„Entwicklung, Validierung und Anwendung eines isothermalen Amplifikationssystems (LAMP) für die Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in kleinen Wiederkäuern und Genotypisierung mit MIRU-VNTR"

Tierärztliche Hochschule Hannover

Research Center for Emerging Infections and Zoonoses

„Entwicklung, Validierung und Anwendung eines isothermalen Amplifikationssystems (LAMP) für die Detektion von Mycobacterium

avium subsp. paratuberculosis (MAP) in

kleinen Wiederkäuern und Genotypisierung mit MIRU-VNTR“

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften

- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von Marie Daniéle Sange

aus Berlin

Hannover 2019

Wissenschaftliche Betreuung:

1. PD Dr. med. vet. Amir Abdulmawjood, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Research Center for Emerging Infections and Zoonoses, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Prof. Prof. h. c. Dr. Ursula Siebert, Institut für Aquatische und Terrestrische Wildtierforschung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

3. PD Dr. habil. rer. nat. Jochen Schulz, Institut für Tierhygiene, Tierschutz und Nutztierethologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Gutachter:

1. Gutachter: Betreuungsgruppe: PD Dr. med. vet. Amir Abdulmawjood, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit Research Center for Emerging Infections and Zoonoses, Prof. Prof. h. c. Dr. Ursula Siebert, Institut für Aquatische und Terrestrische Wildtierforschung, PD Dr. habil. rer. nat. Jochen Schulz, Institut für Tierhygiene, Tierschutz und Nutztierethologie

2. Gutachter: PD Dr. Tobias Eisenberg, Landesbetrieb Hessisches Landeslabor, Gießen

Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2019

„Zwei Dinge sind für unsere Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen.“

(Albert Einstein; *1879 - ^†1955)

Liste der Veröffentlichungen

In der Doktorarbeit enthaltene Arbeiten:

Teile dieser Dissertation wurden bereits in international anerkannten Wissenschaftsjournalen (Peer Review) veröffentlicht bzw. zur Veröffentlichung vorbereitet.

Studie I:

M.D. Sange, A. Becker, A.A. Hassan, M. Bülte, M. Ganter, U. Siebert and A. Abdulmawjood (2019): Development and validation of a loop-mediated isothermal amplification assay—a rapid and sensitive detection tool for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in small ruminants.J Appl Microbiol127, 47- 58.doi:10.1111/jam.14284 (veröffentlicht: 14.04.2019).

Studie II:

M.D. Sange, A. Abdulmawjood, M. Plötz, A.A. Hassan, M. Bülte, C. Reckmann, M. Ganter and U. Siebert (2019): MIRU-VNTR genotyping of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from small ruminants and humans. (Under review, J Vet Micriobiol).

Darüber hinaus sind Teile dieser Dissertation oder mit der Dissertation in fachlichem Zusammenhang stehende Themen veröffentlicht worden:

Posterpräsentation

I. Nachweis von Paratuberkulose aus Kot- und Milchproben mittels LAMP,59. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz 2018, Garmisch- Partenkirchen.

II. Nachweis von Paratuberkulose aus Kot- und Milchproben mittels LAMP, im Rahmen der Tagung der Zoonoseplattform 2018, Berlin.

III. Lamp-based technology as a rapid and sensitive method for detection and identification of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis in unpasteurized and pasteurized colostrum, 60. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz 2019, Garmisch-Partenkirchen.

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... I

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... III

TABELLENVERZEICHNIS ... V

1 EINLEITUNG ... 1

1.1HINTERGRUND ... 1

1.2MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP. PARATUBERCULOSIS (MAP) ... 5

1.3KRANKHEITSVERLAUF ... 6

1.4MAP-GENOM ... 8

1.5MAP-NACHWEISMETHODEN ... 10

1.5.1DIREKTER MAP-NACHWEIS ... 10

1.5.2INDIREKTE NACHWEISMETHODEN ... 13

1.6MAP-GENOTYPISIERUNGSMETHODEN ... 14

1.6.1.RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA(RAPD) ... 14

1.6.2AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP) ... 14

1.6.3PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) ... 15

1.6.4IS900-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS (IS900-RFLP) ... 16

1.6.5MULTI-LOCUS SHORT SEQUENCE REPEATS (MLSSR) ... 16

1.6.6SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP) ... 17

1.6.7WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) ... 18

1.7MAP UND MORBUS CROHN ... 18

1.8MAP UND RESULTIERENDE WIRTSCHAFTLICHE VERLUSTE ... 19

2 ZIELE DIESER ARBEIT ... 21

3 STUDIEN ... 22

I.STUDY: ... 22

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION ASSAY—A RAPID AND SENSITIVE DETECTION TOOL FOR MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP. PARATUBERCULOSIS IN SMALL RUMINANTS. ... 22

II.STUDY: ... 47

MIRU-VNTR GENOTYPING OF MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP. PARATUBERCULOSIS FROM SMALL RUMINANTS AND HUMANS. ... 47

4 DISKUSSION ... 68

5 FAZIT ... 72

6 ZUSAMMENFASSUNG ... 73

7 SUMMARY ... 75

LITERATURVERZEICHNIS ... 77

EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ... 91

DANKSAGUNG ... 92

Abkürzungsverzeichnis

AFLP Amplified fragment length polymorphism AGID Agargel-Immundiffusionstests

BACTEC Bactenecin

BLASTN Basic Local Alignment Search Tool CFU Colony forming unit

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay HEYM Herrold’s Egg Yolk Agar Medium HPC Hexadecylpyridinium chloride IAC Internal amplification control IgA Immunglobulin A

IMS-PCR Immunomagnetic separation-polymerase chain reaction INMV French National Institute for Agricultural Research Nouzilly MIRU-VNTR

JD Johne´s Disease

KBE Kolonie bildende Einheit KBR Komplementbindungsreaktion

LAMP Loop-mediated isothermal amplification system LOD Limit of Detection

MAC Mycobacterium avium complex

MAP Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis Mb Million Basenpaare

MC Morbus Crohn Mio. Million

MIRU Mycobacterial interspersed repetitive units

MIRU-VNTR Mycobacterial interspersed repetitive units- variable number tandem repeats

MLSSR Multi-locus short sequence repeats MOTT Mycobacteria other than tuberculosis M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis

NTM Nontuberculous mycobacteria PANTA Antibiotic mixture

PCR Polymerase chain reaction PFGE Pulsed-field gel electrophoresis q-PCR Quantitive PCR

RAPD Randomly amplified polymorphic DNA SNP Single nucleotide polymorphisms SSR Short sequence repeat

VNTR Variable number tandem repeats WGS Whole genome sequencing

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Lage der MIRU-VNTR-Loki im MAP-Genom. Die rote Linie mit der entsprechenden Zahl beschreibt die Größe des PCR-Fragments (Quelle:

MIRU-VNTR database, http://mac-inmv.tours.inra.fr/index.php?p=fa_nomenclature.) ... 4

Abbildung 2: Kreisförmige Darstellung des Map K-10-Genoms. Von innen: roter Pfeil, rRNA- Operon; dunkelviolettes Histogramm, GC-Gehalt; mehrfarbiges Histogramm, MAP-ORFs, codiert nach funktionaler Klassifizierung (Metabolismus kleiner Moleküle, blau;

Makromolekül-Metabolismus, rot; Zellprozesse, lila; andere Prozesse, gelb; hypothetisch, grün; unbekannt, orange). Das äußere farbige Histogramm gibt die gleiche Transkriptionsrichtung an wie der Replikationsursprung. Das innere farbige Histogramm zeigt die entgegengesetzte Transkriptionsrichtung als Replikationsursprung an. Schwarze Pfeile, 45 tRNAs. Außenkreis, Skala. (Quelle: Li et al. 2005). ... 9

Abbildung 3: MAP-Kolonien auf HEYM-Agar (Herrold´s Egg Yolk Agar) nach 12 Wochen.

(Quelle: Marie Sange, RIZ). ... 10

Abbildung 4: Darstellung von zwei an MAP erkrankten Schafen mit einem trockenen und rauhen Haarkleid sowie der Ausprägung eines sog. Bottlenecks (Lymphknotenschwellungen am Hals). ... 20

Figures Study I:

Figure 1: Nucleotide sequence of ISMap02 with specific binding sites of LAMP primers (coloured). ... 26

Figure 2: Nucleotide sequence of ISMap02 with specific binding sites of LAMP primers (coloured). ... 27

Figure 3: Temperature gradient (62 - 69 °C) with n=6, to detect the best amplification temperature for the fastest detection of MAP (DSM 44133 0.1 ng/μl), in connection with the concentrated (light grey) and standard Primermix (dark grey). ... 33

Figure 4: Typical result of a LAMP run with amplification and annealing curves with the incorporated IAC (blue curve) with an annealing temperature of 90.2°C. The difference of the annealing temperatures of positive (red curve) and negative samples is clearly distinguishable.

