Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis bei Schlachtrindern

(1)

Nachweis von

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis

bei Schlachtrindern

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Julia Elze aus Wolfen

Hannover 2009

(2)

Friedrich-Loeffler-Institut

Dr. H. Köhler

Institut für molekulare Pathogenese Friedrich-Loeffler-Institut

1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. E. Liebler-Tenorio 2. Gutachter: Prof. Dr. J. Rehage

Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2009

gefördert durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung, Hamburg

(3)

Meiner Familie

(4)

(5)

1. EINLEITUNG... 11

2. SCHRIFTTUM... 13

2.1. Historischer Überblick... 13

2.2. Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis... 13

2.2.1 Taxonomie und Morphologie ... 13

2.2.2 Erregereigenschaften ... 14

2.2.3 Geographische Verbreitung und Prävalenz ... 15

2.2.4 Wirtsspektrum... 19

2.3. Erkrankungsbild ... 20

2.3.1 Empfänglichkeit ... 20

2.3.2 Erregerausscheidung und Übertragungswege... 21

2.3.3 Pathogenese... 21

2.3.4 Erkrankungsstadien und klinisches Bild ... 25

2.3.5 Pathologisches und histologisches Bild... 26

2.4 Infektionsnachweis... 28

2.4.1 Direkte Nachweisverfahren und deren Einsatzmöglichkeiten zur Prävalenzerhebung... 28

2.4.1.1 Mikroskopischer Erregernachweis ... 28

2.4.1.2 Kultureller Erregernachweis... 30

2.4.1.3 Methodik der kulturellen Anzucht ... 31

2.4.1.4 Speziesidentifikation mittels Molekularbiologie... 32

2.4.2 Indirekte Nachweisverfahren und deren Einsatzmöglichkeiten zur Prävalenzerhebung... 33

2.4.2.1 Nachweis der zellulären Immunantwort ... 33

2.4.2.2 Nachweis der humoralen Immunantwort: ELISA ... 33

2.4.2.3 Nachweis der humoralen Immunantwort: KBR, AGIDT ... 34

2.5 Wirtschaftliche Bedeutung ... 35

2.6 Bekämpfung und Sanierung ... 36

2.6.1 Impfung und therapeutische Möglichkeiten... 36

2.6.2 Bekämpfungsprogramme des Bundes und der Länder... 38

2.7 Morphologie des Dünndarms und der Lymphknoten ... 39

2.7.1 Anatomischer Aufbau des Darmes ... 39

2.7.2 Histologischer Aufbau der Darmwand ... 40

2.7.3 Darmschleimhautassoziiertes lymphatisches Gewebe unter besonderer Berücksichtigung der Peyerschen Platten... 41

2.7.4 Verteilung von Immunzellen in der Tunica mucosa des Dünndarms ... 43

2.7.5 Aufbau der Lymphknoten ... 45

2.7.6 Zellulärer Aufbau der Lymphknoten... 46

3. MATERIAL UND METHODEN ... 48

3.1 Studiendesign ... 48

3.1.1 Teilstudie 1 ... 48

3.1.2 Teilstudie 2 ... 50

3.2 Probenentnahme und Probenlagerung... 52

3.3 Tiermaterial... 52

3.3.1 Teilstudie 1 ... 53

(6)

3.3.2 Teilstudie 2 ... 54

3.4 Bakteriologische Untersuchung... 54

3.4.1 Mikroskopische Untersuchung des Organmaterials... 54

3.4.2 Kulturelle Untersuchung ... 55

3.4.3 Molekularbiologische Spezifizierung... 58

3.5 Histologische Untersuchung des Organmaterials ... 60

3.5.1 Paraffineinbettung und Anfertigung von Paraffinschnitten... 60

3.5.2 Färbung der Paraffinschnitte... 61

3.5.3 Lichtmikroskopische Beurteilung der histologischen Schnitte... 62

3.6 Immunhistologische Untersuchung... 65

3.6.1 Fertigung der Gefrierschnitte ... 65

3.6.2 Allgemeiner Reaktionsablauf der immunhistologischen Markierung ... 65

3.6.3 Darstellung von bovinen CD-Antigenen, Immunglobulinen und Mykobakterien-Antigen mittels indirekter Immunperoxidase-Reaktion am Gefrierschnitt... 66

3.6.4 Lichtmikroskopische Beurteilung der immunhistologisch markierten Gefrierschnitte... 69

3.6.5 Darstellung von Mykobakterien-Antigen mittels indirekter Immunperoxidase-Reaktion am paraffinschnitt ... 70

3.7 Statistische Auswertung ... 71

4. ERGEBNISSE... 73

4.1 Ergebnisse der makroskopischen, mikrobiologischen und histologischen Untersuchung der Organproben von Schlachtrindern mit makroskopischen Veränderungen einer granulomatösen Enteritis (Teilstudie 1)... 73

4.1.1 Ergebnisse der makroskopischen Untersuchung ... 73

4.1.1.1 Bewertungen einzelner makroskopischer Parameter an den Darmproben ... 73

4.1.1.2 Bewertungen der makroskopischen Veränderungen an den Organproben (makroskopischer Gesamtscore)... 79

4.1.2 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung ... 80

4.1.2.1 Bakterioskopische Untersuchung... 80

4.1.2.2 Kulturelle Untersuchung ... 81

4.1.2.3 Vergleich der makroskopischen Befunde mit den Ergebnissen der bakteriologischen Untersuchung bei Rindern mit makroskopischen Darmveränderungen ... 85

4.1.3 Ergebnisse der histologischen und immunhistologischen Untersuchung ... 86

4.1.3.1 Histologische Befunde ... 86

4.1.3.2 Ergebnisse des Erregernachweises mittels Ziehl-Neelsen-Färbung ... 90

4.1.3.3 Ergebnisse des Erregernachweises mittels immunhistologischer Markierung ... 93

4.1.3.4 Vergleich des Nachweises des Erregers im Gewebe mittels Ziehl-Neelsen-Färbung und immunhistologischer Markierung ... 94

4.1.3.5 Histologischer Score ... 95

(7)

4.1.3.6 Vergleich zwischen den makroskopischen, histologischen und immunhistologischen Befunden bei Rindern mit makroskopischen

Darmveränderungen………..113

4.1.4 Paratuberkulose-Prävalenz bei Beprobung von Schlachtrindern mit makroskopischen Darmveränderungen... 117

4.2 Ergebnisse der makroskopischen, mikrobiologischen und histologischen Untersuchung der Organproben von Schlachtrindern ohne makroskopische Veränderungen einer granulomatösen Enteritis (Teilstudie 2)... 119

4.2.1 Makroskopische Befunde ... 119

4.2.2 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung ... 119

4.2.2.1 Bakterioskopische Untersuchung... 119

4.2.2.2 Kulturelle Untersuchung ... 119

4.2.3 Ergebnisse der histologischen und immunhistologischen Untersuchung .... 121

4.2.3.1 Histologische Befunde ... 121

4.2.3.2 Ergebnisse des Erregernachweises mittels immunhistologischer Markierung ... 123

4.2.4 Paratuberkulose-Prävalenz bei Beprobung von Schlachtrindern ohne makroskopische Darmveränderungen ... 123

4.3 Vergleich der Sensitivität der Nachweismethoden bei Untersuchung der Proben aus Teilstudie 1 und Teilstudie 2 ... 124

4.3.1 Vergleich der Nachweismethoden aus Teilstudie 1... 124

4.3.1.1 Korrelation der Ergebnisse der diagnostischen Methoden ... 126

4.3.1.2 Vergleich der makroskopischen Befunde mit den Ergebnissen der Nachweismethoden ... 128

4.3.2 Vergleich der Ergebnisse der Nachweismethoden aus Teilstudie 2 ... 129

4.3.2.2 Korrelation der Ergebnisse der diagnostischen Methoden ... 131

4.4 Charakterisierung der zellulären Subpopulationen in den granulomatösen Veränderungen... 132

4.4.1 Probenmaterial ... 132

4.4.2 CD68⁺ Zellen... 133

4.4.2.1 in histologisch unveränderten, nicht erregerhaltigen Organen (HS 0a) ... 134

4.4.2.2 in kulturell MAP-positiven Organen ohne histologische Läsionen (HS 0b, HS 0c)... 134

4.4.2.3 in granulomatös veränderten Organen mit den histologischen Scores 1-6... 137

4.4.3 CD4⁺-T-Lymphozyten... 140

4.4.4 CD8⁺-T-Lymphozyten... 148

(8)

4.4.4.1 in histologisch unveränderten, nicht erregerhaltigen Organen (HS 0a)

... 148

4.4.5 Verhältnis von CD4⁺-T-Lymphozyten zu CD8⁺-T-Lymphozyten ... 153

4.4.5.1 Verhältnis von CD4⁺-T-Zellen zu CD8⁺-T-Zellen in histologisch unveränderten, nicht erregerhaltigen Organen (HS 0a)... 153

