Einfluss der diätetischen Phosphor-Versorgung auf die Parathormon- und Vitamin D3-Rezeptor-Expression in Niere und Jejunum bei Ziegen

(1)

Einfluss der diätetischen Phosphor-Versorgung auf die Parathormon- und Vitamin D

₃

-Rezeptor-Expression in Niere

und Jejunum bei Ziegen

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Alexandra Simone Muscher aus Hannover

Hannover 2006

(2)

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Betreuungsgruppe: Prof. Dr. G. Breves

Prof. Dr. M. Hoedemaker Klinik für Rinder

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. G. Gros

Zentrum Physiologie

Medizinische Hochschule Hannover

Externer Gutachter: Prof. Dr. W. Clauss

Institut für Tierphysiologie

Justus-Liebig-Universität Giessen

Tag der mündlichen Prüfung: 08.06.2006

(3)

Piet Hein (1905 - 1996)

Elke und Manfred Muscher

(4)

MUSCHER A., J. HATTENDORF, K. HUBER, E. PFEFER u. G. BREVES (2004):

Effects of different phosphorus supply on the PTH and vitamin D3 receptor expression in small ruminants

Vortrag, 58. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 09. - 11.03. in Göttingen

Effects of different phosphorus supply on the PTH and vitamin D3 receptor expression in small ruminants

Poster, 15. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie, DVG 25. - 27.03. in Berlin

Effects of dietary phosphorus restriction on the renal PTH and vitamin D3 receptor protein expression in goats

Poster, 59. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 08. - 10.03. in Stuttgart-Hohenheim

MUSCHER A., K. HUBER, E. PFEFER u. G. BREVES (2006):

High phosphorus supply influences the expression of renal PTH receptor and NaPi IIa in goats

Poster, 60. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 21. - 23.03. in Göttingen

MUSCHER A., K. HUBER, E. PFEFER u. G. BREVES (2006):

High phosphorus supply influences the expression of renal PTH receptor and NaPi IIa in goats

Poster, 85. Tagung der Deutschen Physiologischen Gesellschaft (DPG) 26. - 29.03. in München

(5)

Inhalt

Abkürzungsverzeichnis VII

Abbildungsverzeichnis IX

Tabellenverzeichnis XIII

1. Einleitung 1

1.1 Phosphor-Haushalt beim kleinen Wiederkäuer 1 1.1.1 Hormone der P- und Ca-Homöostase 1 1.1.2 Regulation der P- und Ca-Homöostase 3 1.1.3 Pi-Transporter als Modulatoren der P- und Ca-Homöostase 6 1.1.4 Hormonelle Regulationsprozesse der P- und Ca-Homöostase 9

1.2 Zielsetzung 13

2. Material und Methoden 14

2.1 Versuchstiere und Haltung 14

2.1.1 Fütterung 15

2.2 Probenentnahme 16

2.3 Chemikalien, Lösungen, Puffer und Medien 17

2.4 Enzyme und Antikörper 17

2.5 Erzeugung von spezifischen DNA-Fragmenten zur

Verwendung als Sonde in den Northern Analysen 19

2.5.1 Primersuche 19

2.5.2 Isolierung von Gesamt-RNA 20

2.5.3 Reverse Transkription 21

2.5.4 Präparative Polymerase-Kettenreaktion 21

2.5.5 Agarose-Gelelektrophorese 23

2.5.6 Extraktion der cDNA aus einem Agarose-Gel 23 2.5.7 Klonierung von PCR-Fragmenten in Escherichia coli 24 2.5.8 Identifikation positiver, inserttragender Bakterienklone

(Blau/Weiß-Selektion) 25

(6)

2.5.9 Anlegen von Glycerol-Stocks 26 2.5.10 Präparation von Plasmid-DNA zur Insertkontrolle 26 2.5.11 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 26