In this example run one MAP sample with an annealing temperature of 92.3 °C. ... 37

Figures Study II:

Figure 5: Top: Example of an agarose gel electrophoretic analysis of VNTR 3, 7, 10, 25, 32 profiles from selected human MAP isolates (n=4) with primers described by Thibault et al.

(2007). Lane 1-3: VNTR 3 with MAP reference strain from cow feces (Lane 1 and 2) and milk as positive control (Lane 3), Lane 4: negative control, Lane 5-8: VNTR 3 with human MAP isolates, Lane 9-12: VNTR 7 showing variance in fragment size of approximately 200 and 230 bp (marked red), Lane 13-16: VNTR 10, Lane 17-20: VNTR 25, Lane 21-24: VNTR 32: no result M= 1000 bp Marker (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany). ... 55

Figure 6: Minimum spanning tree of all numerical codes from different species described in the MAC-INMV-SSR Database (n=88), including the MAP isolates from this study (samples are indicated with an arrow in the spanning tree together with all MAP isolates and separately displayed in the box). Each genotype is displayed as a pie chart. The color-coded distribution of the strain origins is displayed and also the number of species, which showed this numerical code. The number of loci differing between the genotypes is indicated by the style of the connecting lines: normal, 1 difference; thin, 2 differences. ... 58

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Auszug untersuchter MAP MIRU-VNTR-Muster, isoliert aus verschiedenen

Tierarten der MIRU-VNTR-Datenbank. ... 5

Tables Study I

Table 1: Sequence of the designed LAMP primers for detecting ISMap02 gene and melting temperatures. ... 27

Table 2: Strains used for inclusivity and exclusivity test (MAP strains, non-MAP Mycobacteria strains, Non-Mycobacteria strains). ... 27

Table 3: Standard and concentrated Primermix (modified according to OptiGene Limited, Horsham, Great Britain). ... 30

Table 4: Comparison of the detection time of the standard and concentrated primermix in serial dilution steps (1 ng/µl - 1 fg/µl). M= mean of all amplification times and of annealing temperatures (n=6). Sd (±) = standard deviation. ... 33

Table 5: Limit of detection of spiked milk samples (50 ml) with a serial dilution of 1.9 x 10⁵ - 10⁰ MAP cells. Detection was possible to a limit of 1.9 x 10² MAP cells/50 ml milk, respectively.

M= mean of all amplification times and of annealing temperatures (n=6). Sd (±) = standard deviation. ... 34

Table 6: Limit of detection of spiked feces samples (2 g) with a serial dilution of 2.5 x 10⁵ - 10⁰ MAP cells. Detection was possible to a limit of 2.5 x10¹ MAP cells/2 g feces, respectively). M=

mean of all detection times and of annealing temperatures (n=6). Sd (±) = standard deviation.

... 35

Table 7: Results of the dilution series (1 ng/µl - 1 fg/µl) with incorporated IAC in LAMP assay.

M= mean of all detection times and of annealing temperatures (n=6). Sd (±) = standard deviation. ... 35

Table 8: Validation of the LAMP system by testing feces of sheep (n=12) and goats (n=8). .. 36

Tables Study II

Table 9: Representation of individual primer sequences used to perform PCR analysis. ... 52

Table 10: Results of the tested DNA with LAMP. The amplification duration and annealing temperature confirm MAP in the tested DNA from sheep, goats and humans. ... 54

Table 11: Number of repeats counted on each MIRU-VNTR locus of different samples. N indicates the number of samples, which showed the same VNTR pattern. ... 56

Table 12 : Numerical codes of MIRU-VNTR patterns resulting from the occurrence of tandem repeats found in the eight loci and associated with an INMV code, which was created by the MAC-INMV database. The numerical code results from the repeats on the individual loci. N indicates the number of samples, which showed the same VNTR pattern. ... 57

Table 13: Hunter-Gaston diversity index (HGDI) calculated for each locus of all MAP isolates in the MAC-INMV-SSR Database and for the human, sheep and goat isolates from this study, respectively with a 95% confidence interval. The most diverse loci are marked in bold. ... 57

1 Einleitung

1.1 Hintergrund

Die Paratuberkulose der Wiederkäuer (Johne’sche Krankheit) ist eine chronische, infektiöse Durchfallerkrankung, hervorgerufen durch Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), die weltweit vorkommt (Harris und Barletta 2001; Richter et al. 2002; Timms et al.

2016). Der Erreger wird in großen Mengen mit dem Kot und der Milch eines MAP infizierten Tieres ausgeschieden, besitzt eine hohe Tenazität und kommt ubiquitär vor (Olsen et al. 2001;

Bach et al. 2006; Khare et al. 2012). Der kulturelle Nachweis von MAP ist ein direkter Test und gilt als Goldstandard des Nachweises, jedoch ist dieser langwierig und nicht für schnelle MAP Detektionsergebnisse zu gebrauchen (Nielsen et al. 2001; Whittington et al. 2005). Ein indirekter Test ist z.B. die ELISA-Methode (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Mit Hilfe des ELISA können Proteine, Antikörper und Viren, aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin, Kot etc.) nachgewiesen werden. Bei einem direkten ELISA macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikörper zunutze, die an dem nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Ein Antikörper wird zuvor mit einem Enzym markiert. Die durch das Reporterenzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens (Gilardiani et al. 2016; Hatamifar et al. 2016).

Der indirekte ELISA beinhaltet zwei Schritte. Zunächst bindet ein primärer Antikörper an das Antigen, dann erkennt ein markierter zweiter Antikörper den ersten Antikörper. Ein Nachteil dieser ELISA-Methode ist, dass es zu starken unspezifischen Hintergrundsignalen kommen kann. Vorteilhaft ist jedoch, dass es durch die Bindung mehrerer sekundärer Antikörper zu einer signalverstärkenden Wirkung kommt (Gilardiani et al. 2016). Ein Vorteil gegenüber des direkten ELISA ist vor allem die größere Flexibilität. Primäre Antikörper können verwendet werden, ohne vorher markiert zu werden und eine geringe Anzahl an sekundären Antikörpern reichen aus, um ein weites Spektrum an primären Antikörpern abzudecken (Gilardiani et al.

2016; Hatamifar et al. 2016). Die Sensitivitäten der in Deutschland erhältlichen ELISA- Tests für Blutserumproben liegen bei knapp 60 % und die Spezifitäten bei ca. 99 % (FLI 2012).

Generell ist die Sensitivität allerdings durch die Art der Immunantwort bei einer MAP- Infektion limitiert, da häufig keine Antikörper gebildet werden, bevor das Tier den Erreger fäkal ausscheidet. Somit ist die Sensitivität stark vom Erkrankungsstadium abhängig, und ein negativer Test darf nicht als Infektionsfreiheit interpretiert werden (Salgado et al. 2007; Donat et al. 2017; Li et al. 2017). Der Bedarf nach einer schnellen, sensitiven und vorteilsweisen

kostengünstigen Methode ist somit gegeben. MAP wurde nicht nur in Wiederkäuern nachgewiesen, sondern auch in nicht-wiederkäuenden Spezies (Palmer et al. 2005; Raizman et al. 2005; Florou et al. 2008; Miller et al. 2017). Neben Hasen, Wildschweinen, Hunden, Katzen und anderen wildlebenden Tieren wird nach wie vor auch eine Infektion des Menschen mit MAP diskutiert, da MAP-Isolate aus menschlichem Stuhl gewonnen werden konnten (Chiodini et al. 1984a; McNees et al. 2015; Waddell et al. 2015; Oken et al. 2017). Eine speziesspezifische Erkrankung mit MAP ist somit widerlegt. Wildtiere gelten als Reservoir, aber auch als Vektor (Khol et al. 2007; Kopecna et al. 2008; Sevilla et al. 2008; Carta et al.

