Direkte Nachweisverfahren und deren Einsatzmöglichkeiten zur

Zu den direkten Verfahren zählen der mikroskopische sowie der kulturelle Nachweis von MAP aus Kot- und Organmaterial und die PCR. Ebenso ist die Untersuchung auf pathohistologische Veränderungen am Paraffinschnitt möglich.

2.4.1.1 Mikroskopischer Erregernachweis

Der mikroskopische Nachweis des Erregers ist mittels Ziehl-Neelsen-Färbung, Fluoreszenzfärbung und immunhistologischer Markierung an Abklatschpräparaten,

Paraffinschnitten und Gefrierschnitten möglich. Mit der Ziehl-Neelsen-Färbung und der Fluoreszenzfärbung wird ein nicht speziesspezifischer Nachweis (säurefester) Stäbchenbakterien durchgeführt. Die Spezifität der immunhistologischen Erregermarkierung ist abhängig von den Eigenschaften des Antikörpers.

Die mikroskopische Untersuchung von Abklatschpräparaten stellt eine technisch einfache, kostengünstige und schnelle Methode dar, ist aber wegen eingeschränkter Sensitivität und Spezifität als alleiniges Diagnostikum nicht geeignet (HIETALA 1992). Die Anfertigung von Abklatschpräparaten ist mit Organ- und Kotproben durchführbar. Bei einem Keimgehalt von

<10⁶ Keimen/g Gewebe ist die Nachweisgrenze für den bakterioskopischen Nachweis säurefester Stäbchen aus Gewebematerial unterschritten (CHIODINI 1989). Für die Bakterioskopie von Kot mittels Ziehl-Neelsen-Färbung wurde eine Sensitivität von 36,4%

ermittelt (ZIMMER et al. 1999).

Beim mikroskopischen Nachweis des Erregers in Abklatschpräparaten, Paraffinschnitten und Gefrierschnitten sind falsch positive und falsch negative Resultate möglich. Falsch positive Ergebnisse entstehen bei der Ziehl-Neelsen-Färbung und bei der Fluoreszenzfärbung durch den Nachweis anderer säurefester Bakterien und bei der mikroskopischen Untersuchung von Kot zusätzlich durch den Nachweis passagerer Ausscheider. Falsch negative Ergebnisse sind durch intermittierende Ausscheider, Ausscheidung unterhalb der Nachweisgrenze sowie inhomogene Verteilung der Bakterien im Kot bzw. im Gewebe möglich. Bei der immunhistologischen Markierung können sich falsch positive Ergebnisse durch Kreuzreaktivität des verwendeten Antikörpers mit Erregern, mit denen sich MAP gleiche Antigene teilt (besonders andere Mykobakterien), ergeben. Bei der immunhistologischen Untersuchung von Paraffinschnitten von mit M. avium infizierten Tieren mit anti-M. paratuberculosis Serum¹ ergaben sich positive Ergebnisse (THORESEN et al. 1994).

Als Vorteil der immunhistologischen Markierung des Erregers ist zu nennen, dass mittels Ziehl-Neelsen-Färbung nur Bakterien mit intakter Zellwand angefärbt werden, wohingegen mit der immunhistologischen Markierung auch der Nachweis toter Bakterien wie auch Bakterien mit nicht mehr intakter Zellwand möglich ist (THORESEN et al. 1994).

Einundzwanzig Organproben MAP-positiver Rinder mit pathohistologischen Veränderungen waren immunhistologisch¹ zu 100%, in der Ziehl-Neelsen-Färbung zu 86% positiv (PLANTE

1 anti-M. paratuberculosis Serum, Dako Corp., Santa Barbara, CA.

et al. 1996). Die immunhistologische Untersuchung¹ von Paraffinpräparaten von 184 kulturell positiv getesteten Organproben geschlachteter Rinder erbrachte bei 5,92%, die Untersuchung mittels Ziehl-Neelsen-Färbung bei 5,3% der Proben ein positives Ergebnis. Die Sensitivitäten von Ziehl-Neelsen-Färbung und immunhistologischer Färbung unterschieden sich in dieser Studie nicht signifikant (MARTINSON et al. 2008).

