionssequenz IS900, bzw. deren 5’Ende erkannt (MOSS et al. 1991). Der Nachweis ist schnell, da kein Wachstum des Erregers notwendig ist, jedoch handelt es sich um eine vergleichsweise teure Diagnostik.
Die Sensitivität der PCR wird beeinträchtigt durch die besonders in Kotproben enthaltenen Inhibitoren und die schwierige DNA-Aufbereitung (GARRIDO 2000). Die PCR von Gewebe (z.B. Darm, mesenteriale Lymphknoten) erwies sich als sensitiver als die Kot-PCR (STEVENSON und SHARP 1997). Blut und Milch sind als Probenmaterial ebenfalls möglich, werden allerdings selten verwendet. Die Kot-PCR hat beim Schaf eine Sensitivität von 0,94 und eine Spezifität von 0,92 (GARRIDO 2000). Laut KAWAJI und Kollegen (2011) ist die real time quantitative PCR bei Schafen sensitiver als die Kotkultur.
2.2.5.2.4. Mikroskopischer Nachweis
Verwendet werden im mikroskopischen Erregernachweis meist Kotproben oder Mesenteriallymphknoten. Die Anfärbung erfolgt mittels Ziehl-Neelsen-Färbung. Ein positives Ergebnis steht bei Nachweis von mykobakteriellen Ansammlungen in granulomatösen Läsionen fest (COCITO et al. 1994). Diese Nachweismethode ist schnell und wird meist im Anschluss an Sektionen angewandt. Für Herdenscreenings ist sie aufgrund der aufwendigen Probenentnahme ungeeignet, aber sie eignet sich zur Bestätigung bei Tieren mit Abmagerung (STEVENSON und SHARP 1997). Die Bakterioskopie kann nicht alleinig zur Diagnostik verwendet werden, da sie keine Unterscheidungsmöglichkeit zwischen MAP und anderen Mykobakterien bietet.
Die Genauigkeit ist abhängig von der Bakteriendichte im Probenmaterial und dem Krankheitsstadium. Leider ist sie im subklinischen Stadium, wenn eine Identifikation der positiven Tiere am wichtigsten ist, eher gering (RIS et al. 1988). Bei Bakterioskopie mit Ziehl-Neelsen-Färbung liegt die Sensitivität bei 0,36 (ZIMMER et al. 1999).
2.2.5.2.5. Fleischbeschau
Die alleinige pathomorphologische Diagnostik im Schlachthof ist sinnvolles Instrument zur Herdenüberwachung. Wichtig ist eine entsprechende Schulung der Fleischbeschauer, um typische Läsionen nach der Schlachtung zu erkennen. In zwei australischen Untersuchungen lag die Sensitivität in Schlachthöfen bei oviner Paratuberkulose 0,53-0,87 und die Spezifität bei 0.97-1,0 (ABBOTT und WHITTINGTON 2003; BRADLEY und CANNON 2005). Bei Chargen mit hoher Paratuberkulose-Prävalenz stieg die Sensitivität.
2.2.6. Bekämpfung
Wichtigster Faktor der Paratuberkulose-Bekämpfung ist die Prävention von Neuinfektionen. Hierbei sind zwei Hauptstrategien zu verwirklichen: Zum einen sollte durch optimales Management die Hygiene im Betrieb verbessert werden, um Jungtiere möglichst wenig Erregern auszusetzen und zum anderen sollte die Anzahl der infizierten, MAP-ausscheidenden Tiere reduziert werden (MCKENNA et al.
2006).