2.5.12 Agarose-Gelelektrophorese 27

2.5.13 Anlegen von Flüssigkulturen 28

2.5.14 Präparation von Plasmid-DNA zur Sequenzierung 28

2.5.15 Sequenzierung der PCR-Fragmente 28

2.5.16 Präparative Plasmid-Aufreinigung 29

2.5.17 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA und elektrophoretische

Auftrennung im Agarose-Gel 29

2.5.18 Präparative DNA-Elution als Sondenmaterial 29

2.6 Northern Analyse 29

2.6.1 Gesamt-RNA-Isolierung mittels Phenol-Chloroform-Extraktion 29 2.6.2 Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration 30 2.6.3 Anreicherung der Poly A⁺-RNA mittels Affinitätschromatographie 30 2.6.4 Photometrische Quantifizierung der Poly A⁺-RNA und Ausfällen

der Proben 31

2.6.5 RNA-Gelelektrophorese 31

2.6.6 Kapillar-Blot-Verfahren 32

2.6.7 Radioaktive Hybridisierung der Poly A⁺-RNA 32

2.6.8 Auswertung der Daten 34

2.7 Isolierung von Zellkernextrakten für die VDR-Detektion 34 2.8 Simultane Isolierung von apikalen und basolateralen

Membranen aus dem Jejunum 35

2.9 Simultane Isolierung von apikalen und basolateralen

Membranen aus der Niere 37

2.10 Biochemisch-analytische Methoden 38 2.10.1 Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase 38 2.10.2 Bestimmung der Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase 39

2.10.3 Proteinbestimmung 39

2.10.4 Bestimmung von anorganischem Pi im Blutplasma 40

(7)

2.10.5 Bestimmung von Gesamt-Ca im Blutplasma 40 2.10.6 Bestimmung von Calcitriol und PTH im Blutplasma 40

2.10.6.1 Calcitriol 40

2.10.6.2 PTH 41

2.10.7 Bestimmung von Kreatinin im Blutplasma 41

2.11 Western Analyse 42

2.11.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese 42

2.11.2 Tank-Blot-Verfahren 43

2.11.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen 43

2.11.4 Indian-Ink-Färbung 45

2.11.5 Überprüfung der Antikörper-Spezifität 45 2.12 Messung der konzentrationsabhängigen Pi-Aufnahmen

in renale und jejunale BSMV 46 2.12.1 Zur Messung der konzentrationsabhängigen Pi-Aufnahme

verwendete Inkubationsansätze 47

2.12.2 Berechnungen der konzentrationsabhängigen Pi-Aufnahmen 48

2.13 Statistik 49

3. Ergebnisse 50

3.1 Versuch P-Zulage 50

3.1.1 Charakterisierung des Tiermodells 50

3.1.2 Northern Analyse 51

3.1.2.1 Sonden für Northern Analyse 51

3.1.2.2 Semiquantitative Detektion der spezifischen

Rezeptor- und Transporter-mRNA im Jejunum 51 3.1.2.3 Semiquantitative Detektion der spezifischen

Rezeptor- und Transporter-mRNA in der Niere 54 3.1.3 Charakterisierung der BSMV und BLMV 55

3.1.3.1 Anreicherung der renalen BSM 55

3.1.3.2 Anreicherung der renalen BLM 56

3.1.3.3 Anreicherung der jejunalen BSM 56

(8)

3.1.3.4 Anreicherung der jejunalen BLM 57

3.1.4 Western Analyse 57

3.1.4.1 Spezifität des PTHR1-Protein-Nachweises 57 3.1.4.2 Semiquantitative Detektion der spezifischen

Rezeptor- und Transporter-Proteine im Jejunum 59 3.1.4.3 Semiquantitative Detektion der spezifischen

Rezeptor- und Transporter-Proteine in der Niere 62

3.2 Versuch P-Restriktion 65

3.2.1 Charakterisierung des Tiermodells 65

Rezeptor- und Transporter-mRNA im Jejunum 66 3.2.2.2 Semiquantitative Detektion der spezifischen

Rezeptor- und Transporter-mRNA in der Niere 69 3.2.3 Charakterisierung der BSMV und BLMV 70