2013). Aufgrund der gemeinsamen Weidefläche ist der Hauptweg der Übertragung bekanntermaßen die fäkale Kontamination des Grases und der direkte Kontakt zwischen den Arten (Khol et al. 2007; Kopecna et al. 2008; Sevilla et al. 2008; Carta et al. 2013). Dieser Übertragungsweg wurde für vor allem für Rinder und Schafe mit Interaktionen auf Weiden mit Wildwiederkäuern diskutiert. Die wildlebenden Wiederkäuer zeigten ähnliche Subtypen wie Rinder und Schafe, wenn das Habitat sich überschnitt (Gerritsmann et al. 2014). Es ist bekannt, dass nicht nur Wiederkäuer MAP übertragen können, sondern auch nicht- wiederkäuende Spezies. Da MAP von Natur eine hohe Tenazität aufweist- mit einer möglichen Überlebensdauer von mehr als einem Jahr - und einem periodischen Mangel an geeigneten Wirten standhalten kann, ist auch eine stark MAP-kontaminierte Umgebung eine wichtige Infektionsquelle, die insbesondere die Weidetiere einer Gefahr aussetzt (Fecteau et al. 2013;

Eppleston et al. 2014). Für die Etablierung von MAP-Bekämpfungsprogrammen ist die Detektion der MAP-Quelle unabdingbar (Machackova et al. 2004; Fritsch et al. 2012;

Abdolmohammadi et al. 2016). Mithilfe der Genotypisierung, welche ein sehr wichtiges epidemiologisches Instrument darstellt, kann versucht werden, die Infektionsquelle bei Ausbrüchen aufzuspüren (Sohal et al. 2009). Eine der einfachen PCR-basierten Methoden, die eine hohe Auflösungskraft besitzt, sind im Genom von Mykobakterien verteilte repeats, auch MIRU-VNTR genannt (Brown et al. 2009; Weniger et al. 2010; Fawzy et al. 2016). Die Kopienzahl jedes MIRU-VNTR unterscheidet sich aufgrund von Mutationen zwischen epidemiologisch nicht verwandten Stämmen (Biet et al. 2012). Mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU) sind eine spezifische Gruppe von Minisatelliten, die nur in Mykobakterien zu finden sind (Bull et al. 2003). Sie zeichnen sich durch eine Wiederholungssequenz von etwa zehn bis einhundert Nukleotiden aus, und die Häufigkeit, mit der sich die Sequenz wiederholt, variiert. MIRU-Loci (MIRU 1, 2, 3 und 4) wurden zuerst in MAC-Stämmen (Mycobacterium avium complex) durch BLASTN-Analyse (Nucleotid Basic Local Alignment Search Tool) in den zuvor identifizierten MIRU-Sequenzen bei Mycobacterium

tuberculosis (M. tuberculosis) beschrieben (Nikolayevskyy et al. 2016). Es gibt zwei Hauptgruppen von Stämmen, die als "Typ S" und "Typ C" bekannt sind. Diese wurden ursprünglich nach der Wirtsart benannt, aus der sie zuerst isoliert wurden (S = Schaf, C = Rind), basierend auf dem VNTR-Muster (Variable number tandem repeats) (Stevenson 2015). Die Gruppe vom Typ C ist synonym mit den Stämmen des "Typ II" (Stevenson et al. 2002). Eine dritte Gruppe von Stämmen wird als "intermediär" (Collins et al. 1990) oder "Typ III" (De Juan et al. 2005; Castellanos et al. 2007) bezeichnet. Es wurde ursprünglich angenommen, dass diese Gruppe sowohl mit dem Typ S als auch mit dem Typ C verwandt ist. Nach Durchführung der Sequenzierung des gesamten Genoms wurde bestätigt, dass es sich um einen Subtyp von Typ-S-Stämmen und nicht um eine eigene Gruppe handelt (Collins et al. 1990). Variable number tandem repeats (VNTR), wie MIRU, sind ebenfalls eine Art von Minisatelliten und wurden im öffentlich zugänglichen Gesamtgenom des M. avium 104-Stammes mit der Tandem-Repeat-Finder-Software untersucht (Overduin et al. 2004). Im Jahr 2007 wurde im MAP-Genom ein Satz von acht MIRU-VNTR-Loki (VNTR 3, 7, 10, 25, 32, 47 und MIRU X3 und 292) beschrieben (Thibault et al. 2007). Mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU) X3 und 292 sind dieselben Loki wie die beschriebenen MIRU 3 bzw. 2 (Bull et al. 2003) (Abbildung 1). Mithilfe des Diversitätsindexes, der sich aus dem Hunter-Gaston Index berechnet, können die verschiedenen Loki eine Heterogenität aufweisen. Anhand des Musters können die Bakterien unterschieden werden, um die Herkunft zu bestimmen und somit die Quelle der Infektion zu eruieren. Die Loki mit der höchsten Diversität sind die Loki 7 und 32 (Park et al.

2016; De Kruijf et al. 2017).

Abbildung 1:Schematische Darstellung der Lage der MIRU-VNTR-Loki im MAP-Genom. Die rote Linie mit der entsprechenden Zahl beschreibt die Größe des PCR-Fragments (Quelle:

MIRU-VNTR database, http://mac-inmv.tours.inra.fr/index.php?p=fa_nomenclature.)

Acht Loki wurden zur Einrichtung einer Online-Datenbank MAC-INMV (http://mac- inmv.tours.inra.fr/) verwendet, um die Dokumentation und den Vergleich von MIRU-VNTR- basierten MAP-Genotypen zu erleichtern, die in verschiedenen Laboratorien weltweit nachgewiesen wurden. Kürzlich wurde festgestellt, dass MIRU-VNTR-Loki von MAP homoplastisch sind und daher ihre Genauigkeit als genetische Marker für die phylogenetische Analyse beeinträchtigen (Nikolayevskyy et al. 2016). Es wurde berichtet, dass verschiedene Kombinationen von MIRU-VNTR-Loki eine bessere Differenzierung von MAP-Stämmen ergeben (Kremer et al. 2005; Smittipat et al. 2005; Sun et al. 2012). Jedoch wurde kein spezifischer Satz von Loki als Standard vereinbart, und die allelische Vielfalt der Loki kann von Land zu Land und zwischen den Arten variieren, was eine lokale Auswahl geeigneter Loci erfordert (Supply et al. 2006). Dies hat viele Forscher ermutigt, dieses MIRU-VNTR-Panel zu verwenden, um epidemiologische Untersuchungen für MAP-Isolate aus verschiedenen Ländern und Arten durchzuführen (Collins et al. 1990; Machackova et al. 2004; Fritsch et al.

2012; Abdolmohammadi et al. 2016). Mit Hilfe von MIRU-VNTR-Loci kann zwischen VNTR- Mustern von verschiedenen Spezies unterschieden werden, um eine mögliche Übertragung von MAP zwischen diesen Arten zu untersuchen (Tabelle 1).

Tabelle 1: Auszug untersuchter MAP MIRU-VNTR-Muster, isoliert aus verschiedenen Tierarten der MIRU-VNTR-Datenbank.

Tierart MIRU

292 MIRU

X3 VNTR

25 VNTR

47 VNTR

3 VNTR

7 VNTR

10 VNTR

32 Numerischer Code

Rind 4 2 3 3 2 2 2 8 42332228

Schwein 3 2 3 3 2 2 2 8 32332228

Wildschwein 3 2 3 3 2 2 1 8 32332218

Vogel 3 2 3 3 2 2 2 9 32332229

Nager 4 2 3 3 2 2 1 8 42332218

Reh 3 2 3 3 2 2 2 8 32332128

Hirsch 3 2 3 3 2 1 1 8 32332118

Rind 3 2 3 3 2 1 2 8 32332328

Hund 2 1 3 3 2 3 2 8 21332228

Hase 3 2 3 3 2 2 2 10 323322210

Katze 3 2 3 3 2 2 2 8 32332428

Kaninchen 2 2 5 2 2 4 2 8 22522228

1.2 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP)

MAP gehört zu der Gattung Mycobacterium aus der Familie der Mycobacteriaceae, die über 150 verschiedene Arten umfasst. Mykobakterien sind nicht sporenbildende, obligat aerobe, säurefeste Stäbchen, die sich primär intrazellulär vermehren (Collins 1996). Die bekanntesten Vertreter dieser Familie sind die Erreger der Tuberkulose (Mycobacterium tuberculosis), der Rindertuberkulose (Mycobacterium bovis) und der Lepra (Mycobacterium leprae). Weitere Arten, zu denen auch der Mycobacterium avium-Komplex gezählt wird, werden unter dem Begriff atypische Mykobakterien (MOTT: Mycobacteria Other Than Tuberculosis oder NTM:

Nontuberculous Mycobacteria) zusammengefasst (Saito et al. 1989; Turenne et al. 2008). Ein wichtiger Vertreter des Mycobacterium avium-Komplexes ist Mycobacterium avium subsp.

paratuberculosis, der Erreger der Paratuberkulose oder Johne´schen Krankheit der Wiederkäuer und anderer Tierarten (Rogall et al. 1990). MAP ist die Subspezies mit der langsamsten Vermehrungsrate und einer Generationszeit von über 20 Stunden, abhängig von der primär vorhandenen Bakterienzahl und ist ebenfalls die einzige Subspezies, deren Wachstum abhängig ist von dem Siderophor Mycobaktin (Barclay und Ratledge 1983;

Lambrecht und Collins 1992). MAP ist der monokausale Erreger der Johne’schen Krankheit,

welche unheilbare Enteritiden mit tödlichem Ausgang hervorruft und in Deutschland zu den meldepflichtigen Tierkrankheiten zählt (BMELV 2011).

1.3 Krankheitsverlauf

Das Krankheitsgeschehen kann in vier Phasen unterteilt werden, die sich immunologisch, klinisch und pathomorphologisch unterscheiden (Chiodini et al. 1984b):

a. Stilles Infektionsstadium b. Subklinisches Stadium

c./d.Klinisches Stadium/Endstadium a. Stilles Infektionsstadium

Nach der oralen Aufnahme gelangt MAP in den Magen-Darmtrakt und wird zur Überwindung der gastrointestinalen Barriere von M-Zellen ins Darmepithel transportiert (Sorge 2011). Hier erfolgt die Aufnahme und der Transport des Erregers in die Peyerschen Platten des Darmes.