Zu den Hygienemaßnahmen zählen die Einrichtung möglichst sauberer Ablammbereiche und getrennter Weiden für Jungtiere, die auch nicht zuvor von möglicherweise infizierten Alttieren beweidet wurden (GIERKE und KOEHLER 2009;
STEHMAN 1996). Allgemein sollten Jungtiere solange und sobald wie möglich von den potentiell MAP-ausscheidenden Alttieren getrennt gehalten werden und es sollte auf saubere Futter- und Wassertröge geachtet werden (ROBBE-AUSTERMAN 2011). Eine mutterlose Aufzucht ist ebenfalls sinnvoll. Kolostrum und Milch können von nachweislich MAP-negativen Tieren stammen oder hitzebehandelt werden. Die Hitzebehandlung von Kolostrum bei 56-59°C über 60 Minuten tötet nicht alle MAP- Bakterien ab, reduziert deren Anzahl aber stark. Bei Temperaturen über 59°C werden viele Immunglobuline zerstört und das Kolostrum wird zu viskös für eine Fütterung (FERNÁNDEZ et al. 2006; GODDEN et al. 2006; ARGÜELLO et al. 2003).
Milch sollte pasteurisiert werden, entweder bei 63°C über 30 Minuten oder bei 72°C über 15 Sekunden.
Um die Zahl der MAP-Ausscheider in der Herde zu reduzieren, wird empfohlen, möglichst nur Eigenremontierung zu betreiben und ansonsten nur Tiere aus nachweislich negativen Herden zuzukaufen (STEHMAN 1996). Wichtig sind die regelmäßige Testung und die konsequente Merzung von Ausscheidern und klinisch kranken Tieren (GIERKE und KOEHLER 2009). Diese Tiere sollten so früh wie möglich geschlachtet werden, auf jeden Fall noch vor der Ablammperiode (ROBBE- AUSTERMAN 2011). Die Häufigkeit der Testungen ist abhängig von den finanziellen Mitteln und der Zielsetzung: Eine Kontrolle der Paratuberkulose mit Reduktion der Prävalenz ist oft wirtschaftlich sinnvoller als der Versuch der vollständigen Eliminierung von MAP aus Herde (STEHMAN 1996). Laut einer Untersuchung von LU und Mitarbeitern (2008) in Milchrindbetrieben genügt zur Kontrolle der Paratuberkulose bei einem guten Herdenmanagement die Merzung der starken Ausscheider. Die Wahl des Diagnostikums resultiert aus der geplanten Stichprobengröße. Für ein Herdenscreening mittels ELISA benötigt man für eine 95%iger Sicherheit eine Stichprobengröße von 610 Tieren, bei der mikrobiellen Kultur hingegen nur 41 Tiere je Herde (DONAT et al. 2012). Daher sind serologische Testsysteme nur für die Diagnostik in großen Beständen geeignet und wirtschaftlich sinnvoll (DONAT et al. 2012).
In der Hobbyhaltung von Schaf und Ziege bleiben subklinische, ältere Tiere meist sehr lange in der Herde. Wenn die Schlachtung hier keine Option ist, sollte Jung- und Alttiere strikt getrennt aufgestallt werden (ROBBE-AUSTERMAN 2011).
Ein weiteres bisher selten eingesetztes Mittel zur Prävention ist die Chemoprophylaxe (FECTEAU und WHITLOCK 2011). Nachweislich reduziert die Zufütterung von antimikrobiellen Substanzen wie dem Ionophor Monensin die MAP- Ausscheidung und die Ausbildung von typischen pathomorphologischen Veränderungen (BRUMBAUGH et al. 2004). Des Weiteren senkt Gallium in vitro und
in vivo beim Kalb die MAP-Keimzahl. Es sind noch weitere Untersuchungen über den therapeutischen und prophylaktischen Nutzen vonnöten (FECTEAU und WHITLOCK 2011).
Die Paratuberkulose-Kontrolle durch Impfung wird im folgenden Abschnitt erläutert.
In Deutschland wurden 2005 die „Leitlinien für den Umgang mit Paratuberkulose in Wiederkäuerbeständen“ veröffentlicht (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ, ERNÄHRUNG UND LANDWIRTSCHAFT 2005).