4.4.5.2 Verhältnis von CD4⁺-T-Zellen zu CD8⁺-T-Zellen in kulturell MAP- positiven Organen ohne histologische Läsionen (HS 0b, HS 0c)... 153

4.4.5.3 Verhältnis von CD4⁺-T-Zellen zu CD8⁺-T-Zellen in granulomatös veränderten Organen mit den histologischen Scores 1-6... 154

4.4.6 γδ-T-Lymphozyten ... 156

4.4.7 CD1⁺-Zellen... 159

4.4.7.2 in kulturell MAP-positiven Organen ohne histologische Veränderungen (HS 0b, HS 0c)... 160

4.4.8 MHC-II⁺Zellen... 163

4.4.9 IgA⁺Plasmazellen ... 167

4.4.9.3 in histologisch granulomatös veränderten Organen mit den histologischen Scores 1-6... 167

5. DISKUSSION ... 170

6. ZUSAMMENFASSUNG... 183

7. SUMMARY ... 185

8. LITERATURVERZEICHNIS ... 187

9. ANHANG ... 219

(9)

Abkürzungen

µ mikro (x10^-6) Abb. Abbildung

AFB acid fast bacillus (säurefeste Stäbchen)

Ag Antigen

ANV Amphotericin B, Nalidixinsäure, Vancomycin bidest bidestillatus

BSA bovine serum albumin

CD cluster of differentiation

DAB Diaminbenzidintetrachlorid-dihydrat-Lösung

DEPC Diethylpyrocarbonat dest. destillatus

DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxyribonukleosidtriphospat

DPBS Dulbecco´s Phosphat-gepufferte Salzlösung

EpZ Epitheloidzelle

°C Grad Celsius g Gramm

h Stunde (lat. hora)

HE Hämalaun-Eosin-Färbung

HPC Hexadecylpyridiniumchlorid

I.E. Internationale Einheiten

Ig Immunglobulin

IS Insertionssequenz

kHz Kiloherz

KI Konfidenzintervall

l Liter

Lp Lamina propria

m milli (x10^-3) M. Mykobakterium

(10)

M mol/l

makr. makroskopisch

mm Millimeter

min Minute(n)

Nl./ Nll. Nodus lymphaticus/ Nodi lymphatici

Nr. Nummer

PANTA Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixinsäure, Trimethoprim, Azlocillin

PBS phosphate-buffered saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung) PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

RZ Riesenzelle

s Sekunde(n) ssp. subspezies Tab. Tabelle

Taq Thermus aquaticus

TBE-Puffer TRIS-Borat-EDTA-Puffer

TH-Zellen T-Helferzellen

Treg regulatorische T-Zellen

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U/min Umdrehungen pro Minute

U/µl enzym unit/microliter

UV Ultraviolett verg. vergällt

ZN Ziehl-Neelsen-Färbung

% Prozent

∞ unendlich

(11)

1. Einleitung und Zielsetzung

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der unheilbaren, mit Leistungsabfall, Durchfall und Abmagerung einhergehenden und schließlich mit dem Tod endenden Paratuberkulose. Die Erkrankung ist weltweit verbreitet und zeigt eine zunehmende Ausbreitung (BAKKER et al. 2000; BAUMGARTNER et al. 2005). In Deutschland ist die Paratuberkulose meldepflichtig.

Die Infektion der Tiere erfolgt bereits im Kälberalter, bis zum Auftreten erster klinischer Symptome kann eine Inkubationszeit von 2 bis 10 Jahren vergehen (WHITLOCK u.

BUERGELT 1996). Jedoch bereits durch subklinisch erkrankte Tiere entstehen in den betroffenen Betrieben hohe wirtschaftliche Verluste (OTT et al. 1999). Die Erkrankung tritt beim Wiederkäuer auf, der Erreger konnte aber auch bei monogastrischen Tieren und beim Menschen isoliert werden (CHIODINI et al. 1984a). Eine Infektionsgefahr für den Menschen mit Beteiligung des Erregers am Krankheitsbild des Morbus Crohn wird diskutiert (CHIODINI u. ROSSITER 1996).

Aufgrund der hohen wirtschaftlichen Verluste, dem potentiell zoonotischem Charakter sowie der zunehmenden Ausbreitungstendenz ist eine Bekämpfung der Paratuberkulose von großer Wichtigkeit. Entscheidungen über das Vorgehen bei der Bekämpfung der Paratuberkulose auf nationaler Ebene hängen jedoch von der Kenntnis der wahren Prävalenz der Erkrankung auf Herden- und möglichst auch auf Einzeltierebene ab. Über die Prävalenz in Deutschland liegen keine verlässlichen Angaben vor, da eine sichere Erkennung von vor allem in frühen Erkrankungsphasen befindlichen Tieren mit den derzeit zur Verfügung stehenden Untersuchungsmethoden intra vitam nicht möglich ist.

Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob im Rahmen der Schlachtkörperuntersuchung durch gezielte Beprobung von makroskopisch für eine granulomatöse Enteritis verdächtigen Rindern eine Prävalenzerhebung möglich ist. Die Untersuchung der Organproben erfolgte mit kulturellen und histologischen Methoden. Diese Nachweisverfahren werden als die Methoden mit der höchsten Sensitivität angesehen. Bestehende Einschränkungen in der intra vitam Diagnostik könnten damit vermieden und auch Tiere in frühen Erkrankungsstadien erkannt werden.

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Im Einzelnen sollten mit der vorliegenden Arbeit folgende Fragen beantwortet werden:

• Ist durch Anwendung makroskopischer Selektionskriterien eine sichere Erkennung von mit MAP infizierten Rindern bei der Schlachtkörperuntersuchung möglich?

• Können auf der Basis der Schlachtkörperuntersuchung bereits frühe Stadien der MAP-Infektion identifiziert werden?

• Ist eine makroskopische Vorauswahl der zu beprobenden Rinder in Hinblick auf eine Prävalenzerhebung sinnvoll oder sollten auch Tiere mit unveränderten Därmen untersucht werden?

• Inwieweit stimmen die Ergebnisse der angewandten Untersuchungsmethoden bei der Untersuchung von Schlachtkörpern überein?

• Welche Organe sollten für einen sicheren Nachweis der Infektion beprobt werden?

• Inwieweit unterscheiden sich die unterschiedlichen Ausprägungsgrade histologischer Läsionen in der zellulären Zusammensetzung?

(13)

2. Schrifttum

2.1 Historischer Überblick

Bereits ab der Zeit um 1806 können Beschreibungen von Krankheitsbildern ähnlich der Paratuberkulose gefunden werden. Die erste eindeutige Schilderung des Erkrankungsbildes erfolgte 1895 durch Dr. Heinrich Albert Johne und Dr. Langedon Frothingham bei einer Kuh aus dem Raum um Oldenburg (JOHNE u. FROTHINGHAM 1895). Sie gingen von einer besonderen Form der Tuberkulose beim Rind aus, da ihnen der Nachweis säurefester Stäbchen aus verändertem Gewebe gelang. Die nächste Schilderung dieser Erkrankung als

„spezifische Darmerkrankung des Rindes, wahrscheinlich tuberkulöser Natur“ geschah durch Dr. H. Markus im Jahre 1904 (MARKUS 1904). Diese veranlasste Dr. H. A. Johne dazu, seine Diagnose (Tuberkulose) als für nicht mehr unanfechtbar zu erklären. Als eigenständige Erkrankung „Enteritis chronica bovis pseudotuberculosa“ wurde die Paratuberkulose 1906 durch B. Bang beschrieben, da erkrankte Tiere keine Reaktion auf Tuberkulin zeigten und abweichend zu M. bovis-Infektionen die Erregeranzucht auf üblichen Nährmedien nicht gelang (BANG 1906). Die erste kulturelle Anzüchtung erreichte F. W. Twort 1910 durch den Zusatz von hitzeinaktivierten, getrockneten Kulturen von M. phlei (TWORT 1910). Das von ihm neu isolierte Bakterium bezeichnete er als „Mycobacterium enteritidis chronicae pseudotuberculosae bovis Johne“. Durch die experimentelle Infektion einer Herde mit M. avium ssp. paratuberculosis wurde 1914 auch das dritte Henle-Kochsche Postulat erfüllt (COCITO et al. 1994).

2.2 Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis

2.2.1 Taxonomie und Morphologie

M. avium ssp. paratuberculosis (MAP) gehört innerhalb der Klasse der Actinobacteria der Ordnung Actinomycetales, Familie Mycobacteriaceae, Gattung Mycobacterium an. Innerhalb dieser Gattung ist MAP dem M. avium-Komplex zugehörig (THOREL et al. 1990).

Minimalkriterien für die Zuordnung zur Gattung Mycobacterium sind Säure-Alkohol-Festigkeit, ein Anteil von 61-71% der DNA-Basen Guanin und Cytosin

(14)

innerhalb der DNA sowie Mykolsäuren als Bestandteil der Zellwand (LÉVY-FRÉBAULT u.