Der Erreger wird durch Phagozytose von intra- und subepithelialen Makrophagen aufgenommen, persistiert in den Phagosomen und entzieht sich so intrazellulär dem direkten Zugriff des humoralen Immunsystems und der Nachweisbarkeit (Chinodini et al. 1984b). Die Immunantwort ist zu diesem Zeitpunkt zellvermittelt. Das infizierte Tier zeigt keine Klinik (Gruber 2007). Pathohistologisch sind frühestens nach ca. vier Wochen erste diffuse Zellinfiltrationen nachweisbar. Die typischen Infiltrationen von Epitheloidzellen und Langhans’

Riesenzellen sind nach ca. vier Monaten vollendet (Gruber 2007). Mikroskopisch sind im Darmmaterial säurefeste Bakterien sichtbar und MAP lässt sich anzüchten. Zu diesem Zeitpunkt der Infektion wird der Erreger nicht oder nur unterhalb der Nachweisgrenze ausgeschieden (Klee 2002). Die ausgeschiedenen Bakterienmengen liegen über 2–8 KBE/50 ml Milch (Van Schaik et al. 2007; Ricchi et al. 2016) und unter 30 KBE/g Kot (Whitlock et al.

2000; Crossley et al. 2005).

b. Subklinisches Stadium

Werden die von Makrophagen aufgenommenen Bakterien nicht gehemmt oder zerstört, erfolgt die intrazelluläre Vermehrung mit anschließendem Zelltod und der Freisetzung der Erreger in das umliegende Gewebe und in das Darmlumen (Gruber 2007). Mit der Freisetzung von MAP schaltet sich die humorale Abwehr ein. Pathomorphologisch kommt es zu einer gering- bis mittelgradigen Schleimhauthypertrophie und Vergrößerung der Mesenteriallymphknoten mit Infiltration epitheloider Zellen, Langhans’ Riesenzellen und schaumig erscheinenden Makrophagen mit phagozytierten säurefesten Stäbchen, ohne- dass das Tier Symptome zeigt (Klee 2002). Die Auscheidungsrate von MAP ist in dieser Phase ebenfalls gering und die durchschnittliche Bakterienlast liegt unter 10 KBE/50 ml Milch und bis zu 30 KBE/g Kot (Whitlock et al. 2000; Crossley et al. 2005).

c./d. Klinisches Stadium und Endstadium

Die Inkubationszeit liegt zwischen 2 - 10 Jahren. In der Regel erkranken Tiere im Alter zwischen 3 - 6 Jahren. Dabei treten klinische Symptome intermittierend auf, mit Phasen, in denen die Tiere keine Symptome zeigen. Zunächst herrschen unspezifische Symptome vor: bei milchgebenden Nutztieren sinkt die Milchleistung um 10 - 20 %, die Tiere magern trotz guter Futteraufnahme ab und das Geburtsgewicht der Nachkommen ist vermindert (Klee 2002). Als Auslöser des Ausbruches werden Stressfaktoren wie z.B. Geburten genannt. Schließlich tritt ein langanhaltender, überlriechender, schaumiger Durchfall auf und letztendlich kommt die Milchleistung zum Erliegen. Die intermittierenden Durchfälle sind weder durch Antibiotika noch durch Antiparasitika zu beeinflussen (Weiss 2007). Pathologisch-anatomisch liegt eine hochgradige Schleimhauthypertrophie mit hirnwindungsähnlicher Darmstruktur und hochgradiger Schwellung der Mesenteriallymphknoten vor (Klee 2002; Weiss 2007). Das histologische Bild ist geprägt von einer granulomatösen Entzündung, die sich bis in die Submukosa ausbreitet (Gruber 2007). Die Lamina propria ist erheblich entzündet, transmurale Prozesse kommen vor, sind aber selten. Die histologischen Veränderungen sind als Tuberkel angeordnet oder diffus in der Schleimhaut und den Lymphknoten verteilt. Betroffen sind im Wesentlichen nur der hintere Dünndarm (Ileum, Jejunum), teilweise auch das Kolon (Weiss 2007). Auch in Leber und Lunge können Veränderungen zu finden sein, jedoch werden Fisteln oder Fissuren nicht beschrieben. In der klinischen Phase ist ein Antikörpernachweis möglich und letztendlich nimmt im finalen Stadium die humorale Immunantwort dann ab, bis hin zur Anergie: ein serologischer Nachweis kann negativ sein. In diesem Stadium wird der Erreger

hochgradig ausgeschieden. Bei Kühen wird die Ausscheidungsrate des Bakteriums mit 100 KBE/ml Milch (Köhler et al. 2003; Gruber 2007; Weiss 2007) und mehr als 100 KBE/g Kot angegeben, welche als hohe Bakterienlast angesehen wird (Whitlock et al. 2000; Crossley et al. 2005).

1.4 MAP-Genom

Das komplette Genom von MAP (4,38 Mb) aus einem typischen bovinen "Typ II" Stamm (MAP ATCC BAA 968/K-10) einer Kuh mit Johne’scher Krankheit wurde erstmals im Jahr 2005 in den USA sequenziert (Accession number: NC_002944) (Li et al. 2005) (Abbildung 2).

Insertionssequenzen haben sich als wichtig erwiesen, um zwischen Mykobakterien-Spezies und Unterarten unterscheiden zu können (Cousins et al. 1999). Der MAP K-10-Stamm enthält 19 verschiedene Insertionssequenzen mit insgesamt 58 Kopien, einschließlich IS1311 und der MAP spezifischen Elemente IS900, f57, ISMav2, ISMap02, ISMap04 und Homologen von REP13E12 (Li et al. 2005). Die Sequenz f57 und das hspX-Gen liegen jeweils in einer einzigen Kopie im MAP-Genom vor, während ISMav2 in drei Kopien vorliegt (Li et al. 2005).

Abbildung 2: Kreisförmige Darstellung des Map K-10-Genoms. Von innen: roter Pfeil, rRNA- Operon; dunkelviolettes Histogramm, GC-Gehalt; mehrfarbiges Histogramm, MAP-ORFs, codiert nach funktionaler Klassifizierung (Metabolismus kleiner Moleküle, blau;

Makromolekül-Metabolismus, rot; Zellprozesse, lila; andere Prozesse, gelb; hypothetisch, grün; unbekannt, orange). Das äußere farbige Histogramm gibt die gleiche Transkriptionsrichtung an wie der Replikationsursprung. Das innere farbige Histogramm zeigt die entgegengesetzte Transkriptionsrichtung als Replikationsursprung an. Schwarze Pfeile, 45 tRNAs. Außenkreis, Skala. (Quelle: Li et al. 2005).

Aufgrund der geringen Anzahl an vorliegenden Kopien im MAP-Genom sind diese Marker weniger sensitiv als IS900, dadurch aber spezifischer (Englund et al. 2002; Möbius et al. 2008a;

Möbius et al. 2008b). ISMap02 ist mit sechs identischen Kopien im MAP-Genom vertreten.

Falsch-positive Ergebnisse bei der molekularbiologischen Diagnostik sind jedoch möglich, da IS900-ähnliche Sequenzen auch bei anderen Mykobakterien-Spezies vorkommen (Englund et al. 2002). Insertionssequenzen können sich in regulatorische oder kodierende Regionen des

Genoms inserieren und somit die Genfunktion des Wirtes stören (Stevenson 2015). Zusätzlich können sie DNA-Umlagerungen durch eine Transposon-vermittelte Rekombination bewirken (Rathnaiah et al. 2017). Diese Insertionselemente sind einzigartig für MAP und werden daher als diagnostisches Werkzeug verwendet, um diese in klinischen Proben nachzuweisen (Kremer et al. 2005; Smittipat et al. 2005; Sun et al. 2012).