3.2.3.1 Anreicherung der renalen BSM 70

3.2.3.2 Anreicherung der renalen BLM 71

3.2.3.3 Anreicherung der jejunalen BSM 72

3.2.3.4 Anreicherung der jejunalen BLM 73

Rezeptor- und Transporter-Proteine im Jejunum 74 3.2.4.2 Semiquantitative Detektion der spezifischen

Rezeptor- und Transporter-Proteine in der Niere 77 3.2.5 Pi-Aufnahme als Funktion der Pi-Konzentration in jejunale BSMV 80 3.2.6 Pi-Aufnahme als Funktion der Pi-Konzentration in renale BSMV 81

3.3 Übersicht der Ergebnisse 81

4. Diskussion 83

4.1 Beurteilung der angewandten Methoden 83 4.1.1 Bestimmung der Hormonkonzentrationen 83

(9)

4.1.2 Semiquantifizierung der Rezeptor- und Transporter-mRNA/Proteine in Jejunum und Niere

mittels Northern/Western Analyse 83

4.1.3 Anreicherung der BSM und BLM 83

4.1.4 Pi-Aufnahmen in isolierte jejunale und renale BSMV 84

4.2 Calcitriol 84

4.3 Parathormon 85

4.4 Komponenten der P- und Ca-Homöostase 85 4.5 Existenz des VDR und PTHR1 beim Wiederkäuer und

deren mögliche physiologische Bedeutung 86 4.6 Störung der P- und Ca-Homöostase durch eine diätetische

P-Zulage 88

4.6.1 Einfluss auf die Pi-, Ca-, PTH- und Calcitriol-Konzentrationen im

Plasma 88

4.6.2 Einfluss auf die jejunale NaPi IIb-Expression 91 4.6.3 Einfluss auf die renale NaPi IIa-Expression 92 4.6.4 Einfluss auf die jejunale und renale VDR-Expression 93 4.6.5 Einfluss auf die renale PTHR1-Expression 94 4.6.6 Einfluss auf die jejunale PTHR1-Expression 99 4.7 Störung der P- und Ca-Homöostase durch eine diätetische

P-Restriktion 99

4.7.1 Einfluss auf die Pi-, Ca-, PTH- und Calcitriol-Konzentrationen im

Plasma 99

4.7.2 Einfluss auf die jejunale NaPi IIb-Expression 102 4.7.3 Einfluss auf die renale NaPi IIa-Expression 102 4.7.4 Einfluss auf die jejunale und renale VDR-Expression 104 4.7.5 Einfluss auf die renale und jejunale PTHR1-Expression 105 4.8 Schlussfolgerungen und Ausblick 106

5. Zusammenfassung 108

(10)

6. Summary 110

7. Literaturverzeichnis 112

8. Anhang 142

8.1 Chemikalien 149

8.2 Enzyme 151

8.3 Versuch P-Zulage 153

8.4 Versuch P-Restriktion 162

8.4.3 Pi-Aufnahme als Funktion der Pi-Konzentration in renale und

jejunale BSMV 171

9. Danksagung 172

(11)

Abkürzungsverzeichnis

Ø Durchschnitt

1α-OHase 25-Hydroxycholecalciferol-1α-Hydroxylase 1α, 25 (OH)2 D3 1α, 25-Dihydroxycholecalciferol, Calcitriol

Abb. Abbildung

APS Ammoniumpersulfat

Aq. bidest. Aqua bidestillata (doppelt destilliertes Wasser) ATP (ase) Adenosintriphosphat (ase)

BaFBr:Eu mit Europium dotierte Bariumhalogenid Kristalle BLAST basic local alignment search tool

BLMV basolaterale Membranvesikel

bp Basenpaare

BSMV Bürstensaummembranvesikel

°C Grad Celsius

Ca Calcium

ca. circa

cAMP cyclic adenosine monophosphate (zyklisches Adenosinmonophosphat)

cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) cpm counts per minute (Zerfallsrate pro Minute)