PORTAELS 1992).

Es werden mit Biotyp C (= cattle strain) und Biotyp S (= sheep strain) zwei Gruppen unterschieden, in welche die meisten MAP-Stämme hinsichtlich ihrer phänotypischen Eigenschaften klar eingeteilt werden können (COLLINS et al. 1990a; WHITTINGTON et al.

2000b). Kolonien von MAP sind klein (1-5 mm), fest, glänzend, weiß oder pigmentiert, mit rauer oder glatter Oberfläche (CHIODINI et al. 1984a). Das einzelne Bakterium hat eine Größe von 1-1,5 x 0,3-0,5 µm, ist grampositiv, aerob und unbeweglich (GEDEK et al. 1993).

Aufgrund extrazellulärer Filamente, mit denen die Bakterien Verbindungen untereinander bilden, liegt der Erreger vor allem in Nestern vor (MERKAL et al. 1973).

2.2.2 Erregereigenschaften

Wie alle Mykobakterien zeichnet sich der Erreger der Paratuberkulose durch Säure-Alkohol-Festigkeit aus. Diese ist durch in der Zellwand an Arabinogalactankomplexe gebundene Mykolsäuren bedingt. Die Zellwand ist reich an Lipiden und zeigt eine geringe Permeabilität, woraus sich eine lange Generationszeit ergibt (CLARKE 1997). Dies wird deutlich durch ein langsames Wachstum von MAP in Kultur, welches neben der Mycobactinabhängigkeit und der Insertionssequenz 900 ein Charakteristikum des Erregers ist (MERKAL u. CURRAN 1974; GREEN et al. 1989).

Aufgrund seiner Zellwandstruktur ist der Erreger sehr resistent gegenüber Umwelteinflüssen.

MAP wurde in Kot/Erde-Gemisch noch nach 55 Wochen, in bovinem Urin bzw.

Urin/Kot-Gemisch (90% Urin, 10% Kot) jedoch für weniger als 30 Tage nachgewiesen (LARSEN et al. 1956; WHITTINGTON et al. 2004). Die Überlebenszeit verringerte sich bei Sonneneinstrahlung und betrug bei direkter Bestrahlung zwischen 65 und 100 Stunden (LARSEN et al. 1956). Auch Wasser kann als ein Reservoir für MAP dienen. Der Erreger war aus Wasser mittels Flüssigmedium (BACTEC™ MGIT™ 960) für mindestens 632 Tage kultivierbar und mittels real-time PCR noch nach 841 Tagen nachweisbar (PICKUP et al.

2005).

Beobachtungen über Perioden ohne Koloniewachstum und Schwankungen in der Anzahl koloniebildender Einheiten bei der mehrmaligen Beprobung von Umweltproben ließen WHITTINGTON und Mitarbeiter (2004, 2005) das Vorliegen einer Ruheperiode von MAP vermuten. Diese Periode stellt sich als ein Stadium des Überlebens von nicht sporenbildenden

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Bakterien ohne Vermehrung dar. Entsprechende Gensequenzen konnten im Genom von MAP nachgewiesen werden (WHITTINGTON et al. 2004). Eine DNA-Sequenz analog dem Dps-ähnlichen Protein (DNA binding protein from stationary phase cells), das von M. smegmatis bei oxidativem Stress und Nährstoffmangel exprimiert wird, ist im Genom von MAP vorhanden. Ein zweites Gen, das für das relA-Protein kodiert, ist ebenfalls im Genom von MAP präsent. RelA induziert eine Ansammlung von hyperphosphoryliertem Guanosin als Antwort auf einen Mangel an Aminosäuren und Carbon und konnte auch bei M. tuberculosis gefunden werden.

Neben der hohen Tenazität zeigt MAP eine hohe Thermostabilität. Nach 12 Monaten bei -14°C und anschließenden 5 Monaten bei 4°C konnte noch ein Koloniewachstum von MAP nachgewiesen werden (LARSEN et al. 1956). Bei Temperaturen von -70°C für eine Dauer von 3 bis 15 Wochen zeigte sich in Kotmaterial eine Reduktion der Lebensfähigkeit des Organismus (RICHARDS u. THOEN 1977). Bei einem Keimgehalt von ≥10¹ KBE/ml Milch führt eine Kurzzeiterhitzung der Milch auf 71,7°C für 15 s zu keiner vollständigen Eliminierung des Erregers (GRANT et al. 1998). So konnte in der Tschechischen Republik in 1,6% und in Großbritannien in 1,8% der kommerziell erhältlichen pasteurisierten Milch MAP mittels kultureller Anzucht nachgewiesen werden (AYELE et al. 2005; GRANT et al. 2002).

Die Wirksamkeit der Pasteurisierung wird durch eine Homogenisierung der Milch aufgrund der damit verbundenen Verringerung der Klumpengröße der Bakterien erhöht (GRANT et al.

2005). Eine Verlängerung der Einwirkzeit der Pasteurisierungstemperatur wirkte sich stärker auf die Effektivität der Pasteurisierung aus als ein Anstieg der Temperatur (GRANT et al.

1999).

Der Erreger ist resistent gegen die meisten Desinfektionsmittel (CHIODINI et al. 1984a).

Eine Behandlung von Wasser mit Chlor (2 µl/ml, 30 min) konnte kein vollständiges Abtöten bewirken (WHAN et al. 2001).

2.2.3 Geographische Verbreitung und Prävalenz

Die Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete Erkrankung (BAKKER et al. 2000). Im Jahr 2006 wurden in Deutschland 240 Fälle von Paratuberkulose gemeldet. Es ist davon auszugehen, dass eine Vielzahl weiterer Fälle nicht erfasst wird. Bei den meisten Tieren wird die Erkrankung aufgrund ihres latenten Charakters nicht diagnostiziert. Desweiteren werden selbst klinisch erkrankte Tiere nicht unbedingt als MAP-infiziert erkannt und gemeldet.

(16)

Angesichts der schon in der subklinischen Phase auftretenden Leistungsminderungen wird ein Großteil der an Paratuberkulose erkrankten Tiere zudem bereits der Schlachtung zugeführt, bevor ein Auftreten klinischer Symptome zu beobachten ist. Bei Todesfällen wird die Todesursache in der Regel nicht näher untersucht (DONAT et al. 2005).

Es wurden verschiedene Studien zur Prävalenzerhebung durchgeführt, von denen ein Teil in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefasst dargestellt ist. Die Ergebnisse der Studien variieren zum Teil stark und können nicht unmittelbar miteinander verglichen werden, da die Ergebnisse von der verwendeten Nachweismethode und dem zur Untersuchung gelangten Probenmaterial (Herdengröße, Rasse, Nutzungsart, Alter, zum Teil vorselektierte Proben aus Untersuchungsämtern) beeinflusst werden. Vor allem in größeren Herden, bei Tieren der Nutzungsrassen Milch und bei Tieren ab einem Alter von zwei Jahren sind häufiger positive Resultate zu erwarten (DONAT et al. 2005; MUSKENS et al. 2000; NIELSEN u. TOFT 2008).

Eine Studie ermittelte eine durchschnittliche Einzeltierprävalenz bei Rindern in Europa von näherungsweise 20% und eine durchschnittliche Herdenprävalenz von >50% (NIELSEN u.

TOFT 2008). Es liegen jedoch keine verlässlichen Angaben vor. Die gegenwärtigen Nachweisverfahren sind nicht dafür geeignet, einen Überblick über die wahre Prävalenz der Erkrankung zu erlangen, da keine der zur Verfügung stehenden intra vitam Methoden eine zuverlässige Diagnose der Erkrankung auf Einzeltierebene gewährleisten kann. Vor allem das Infektionsstadium der untersuchten Tiere beeinflusst in hohem Maße die Sensitivität der verwendeten Untersuchungsmethode. Bisherige Prävalenzerhebungen zeichnen sich daher durch eine Ungenauigkeit der erhobenen Daten aus (KÖHLER et al. 2008).

(17)

Schrifttum17

tudien zur Prävalenzerhebung (weltweit)

Boelaert (2000)

Cetinkaya (1996)

Muskens (2000)

Gasteiner (1999)

Bögli- Stuber (2005)

McKenna (2004)

Collins (1994) 2,9%

k.A.

2,5 ± 3,2%

k.A.

18%

k.A.

55%

(54% bei nicht vakzinierten

Herden)

6,96%

k.A.

50%

0,87%

3,5 (PCR) 2,6%

(Organkultur)

k.A.