2.4.1.2 Kultureller Erregernachweis

Eine kulturelle Anzucht des Erregers wird aus Organ- und Kotproben durchgeführt.

Wie bei der mikroskopischen Untersuchung von Kotproben können auch beim kulturellen Nachweis von MAP im Kot eine intermittierende Erregerausscheidung, Ausscheidung unterhalb der Nachweisgrenze und eine inhomogene Verteilung des Erregers im Kot falsch negative Ergebnisse zur Folge haben. Die Nachweisgrenze für den kulturellen Nachweis von MAP aus Kotproben liegt bei 100 KBE/g Kot (HIETALA 1992). Die Sensitivität der Kotkultur wird mit 33%-85,6% angegeben, die Spezifität mit 93%-100% (HUDA u. JENSEN 2003; MEYER ZU VILSENDORF 1995; WHITLOCK et al. 2000; ZIMMER et al. 1999;

HIETALA 1992; NIELSEN u. TOFT 2007; SOCKETT et al., 1992a, 1992b). Die Beprobung von Umweltkotproben aus stark frequentierten Stallbereichen wurde als kostengünstiges Verfahren zur Feststellung des Paratuberkulosestatus von Rinderherden beschrieben (LOMBARD et al. 2006).

Als die Methode mit der höchsten Sensitivität wird der kulturellen Nachweises von MAP aus Organmaterial angesehen (AMEMORI et al. 2004; HUDA u. JENSEN 2003). Der sicherste Nachweis gelingt aus Proben des distalen Jejunums und Ileums sowie der Ileocaecalklappe inklusive zugehöriger Lymphknoten (AMEMORI et al. 2004). Bei einer Untersuchung von 204 Rindern konnten mittels kultureller Untersuchung von Organproben im Vergleich zur Histologie mehr positive Ergebnisse erzielt werden (MARTINSON et al. 2008). Jedoch verfügt auch diese Methode über keine 100%ige Sensitivität. Bei Schafen, bei denen die kulturelle Anzucht von MAP erschwert ist, wie auch bei Untersuchungen von Organproben von Rindern zeigte sich die histopathologische Untersuchung von Organmaterial als dem kulturellen Nachweis überlegen (KURADE et al. 2004; GONZÁLES u. GEIJO 2005; PEREZ et al. 1996).

2.4.1.3 Methodik der kulturellen Anzucht

Für die kulturelle Anzucht werden vorwiegend eihaltige Nährböden verwendet (HERROLD 1931). Dem Nährboden wird Mycobactin als eisenbindendes Siderophor zugesetzt, zu dessen Bildung MAP nicht in der Lage ist (FRANCIS et al. 1953). Berichte über den Verlust der Mycobactinabhängigkeit einiger Stämme in der Subkultur konnten durch den Nachweis der Verunreinigung der Subkulturen mit zellwandgebundenem Mycobactin zurückgewiesen werden (LAMBRECHT u. COLLINS 1992). Die Mycobactinabhängigkeit stellt daher weiterhin ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal von MAP zu anderen Mykobakterienarten dar. Ein weiteres Charakteristikum ist die lange Kultivierungszeit, welche beim Rind bis zu 16 Wochen, beim Schaf bis zu über 6 Monaten betragen kann. Aufgrund der langen Bebrütungszeit muss eine bakteriologische und mykologische Kontamination der Kulturen möglichst vermieden werden. Dies wird durch antibiotische Zusätze im Nährboden und durch eine Dekontamination des Probenmaterials vor dem Beimpfen erreicht. Als Dekontaminationsmittel stellt Hexadecylpyridiniumchlorid (HPC) das Mittel der Wahl dar (CHIODINI et al. 1984a) .