DAG Diacylglycerol

DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2’-Desoxyribonukleosid-5’-triphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetat

EtBr Ethidiumbromid

g Gramm

g Vielfaches der Erd- oder Normalfallbeschleunigung (gn = 9,80665 m · s^-2)

GFR glomeruläre Filtrationsrate

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-ethansulfonsäure HRP horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)

IgG Immunglobulin G

IP3 Inositol-3-Phosphat

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

Km MICHAELIS-MENTEN-Konstante, Halbsättigungskonstante bei sättigbarem Transport

KTED Kalium-Tris-EDTA-DTT l Liter

LP Leupeptin

LB-Medium Luria-Bertani-Medium

MARRS membrane-associated rapid response steroid binding protein

ME Umsetzbare Energie

(12)

min Minute

MJ Megajoule

MMLV moloney murine leukemia virus

MOPS 3-Morpholino-Propansulfonsäure

mRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)

n Stichprobenumfang

NaCl Natriumchlorid

NaPi IIa Natrium-abhängiger Phosphattransporter Typ IIa NaPi IIb Natrium-abhängigen Phosphattransporter Typ IIb

NC Nitrocellulose

NCBI national center for biotechnology information PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Saline)

PBSC Pefabloc SC

PBST phosphatgepufferte Saline mit Tween 20 Pi anorganisches Phosphat

PMSF Phenylmethylsulphonfluoride

PS Pepstatin A

PTH Parathormon

PTHR1 Parathormon-Rezeptor Typ 1

PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

r² Bestimmungsmaß

RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur

s Sekunde

SD standard deviation (Standardabweichung) SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) SETT Saccharose-EDTA-Triton X-Tris/HCl

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA

TED Tris-EDTA-DTT

TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylenediamin Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan TRPV transient receptor potential vanilloid

(Vanilloid-Rezeptor-Unterfamilie) Tween 20 Polyoxyethylenesorbitan-Monolaurat

U unit

u. a. unter anderem

upm Umdrehungen pro Minute VDR Vitamin D3-Rezeptor

Vmax maximale Aufnahmerate

x arithmetisches Mittel

Chemische Elemente werden nach der internationalen Nomenklatur abgekürzt.

(13)

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: Schematische Darstellung des VDR-Proteins

(JONES et al. 1998). 1

Abbildung 1-2: Schematische Darstellung des PTHR1 der Ratte. 3 Abbildung 1-3: Mechanismus zur Erhaltung der P- und Ca-Homöostase bei Hy-

pophosphatämie/Hyperphosphatämie ohne vorherige Änderun- gen der Plasma-Ca-Spiegel beim Nichtwiederkäuer. 9 Abbildung 2-1: Übersichtsschema der angewandten Methoden. 18 Abbildung 2-2: Plasmid-Karte von pCR^®2.1-TOPO^®. 25 Abbildung 2-3: Kapillar-Blot-Verfahren für den Transfer von RNA. 32 Abbildung 3-1: Rezeptorspezifische DNA-Sonden mittels PCR kreiert. 51 Abbildung 3-2: Semiquantitativer Nachweis der jejunalen VDR-mRNA bei Zie-

gen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage mittels Nor-

thern Analyse. 52

Abbildung 3-3: Expression der jejunalen VDR-mRNA bei Ziegen in Abhängig- keit von der diätetischen P-Zulage. 52 Abbildung 3-4: Semiquantitativer Nachweis der jejunalen NaPi IIb-mRNA bei

Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage mittels

Northern Analyse. 53

Abbildung 3-5: Expression der jejunalen NaPi IIb-mRNA bei Ziegen in Abhängig- keit von der diätetischen P-Zulage. 53 Abbildung 3-6: Semiquantitativer Nachweis der renalen NaPi IIa- und PTHR1-

mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage mittels Northern Analyse. 54 Abbildung 3-7: Expression der renalen NaPi IIa (A)-mRNA und PTHR1-mRNA

(B) bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage.