Hierdurch sollen Bekämpfungsmaßnahmen bundesweit vereinheitlicht werden (GIERKE und KOEHLER 2009). Die Leitlinien bestehen aus 3 Abschnitten:
- Allgemeine Hygienemaßnahmen wie z.B. Stallhygiene, mutterlose Aufzucht, Aufzucht in festen Gruppen, Kolostrummanagement, möglichst Eigenremontierung und Schlachtung klinisch auffälliger Tiere,
- Bestandsüberwachung und
- Vorbereitung einer bundesweiten Überwachung und Erfassung der Paratuberkulose.
2.2.7. Impfung
Erste Impfungen gegen Paratuberkulose wurden 1926 von Vallee und Rinjard mittels eines attenuierten Lebendimpfstoffs bei Rindern durchgeführt (ROSSEELS und HUYGEN 2008). Es wurden für ovine und bovine Paratuberkulose verschiedene attenuierte Lebendimpfstoffe und Totimpfstoffe auf den Markt gebracht. Für gewöhnlich werden mineralölhaltige Adjuvanzen verwendet. Alle derzeit international erhältlichen Impfstoffe reduzieren das Auftreten klinischer Symptome und die Erregerausscheidung, sie bieten aber keinen Schutz gegen eine Neuinfektion und es sind bis dato noch keine Markerimpfstoffe vorhanden (ROSSEELS und HUYGEN 2008). In Deutschland ist derzeit kein Paratuberkuloseimpfstoff zugelassen.
Der optimale Impfzeitpunkt bei kleinen Wiederkäuern wird kontrovers diskutiert. Da sich Lämmer schon bald nach der Geburt mit MAP infizieren, empfehlen einige Autoren eine Impfung möglichst frühzeitig, am besten bereits in den ersten Lebenswochen (LARSEN et al. 1964; SAXEGAARD und FODSTAD 1985). JUSTE und PEREZ (2011) betonen hingegen die Vorteile eines späteren Impfzeitpunkts nach mehreren Lebensmonaten: das ausgereifte Immunsystem und das leichtere und ökonomischere Management, da mehr Zeit für die Auswahl der zu impfenden Tiere besteht. CORPA und Mitarbeiter (2000a) wiesen den positiven Effekt der Impfung auch bei adulten Ziegen nach. Die geimpften Tiere zeigten im Vergleich zur jüngeren Kontrollgruppe zudem signifikant seltener klinische Symptome. Jedoch kann es bei der Impfung adulter Tiere bei einer fortgeschrittenen Erkrankung auch zum Wirkungsverlust der Impfung kommen. Eine weitere Studie verglich die Immunantwort von Ziegen- und Schaflämmern, die zum Impfzeitpunkt 15 Tage bzw.
5 Monate alt waren und wies in der Gruppe der älteren Tieren eine höhere und dauerhaftere Antikörperproduktion sowie eine länger andauernde Zytokinproduktion nach (CORPA et al. 2000c). Dies ist möglicherweise durch ein unreifes Immunsystem der jüngeren Lämmer zu erklären. WINDSOR (2006) kann hinsichtlich der Erregerausscheidung keine Unterschiede zwischen einer Impfung im Alter von zwei Jahren und einer Impfung im Alter von 3-8 Monaten feststellen.
Gegen MAP geimpfte Tiere reagieren falsch positiv auf immunologische Tests zur Diagnose von natürlichen MAP-Infektionen sowie von Mycobacterium bovis- Infektionen. Durch ein hohes Maß an Kreuzreaktivität können Tests zur Tuberkulose- Überwachung wie der single intradermal tuberculin test (SIT) und der single intradermal comparative cervical tuberculin test (SICCT) positiv ausfallen, wenn eine natürliche Infektion mit MAP vorliegt oder gegen MAP geimpft wurde (ÁLVAREZ et al. 2008).