1,99%

6,5-10%

16,1%

7,29%

ELISA

PCR Kultur

ELISA

PCR Kultur

Kultur Histologie

ELISA Herden/ Tiere

556/13317

k.A./1553

378/15822

2757/11028

13/310

k.A./984

158/4990 alle

Nutzungstypen

alle Nutzungstypen

Milchvieh

alle Nutzungstypen

Milchvieh

alle Nutzungstypen Stichproben-

erhebung

Stichproben- erhebung

Vorselektion

Stichproben- erhebung Belgien

England (GB)

Nieder- lande

Österreich

Schweiz

Ostkanada und Maine

(USA) Wisconsin

(USA)

(18)

m18

tudien zur Prävalenzerhebung (Deutschland)

Weber (2000)

Schmid (2005)

Hacker (2004)

Pohl (1993)

Donat (2005)

Schött (2002) prävalenz

k.A.

bei 35,5% der Herden > 10%

0-63,7%

prävalenz

28,8%

k.A.

84,7%

k.A.

95,3%

k.A.

prävalenz

11,2%

4,38%

12,2%

17% (Kultur) 33,3%

(ELISA)

9,6%

12,7%

Kultur

ELISA

Kultur ELISA

ELISA

Milch- ELISA Herden/Tiere

52/1116

k.A./1985

59/2997

14/855

493/55394

307/20540 alle Nutzungs-

typen

alle Nutzungs- typen

Milchvieh

alle Nutzungs- typen

Milchvieh Mutterkuh- haltung

Milchvieh Vorselektion

Vorselektion

Vorselektion Stichproben-

erhebung

Stichproben- erhebung Bayern

Bayern

Mecklenburg- Vorpommern

Nordrhein- Westfalen

Sachsen

Thüringen

(19)

2.2.4 Wirtsspektrum

Sah man die Paratuberkulose zunächst ausschließlich als eine Infektion der Hauswiederkäuer an, so wurde die Erkrankung später auch bei verschiedenen Zoo- und Wildwiederkäuern nachgewiesen (DEUTZ et al. 2005; WEBER et al. 1992). Bei monogastrischen Tieren und Vögeln konnte der Erreger ebenfalls isoliert werden (BEARD et al. 2001a). Die kulturelle Anzüchtung gelang bei Zoo-und Wildwiederkäuern wie auch bei monogastrischen Tieren und Vögeln außer aus Kot auch aus Gewebematerial, so dass nicht nur von einer transienten Ausscheidung des Erregers auszugehen ist (CORN et al. 2005). Diese Annahme wird durch das Vorliegen von säurefesten Stäbchen im Gewebe sowie histopathologischen Veränderungen entsprechend den Befunden einer Paratuberkulose der Hauswiederkäuer unterstützt, welche unter anderem in Proben von Fuchs, Krähe und Kaninchen gefunden werden konnten (BEARD et al. 2001a, 2001b). Wildtiere können also ein Reservoir des Erregers darstellen, welches bei der Erarbeitung von Kontrollstrategien mit einzubeziehen ist.

Auch wenn die Kontamination der Umwelt mit MAP durch Wildtiere im Vergleich zum Grad der Kontamination durch Hauswiederkäuer als nur geringfügig anzusehen ist, kann ihnen eine epidemiologische Bedeutung als Verbreiter insbesondere in Paratuberkulose-freie Bestände zukommen (CORN et al. 2005). Eine experimentelle Infektion von Hauswiederkäuern mit Isolaten aus Wildtieren war möglich (BEARD et al. 2001c). Histopathologische Veränderungen und Diarrhoe konnten nach einer experimentellen Infektion von Jungkaninchen mit bovinen MAP-Isolaten hervorgerufen werden (MOKRESH u. BUTLER 1990). Es kann daher von einer Übertragung zwischen den Arten ausgegangen werden. Diese Annahme wird durch das Auffinden gleicher Genotypen von MAP in Haus- und Wildtieren unterstützt (GREIG et al. 1999).

Ein humanpathogenes Potential von MAP wird im Zuge der Diskussion um die Pathogenese des Morbus Crohn in Betracht gezogen. Als Risikofaktoren einer Morbus Crohn-Erkrankung werden genetische Disposition, Autoimmunerkrankung, Ernährungsgewohnheiten sowie Infektionen mit besonderem Augenmerk auf MAP genannt (CHIODINI et al. 1984b;

PHILLIP 1975). Derzeit wird von einer multifaktoriellen Genese der Erkrankung ausgegangen. Für eine Beteiligung von MAP an der Ätiologie des Morbus Crohn spricht das ähnliche Krankheitsbild sowie der zum Teil gehäufte Nachweis des Erregers bei Morbus Crohn Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen (GRANT 2005). Eine mögliche

(20)

Expositionsquelle für den Menschen stellen Milch und Milchprodukte dar. MAP konnte in kommerziell erhältlicher pasteurisierter Milch nachgewiesen werden (AYELE et al. 2005;

GRANT et al. 2002). Aus verschiedenen Rohmilchkäsen gelang ebenso eine Isolierung des Erregers (IKONOMOPOULOS et al. 2005). Jedoch bleibt der kausale Zusammenhang zwischen MAP und Morbus Crohn weiter umstritten (WADDELL et al. 2008). Die derzeit vorliegenden Daten sind für eine abschließende Bewertung des zoonotischen Potentials von MAP noch nicht ausreichend.

2.3 Erkrankungsbild

2.3.1 Empfänglichkeit

Die Empfänglichkeit für MAP ist im Alter von unter 30 Tagen am höchsten, später entwickelt sich eine altersabhängige Resistenz (CLARKE 1997; LARSEN et al. 1975). Die Ursache der erhöhten Anfälligkeit neugeborener Tiere für den Erreger ist nicht abschließend geklärt. Der Darm ist in den ersten Lebensstunden in besonderem Maße zur Aufnahme von Makromolekülen wie Immunglobulinen befähigt. Dies kann mit einer Herabsetzung der mukosalen Barriere gegen MAP verbunden sein (SWEENEY 1996). COCITO und Mitarbeiter (1994) führen die besondere Empfänglichkeit von Neugeborenen auf das in diesem Alter noch unterentwickelte Immunsystem zurück. Zusatz von anti-MAP-Serum zu MAP-beinhaltendem Inokulum erhöhte die Zahl aufgenommener Bakterien in das Dome-Epithel der Peyerschen Platten (MOMOTANI et al. 1988). Durch Opsonisierung des Erregers mit maternalen Antikörpern gegen MAP, die im Kolostrum von Kühen aus infizierten Herden vorkommen können, könnte somit die Aufnahme des Erregers verstärkt werden.

Eine Infektion mit MAP ist außer vom Alter auch von Faktoren wie Dosis, Virulenz des Erregers oder Stresseinwirkung abhängig, so dass eine Infektion adulter Tiere ebenfalls möglich ist. Die histopathologischen Veränderungen sind dann nur schwach ausgeprägt, es kann nur eine geringe Anzahl Bakterien isoliert werden und es sind in der Regel keine klinischen Symptome zu beobachten (LARSEN et al. 1975).

(21)

2.3.2 Erregerausscheidung und Übertragungswege

Eine Übertragung von MAP zwischen den Tieren erfolgt hauptsächlich auf dem fäkal-oralen Weg (SWEENEY 1996). Den Hauptrisikofaktor für eine Ansteckung des Kalbes stellt der direkte Kontakt zur Mutter dar, aber auch eine Übertragung von Kalb zu Kalb ist möglich (BENEDICTUS et al. 2007; VAN ROERMUND et al. 2007). Der Kontakt mit Kot kann außer auf direktem Weg auch über fäkal verunreinigte Euter, Milch und Kolostrum, Futter, Schuhe, Gerätschaften oder Abkalbeboxen erfolgen (SWEENEY 1996). Des Weiteren geschieht eine Ausscheidung des Bakteriums über Kolostrum und Milch, vor allem bei Tieren, deren Kot ebenfalls stark erregerhaltig ist (SWEENEY et al. 1992). Eine Übertragung von MAP bei der künstlichen Besamung und beim Embryotransfer ist theoretisch möglich, da MAP aus Samen, primären Geschlechtsorganen und Uterusspülflüssigkeit isoliert werden konnte (AYELE et al. 2004; ROHDE u. SHULAW 1990). Eine größere Bedeutung kommt der intrauterinen Übertragung von MAP zu, wobei die Inzidenz wie bei den anderen Übertragungswegen von der Innerherdenprävalenz und dem Anteil klinisch erkrankter Tiere in einer Herde abhängig ist. Das Risiko einer intrauterinen Übertragung wird mit 26,4%

(95% Konfidenzintervall 11,3% - 40,7%) angegeben, so dass eine Entfernung bzw. stärkere Kontrolle von Nachkommen erkrankter Kühe auch bei fehlendem Mutter-Kalb-Kontakt angestrebt werden sollte (SEITZ et al. 1989).

Zwischen den Herden wird MAP vor allem durch den Handel mit latent infizierten Tieren verbreitet (SWEENEY 1996). Der Verbreitung des Erregers durch Wildtiere, Insekten, Annelida, Nematodenlarven oder kontaminiertes Wasser, Fahrzeuge und ähnliches kommt nur eine untergeordnete Bedeutung zu (FISCHER et al. 2003, 2004; WHITTINGTON et al.