54 Abbildung 3-8: Überprüfung der renalen PTHR1-Antikörper-Spezifität in renalen

BSM und BLM. 58

Abbildung 3-9: Überprüfung der PTHR1-Antikörper-Spezifität in jejunalen BLM.

58

(14)

Abbildung 3-10: Semiquantitativer Nachweis des VDR-Proteins in jejunalen Zell- kernextrakten bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P- Zulage mittels Western Analyse. 59 Abbildung 3-11: Expression des VDR-Proteins in jejunalen Zellkernextrakten bei

Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 59 Abbildung 3-12: Semiquantitativer Nachweis des NaPi IIb-Proteins in jejunalen

BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage

mittels Western Analyse. 60

Abbildung 3-13: Expression des NaPi IIb-Proteins in jejunalen BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 60 Abbildung 3-14: Semiquantitativer Nachweis des PTHR1-Proteins in jejunalen

BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage

Abbildung 3-15: Expression des PTHR1-Proteins in jejunalen BLM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 61 Abbildung 3-16: Semiquantitativer Nachweis des VDR-Proteins in renalen Zell-

kernextrakten bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P- Zulage mittels Western Analyse. 62 Abbildung 3-17: Expression des VDR-Proteins in renalen Zellkernextrakten bei

Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 62 Abbildung 3-18: Semiquantitativer Nachweis des PTHR1-Proteins in renalen BSM

bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage mittels

Western Analyse. 63

Abbildung 3-19: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 63 Abbildung 3-20: Semiquantitativer Nachweis des PTHR1-Proteins in renalen BLM

bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage mittels

Western Analyse. 64

Abbildung 3-21: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BLM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 64 Abbildung 3-22: Semiquantitativer Nachweis der jejunalen NaPi IIb- und VDR-

mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion mittels Northern Analyse. 66

(15)

Abbildung 3-23: Expression der jejunalen VDR-mRNA bei Ziegen in Abhängig- keit von der diätetischen P-Restriktion. 67 Abbildung 3-24: Expression der jejunalen NaPi IIb-mRNA bei Ziegen in Abhängig-

keit von der diätetischen P-Restriktion. 68 Abbildung 3-25: Semiquantitativer Nachweis der renalen NaPi IIa- und PTHR1-

mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion mittels Northern Analyse. 69 Abbildung 3-26: Expression der renalen NaPi IIa (A)-mRNA und PTHR1-mRNA

(B) bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion.

69 Abbildung 3-27: Semiquantitativer Nachweis des VDR-Proteins in jejunalen Zell-

kernextrakten bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion mittels Western Analyse. 74 Abbildung 3-28: Expression des VDR-Proteins in jejunalen Zellkernextrakten bei

Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 74 Abbildung 3-29: Semiquantitativer Nachweis des NaPi IIb-Proteins in jejunalen

BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restrikti- on mittels Western Analyse. 75 Abbildung 3-30: Expression des NaPi IIb-Proteins in jejunalen BSM bei Ziegen in

Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 75 Abbildung 3-31: Semiquantitativer Nachweis des PTHR1-Proteins in jejunalen

BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restrikti- on mittels Western Analyse. 76 Abbildung 3-32: Expression des PTHR1-Proteins in jejunalen BLM bei Ziegen in

Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 76 Abbildung 3-33: Semiquantitativer Nachweis des VDR-Proteins in renalen Zell-

kernextrakten bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion mittels Western Analyse. 77 Abbildung 3-34: Expression des VDR-Proteins in renalen Zellkernextrakten bei

Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 77 Abbildung 3-35: Semiquantitativer Nachweis des PTHR1-Proteins in renalen BSM

bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion

(16)

Abbildung 3-36: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BSM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 78 Abbildung 3-37: Semiquantitativer Nachweis des PTHR1-Proteins in renalen BLM

bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion

Abbildung 3-38: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BLM bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 79 Abbildung 3-39: Maximale Pi-Aufnahmeraten (Vmax; A) und Halbsättigungs-

konstanten (Km; B) des Na⁺-abhängigen Pi-Transportsystems der jejunalen BSMV von Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen

P-Restriktion. 80

Abbildung 3-40: Maximale Pi-Aufnahmeraten (Vmax; A) und Halbsättigungs- konstanten (Km; B) des Na⁺-abhängigen Pi-Transportsystems der renalen BSMV von Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen

P-Restriktion. 81

Abbildung 4-1: Zusammenhang zwischen Pi- und PTH-Konzentrationen im Plasma bei Ziegen des P-Zulage-Versuchs. 89 Abbildung 4-2: Zusammenhang zwischen Plasma-Pi-Konzentrationen und rena-

len PTHR1-mRNA-Mengen bei Ziegen des P-Zulage-Versuchs.

94 Abbildung 4-3: Zusammenhang zwischen Plasma-Pi-Konzentrationen und (A)

PTHR1-Protein-Mengen in renalen BSM und (B) PTHR1-Protein- Mengen in renalen BLM bei Ziegen des P-Zulage-Versuchs.

95 Abbildung 4-4: Zusammenhang zwischen Plasma-PTH-Konzentrationen und (A)

renalen PTHR1-mRNA-Mengen und (B) PTHR1-Protein-Mengen in renalen BSM bei Ziegen des P-Zulage-Versuchs. 96 Abbildung 4-5: Zusammenhang zwischen PTH-Konzentrationen und renalen

NaPi IIa-mRNA-Mengen bei Ziegen des P-Zulage-Versuchs . 96

(17)

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2-1: Gruppeneinteilung der Versuchstiere. 14 Tabelle 2-2: Rohnährstoff-, Ca- und P-Gehalte des Kraftfutters der oP-

und dP-Gruppe (Institut für Tierernährung, Universität Bonn). 15 Tabelle 2-3: Zusammensetzung des Kraftfutters der P^–- und P⁺-Gruppen. 16 Tabelle 2-4: Sequenzen der PCR-Primer, spezifische annealing

Temperaturen und Größe der Amplifikate. 20 Tabelle 2-5: Pipettierschema für die PCR-Reaktion. 22

Tabelle 2-6: PCR-Bedingungen. 23

Tabelle 2-7: Restriktionsverdau. 27

Tabelle 2-8: Vorbereitung der Proben für die SDS-PAGE. 42 Tabelle 2-9: Antikörper und Streptavidin für den spezifischen Protein-Nachweis.

44 Tabelle 3-1: Pi-, Ca-, PTH-, Calcitriol- und Kreatinin-Konzentrationen im Plasma von

Ziegen unter diätetischer P-Zulage. 50

Tabelle 3-2: Spezifische Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP) und Na⁺/K⁺- ATPase im Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BSM. 55 Tabelle 3-3: Spezifische Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphata-

se (AP) im Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BLM. 56 Tabelle 3-4: Spezifische Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphata-

se (AP) im Homogenat und Vesikelsuspension von jejunalen BLM. 57 Tabelle 3-5: Pi-, Ca-, PTH-, Calcitriol- und Kreatinin-Konzentrationen im Plasma von

Ziegen bei einer diätetischen P-Restriktion. 65 Tabelle 3-6: Spezifische Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP) und Na⁺/K⁺-

ATPase im Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BSM. 70 Tabelle 3-7: Spezifische Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphata-

se (AP) im Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BLM. 71

(18)

Tabelle 3-8: Spezifische Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP) und Na⁺/K⁺- ATPase im Homogenat und Vesikelsuspension von jejunalen BSM.

72

Tabelle 3-9: Spezifische Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphata- se (AP) im Homogenat und Vesikelsuspension von jejunalen BLM. 73 Tabelle 3-10: Übersicht der Ergebnisse beider Versuche. 82 Tabelle 8-1: Rezepte für Lösungen, Puffer und Medien. 142 Tabelle 8-2: Im Rahmen der Untersuchung zusätzlich verwendete Chemikalien.