Ein weiterer Nachteil der Impfung ist das Risiko einer versehentlichen Selbstinjektion des Impfenden bzw. des Tierarztes. In diesen Fällen entwickeln sich meist granulomatös-nekrotisierende Wunden mit Fistelbildung. Selten wird auch eine Amputation des betroffenen Fingers notwendig (WINDSOR 2006).
Windsor berichtet, dass durch Impfung mit dem attenuierten Impfstoff Gudair® (CZ Veterinaria, Spanien) die Mortalität bei Schafen um ca. 90% reduziert wird, desweiteren treten die klinischen Symptome später auf und die Anzahl der ausgeschiedenen Erreger sinkt. In Australien ist die Impfung mit Gudair® derzeit die Hauptmaßnahme zur Kontrolle von oviner Paratuberkulose (WINDSOR 2006).
Gudair® verursacht an der Injektionsstelle bekanntermaßen Läsionen, die durch die Formulierung mit Adjuvanzen auf Ölbasis verursacht werden. EPPLESTON und WINDSOR (2007) untersuchten die ökonomischen Auswirkungen dieser Läsionen bei Schafen, die am Hals geimpft wurden und berichten, dass durch ein Ausschneiden der Läsionen oder der Lymphknoten keine relevanten Mehrkosten bei der Schlachtung entstehen. Bei Schafen wurden nach Injektion am Hals und an der seitlichen Bauchwand Läsionen von bis zu 5-10 cm Größe gefunden (WINDSOR 2006). Etwa die Hälfte der Tiere entwickelt diese Läsionen und bei 20-25 % der Tiere sind sie auch nach 4 Jahren noch zu sehen. Der drainierende Lymphknoten kann ebenfalls miteinbezogen und bis zehnfach vergrößert sein (EPPLESTON und WINDSOR 2007). Es treten geringfügige Minderzunahmen bei geimpften Lämmern im ersten Lebensjahr auf, eine Auswirkung auf die Wollproduktion ist nicht bekannt (REDDACLIFF et al. 2006).
2.2.8. Behandlung
Bisher ist keine Heilung von Paratuberkulose möglich und eine Behandlung erreicht lediglich eine Reduktion der klinischen Symptome und Verlängerung der Lebenszeit (FECTEAU und WHITLOCK 2011). Indiziert sind Therapieversuche nur in Einzelfällen bei Tieren mit hohem Zuchtwert oder bei Hobbytieren. Bei Zuchttieren wird allerdings häufig auch bei künstlicher Besamung MAP-Freiheit verlangt.
Insgesamt wird eine Therapie von an Paratuberkulose erkrankten Tieren nur sehr selten durchgeführt, denn sie bedeutet in jedem Fall eine lebenslange Medikamentengabe und bringt das Risiko der kontinuierlichen Erregerausscheidung mit sich.
In vitro wird das Wachstum von MAP durch die meisten Antimetabolite und Antibiotika gehemmt. Zu den verwendbaren Medikamenten zählen Antimetabolite wie Isoniazid, Dapson und Sulfate sowie Antibiotika wie Aminoglykoside, Rifampin und Clofazimin, die sowohl bei experimentellen und natürlichen MAP-Infektionen untersucht wurden (COCITO et al. 1994; MERKAL und LARSEN 1973; SLOCOMBE 1982; FECTEAU und WHITLOCK 2011).
Isoniazid inhibiert Synthese von Mycolsäure, einem Bestandteil der Zellwand von Mykobakterien und wird auch gegen humane Tuberkulose eingesetzt (SOMOSKOVI et al. 2001). Mehrere Autoren berichten über erneute Gewichtszunahme und festeren Kot bei Rindern nach Verwendung von Isoniazid allein oder in Kombination (HOFFSIS et al. 1990; BALDWIN 1976). Nachgewiesen wurde allerdings auch eine weitere Erregerausscheidung.