2001; CORN et al. 2005; SWEENEY 1996)).

2.3.3 Pathogenese

Der Erreger der Paratuberkulose wird im Darm vor allem über M-Zellen aufgenommen (MOMOTANI et al. 1988; SIGURDARDOTTIR et al. 2001). Zielzellpopulation von MAP sind die sub- und intraepithelialen Makrophagen (MOMOTANI et al. 1988). Zu Beginn der Infektion ist der Erreger vor allem im Interfollikularbereich der Peyerschen Platten des distalen Dünndarms zu finden (SIGURDARDOTTIR et al. 2001). Diese besitzen große Lymphfollikel und nur kleine T-Zell-abhängige Interfollikularzonen. Dadurch steht nur eine

(22)

geringe Anzahl T-Zellen für den Erstkontakt mit dem Antigen bereit. Dies kann nach Rezirkulation dieser Zellen in einer verschlechterten Ausgangslage für eine spätere zellvermittelte Immunantwort gegen den intrazellulären Erreger im gesamten Darm und auch in den Lymphknoten resultieren. Später breitet sich der Erreger in die Lamina propria des Darmes und im Verlauf der Infektion im gesamten Körper aus (KURADE et al. 2004;

BUERGELT et al. 1978).

Ein Teil der Makrophagen ist zu einer Abtötung des Erregers befähigt, dennoch stellen die Makrophagen die intrazelluläre Nische für das Überleben und die Vermehrung des Erregers dar (ZURBRICK u. CZUPRYNSKI 1987). Die lange Inkubationszeit der Erkrankung zeigt, dass die Hemmung einer massiven intrazellulären Vermehrung des Erregers durch den Wirt zunächst möglich ist (WOO u. CZUPRYNSKI 2008). Im Verlauf der Infektion kommt es jedoch zur Beeinflussung von Effektorfunktionen der Makrophagen, der Zytokinproduktion wie auch der T-Zell-Antwort:

1. Eine Infektion boviner Makrophagen mit MAP führt zu einer herabgesetzten Expression von MHC-I und MHC-II auf der Makrophagenoberfläche, verbunden mit einer Reduktion der Antigen-Präsentation und T-Zell-Aktivierung (VALHEIM et al. 2004). Dies konnte nach Infektion von Makrophagen mit M. avium ssp. avium nicht in gleichem Maße beobachtet werden wie bei MAP. M. avium ssp. avium ist ein Erreger, der im Wiederkäuer in der Regel keine schweren Erkrankungen verursacht (WEISS et al. 2001).

2. Eine Reduzierung von CD1 auf antigenpräsentierenden Zellen wurde nach Infektion mit M. tuberculosis und MAP berichtet. Dies führt zu einer Verminderung der Präsentation von mykobakteriellen Lipiden und Glykolipiden (STENGER et al. 1998; REDDACLIFF et al. 2004).

3. In den Makrophagen kommt es nach Infektion mit Mykobakterien zur Änderung intrazellulärer Abwehrmechanismen. Es wurde nachgewiesen, dass es nach Infektion von Monozyten mit MAP zu einer Hemmung der Phagosomen-Lysosomen-Fusion kommt (WOO et al. 2007). WEISS und Mitarbeiter (2004) dokumentierten eine geringere Ansäuerung der Phagosomen bei mit MAP infizierten Makrophagen im Vergleich zu nicht infizierten wie auch mit M. avium ssp. avium infizierten Makrophagen. Ebenso war die Anzahl apoptotischer Zellen nach 24- und 48-stündiger Infektion bei mit M. avium

(23)

ssp. avium infizierten Zellen größer als bei mit MAP infizierten Makrophagen (WEISS et al. 2004).

4. Eine Infektion mit MAP führt zu einem Anstieg von IL-10, welches von aktivierten Makrophagen und T-Zellen gebildet wird. Hauptfunktion von IL-10 ist die Hemmung aktivierter Makrophagen (KHALIFEH u. STABEL 2004; WEISS et al. 2002).

5. Ein Anstieg von TGFβ wurde in Stadien der Erkrankung mit fortgeschrittenen pathohistologischen Läsionen durch immunhistologische Untersuchungen von Rinder- und Schafgewebe dokumentiert (MUNOZ et al. 2008). Der Gehalt des Gewebes an immunhistologisch markiertem TGFβ war positiv korreliert mit der Anzahl säurefester Stäbchen in den Makrophagen. Dies lässt einen Zusammenhang zwischen starker Expression von TGFβ und der Unfähigkeit der Makrophagen, das bakterielle Wachstum von MAP zu hemmen, annehmen (MUNOZ et al. 2008). TGFβ unterdrückt die Reaktion inflammatorischer T-Zellen und die zelluläre Immunantwort wie auch die Makrophagenaktivierung (JANEWAY et al. 2002).

6. Als Folge der Hemmung der T-Zellen wird die IFNγ-Freisetzung reduziert. Der Modulierung der IFNγ-Freisetzung wird eine wichtige Rolle für das intrazelluläre Überleben von MAP beigemessen (STABEL 2000). Bei subklinisch infizierten Rindern konnte signifikant mehr IFNγ nachgewiesen werden als bei klinisch erkrankten Tieren (KHALIFEH u. STABEL 2004; SWEENEY et al. 1998). IFNγ ist für die Aktivierung oxidativer und antimikrobieller Aktivitäten von Makrophagen von Bedeutung (NATHAN et al. 1983). Hauptproduzent von IFNγ sind CD4⁺-TH1-Zellen (BASSEY u. COLLINS 1997).

7. Bei einer immunhistologischen Untersuchung von Schafgewebe wurde bei der pauzibazillären bzw. tuberkulösen Form der Erkrankung eine höhere Dichte an CD4⁺-T-Zellen gefunden als bei Kontrolltieren, verbunden mit einem Anstieg des CD4:CD8 Quotienten (LITTLE et al. 1996). Ein Absinken von CD4⁺-T-Zellen ist mit späten Stadien der Erkrankung assoziiert, da es durch den Verlust an Antigen-spezifischen CD4⁺-TH1-Zellen und somit der Verminderung der zellvermittelten Immunantwort zum Verlust der Kontrolle über die Vermehrung des Erregers kommt (KOETS et al. 2002). In der multibazillären bzw. lepromatösen Form ist gegenüber den Kontrolltieren die Dichte

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an CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen im Gewebe erniedrigt und der Anteil an CD8⁺-T-Zellen überwiegt (LITTLE et al. 1996).

8. Im Verlauf der Erkrankung baut sich zunehmend eine humorale CD4⁺-TH2-vermittelte Immunantwort auf (CLARKE 1997). Diese ist gegen den intrazellulär vorliegenden Erreger MAP nicht effektiv. Der Wechsel zu einer humoralen Immunantwort kann zu jedem Zeitpunkt, abhängig von Infektionsdosis und Infektionsweg, beginnen (COUSSENS 2004). Die Ursache ist unbekannt. Es werden genetische Faktoren des Wirtes, der konstante Kontakt der Immunzellen mit dem Antigen oder auch die Entwicklung IL-10 sezernierender Treg-Zellen (regulatorische T-Zellen) diskutiert (COUSSENS 2004; DE ALMEIDA et al. 2008). CLARKE und Mitarbeiter (1997) gehen davon aus, dass der Beginn der Antikörper-Produktion initiiert wird durch Lysis der infizierten Zellen und Freisetzung der Antigene nach Monaten der Infektion.

9. Den γδ-T-Zellen wird eine Bedeutung besonders zu Beginn einer Infektion mit MAP beigemessen (SOHAL et al. 2008). Schaf und Rind verfügen über einen hohen Anteil an γδ-T-Zellen (HEIN u. MACKAY 1991). Bei Schafen, die an der tuberkulösen Form der Paratuberkulose erkrankten, ist der Anteil an γδ-T-Zellen im Gewebe höher als bei Kontrolltieren und Tieren mit lepromatösen Läsionen einer Paratuberkulose-Erkrankung.

Die Anzahl an γδ-T-Zellen ist bei lepromatös erkrankten Schafen im Vergleich zu Kontrolltieren im Gewebe nicht signifikant verändert (LITTLE et al. 1996). Eine Inkubation von mit MAP infizierten Makrophagen mit γδ-T-Zellen führte dessen ungeachtet zu keiner gesteigerten Produktion an IFN-γ oder NO in der Zellkultur. Die Lebensfähigkeit der Bakterien wurde nicht beeinflusst (SIMUTIS et al. 2007). Eine Ausschaltung des TcR-δ-Gens in γδ T cell knockout-Mäusen resultierte in einer geringeren Granulombildung (TANAKA et al. 2000). Die Bedeutung der γδ-T-Zellen scheint so weniger in der direkten Bekämpfung von MAP und Aktivierung von Makrophagen als mehr in der Beeinflussung von Zellwanderung und Granulombildung zu liegen (SIMUTIS et al. 2007).