1.5 MAP-Nachweismethoden

In der mikrobiologischen Diagnostik von MAP wird zwischen direktem und indirektem Erregernachweis unterschieden. Letzterer stützt sich auf spezifische Immunreaktionen, die nach Erregerkontakt (Exposition, Infektion, Immunisierung) auftreten (Gilardoni et al. 2012)

1.5.1 Direkter MAP-Nachweis

1.5.1.1 Kultureller Erregernachweis

Als Goldstandard gilt der kulturelle Erregernachweis. Die Spezifität wird mit 100 % angegeben (Collins 1996; Collins et al. 2006). Im subklinischen Stadium liegt die Sensitivität aufgrund der intermittierenden Erregerausscheidung und unterschiedlichen Kultivierungsmethoden verschiedenen Literaturangaben zufolge lediglich bei 23 bis 49 % (Whitlock et al. 2000; Nielsen et al. 2001). Die kulturelle Methode hat einen enormen Nachteil. Durch das langsame Wachstum von MAP mit ca. 8 - 12 Wochen ist diese Methode nicht für einen schnellen Nachweis geeignet (Homuth 2002). Allerdings kann im positiven Fall die Aussage des Vorliegens vermehrungsfähiger MAP getroffen werden (Ris et al. 1988) (Abbildung 3). Die Auswertung der kulturellen Anzüchtung erfolgt lichtmikroskopisch nach der Ziehl-Neelsen- Färbung als säurefeste Stäbchen (Homuth 2002). Dieses hoch spezifische Verfahren erfasst Abbildung 3: MAP-Kolonien auf

HEYM-Agar (Herrold´s Egg Yolk Agar) nach 12 Wochen. (Quelle:

Marie Sange, RIZ).

MAP i. d. R. nur bei hoher Erregerdichte im Probenmaterial von klinisch erkrankten Tieren, nicht jedoch bei subklinisch infizierten Tieren (geringe Sensitivität) (Merkal et al. 1968;

Jørgensen 1983). Zur Reduzierung der Begleitflora ist es empfehlenswert, die Anzuchtnährmedien mit einem antibiotisch und antimykotisch wirkenden Gemisch zu versetzen, um eine Überwucherung mit Pilzen oder anderen Bakterien zu vermeiden (Ris et al. 1988). Mehr oder weniger stark mit sonstigen Bakterien kontaminierte Substrate (Kot, Rohmilch) müssen zur weitgehenden Abtötung dieser Keime vorbehandelt werden, dabei wird die Verwendung von 0,75 % HPC für mindestens 24 h vorgeschlagen (AVID 2007). Bei massiven Ausscheidern können Erreger ohne vorherige Isolierung direkt im Kotpräparat nach Ziehl-Neelsen lichtmikroskopisch nachgewiesen werden. MAP stellt hohe Nährbodenansprüche und wird auf eidotterhaltigen Nährböden mit Mycobatinzusatz angezüchet (AVID 2007). Als Festnährmedium hat sich vor allem Herrold ́s Egg Yolk Medium (HEYM) bewährt, aber auch Löwenstein-Jensen-Medium, Middlebrook 7H10 und Middlebrook 7H11-Agar können zur MAP Kultivierung eingesetzt werden (Whittington et al.

2010). Eine Weiterentwicklung des klassischen kulturellen Nachweises ist die Anzucht im BACTEC®-System. Ein Bakterienwachstum wird anhand von freigesetztem ¹⁴CO2 bestimmt.

Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass ein Nachweis schon nach ca. 5 bis 8 Wochen möglich ist. Der Nachteil jedoch ist der Umgang mit radioaktivem Material (Homuth 2002).

1.5.1.2 Antigen-Nachweis

Die Problematik kreuzreaktiver Antigene innerhalb der Mykobakterien hat bei der Herstellung monoklonaler Antikörper noch nicht zu verwertbaren und robusten MAP-spezifischen Antigenfänger Tests geführt (Nielsen et al. 2013). Im Western-Blot-Verfahren können die verschiedenen Proteine von MAP differenziert werden, was zur Identifizierung des mycobakteriellen Proteins HupB geführt hat, welches mit IgA Antikörpern aus dem Darm von MC Patienten (Morbus Crohn) reagiert und evtl. zur Aufrechterhaltung des chronisch entzündlichen Prozesses beiträgt (Collins et al. 2000). Ein Rückschluss auf MAP als krankheitsauslösendes Agens von MC lässt sich aus dieser Beobachtung jedoch nicht ableiten.

Die tatsächliche Bedeutung bakterieller Untereinheiten und deren potentielle Beteiligung an der MC-Chronizität ist noch nicht geklärt und erfordert noch fundierte wissenschaftliche Arbeit (Verdier et al. 2013).

1.5.1.3 DNA-Nachweis

Molekularbiologische Methoden zum Genomnachweis von Erregern sind mittlerweile durch den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) etabliert und weit verbreitet (Green et al.

1989). Der am häufigsten in der molekularen MAP-Diagnostik genutzte Genomabschnitt ist IS900 (Millar et al. 1996; Pillai et al. 2002; Timms et al. 2016; Butot et al. 2019). Zur molekularen Untersuchung von Proben mit hohem Verdünnungsfaktor für MAP (z.B. Kot und Milch) hat sich ein Anreicherungsverfahren mit antikörperbeschichteten, supermagnetischen Fängerpartikeln (beads), gefolgt von hoch sensitiven PCR Verfahren wie real-time PCR bewährt (Gilardoni et al. 2016). Eine weitere MAP Kombinations- Nachweisstrategie ist die Anreicherung von MAP mit Hilfe paramagnetischer Partikel, die mit einem M.

paratuberculosis-spezifischen Peptid gekoppelt sind, ebenfalls gefolgt von einer PCR zum Nachweis eines Insertionselements (Schönenbrücher et al. 2009). Auch stellt die loop- mediated isothermal amplification (LAMP) eine Möglichkeit zum Nachweis von MAP dar.

Diese Methode ist hochspezifisch mit besonders hoher Zielselektivität, da sechs Primer an acht spezifische Zielsequenzen binden (Nagamine et al. 2002). Ein weiterer Vorteil dieses Systems besteht darin, dass es portabel ist (Akku betrieben) und es keines Thermocylers bedarf, da die Reaktion isothermal abläuft. Eine Vielzahl von Studien haben sich mit dem IS900- Gen in Verbindung mit der PCR- und LAMP-Methode beschäftigt. Die erhältlichen MAP- Detektions-PCR-Kits basieren auf der IS900-Sequenz (Millar et al. 1996; Pillai et al. 2002), jedoch wurde festgestellt, dass das Targeting der IS900-Sequenz sowohl mit gängiger PCR als auch mit LAMP, oftmals eine Kreuzreaktivität mit eng verwandten Mykobakterien wie M.

scrofulaceum, M. avium avium und M. intracellulare aufweist (Naser et al. 1999; Jayarao et al.

2004; Enosawa et al. 2003; Iwamoto et al. 2003; Trangoni et al. 2015). Die Nachweisgrenzen des IS900-Gens mit der LAMP-Methode lagen hierbei zwischen 100 und 500 fg/25 μl. Die Isolierung von DNA aus verschiedenen Matrices wie Milch und Kot ist aufwendig. Vor allem enthält Kot sehr viele variable Bestandteile, die von der Ernährung, der Darmflora und der Umgebung des Tieres abhängen (Oikarinen et al. 2009). Inhibitoren können Polysaccharide oder Chlorophyll aus Kräutern und Gemüse, Gallensalzen, Harnstoff, Glykolipiden, Hämoglobin und Heparin sein (Oikarinen et al. 2009). Es ist auch sehr wahrscheinlich, dass die Fäkalien von Tieren mit klinischer Paratuberkulose, Blut und Epithelzellen enthalten können, die auf ein Abplatzen der verdickten Schleimhaut im Zusammenhang mit der Krankheit im Endstadium zurückzuführen sind.

Es wurde festgestellt, dass vor allem diese Komponenten die PCR hemmen (Inglis und Kalischuk 2003). Weitergehende molekularbiologische Nachweisverfahren sind der Restriktionsenzym-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP), Hybridisierungen zur Feststellung von Sequenzunterschieden innerhalb der M. avium Subspezies und gezielte Genomabschnitt-Sequenzierungen (Moss et al. 1991; Bauerfeind et al. 1996; Davidson et al.

2016).

1.5.2 Indirekte Nachweismethoden

1.5.2.1 Zelluläre Immunantwort

Als indirekte Nachweismethoden einer stattgefundenen Infektion mit MAP kommen die zelluläre und humorale Immunantwort als Antikörpernachweis in Frage (Ganusov et al. 2015).

In Analogie zur äußerst erfolgreichen Bekämpfung der Tuberkulose (Tuberkulintest) wurde als in-vivo Nachweis spezifischer zellulärer Immunantwort gegen MAP auch der Intrakutantest als sog. „Johnin“ Test angewandt (Benedictus, Bosma 1985). Er hat aber eine geringe Spezifität und ist deshalb als alleinige Methode für Bekämpfungsprogramme kaum nutzbar. Als Alternative zum in-vivo Nachweis der zellvermittelten Immunität wurde die in-vitro Interferon-gamma Sekretion spezifisch restimulierter Leukozyten eingesetzt (Jungersen et al.

2002). Diesem, als Kit vermarktetem, Test wird eine Spezifität von 66 - 67 % zugesprochen.

Letztlich scheint nur die Kombination von Hauttest und Interferon-gamma-Nachweis sinnvoll, da Tiere, die tatsächlich MAP infiziert sind eine Spezifität von 97,6 % aufweisen (Seva et al.

2014).