Eine Verkürzung der Nachweiszeit soll durch die Anzucht im BACTEC-System¹ erreicht werden können. Die Nachweisgrenze bei der Untersuchung von Kotproben liegt unter 10 KBE/g Kot (COLLINS et al. 1990b). Ein bakterielles Wachstum kann anhand der Freisetzung von ¹⁴CO2 nachvollzogen werden. Hohe Anschaffungskosten und der Umgang mit Radioisotopen sind ein Nachteil dieser Methode (AYELE et al. 2001). Durch die Verwendung eines neuartigen BACTEC-Systems², welches statt ¹⁴CO2 die Abnahme der Sauerstoffkonzentration mit Hilfe einer fluoreszierenden Indikatorsubstanz anzeigt, wird die Erzeugung von radioaktivem Abfall vermieden. Es wird in beiden Systemen nur ein unspezifischer Nachweis bakterieller Vermehrung durchgeführt, so dass nach erfolgtem Wachstum eine Speziesidentifikation notwendig ist. Für die radiometrische Untersuchung von Kot wurde eine Sensitivität von 54,4% ± 7,3% und eine Spezifität von 100% ermittelt bei einer Verkürzung der Nachweiszeit auf bis zu 7 Wochen (COLLINS et al. 1990b; SOCKETT et al. 1992a). Bei der verbesserten Kultivierungsmethode auf Festmedien beträgt die durchschnittliche Anzuchtzeit 6-8 Wochen (KÖHLER, persönliche Mitteilung). Da bei beiden

1 BACTEC™ 460 TB, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

2 BACTEC™ MGIT™ 960, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

Nachweisverfahren die Notwendigkeit der Speziesidentifizierung mittels PCR und / oder Subkultivierung besteht, stellt die Anzucht im BACTEC™ MGIT™-System insofern keine wesentliche Verkürzung der Nachweiszeit dar (KÖHLER u. GIERKE 2006). Das Auftreten falsch-positiver bzw. falsch-negativer Gerätesignale ist möglich.

2.4.1.4 Speziesidentifikation mittels Molekularbiologie

Bei erfolgtem kulturellem Wachstum sollte die Diagnose MAP mittels PCR aus dem Koloniematerial sowie durch Subkultivierung zum Nachweis der Mycobactinabhängigkeit abgesichert werden. Die PCR wird zudem zum direkten Nachweis von MAP aus Kot- und Organmaterial eingesetzt. Der Nachweis nicht lebensfähiger Keime und Kontaminationen kann zu falsch positiven Ergebnissen führen. Neben intermittierender Ausscheidung des Erregers, inhomogener Verteilung von MAP im Kot und Ausscheidung unterhalb der Nachweisgrenze können falsch negative Resultate aufgrund von Polymerase-Hemmstoffen (z.B. Proteine, Anionen, Salze) auftreten. Mittels PCR konnte der Erreger aus Kot bei mit 10² Keimen/g Kot gespikten Proben nachgewiesen werden (VANSNICK et al. 2007). Nach WHIPPLE und Mitarbeiter (1992) und ZIMMER (1999) liegt die Nachweisgrenze bei 10³-10⁴ KBE/ g Kot. Die Methode sollte daher für die Erkennung von moderaten und starken Ausscheidern verwendet werden (WHIPPLE et al. 1992). Die direkte PCR aus Kot verfügt je nach Autor und Testsystem über eine Sensitivität von 4%-70,2% und über eine Spezifität von 85,3%-100% (CHRISTOPHER-HENNINGS et al. 2003; WHIPPLE et al. 1992; VANSNICK et al. 2007; CLARK et al. 2008; WELLS et al. 2006). Die Sensitivität ist abhängig vom Grad der Bakterienausscheidung wie auch von der Extraktionsmethode (CHRISTOPHER-HENNINGS et al. 2003). Die Spezifität wird von der Wahl des Primers beeinflusst. Die Targetregion IS900 wurde als erste MAP-spezifische Zielsequenz isoliert (GREEN et al. 1989). Auch bei anderen Mykobakterienarten als MAP konnten IS900-like Sequenzen im Genom gefunden werden. Bei gründlicher Auswahl eines geeigneten Primers kann IS900 aber weiterhin als Zielsequenz empfohlen werden (COUSINS et al. 1999;

MÖBIUS et al. 2008). Auch Locus f57 und Locus 255 verfügen über eine ausreichende Spezifität zur Erkennung von MAP (MÖBIUS et al. 2008).

2.4.2 Indirekte Nachweisverfahren und deren Einsatzmöglichkeiten zur