Trotz zahlreicher Studien sind die Mechanismen, die den Erreger zum Überleben in den Makrophagen befähigen, nicht abschließend geklärt (WOO u. CZUPRYNSKI 2008).

(25)

2.3.4 Erkrankungsstadien und klinisches Bild

Das Erkrankungsbild der Paratuberkulose ist sehr variabel. Der Krankheitsverlauf kann nach Schweregrad der klinischen Symptome, nach der dominierenden Immunantwort und der Möglichkeit des diagnostischen Nachweises in vier Stadien eingeteilt werden (WHITLOCK u. BUERGELT 1996):

Stadium I entspricht der stummen Infektion von Jungtieren unter zwei Jahren. Es ist keine Klinik und kein Kümmern der Tiere zu beobachten. Ein Infektionsnachweis kann in einzelnen Fällen über histologische und kulturelle Untersuchung von Gewebematerial erbracht werden.

Stadium II entspricht der subklinischen Infektion erwachsener Tiere. Sie zeigen in diesem Stadium bereits Leistungsabfall und eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit (MERKAL et al.

1975). Aufgrund dessen werden mit MAP infizierte Tiere häufig vor dem Auftreten erster klinischer Symptome der Schlachtung zugeführt. Serologische Nachweisverfahren und Kotkultur können in Stadium II intermittierend positive Resultate ergeben. Ein positives Ergebnis in der Kotkultur konnte 1-2½ Jahre vor dem Auftreten erster klinischer Symptome beobachtet werden (MERKAL et al. 1968).

Stadium III entspricht der klinischen Erkrankung. Es kommt bei erhaltenem Appetit zu intermittierendem Durchfall, welcher mit Gewichtsverlust verbunden ist. Angewandte Nachweisverfahren sind meist positiv. Bei manchen Tieren erfolgt eine Streuung des Erregers im gesamten Körper, so dass er aus Milch und Kolostrum isoliert werden kann (SWEENEY 1996). Die erkrankten Tiere können wieder in das subklinische Stadium übertreten oder es kommt zu einer Verschlechterung der Symptome und Übertritt in Stadium IV.

Stadium IV entspricht der fortgeschrittenen klinischen Erkrankung. Sie ist gekennzeichnet durch einen anhaltenden Durchfall. Dieser führt zu Kachexie und aufgrund der entstehenden Hypoproteinämie zu Ödembildung vor allem im Kehlgangsbereich. Weiterhin kommt es zu Störungen des Allgemeinbefindens. Die Erkrankung endet aufgrund von Dehydratation und Auszehrung tödlich. Angewandte Nachweisverfahren sind in der Regel positiv.

Bis zum Auftreten erster klinischer Symptome kann eine Inkubationszeit von 2-10 Jahren vergehen. Während dieser Zeit erfolgt bereits eine Ausscheidung und damit Verbreitung des Erregers im Bestand. So ist für jedes Tier mit fortgeschrittener Klinik von bis zu 25 anderen, nicht klinisch in Erscheinung tretenden, aber infizierten Tieren in der Herde auszugehen

(26)

(„Eisberg-Effekt“) (WHITLOCK u. BUERGELT 1996) (Abb. 1). Am häufigsten sind erste klinische Symptome im Alter von zwei bis fünf Jahren zu beobachten (CLARKE 1997).

Abb 1: Häufigkeit von Rindern mit den Stadien I-IV der Paratuberkulose (I stumme Infektion der Jungtiere, II subklinische Infektion, III klinische Erkrankung, IV fortgeschrittene klinische Erkrankung). Die Wahrscheinlichkeit des Erkrankungsnachweises ist nur bei den wenigen klinisch erkrankten Tieren hoch. Klinisch erkrankte Tiere stellen nur die Spitze des Eisberges dar („Eisberg-Effekt“).

Die Dauer der einzelnen Stadien ist variabel, ein Übergang aus Stadium II zur fortgeschrittenen klinischen Erkrankung kann innerhalb weniger Wochen erfolgen (WHITLOCK u. BUERGELT, 1996). Stress, wie er während der peripartalen Phase und der Laktationsphase durch endokrine und metabolische Veränderungen auftritt, kann als Auslöser klinischer Symptome in Betracht kommen (CHIODINI et al. 1984a). Infizierte Hochleistungskühe entwickeln häufiger eine klinische Paratuberkulose als Kühe mit normaler Produktionsleistung (BENEDICTUS et al. 1987). Daneben wird der Krankheitsverlauf von Infektionsdosis, Infektionsroute, Infektionsalter, Immunstatus und Virulenz des infizierenden Agens beeinflusst (CLARKE 1997).

2.3.5 Pathologisches und histologisches Bild

Charakteristisch für das pathologische Bild der Paratuberkulose ist eine segmentale Verdickung der Darmwand mit schlecht verstreichbaren, an Hirnwindungen erinnernden Schleimhautfalten. Diese Veränderungen treten vor allem im distalen Dünndarm auf. Eine Vergrößerung regionaler Lymphknoten und eine Stauung und Erweiterung mesenterialer Lymphgefäße sind zu beobachten. In fortgeschrittenen Fällen kann der Erreger im gesamten

Erkrankungsnachweis

Klinische Symptome

Subklinischer Verlauf

(27)

Körper streuen, so dass Granulome vor allem auch in der Leber zu finden sein können.

Verkalkungen des Endokards und der Aorta wurden im Zusammenhang mit der Paratuberkulose beschrieben (BUERGELT et al. 1978).

Histopathologisch ergibt sich das Bild einer chronischen granulomatösen Enteritis. Die histologischen Veränderungen werden aufgrund von

• Ausprägungsgrad, Lokalisation und Verteilung

• vorliegendem Zelltyp

• Anwesenheit und Anzahl säurefester Stäbchen

je nach Autor in 3-5 Klassen eingeteilt (BUERGELT et al. 1978; GONZÁLES u. GEIJO 2005; KURADE et al. 2004; PEREZ et al. 1996). GONZÁLES und GEIJO (2005) unterteilen die Läsionen beim Rind in 5 Formen (Tab. 3).

Tab. 3: Klassifizierung der histopathologischen Läsionen beim mit MAP infiziertem Rind (nach GONZÁLES und GEIJO 2005)

Typ Lokalisation/Verteilung dominierender Zelltyp

Anzahl säurefester Stäbchen fokale

Läsionen

Lymphknoten, ileocaecales Lymphgewebe

Epitheloidzellen

Riesenzellen keine bis wenige multifokale

Läsionen

Lymphknoten Lamina propria, v.a. Villi

intestinales

Epitheloidzellen

Riesenzellen keine bis mäßig viele diffuse

multibazilläre Läsionen

diffus verteilt Epitheloidzellen viele diffuse

lymphozytäre Läsionen (pauzibazillär)

diffus verteilt Lymphozyten

Riesenzellen vereinzelt diffuse

intermediäre Läsionen

diffus verteilt

Lymphozyten Epitheloidzellen

Riesenzellen Plasmazellen

abhängig von Anzahl Epitheloidzellen

Betrachtet man verschiedene Darmabschnitte eines Tieres, so lassen sich die dort beobachteten Läsionen zum Teil verschiedenen Typen von Veränderungen zuordnen (GONZÁLES u. GEIJO 2005). Der Typ der Veränderung ist nicht mit der Dauer der Infektion korreliert (KURADE et al. 2004). Klinische Symptome lassen sich vor allem in Fällen mit

(28)

diffusen Veränderungen beobachten, auch wenn nicht alle Tiere mit diffusen Veränderungen klinisch erkranken (GONZÁLES u. GEIJO 2005).

Beim Schaf konnte gezeigt werden, dass histologische Veränderungen mit nur wenigen säurefesten Stäbchen (pauzibazilläre oder tuberkulöse Form) Folge einer ausgeprägten zellulären Immunantwort, Läsionen mit reichlich säurefesten Stäbchen (multibazilläre oder lepromatöse Form) assoziiert mit einer ausgeprägten humoralen Immunantwort sind (PEREZ et al. 1997, 1999).

2.4 Infektionsnachweis

Für die Wahl geeigneter diagnostischer Methoden ist die Sicherheit ihrer Aussagekraft entscheidend. Zur Auswahl stehen direkte und indirekte Nachweisverfahren. Keines der derzeit zur Verfügung stehenden Nachweisverfahren weist eine 100%ige Nachweissicherheit auf (HIETALA 1992). Die Bewertung einer Methode hinsichtlich ihrer Sensitivität wird wesentlich von dem zum Vergleich herangezogenen Goldstandard, von der Innerherdenprävalenz sowie dem Erkrankungsstadium der zur Beprobung gelangten Tiere beeinflusst (HIETALA 1992). Die Spezifität wiederum ist abhängig von den Umweltbedingungen der untersuchten Population (andere Infektionskrankheiten, Vorkommen kreuzreagierender Antigene) (KÖHLER et al. 2008).