1.5.2.2 Humorale Immunantwort

Serologische Tests basieren auf dem Nachweis MAP-spezifischer Antikörper, überwiegend als Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) (Botaro et al. 2017). In Deutschland sind momentan vier kommerzielle ELISA zum Antikörpernachweis zugelassen, welche alle eine eingeschränkte Sensitivität aufweisen (FLI 2012). Die Sensitivitäten der in Deutschland erhältlichen ELISA- Tests für Blutserumproben liegen bei knapp 60 % und die Spezifitäten bei ca. 99 % (FLI 2012). Generell ist die Sensitivität allerdings durch die Art der Immunantwort bei einer MAP-Infektion limitiert, da häufig keine Antikörper gebildet werden, bevor das Tier den

Erreger fäkal ausscheidet. Somit ist die Sensitivität stark vom Erkrankungsstadium abhängig und ein negativer Test darf nicht als Infektionsfreiheit interpretiert werden. Der Agargelimmunodiffusionstest (AGIDT) wurde als Schnelltest für Tiere mit Paratuberkulose- verdächtigen Symptomen entwickelt. Er wird fast ausschließlich zur MAP-Diagnostik bei Schafen, vor allem in Australien, verwendet (Reinshagen 2009). Die Vorteile des AGIDT liegen in der einfachen, schnellen und kostengünstigen Durchführung sowie der hohen Spezifität, welche sich durch Vorabsorbtion mit M. phlei-Extrakt noch verbessern lässt und dann nahezu 100 % beträgt (Merkal et al. 1968; Ris et al. 1988). Die Anwendung des Agargel- Immundiffusionstests (AGID) ist nur bei Tieren mit klinischer Symptomatik sinnvoll, weil nur dann eine gerade noch akzeptable Sensitivität von 50 % erreicht wird (Ris et al. 1988). Für Bestandsuntersuchungen kommen beide Tests wegen ihrer geringen Spezifität nicht in Frage (Reinshagen 2009).

1.6 MAP-Genotypisierungsmethoden

1.6.1. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)

Die RAPD-Analyse ist eine einfache und kostengünstige PCR-basierte Fingerprint-Technik (Fawzy et al. 2016). Bei dieser Analyse wird die genomische DNA direkt unter PCR- Bedingungen mit niedriger Stringenz unter Verwendung eines einzelnen kurzen Primers (10–

22 Basen) einer beliebigen Sequenz amplifiziert. In der letzten Dekade des 20. Jahrhunderts wurde RAPD häufig zur Subtypisierung verschiedener Organismen wie Mycoplasmen, M.

tuberculosis und M. avium verwendet (Sevilla et al. 2008). Später fand man heraus, dass nur ein Primer - unter 20 verschiedenen Primern, die in einem kommerziellen Kit erhältlich sind - zur Identifizierung und Subtypisierung von MAP und M. avium mittels RAPD-Analyse geeignet ist (Pillai et al. 2001). Sechs verschiedene Genotypen wurden sowohl für MAP- als auch für M.

avium-Isolate mit dieser Methode identifiziert (Fawzy et al. 2016).

1.6.2 Amplified fragment length polymorphism (AFLP)

AFLP ist eine schnelle PCR-basierte Fingerprint-Technik. Dabei wird die DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen fragmentiert und anschließend mit einem Adapter ligiert, welche

komplementär zu den Restriktionsregionen sind (Pillai et al. 2001). Die adaptierten Restriktionsfragmente werden dann mittels PCR amplifiziert und auf Polyacrylamidgelen entweder durch Autoradiographie oder durch Fluoreszenz basierte Verfahren sichtbar gemacht. Eine Vielzahl von Restriktionsenzymen und Adaptern/Primern können kombiniert werden, was AFLP zu einem flexiblen Werkzeug macht (Sevilla et al. 2008). Dieses ist für verschiedene Anwendungen, wie genetische Charakterisierung und genetische Kartierung geeignet. Darüber hinaus ist AFLP auf der gesamten Genomebene empfindlich gegenüber dem Nachweis von Polymorphismen. Jedoch leidet die AFLP-Methode unter einigen Einschränkungen wie der Notwendigkeit einer gereinigten DNA mit hohem Molekulargewicht, einer schlechten Reproduzierbarkeit und einer Schwierigkeit der Standardisierung aufgrund einer subjektiven Interpretation der Bandenmuster (Fawzy et al. 2016).

1.6.3 Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)

PFGE ist eine auf Fingerprint basierende Genotypisierungstechnik, die erstmals von Schwartz und Cantor in 1984 zur Trennung von Hefechromosomen beschrieben wurde. PFGE ist eine spezielle Form der Gelelektrophorese, bei der eingeschränkte DNA-Fragmente einer periodischen Neuorientierung des elektrischen Feldes relativ zur Gelrichtung unterzogen werden, um eine bessere Trennung der DNA-Fragmente zu ermöglichen (Schwartz, Cantor 1984). In Australien wurde die PFGE-Methode erstmals zur Genotypisierung von MAP-Isolaten verschiedener Wiederkäuerarten eingesetzt (Feizabadi et al. 1997). Die PFGE-Methode konnte zwischen den drei Haupt-MAP-Typen (I, II und III) unterscheiden. In einem ersten Schritt wurden pigmentierte und nicht pigmentierte MAP-Isolate in zwei genetische Gruppen (Typ I und Typ II) eingeteilt (Stevenson et al. 2002). Später wurde festgestellt, dass MAP-Isolate vom Typ III unterschiedliche PFGE-Fingerabdruckprofile aufweisen (Möbius et al. 2008a). Die PFGE-Methode wird allerdings in der Literatur nicht allgemein als MAP-Typisierungstechnik beschrieben (Schwartz und Cantor 1984; Feizabadi et al. 1997).

1.6.4 IS900-restriction fragment length polymorphisms (IS900-RFLP)

RFLP ist ebenfalls ein auf Fingerprint, basierender Typisierungsansatz, bei dem das Genom eines Organismus mit einem oder mehreren Restriktionsendonukleaseenzymen verdaut wird, gefolgt von der Elektrophorese der DNA-Fragmente. Diese Fragmente werden dann auf eine Membran übertragen ("Southern Blot"), wo sie mit einer markierten DNA-Sonde hybridisiert werden, die auf eine MAP-spezifische Insertionssequenz (IS900) abzielt (Möbius et al. 2008a).

Die IS900-RFLP nutzt die IS900-Insertionsstellen, die sich von einem MAP-Stamm zum anderen unterscheiden. Die meist verwendeten Enzyme sind: BstEII, PvuII und PstI. Die Kombination der Ergebnisse von zwei oder mehreren IS900-RFLP-Reaktionen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme erhöht die Gesamtdiskriminationskraft/-index (DI) der MAP-Genotypisierung (Möbius et al. 2008a). Der DI ist ein Zahlenwert im Bereich von 0 - 1, der die Wahrscheinlichkeit beschreibt, dass eine bestimmte Typisierungsmethode zwischen zwei epidemiologisch nicht verwandten Stämmen einer bestimmten Population unterschieden werden können (Möbius et al. 2008a). Mithilfe der IS900-RFLP konnte auch zwischen den drei Haupt-MAP-Typen „Typ I oder S“, „Typ II oder C“ und „Typ III oder Intermediär“ unterschieden werden (Collins et al. 1990). Dennoch weist die RFLP-Methode Nachteile auf, die seine Verwendung, insbesondere nach dem Fortschritt der Sequenzierungstechnologien in den letzten Jahren, einschränken. Es ist mühsam, zeitaufwendig und erfordert eine erhebliche Menge an Kulturmaterial für die genomische DNA-Extraktion (Collins et al. 1990; Möbius et al. 2008a).

1.6.5 Multi-locus short sequence repeats (MLSSR)

In einem ersten Screening der SSR (short sequence repeats) im MAP-Genom wurden einige Mono-, Di- und Tri-Nucleotid-Wiederholungen durch In-Silico-Analyse des ersten vollständigen MAP-Genoms, des MAP-Stamms K10 (Li et al. 2005), identifiziert. Diese Wiederholungen zeichnen sich durch eine ganzzahlige Anzahl identischer Kopien der ursprünglichen Wiederholungssequenz aus, wohingegen unvollständige Wiederholungen eine Folge von n ganzzahligen Kopien plus ein Fragment der ursprünglichen Wiederholungssequenz besitzen können (Amonsin et al. 2004). In einer vorläufigen Analyse unter Verwendung einer Untergruppe verschiedener MAP-Isolate wurde festgestellt, dass elf

dieser Wiederholungen polymorph sind (SSR1- SSR11) (Amonsin et al. 2004). In einem sequenzbasierten Ansatz wurden diese polymorphen Loki anschließend für die Typisierung von 27 genetisch verschiedenen MAP-Isolaten verwendet. Die Analyse zeigte einen hohen DI von 0,96, indem 20 verschiedene SSR-Typen (zwei phylogenetische Hauptgruppen) identifiziert wurden, die ausreichten, um epidemiologische Untersuchungen zu unterstützen.