149

Tabelle 8-3: Primärantikörper. 151

Tabelle 8-4: Sekundärantikörper und Streptavidin. 152 Tabelle 8-5: Antigenes Peptid/Rekombinantes Protein. 152 Tabelle 8-6: Pi-, Ca-, PTH-, Calcitriol- und Kreatinin-Konzentrationen im Plasma von

Ziegen unter diätetischer P-Zulage. 153

Tabelle 8-7: Expression der jejunalen VDR-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von

der diätetischen P-Zulage. 153

Tabelle 8-8: Expression der jejunalen NaPi IIb-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 154 Tabelle 8-9: Expression der renalen NaPi IIa-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von

Tabelle 8-10: Expression der renalen PTHR1-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von

Tabelle 8-11: Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP) und Na⁺/K⁺-ATPase im Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BSM. 156 Tabelle 8-12: Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphatase (AP) im

Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BLM. 157 Tabelle 8-13: Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphatase (AP) im

Homogenat und Vesikelsuspension von jejunalen BLM. 158 Tabelle 8-14: Expression des VDR-Proteins in jejunalen Zellkernextrakten bei Ziegen

in Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 159

(19)

Tabelle 8-15: Expression des NaPi IIb-Proteins in jejunalen BSM bei Ziegen in Ab- hängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 159 Tabelle 8-16: Expression des PTHR1-Proteins in jejunalen BLM bei Ziegen in Ab-

hängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 160 Tabelle 8-17: Expression des VDR-Proteins in renalen Zellkernextrakten bei Ziegen in

Abhängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 160 Tabelle 8-18: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BSM bei Ziegen in Ab-

hängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 161 Tabelle 8-19: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BLM bei Ziegen in Ab-

hängigkeit von der diätetischen P-Zulage. 161 Tabelle 8-20: Pi-, Ca-, PTH-, Calcitriol- und Kreatinin-Konzentrationen im Plasma von

Ziegen bei einer diätetischen P-Restriktion. 162 Tabelle 8-21: Expression der jejunalen VDR-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von

der diätetischen P-Restriktion. 162 Tabelle 8-22: Expression der jejunalen NaPi IIb-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit

von der diätetischen P-Restriktion. 163

Tabelle 8-23: Expression der renalen NaPi IIa-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 163 Tabelle 8-24: Expression der renalen PTHR1-mRNA bei Ziegen in Abhängigkeit von

der diätetischen P-Restriktion. 164 Tabelle 8-25: Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP) und Na⁺/K⁺-ATPase im

Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BSM. 165 Tabelle 8-26: Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphatase (AP) im

Homogenat und Vesikelsuspension von renalen BLM. 166 Tabelle 8-27: Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP) und Na⁺/K⁺-ATPase im

Homogenat und Vesikelsuspension von jejunalen BSM. 167 Tabelle 8-28: Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase und alkalischen Phosphatase (AP) im

Homogenat und Vesikelsuspension von jejunalen BLM. 168 Tabelle 8-29: Expression des VDR-Proteins in jejunalen Zellkernextrakten bei Ziegen

in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 169 Tabelle 8-30: Expression des NaPi IIb-Proteins in jejunalen BSM bei Ziegen in Ab-

hängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 169

(20)

Tabelle 8-31: Expression des PTHR1-Proteins in jejunalen BLM bei Ziegen in Abhän- gigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 169 Tabelle 8-32: Expression des VDR-Proteins in renalen Zellkernextrakten bei Ziegen in

Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 170 Tabelle 8-33: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BSM bei Ziegen in Abhän-

gigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 170 Tabelle 8-34: Expression des PTHR1-Proteins in renalen BLM bei Ziegen in Abhän-

gigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 170 Tabelle 8-35: Maximale Pi-Aufnahmeraten (Vmax) und Halbsättigungskonstanten (Km)

des Na⁺-abhängigen Pi-Transportsystems der jejunalen BSMV bei Zie- gen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 171 Tabelle 8-36: Maximale Pi-Aufnahmeraten (Vmax) und Halbsättigungskonstanten (Km)

des Na⁺-abhängigen Pi-Transportsystems der renalen BSMV bei Ziegen in Abhängigkeit von der diätetischen P-Restriktion. 171