Innerhalb einer Herde sind Tiere in unterschiedlichen Infektionsstadien vorhanden. Diese können in den zur Verfügung stehenden diagnostischen Verfahren unterschiedlich reagieren (BAKKER et al. 2000). Daher wird eine wiederholte Beprobung mit verschiedenen diagnostischen Methoden in halbjährlichem Abstand empfohlen (MERKAL et al. 1968).

2.4.1 Direkte Nachweisverfahren und deren Einsatzmöglichkeiten zur Prävalenzerhebung

Zu den direkten Verfahren zählen der mikroskopische sowie der kulturelle Nachweis von MAP aus Kot- und Organmaterial und die PCR. Ebenso ist die Untersuchung auf pathohistologische Veränderungen am Paraffinschnitt möglich.

2.4.1.1 Mikroskopischer Erregernachweis

Der mikroskopische Nachweis des Erregers ist mittels Ziehl-Neelsen-Färbung, Fluoreszenzfärbung und immunhistologischer Markierung an Abklatschpräparaten,

(29)

Paraffinschnitten und Gefrierschnitten möglich. Mit der Ziehl-Neelsen-Färbung und der Fluoreszenzfärbung wird ein nicht speziesspezifischer Nachweis (säurefester) Stäbchenbakterien durchgeführt. Die Spezifität der immunhistologischen Erregermarkierung ist abhängig von den Eigenschaften des Antikörpers.

Die mikroskopische Untersuchung von Abklatschpräparaten stellt eine technisch einfache, kostengünstige und schnelle Methode dar, ist aber wegen eingeschränkter Sensitivität und Spezifität als alleiniges Diagnostikum nicht geeignet (HIETALA 1992). Die Anfertigung von Abklatschpräparaten ist mit Organ- und Kotproben durchführbar. Bei einem Keimgehalt von

<10⁶ Keimen/g Gewebe ist die Nachweisgrenze für den bakterioskopischen Nachweis säurefester Stäbchen aus Gewebematerial unterschritten (CHIODINI 1989). Für die Bakterioskopie von Kot mittels Ziehl-Neelsen-Färbung wurde eine Sensitivität von 36,4%

ermittelt (ZIMMER et al. 1999).

Beim mikroskopischen Nachweis des Erregers in Abklatschpräparaten, Paraffinschnitten und Gefrierschnitten sind falsch positive und falsch negative Resultate möglich. Falsch positive Ergebnisse entstehen bei der Ziehl-Neelsen-Färbung und bei der Fluoreszenzfärbung durch den Nachweis anderer säurefester Bakterien und bei der mikroskopischen Untersuchung von Kot zusätzlich durch den Nachweis passagerer Ausscheider. Falsch negative Ergebnisse sind durch intermittierende Ausscheider, Ausscheidung unterhalb der Nachweisgrenze sowie inhomogene Verteilung der Bakterien im Kot bzw. im Gewebe möglich. Bei der immunhistologischen Markierung können sich falsch positive Ergebnisse durch Kreuzreaktivität des verwendeten Antikörpers mit Erregern, mit denen sich MAP gleiche Antigene teilt (besonders andere Mykobakterien), ergeben. Bei der immunhistologischen Untersuchung von Paraffinschnitten von mit M. avium infizierten Tieren mit anti-M. paratuberculosis Serum¹ ergaben sich positive Ergebnisse (THORESEN et al. 1994).

Als Vorteil der immunhistologischen Markierung des Erregers ist zu nennen, dass mittels Ziehl-Neelsen-Färbung nur Bakterien mit intakter Zellwand angefärbt werden, wohingegen mit der immunhistologischen Markierung auch der Nachweis toter Bakterien wie auch Bakterien mit nicht mehr intakter Zellwand möglich ist (THORESEN et al. 1994).

Einundzwanzig Organproben MAP-positiver Rinder mit pathohistologischen Veränderungen waren immunhistologisch¹ zu 100%, in der Ziehl-Neelsen-Färbung zu 86% positiv (PLANTE

1 anti-M. paratuberculosis Serum, Dako Corp., Santa Barbara, CA.

(30)

et al. 1996). Die immunhistologische Untersuchung¹ von Paraffinpräparaten von 184 kulturell positiv getesteten Organproben geschlachteter Rinder erbrachte bei 5,92%, die Untersuchung mittels Ziehl-Neelsen-Färbung bei 5,3% der Proben ein positives Ergebnis. Die Sensitivitäten von Ziehl-Neelsen-Färbung und immunhistologischer Färbung unterschieden sich in dieser Studie nicht signifikant (MARTINSON et al. 2008).

2.4.1.2 Kultureller Erregernachweis

Eine kulturelle Anzucht des Erregers wird aus Organ- und Kotproben durchgeführt.

Wie bei der mikroskopischen Untersuchung von Kotproben können auch beim kulturellen Nachweis von MAP im Kot eine intermittierende Erregerausscheidung, Ausscheidung unterhalb der Nachweisgrenze und eine inhomogene Verteilung des Erregers im Kot falsch negative Ergebnisse zur Folge haben. Die Nachweisgrenze für den kulturellen Nachweis von MAP aus Kotproben liegt bei 100 KBE/g Kot (HIETALA 1992). Die Sensitivität der Kotkultur wird mit 33%-85,6% angegeben, die Spezifität mit 93%-100% (HUDA u. JENSEN 2003; MEYER ZU VILSENDORF 1995; WHITLOCK et al. 2000; ZIMMER et al. 1999;

HIETALA 1992; NIELSEN u. TOFT 2007; SOCKETT et al., 1992a, 1992b). Die Beprobung von Umweltkotproben aus stark frequentierten Stallbereichen wurde als kostengünstiges Verfahren zur Feststellung des Paratuberkulosestatus von Rinderherden beschrieben (LOMBARD et al. 2006).

Als die Methode mit der höchsten Sensitivität wird der kulturellen Nachweises von MAP aus Organmaterial angesehen (AMEMORI et al. 2004; HUDA u. JENSEN 2003). Der sicherste Nachweis gelingt aus Proben des distalen Jejunums und Ileums sowie der Ileocaecalklappe inklusive zugehöriger Lymphknoten (AMEMORI et al. 2004). Bei einer Untersuchung von 204 Rindern konnten mittels kultureller Untersuchung von Organproben im Vergleich zur Histologie mehr positive Ergebnisse erzielt werden (MARTINSON et al. 2008). Jedoch verfügt auch diese Methode über keine 100%ige Sensitivität. Bei Schafen, bei denen die kulturelle Anzucht von MAP erschwert ist, wie auch bei Untersuchungen von Organproben von Rindern zeigte sich die histopathologische Untersuchung von Organmaterial als dem kulturellen Nachweis überlegen (KURADE et al. 2004; GONZÁLES u. GEIJO 2005; PEREZ et al. 1996).

(31)

2.4.1.3 Methodik der kulturellen Anzucht

Für die kulturelle Anzucht werden vorwiegend eihaltige Nährböden verwendet (HERROLD 1931). Dem Nährboden wird Mycobactin als eisenbindendes Siderophor zugesetzt, zu dessen Bildung MAP nicht in der Lage ist (FRANCIS et al. 1953). Berichte über den Verlust der Mycobactinabhängigkeit einiger Stämme in der Subkultur konnten durch den Nachweis der Verunreinigung der Subkulturen mit zellwandgebundenem Mycobactin zurückgewiesen werden (LAMBRECHT u. COLLINS 1992). Die Mycobactinabhängigkeit stellt daher weiterhin ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal von MAP zu anderen Mykobakterienarten dar. Ein weiteres Charakteristikum ist die lange Kultivierungszeit, welche beim Rind bis zu 16 Wochen, beim Schaf bis zu über 6 Monaten betragen kann. Aufgrund der langen Bebrütungszeit muss eine bakteriologische und mykologische Kontamination der Kulturen möglichst vermieden werden. Dies wird durch antibiotische Zusätze im Nährboden und durch eine Dekontamination des Probenmaterials vor dem Beimpfen erreicht. Als Dekontaminationsmittel stellt Hexadecylpyridiniumchlorid (HPC) das Mittel der Wahl dar (CHIODINI et al. 1984a) .