Weiterhin wurde die Stabilität von diesen SSR-Loki als genetische Marker untersucht und das Ergebnis zeigte, dass die untersuchten Loci, ausgenommen SSR2, nach zehn in-vitro-Passagen von drei genetisch unterschiedlichen MAP-Isolaten unverändert stabil blieben (Harris et al.

2006). Aufgrund der Instabilität des SSR2-Lokus wurde empfohlen, diesen Lokus bei epidemiologischen Untersuchungen nicht zu verwenden (Harris et al. 2006). Aufgrund der technischen Einschränkungen bei der Sequenzierung eines langen Abschnitts einer Mononukleotidwiederholung wurde vorgeschlagen, dass mehr als zehn Guaninbasen am SSR- Lokus 1 als ≥11G interpretiert werden sollten, was aber die Diskriminationskapazität dieses Lokus einschränkt. Es wurden verschiedene Versuche unternommen, um dieses Problem zu lösen, indem die genaue Kopienzahl an diesem Lokus entweder durch Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) (Ahlstrom et al.

2014) oder durch kapillargelelektrophoresebasierte Fragmentanalyse bestimmt wurde (Podder et al. 2015). Dadurch wurde die Erkennungsgrenze für Kopiennummern am SSR- Standort 1 auf 15 bzw. 21 Nukleotide erweitert, um somit eine bessere Diskriminationskapazität für den Lokus SSR1 zu erreichen.

1.6.6 Single nucleotide polymorphisms (SNP)

Single nucleotide polymorphisms (SNPs) sind Punktmutationen einzelner Nukleotide entlang des Genoms und daher stabile genetische Marker, mit denen die phylogenetische Vorgeschichte eines Organismus zurückverfolgt werden kann (Li et al. 2005). Die Verfügbarkeit des ersten vollständigen MAP-Genoms hat die Wissenschaftler dazu veranlasst, nach SNPs zu suchen, die zur MAP-Typisierung und für phylogenetische Analysen verwendet werden können (Li et al. 2005). Untersuchungen einzelner oder mehrerer Gensequenzen wie z.B. das 65 kDa Hitzeschockprotein (hsp65), das chromosomale Replikationsinitiatorprotein (dnaA), die DNA-Polymerase III-Untereinheit Beta (dnaN), die DNA-Topoisomerase IV- Untereinheit B (gyrB), die DNA-Gyrase-Untereinheit A (gyrA) und andere ermöglichten es

Wissenschaftlern, SNPs zu finden, die es erlauben, zwischen den wichtigsten MAP-Typen (I, II und III) zu unterscheiden (Li et al. 2005; Turenne et al. 2008).

1.6.7 Whole genome sequencing (WGS)

Unter Verwendung eines Shotgun-Sequenzierungsansatzes wurde 2005 die erste Genomsequenz des MAP-Rinderstamms K10 veröffentlicht (Li et al. 2005). Dieses hat nachfolgende MAP-Genstudien für diagnostische, vergleichende genomische und epidemiologische Zwecke erleichtert. Seitdem wurden auch vollständige Genome anderer MAP-Isolate aus verschiedenen geografischen Gebieten veröffentlicht. Derzeit sind 44 MAP- Genome aus verschiedenen MAP-Isolaten in der Genomdatenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes) des Nationalen Zentrums für biotechnologische Informationen (NCBI) hinterlegt (Bannantine et al. 2012). Mit Hilfe der genomischen Unterschiede verschiedener MAP-Isolate ist es möglich, diese in unterschiedlichen Stämmen zu vergleichen, um epidemiologische Ausbrüche zu verstehen (Bannantine et al. 2014). Obwohl diese Methode hochauflösende Ergebnisse liefert wie z.B.

einzelne Mutationen, Insertionen und Deletionen, sind die damit verbundenen Kosten noch immer nicht für jeden Wissenschaftler erschwinglich (Li et al. 2005).

1.7 MAP und Morbus Crohn

Im Gegensatz zu Tieren erkranken Menschen nicht an der Johne'schen Krankheit. Ein Zusammenhang zwischen MAP und MC, einer chronischen Darmentzündung des Menschen, wird seit einer Veröffentlichung im Jahr 1913 diskutiert (Pierce 2009). Seitdem gibt es viele Untersuchungen, die sich mit einem möglichen Zusammenhang beschäftigen. Klar ist jedoch, dass MAP sowohl aus Darmbiopsien von MC Patienten als auch von gesunden Probanden isoliert werden konnte (Collins et al. 2000; Stephan 2007; Pierce 2009). Die Studien untersuchten Darmbiopsien von MC-positiven und MC-negativen Patienten mit IS900-RFLP und verglichen die Ergebnisse mit MAP-positivem Schaf- und Ziegenkot- sowie Darmproben.

Mit der IS900-RFLP-Methode konnte die Typ S-Gruppe unter den drei Spezies nachgewiesen werden, und dieses deutet auf eine MAP-Übertragung zwischen Tier und Mensch hin. MAP

zeichnet sich durch eine außergewöhnlich hohe Tenazität aus und kann sowohl die Käseherstellung als auch die Pasteurisierung überleben (Gao et al. 2002). Es konnte allerdings gezeigt werden, dass die MAP-Erregerlast in Milch durch die Pasteurisierung um mindestens 4 bis 5 log-Stufen reduziert wird und somit in herkömmlicher, pasteurisierter Milch nur eine Rolle bei immunsupprimierten Patienten spielt (Rowe und Donaghy 2008). Hingegen stellen Rohmilch und deren Produkte eine Gefahr für den gesunden Menschen dar (Feta Käse, Paneer; indischer Rohmilchkäse, etc.) (Ikonomopoulos et al. 2005; Singh et al. 2016).

Verschiedene Studien konnten zeigen, dass die MAP Bakterienlast in diesen Produkten erhöht ist und somit eine Erkrankung bei dem Endverbraucher ausgelöst werden kann (Spahr und Schafroth 2001; Eltholth et al. 2009; Bharathy et al. 2017).

1.8 MAP und resultierende wirtschaftliche Verluste

Eine MAP-Erkrankung führt vor allem bei Viehhaltern, die diese Tiere als Haupterwerb halten, zu enormen wirtschaftlichen Verlusten (Imirzalioglu et al. 2011; Gilardoni et al. 2016). Viele wissenschaftliche Studien haben gezeigt, dass die subklinische MAP-Infektion, zu einer Verringerung der Milchleistung (600 kg/Kuh und Laktation) geführt hat (Pritchard et al. 2016).

Bei konstanter Futteraufnahme leiden die Tiere unter Gewichtsverlust, produzieren weniger Milch und Milch mit geringerem Fett- und Proteingehalt (Elzo et al. 2006; Kuepper et al. 2013).

Der wirtschaftliche Schaden der MAP-Infektion ist nicht nur bei der Kuhmilchproduktion, sondern auch bei Schafen und Ziegen ein ernstes Problem (Weber 2006). Während die Schaffleischproduktion weltweit zurückgeht, liegt die Wollproduktion bei 2,2 Millionen Tonnen pro Jahr (Henry 2011). Länder wie Australien, Neuseeland, Deutschland, Großbritannien und Nordirland gehören zu den führenden Produzenten von Schafwolle für die Bekleidungsindustrie (FAO 2016). Weitere wirtschaftliche Verluste durch MAP sind bei der Herstellung von Schafmilchprodukten wie Feta-Käse zu verzeichnen. Feta-Käse hat in den letzten Jahren an Popularität gewonnen (Salgado et al. 2007). Zwei Studien in Australien lieferten objektive Informationen zu den wirtschaftlichen Auswirkungen von JD bei Schafen.