Rifampicin (auch Rifampin) dringt in Leukozyten ein und ist besonders wirksam gegen intrazelluläre Erreger. Es wird auch bei humaner Tuberkulose und Rhodococcus equi-Infektionen verwendet. Rifampicin sollte in Kombination mit einem anderen antimikrobiellen Wirkstoff verwendet werden, um synergistische Wirkungen auszunutzen und Resistenzbildung zu vermeiden. Berichtet wird über Kombinationen mit Levamisol und Streptomycin bei experimentell infizierten Hasen und natürlich infizierten Ziegen. In beiden Studien nahmen die klinischen Symptome ab und bei den untersuchten Ziegen war nach Behandlung auch kein Erreger in der Kultur von Gewebeproben mehr nachweisbar (MONDAL et al. 1994; SLOCOMBE 1982).
Clofazimin ist das am häufigsten eingesetzte Antibiotikum bei der Paratuberkulose des Rindes (HOFFSIS et al. 1990; COCITO et al. 1994). Es inhibiert die Replikation bakterieller DNA und weist eine gute intrazelluläre Wirksamkeit auf. Studien berichten über reduzierte Erregerzahl von MAP beim experimentell infizierten Lamm, eine Studie mit natürlich infizierten Rindern wies eine reduzierte Erregerzahl und verminderte klinische Symptome nach (WHITLOCK et al. 1983; FECTEAU und WHITLOCK 2011). In dieser Studie wurde eine lebenslange Behandlung ausdrücklich empfohlen, bei Beendung der Behandlung nahmen klinische Anzeichen innerhalb von 1 bis 2 Wochen wieder zu (WHITLOCK et al. 1983).
Des Weiteren können Therapieversuche mit Aminogykosiden, Dapson und neueren Medikamenten wie Cyclosporin A, Rapamycin oder Azathioprin unternommen werden (FECTEAU und WHITLOCK 2011).
2.2.9. Wirtschaftliche Relevanz
Bei Rindern und kleinen Wiederkäuern ist die Paratuberkulose eine der am weitesten verbreiteten bakteriell bedingten Erkrankungen und hat somit in hohem Maße Einfluss auf die weltweite Agrarwirtschaft.
Wirtschaftliche Einbußen in Paratuberkulose-positiven Schaf- und Ziegenherden entstehen durch erhöhte Mortalität, geringeres Schlachtgewicht, geringere Milchleistung und verminderte Fruchtbarkeit. Bei Milchrindern wurden ebenfalls höhere Mastitisraten und erhöhter Zellgehalt der Milch bei MAP-positiven Tieren konstatiert. Desweiteren entstehen bei Rindern und kleinen Wiederkäuern wirtschaftliche Nachteile durch Kosten für Diagnostik und Kontrollprogramme, Remontierung, kürzere Nutzungszeiten sowie durch den für MAP-positive Herden eingeschränkten nationalen und internationalen Handel (HASONOVA und PAVLIK 2006; MCKENNA et al. 2006; HUTCHINSON 1996).
Bei einer Studie in australischen Schafherden betrug die durch Paratuberkulose verursachte Mortalität bei den adulten Schafen 6,2%, während die gemeinhin als normal akzeptierte Mortalitätsrate durch sämtliche Todesursachen mit 2-3% deutlich
geringer liegt (ANON. 2005). In den untersuchten Betrieben war Paratuberkulose für 69% der Todesfälle verantwortlich.
Zur Milchleistung MAP-infizierter Milchziegen existieren kaum Studien. SMITH und Mitarbeiter (2009) zeigten auf, dass mit MAP-infizierte Kühe täglich 0,5 bis 1 kg Milch weniger geben als nicht-infizierte Tiere. Kühe, die fäkal über 30 cfu (colony forming units) pro Gramm Kot ausschieden, also starke Ausscheider waren, gaben sogar 4 kg Milch weniger.