Eine Verkürzung der Nachweiszeit soll durch die Anzucht im BACTEC-System¹ erreicht werden können. Die Nachweisgrenze bei der Untersuchung von Kotproben liegt unter 10 KBE/g Kot (COLLINS et al. 1990b). Ein bakterielles Wachstum kann anhand der Freisetzung von ¹⁴CO2 nachvollzogen werden. Hohe Anschaffungskosten und der Umgang mit Radioisotopen sind ein Nachteil dieser Methode (AYELE et al. 2001). Durch die Verwendung eines neuartigen BACTEC-Systems², welches statt ¹⁴CO2 die Abnahme der Sauerstoffkonzentration mit Hilfe einer fluoreszierenden Indikatorsubstanz anzeigt, wird die Erzeugung von radioaktivem Abfall vermieden. Es wird in beiden Systemen nur ein unspezifischer Nachweis bakterieller Vermehrung durchgeführt, so dass nach erfolgtem Wachstum eine Speziesidentifikation notwendig ist. Für die radiometrische Untersuchung von Kot wurde eine Sensitivität von 54,4% ± 7,3% und eine Spezifität von 100% ermittelt bei einer Verkürzung der Nachweiszeit auf bis zu 7 Wochen (COLLINS et al. 1990b; SOCKETT et al. 1992a). Bei der verbesserten Kultivierungsmethode auf Festmedien beträgt die durchschnittliche Anzuchtzeit 6-8 Wochen (KÖHLER, persönliche Mitteilung). Da bei beiden

1 BACTEC™ 460 TB, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

2 BACTEC™ MGIT™ 960, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

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Nachweisverfahren die Notwendigkeit der Speziesidentifizierung mittels PCR und / oder Subkultivierung besteht, stellt die Anzucht im BACTEC™ MGIT™-System insofern keine wesentliche Verkürzung der Nachweiszeit dar (KÖHLER u. GIERKE 2006). Das Auftreten falsch-positiver bzw. falsch-negativer Gerätesignale ist möglich.

2.4.1.4 Speziesidentifikation mittels Molekularbiologie

Bei erfolgtem kulturellem Wachstum sollte die Diagnose MAP mittels PCR aus dem Koloniematerial sowie durch Subkultivierung zum Nachweis der Mycobactinabhängigkeit abgesichert werden. Die PCR wird zudem zum direkten Nachweis von MAP aus Kot- und Organmaterial eingesetzt. Der Nachweis nicht lebensfähiger Keime und Kontaminationen kann zu falsch positiven Ergebnissen führen. Neben intermittierender Ausscheidung des Erregers, inhomogener Verteilung von MAP im Kot und Ausscheidung unterhalb der Nachweisgrenze können falsch negative Resultate aufgrund von Polymerase-Hemmstoffen (z.B. Proteine, Anionen, Salze) auftreten. Mittels PCR konnte der Erreger aus Kot bei mit 10² Keimen/g Kot gespikten Proben nachgewiesen werden (VANSNICK et al. 2007). Nach WHIPPLE und Mitarbeiter (1992) und ZIMMER (1999) liegt die Nachweisgrenze bei 10³-10⁴ KBE/ g Kot. Die Methode sollte daher für die Erkennung von moderaten und starken Ausscheidern verwendet werden (WHIPPLE et al. 1992). Die direkte PCR aus Kot verfügt je nach Autor und Testsystem über eine Sensitivität von 4%-70,2% und über eine Spezifität von 85,3%-100% (CHRISTOPHER-HENNINGS et al. 2003; WHIPPLE et al. 1992; VANSNICK et al. 2007; CLARK et al. 2008; WELLS et al. 2006). Die Sensitivität ist abhängig vom Grad der Bakterienausscheidung wie auch von der Extraktionsmethode (CHRISTOPHER-HENNINGS et al. 2003). Die Spezifität wird von der Wahl des Primers beeinflusst. Die Targetregion IS900 wurde als erste MAP-spezifische Zielsequenz isoliert (GREEN et al. 1989). Auch bei anderen Mykobakterienarten als MAP konnten IS900-like Sequenzen im Genom gefunden werden. Bei gründlicher Auswahl eines geeigneten Primers kann IS900 aber weiterhin als Zielsequenz empfohlen werden (COUSINS et al. 1999;

MÖBIUS et al. 2008). Auch Locus f57 und Locus 255 verfügen über eine ausreichende Spezifität zur Erkennung von MAP (MÖBIUS et al. 2008).

(33)

2.4.2 Indirekte Nachweisverfahren und deren Einsatzmöglichkeiten zur Prävalenzerhebung

Indirekte Nachweisverfahren sind der Johnin-Haut-Test und der Interferon-Gamma-Test zum Nachweis der zellulären Immunantwort sowie die Komplementbindungsreaktion (KBR), der Agargelimmundiffusiontest (AGIDT) und der enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) zum Nachweis einer humoralen Immunantwort.

Durch den Wandel von zellulärer zu humoraler Immunantwort im Verlauf der Erkrankung sind die Ergebnisse immunologischer Testverfahren variabel (CHIODINI et al. 1984a;

WHITTINGTON et al. 2000a). Die Serologie ist daher zur Einzeltierdiagnostik nicht geeignet und sollte nicht als alleiniges Diagnostikum in einem Sanierungsverfahren angewendet werden (SOCKETT et al. 1992c). Vor allem zur Erkennung subklinischer Tiere sind serologische Tests untauglich (SWEENEY et al. 1995). Aufgrund des von WHITLOCK und Mitarbeitern (1996) beschriebenen „Eisberg-Effekts“ wird nur ein kleiner Teil der tatsächlich infizierten Tiere eines Bestandes mittels indirekter Nachweisverfahren erkannt. Die Serologie kann jedoch zum Auffinden infizierter Bestände Verwendung finden (POHL 1993).

2.4.2.1 Nachweis der zellulären Immunantwort

Der Nachweis der zellulären Immunantwort wird beim Johnin-Test nach intrakutaner Applikation von MAP-Extrakt durch eine allergische Reaktion vom verzögerten Typ erbracht.

Beim Interferon-Gamma-Test wird in vitro die Sekretion von IFN-γ als Marker einer zellulären Immunreaktion gemessen. Der Johnin- sowie der Interferon-Gamma-Test weisen eine geringe Spezifität auf und sind als alleiniges Diagnostikum nicht geeignet (HUDA u.

JENSEN 2003; MERKAL et al. 1968; PAOLICCHI et al. 2003). Zurzeit sind keine validierten Tests verfügbar.

Der Nachweis einer zellulären Immunantwort ist in frühen Erkrankungsstadien möglich und nimmt mit Fortschreiten der Erkrankung ab (HIETALA 1992).

2.4.2.2 Nachweis der humoralen Immunantwort: ELISA

Zum Nachweis einer humoralen Immunantwort wird vor allem der ELISA angewendet.

Durch Entwicklung eines ELISA mit M. phlei-Präabsorption konnte die Spezifität der Testsysteme durch Verringerung von Kreuzreaktionen mit anderen, zum Teil ubiquitär

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vorkommenden Mykobakterien-Arten wie auch z.B. mit Corynebacterium pseudotuberculosis und E. coli erhöht werden (MILNER et al. 1990). Die Sensitivität des ELISA ist wie die der anderen indirekten Nachweisverfahren abhängig vom Erkrankungsstadium (KÖHLER et al.

2008; MILNER et al. 1990). Bei starken Ausscheidern von MAP im Kot sind mehr Tiere im ELISA positiv als bei schwachen Ausscheidern (NIELSEN 2008). Für starke Ausscheider wurde eine Sensitivität eines ELISA von 88,2% ermittelt, für schwache Ausscheider eine Sensitivität von 4,8% (CLARK et al. 2008). Die Sensitivität eines kommerziell erhältlichen ELISA schwankte zwischen 87% für klinisch kranke Tiere und 15% für subklinisch erkrankte Rinder (SWEENEY et al. 1995). Die durchschnittliche Sensitivität der ELISA beträgt je nach Testsystem und Autor zwischen 6,9% und 74%, die Spezifität zwischen 84,7% und 99,8%

(CLARK et al. 2008; COLLINS et al. 2005; MCKENNA et al. 2004, 2005; SHIN et al. 2008).

Mittels ELISA wird außer aus Blutproben auch der Nachweis von Antikörpern aus der Milch durchgeführt. Es wurde von einer signifikanten Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen von Serum-ELISA und Milch-ELISA bei Einzelmilchproben berichtet (GEISBAUER et al.

2007). GEUE und Mitarbeiter (2007) sehen das Verfahren des Antikörpernachweises aus Tankmilch aufgrund großer Schwankungen in den ermittelten Prävalenzen (0% bis 37%) als nicht geeignet zur Herdendiagnostik an.

2.4.2.3 Nachweis der humoralen Immunantwort: KBR, AGIDT

Die beiden Verfahren werden in Deutschland nicht mehr in der Routinediagnostik angewendet, da bisherige Testsysteme nur über eine eingeschränkte Sensitivität verfügten.

Für die KBR wurde eine Sensitivität zwischen 17,9% und 43% und eine Spezifität zwischen 72% und 99% ermittelt (MEYER ZU VILSENDORF 1995; POHL 1993; REICHEL et al.

1999; SOCKETT et al. 1992c). Die Sensitivität des AGIDT wird mit 6,9% und 26,6%, die Spezifität mit 98% bzw. 100% angegeben (POHL 1993; SOCKETT et al. 1992c).