Der Durchschnitt der durch die Krankheit verursachten Todesfälle lag bei 6,2 % der adulten Tiere in der Herde pro Jahr (Elzo et al. 2006; Kuepper et al. 2013). Die Sterblichkeitsraten in den Herden lagen zwischen 2,1 und 17,5 % pro Jahr, wobei MAP für 69 % aller Todesfälle in den untersuchten Betrieben verantwortlich war (Vlontzos und Areos 2007). Zusätzlich

ergaben die Studien, dass eine MAP-Infektion zu einer durchschnittlichen Verringerung der erwarteten Gewinnspanne in jedem Betrieb um 6,4 % führte (Bush et al. 2006). Im Gegensatz zu Rindern weisen die meisten Schafe, die an der Johne´schen Krankheit sterben, eine normale Kotzusammensetzung auf, so dass Durchfall bei kleinen Wiederkäuern nur im Endstadium der Krankheit als signifikantes Zeichen für Paratuberkulose angesehen wird (Robbe-Austerman 2011; Tuerlinckz et al. 2018). Eine MAP-Infektion bei Schafen bleibt tendenziell verborgen und zeigt nur indirekte Auswirkungen auf die Produktion (Hasanova und Pavlik 2006). In den letzten Jahren meldeten mehrere andere europäische Länder wie Großbritannien, Italien und Frankreich aber auch Chile vermehrt MAP-Nachweise in Ziegen (Kruze et al. 2006; Windsor 2015). Ziegen zeigen erst in einem späten Krankheitsstadium, ebenso wie Schafe, Anzeichen von Durchfall (Robbe-Austerman 2011). Sie fallen durch Gewichtsverlust auf und entwickeln

ein trockenes, raues Haarkleid (Abbildung 4). Ziegen sowie Schafe scheiden MAP mit der Milch aus (Moser 1982) Die größten Ziegenmilcherzeuger sind Frankreich, Spanien und Griechenland mit einer Jahresproduktion von bis zu 5,3 Mio. Tonnen im Jahr. Spanien ist mit über 150.000 Tonnen im Jahr einer der führenden Hersteller von Ziegenfleisch (De-Arriba und Sánchez-Andrés 2014). Um wirtschaftliche Schäden zu vermeiden, ist es unerlässlich, infizierte Tiere zu diagnostizieren, die die Krankheit verbreiten. Da es keine Mittel gegen MAP gibt, besteht die einzige Kontrolle des Herdenmanagements darin, die Tiere genau zu überwachen und infizierte Individuen so früh wie möglich aus der Herde zu entfernen (Bastida und Juste 2011).

Abbildung 4: Darstellung von zwei an MAP erkrankten Schafen mit einem trockenen und rauhen Haarkleid sowie der Ausprägung eines sog. Bottlenecks (Lymphknotenschwellungen am Hals).

2 Ziele dieser Arbeit

Der Fokus dieser Arbeit lag spezifisch auf kleinen Wiederkäuern, die im Gegensatz zu Rindern erst sehr spät klinische Anzeichen der Erkrankung zeigen. Während Rinder bereits in der subklinischen Phase wässrigen Durchfall aufweisen, zeigt sich dieses deutliche Symptom bei kleinen Wiederkäuern erst kurz vor dem Tod. Eine stetige Gewichtsabnahme bei normalem Fressverhalten wird oftmals zu spät erkannt. Erst wenn ein chronischer Durchfall in der klinischen Phase besteht, werden die Tierhalter auf eine mögliche Erkrankung mit MAP aufmerksam. Daher wurde in dieser Arbeit eine sensitive und schnelle Detektionsmethode, basierend auf dem Insertionselement ISMap02, isoliert aus Kot und Milch, etabliert und validiert. Diese Methode ist im Gegensatz zur konventionellen PCR kostengünstiger und Ergebnisse sind bereits nach 30 Minuten verfügbar. Eine lückenlose Überwachung einer möglichen MAP- Infektion des Tierbestandes ist somit frühzeitig gegeben. Ebenso wurde der Aspekt auf die Genotypisierung von MAP gelegt. Es ist bekannt, dass MAP nicht nur bei Wiederkäuern auftritt, sondern auch in anderen Spezies.Diese Tatsache weist darauf hin, dass MAP nicht artspezifisch ist. Das zoonotische Potenzial von MAP ist jedoch trotz 30-jähriger Forschung noch nicht vollständig geklärt. Die Rolle, die MAP bei MC spielen kann, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Obwohl es viele Wissenslücken über die Exposition und die Bedingungen gibt, unter denen diese Krankheit beim Menschen auftritt, ist es wichtig, das Risiko einer Exposition des Menschen gegenüber MAP aus verschiedenen Quellen, einschließlich des direkten Kontakts mit Tieren, der Umwelt und des Verzehrs potenziell kontaminierter Lebensmittel, besser zu verstehen. Aus diesem Grund wurden MAP-Isolate von verschiedenen Spezies auf gemeinsame MIRU-VNTR-Muster untersucht, um den möglichen Austausch zwischen verschiedenen Spezies zu eruieren.

3 Studien

I. Study:

Development and validation of a loop-mediated isothermal amplification assay—a rapid and sensitive detection tool for Mycobacterium avium subsp.

paratuberculosis in small ruminants.

Authors: Marie Daniéle Sange¹, André Becker², Abdulwahed Ahmed Hassan³, Michael Bülte³, Martin Ganter⁴, Ursula Siebert¹, Amir Abdulmawjood^2*

1Institute for Terrestrial and Aquatic Wildlife Research, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany

2Research Center for Emerging Infections and Zoonoses, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany

3Institute of Food Science, Faculty of Veterinary Medicine of the Justus-Liebig-University Gießen, Gießen, Germany

4Clinic for Swine, Small Ruminants and Forensic Medicine, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany

*Corresponding author:

E-mail: Amir.abdulmawjood@tiho-hannover.de

Abstract

Aims: The aim of this study was to design an assay for the identification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) to be used in feces and milk samples of small ruminants with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) system, as a time-saving and user- friendly method in contrast to real-time PCR.

Methods and Results: For the detection of MAP in milk and feces of small ruminants, we developed a set of primers, specific for the target gene ISMap02. The analytical sensitivity of LAMP, when targeting ISMap02, showed a DNA detection limit of 10 fg/μl. After performing spiking experiments with two MAP reference strains, DSM 44133 and Niebüll, the limit of detection, using the LAMP protocol described herein was 3.8 MAP CFU/ml milk and 12.5 MAP CFU/g feces. All LAMP results during the establishment of the assay were compared to those of the real-time PCR results. An internal amplification control was incorporated into the assay to exclude false-negative results produced and had no significant negative impact on the analytical sensitivity. Validation of the assay was confirmed by testing field samples of feces and revising the results with real-time PCR.

Conclusion: Our study conducted the first MAP detection system with a LAMP targeting ISMap02. Due to the positive results we encourage the use of LAMP in combination with ISMap02, when detecting MAP in feces samples, as an alternative to targeting other genes as f57 or IS900. Further research on MAP detection in different matrices like raw milk, tissue or sperm with this system is recommended.

Significance and Impact of the Study: This study provides new achievements in MAP diagnostic. Especially small ruminants do not show signs of diarrhea until the terminal stage of the illness. The greatest task in fighting MAP is to rule out animals, which shed MAP with feces and milk before showing symptoms of Johne’s disease. Worldwide there is a need to eradicate animals, which are low MAP shedders to stop the illness spreading in animal holdings. MAP detection with LAMP is time saving, easy to use, does not need expensive equipment, as, for example, PCR kits and can be used without access to laboratories. The target gene ISMap02 was shown to be a specific insertion element for MAP and is a reliable aim in future MAP detection studies.

Introduction

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of Johne's disease (JD) in cattle. JD is a chronic, granulomatous severe form of gastroenteritis with progressive weight loss and emaciation affecting domestic and wild ruminants, e.g., cattle, sheep, goats, red deer, and rabbits worldwide (Harris and Barletta 2001, Raizman et al. 2005, Imirzalioglu et al. 2011). Infected livestock periodically shed MAP via feces and milk, which results in environmental distribution, where MAP can survive for extended periods (Eppleston et al.

2014). A subsequent consequence is an economic damage. Many scientific studies have shown that subclinical paratuberculosis, the form in which no symptoms of disease are present, has led to a reduction in milk yield (600 kg/cow/lactation) (Pritchard et al. 2016).

With constant feed intake, the animals suffer from weight loss; produce less milk and milk with lower fat and protein content (Kuepper et al. 2013; Hasanova and Pavlik 2006; McNees et al. 2015). Not only is the economic damage of paratuberculosis in cow milk production a serious problem, but also in sheep and goat holdings (Weber 2006; Ayele 2001). While sheep meat production is decreasing worldwide, the wool production lies at 2.2 million tons per year (Henry 2011). Countries as Australia, New Zealand, Germany, Great Britain and Northern Ireland are one of the leading producers of sheep wool for the clothing industry (FAO 2016).

Other economic losses caused by JD, is the production of sheep milk products, as feta cheese.

Feta cheese has gained popularity over the last few years. Two studies in Australia provided objective information on the economic impact of JD in sheep, revealing that the average of deaths caused by the disease was 6.2 % of adults in the flock every year. Death rates in the flocks ranged from 2.1 to 17.5 % per year, with MAP being responsible for 69 % of all deaths in the studied farms (Vlontzos and Areos 2007). Additionally, the studies determined that a MAP-infection resulted in an average reduction of 6.4 % in the expected profit margin in each farm, which included the direct costs associated to the disease, such as production costs due to animal death (Bush et al. 2006). Unlike cattle, most of the sheep that die from JD showed normal fecal composition, so diarrhea is not seen as a significant sign of paratuberculosis in small ruminants, except in the terminal stages of the disease (Robbe-Austerman 2011;

Underwood and Schoell 2015; Tuerlinckx et al. 2018). Paratuberculosis in sheep tends to remain hidden, showing only indirect effects in the production (Hasanova and Pavlik 2006).

Other small ruminates than sheep are also susceptible to MAP. First findings in goats were reported in 1912. From then on in the following years the disease was reported in several