OTT und Kollegen (1999) bemisst die Einbußen von Paratuberkulose-positiven Milchrindherden auf US$100 pro Kuh im Vergleich zu negativen Herden. Dieser Verlust berechnet sich aus geringerer Milchleistung und erhöhten Kosten für Remontierung (OTT et al. 1999). Es besteht jedoch stets die Möglichkeit, dass die wirtschaftlichen Einbußen als zu niedrig berechnet werden, da subklinisch erkrankte Tiere schwierig erkannt werden und deren geringere Leistung daher nicht mit berechnet wird (MCKENNA et al. 2006).
3. Material und Methoden
3.1. Seroprevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in small ruminants in Germany
Seroprävalenz von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis bei kleinen Wiederkäuern in Deutschland
3.1.1. Herden und Tiere
Für diese Studie wurden 167 Herden aus sämtlichen Bundesländern (außer den Stadtstaaten Berlin und Bremen) beprobt. Die Herden wurden nicht nach statistischen oder epidemiologischen Erwägungen ausgewählt, sondern die Besitzer aller Herden waren Kunden der Klinik für Kleine Klauentiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover oder der Tierärztlichen Praxis Dr. Seelig, Heidenrod. Auf der Karte in Abbildung 1. sind die Herdenstandorte markiert, zusätzlich ist die Anzahl von Schafherden bezogen auf den jeweiligen Landkreis erkenntlich.
Die Beprobung fand von November 2009 bis Dezember 2010 statt. Insgesamt wurden 150 Schafherden und 17 Ziegenherden (eingeschlossen 3 gemischte Herden mit beiden Tierarten) beprobt. Die Herdengröße reichte von 5 bis 2000 Muttertieren.
Die Schafherden wurden hauptsächlich zur Landschaftspflege und Lämmerproduktion gehalten, während die Ziegen vor allem zur Milchproduktion gezüchtet wurden. In zwei der drei gemischten Herden wurden auch die Ziegen zur Landschaftspflege gehalten, im dritten gemischten Betrieb dienten beide Spezies der Milchproduktion.
In jeder Herde wurden nach Möglichkeit zehn Tiere mit niedrigem Body Condition Score (BCS) beprobt. War die Herde hinsichtlich des BCS homogen, so wurden zehn Tiere zufällig ausgewählt. Bei Herden mit zehn Tieren und weniger wurden alle Tiere beprobt.
Insgesamt wurden von 1609 Tieren, darunter 1473 Schafe und 136 Ziegen, Proben genommen [Derzeit werden 2,1 Millionen Schafe und 124000 Ziegen in Deutschland gehalten. (STATISTISCHES BUNDESAMT 2010)].
3.1.2. Blutprobenentnahme und Serologie
Die Blutproben wurden aus der Vena jugularis externa oder der Vena cava cranialis entnommen, hierbei wurde eine sterile Kanüle und ein 10 ml Serumröhrchen (Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Deutschland) verwendet (GANTER et al. 2001). Alle Proben wurden im Labor der Klinik für kleine Klauentiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bearbeitet.
Die Blutproben wurden bei 2000g 20 Minuten zentrifugiert und das gewonnene Serum bis zur weiteren Untersuchung bei -20°C gelagert. Mittels Cattletype® MAP Ab ELISA (Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig) wurde im Serum die MAP- Antikörperaktivität untersucht. Dieser ELISA hat in Rinderserum laut Hersteller eine Sensitivität von 0,90 und eine Spezifität von 0,99 (LABOR DIAGNOSTIK LEIPZIG 2011).
Nach Anweisung des Herstellers wurden die Serumproben zunächst verdünnt und anschließend mit einem Puffer, der Mycobacterium phlei-Extrakt enthält, vorinkubiert.
Hierdurch wurde das Risiko von Kreuzreaktionen mit atypischen Mykobakterien minimiert. Proben, Negativ- und Positivkontrolle wurden auf eine mit nicht- infektiösem MAP-Antigen beschichtete Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen übertragen. MAP-spezifische Antikörper banden an das immobilisierte Antigen,
ungebundenes Material wurde anschließend durch Waschen entfernt. Ein Meerrettichperoxidase-konjugierter, Glykoprotein B-spezifischer monoklonaler Antikörper weist an das Antigen gebundene Antikörper nach. Ungebundenes Konjugat wurde ausgewaschen. Die Farbreaktion wurde durch Zugabe von TMB (Tetramethylbenzidin) Substratlösung gestartet und nach 10 Minuten gestoppt. Mit einem Photometer (MRXe reader, DYNEX Technologies, Chantilly, USA) wurde die Farbreaktion gemessen und die Optische Dichte (OD) bestimmt. Die OD-Werte korrelieren mit der Konzentration MAP-spezifischer Antikörper in der Probe.
Durch folgende Gleichung wurde der SP-Quotient ermittelt:
Proben mit einem S/P-Quotient unter 0,3 wurden als negativ beurteilt, solche mit einem Wert zwischen 0,3 und 0,4 als fraglich und Proben mit einem S/P-Quotient von 0,4 und darüber als positiv.
3.1.3. Body Condition Score, Alter, Herdengröße
Jedem Tier wurde ein Body Condition Score (BCS) von 1 bis 5 zugeteilt, wobei 1 für abgemagert und 5 für adipös steht (RUSSEL 1984).
Das Alter der Tiere wurde in Jahren dokumentiert. Es wurde anhand der Dentition der Schneidezähne geschätzt und vor allem bei Tieren über vier Jahren konnte mithilfe von Ohrmarken und anderen individuellen Merkmalen das Alter in der Regel genauer bestimmt werden.
Die Herdengröße wurde nach Anzahl der Muttertiere in der Herde dokumentiert.
3.1.4. Statistische Methoden
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mittels SAS® 9.1 Software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Die Verteilung der Parameter BCS, Alter und Herdengröße wurden mittels χ²-Tests verglichen. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant erachtet. Bei Probenanzahlen unter 5 je Kategorie wurde anstelle des χ²-Tests der exakte Fisher-Test angewandt.
3.2. Impfreaktionen und Nebenwirkungen einer Vakzinierung gegen Paratuberkulose bei Milchziegen
3.2.1. Tiere
Die Untersuchungen wurden an einer Milchziegenherde mit 280 Tieren, davon 200 Muttertiere, durchgeführt. Es handelt sich um einen Bioland-Betrieb, welcher ausschließlich bunte deutsche Edelziegen hält (RAT DER EUROPÄISCHEN UNION 2007). Die Herde ist ohne klinische Pseudotuberkulose-Fälle und anerkannt Caprines-Arthritis-Encephalitis-Virus(CAEV)-unverdächtig. Die Tiere werden in Laufställen gehalten und haben täglichen Weidegang. Zugekauft werden nur Zuchtböcke.
In Voruntersuchungen war bereits festgestellt worden, dass mehrere Tiere im Bestand serologisch MAP-positiv sind und es traten wiederholt klinische Fälle von Paratuberkulose auf.
trolle Negativkon OD
Mittelwert trolle
Positivkon OD
Mittelwert
trolle Negativkon OD
Mittelwert Probe
= OD Quotient - P S/
Es wurde eine Untersuchungsgruppe von 40 Tieren gebildet, hierunter 10 Lämmer, 10 einjährigen Ziegen und 20 Muttertiere, von denen je 10 zuvor serologisch MAP- positiv bzw. MAP-negativ getestet worden waren. Die Lämmer wurde mutterlos aufgezogen und mit Kuhkolostrum und Kuhmilch versorgt, welche zuvor mittels PCR negativ auf MAP getestet wurden.
3.2.2. Impfung
Zur Impfung wurde der in Deutschland nicht zugelassene Impfstoff Gudair® (CZ Veterinaria, Spanien) verwendet. Die Landesregierung Nordrhein-Westfahlen genehmigte den Einsatz nach §17c des Tierseuchengesetzes (DEUTSCHER BUNDESTAG 2004).
Gudair® enthält den inaktivierten Mycobacterium-avium-subsp.-paratuberculosis- Stamm 316F.
Die gesamte Milchziegenherde wurde an Tag 0 der Studie mit Gudair® geimpft. 1ml des Impfstoffs wurde subkutan an der linken Brustwand appliziert, wobei für jedes Tier eine neue sterile Kanüle verwendet wurde.
Bei den 40 Tieren der Untersuchungsgruppe wurde die Injektionsstelle geschoren um spätere Messungen zu erleichtern.
Mehrere Studien berichten vom Auftreten schmerzhafter Läsionen nach Injektion von Gudair® (WINDSOR 2006; REDDACLIFF et al. 2006; EPPLESTON und WINDSOR 2007). Da die Ziegen zum Melken im Fressgitter fixiert werden, wurde nicht am Ohrgrund oder Hals, sondern an der seitlichen Brustwand geimpft.
Eine unbehandelte Kontrollgruppe wurde nicht gebildet.
3.2.3. Untersuchung der Impfstoffverträglichkeit
Die Untersuchungen auf lokale und systemische Verträglichkeit des Impfstoffes an der Gruppe von 40 Tieren fanden an Tag 0 (dem Tag der Impfung), Tag 1 bis 4, Tag 8, Tag 15, Tag 28 und Tag 84 statt.
Um die lokale und systemische Verträglichkeit der Impfung zu untersuchen, wurden die Parameter Körperinnentemperatur, Hautfaltendicke an der Injektionsstelle, Schmerzhaftigkeit der Injektionsstelle, Futteraufnahme und Milchleistung bei laktierenden Tieren erfasst.
Die Körperinnentemperatur wurde rektal gemessen.
Die Hautfaltendicke wurde mittels Federkutimeter am dicksten Bereich der Injektionsstelle auf eine Dezimalstelle genau gemessen, soweit dies aufgrund der Dickenzunahme noch möglich war. Das Auftreten von Läsionen und Wunden wurden adspektorisch und palpatorisch untersucht und photographisch dokumentiert.
Die Schmerzhaftigkeit der Injektionsstelle wurde eingeteilt in schmerzhaft und nicht schmerzhaft. Kriterien waren Abwehrbewegungen bei der Palpation und Auftreten von Lahmheiten der linken Vordergliedmaße, die durch ein Wandern der Schwellung in der Unterhaut in den Bereich caudal des Schultergelenks entstanden.
Die Einteilung der Futteraufnahme erfolgte in vorhanden und nicht vorhanden. Die Fresslust wurde bei den laktierenden Ziegen durch die Kraftfutteraufnahme beim morgendlichen Melkgang im Fressgitter erfasst. Bei Zutretern und Lämmern wurde die Raufutteraufnahme bei der Silagefütterung am Morgen erfasst.
Zur Erfassung der Milchleistung wurde beim morgendlichen Melken die Milch der Tiere der Untersuchungsgruppe von Hand abgemolken und das Volumen individuell gemessen.
3.2.4. Blutprobenentnahme und Serologie
Die Blutprobenentnahme und die Serologie wurden in der zweiten Studie durch die gleiche Weise durchgeführt wie in der ersten Studie.
3.2.5. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mithilfe des Programms SAS® 9.1 Software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Mittels Shapiro-Wilk-Test wurde die Untersuchung auf Normalverteilung durchgeführt. Zum Vergleich der erhobenen Daten zu Körperinnentemperatur und Hautfaltendicke wurde der Wilcoxon-Test verwendet. Bei den Daten zur Milchleistung wurde entsprechend der gepaarte T-Test verwendet. P-Werte unter 0,05 galten als signifikant. Eine Bonferroni-Korrektur wurde durchgeführt und p-Werte unter 0,05 dividiert durch die Testanzahl wurden als statistisch signifikant angesehen.