(21)

1. Einleitung

1.1 Phosphor-Haushalt beim kleinen Wiederkäuer

1.1.1 Hormone der P- und Ca-Homöostase

Die Phosphor (P)- und Calcium (Ca)-Homöostase wird beim monogastrischen Tier hauptsächlich durch 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3 (1α, 25 (OH)2 D3, Calcitriol) und Pa- rathormon (PTH) reguliert (JONES et al. 1998; POTTS 2005). Calcitonin ist an der Regulation in geringerem Umfang beteiligt (AUDRAN u. KUMAR 1985; BREVES u.

SCHRÖDER 1991).

Calcitriol, ein Steroidhormon, ist die physiologisch aktive Form des Vitamin D. Neben der Regulation der P- und Ca-Homöostase ist es an Prozessen der Zelldifferenzie- rung, Zellproliferation und Apoptose beteiligt (BROWN et al. 1999). Vitamin D wird in der Haut gebildet oder mit der Nahrung aufgenommen und in zwei Hydroxylie- rungsschritten in Leber und Niere in die aktive Form umgewandelt (HORSTING u.

DELUCA 1969; HENRY 1992). Der Abbau erfolgt ebenfalls in der Niere. Aufgrund seiner lipophilen Eigenschaft kann es durch die Zell- und Kernmembran diffundieren.

Im Zellkern bindet es mit hoher Affinität an Vitamin D3-Rezeptoren (VDR). Diese Re- zeptoren sind Transkriptionsfaktoren, die eine DNA-Bindungsdomäne besitzen (Abb.

1-1). Anhand der DNA-Bindungsdomäne erfolgt die Bindung an bestimmte DNA- Bindungsmotive (hormone-responsive elements) in Promotorbereichen von Calcitriol- regulierten Genen. Der VDR besitzt außerdem eine Liganden-Bindungsdomäne, die für die spezifische Interaktion mit dem Hormon (Ligand) verantwortlich ist. Der Li- gand-gebundene Rezeptor interagiert mit Kofaktoren, die den Kontakt zur Transkrip- tionsmaschinerie herstellen, und so die Transkription der Gene starten oder hemmen (MANGELSDORF et al. 1995).

Hormon- Bindungsstelle DNA-

Bindungsstelle

COO^- NH₂

Abbildung 1-1: Schematische Darstellung des VDR-Proteins (JONES et al.

1998).

(22)

Neben den genomischen Effekten hat Calcitriol auch eine schnelle (innerhalb von Sekunden bis Minuten) Wirkung, die keine mRNA-Synthese oder -Repression erfor- derte (BARAN 1994). Die Bindung erfolgte hier nicht an den VDR im Zellkern, sondern an MARRS (membrane-associated rapid response steroid binding protein). Das MARRS-Protein wurde in den basolateralen Membranen von Enterozyten bei Ratten und Hühnern gefunden (FLEET 2004). Die Signalübertragung erfolgte anhand von intrazellulären Signaltransduktionswegen wie Phospholipase C und verschiedenen Proteinkinasen (NEMERE et al. 1998). Konformationsänderungen des Calcitriol ent- schieden darüber, ob die Bindung an den membran- oder kernständigen Rezeptor erfolgte (NORMAN et al. 2001). Durch die zusätzliche Bindung von Calcitriol an MARRS könnten die genomischen Aktionen des Calcitriol verstärkt werden (NOR- MAN et al. 2001).

PTH, das zweite Hormon, das an der Regulation der P- und Ca-Homöostase beteiligt ist, wird in den Epithelkörperchen der Nebenschilddrüse gebildet und ist ein Peptid- hormon mit 84 Aminosäuren. Die Hormonsynthese wird durch die extrazelluläre Ca- Konzentration geregelt, die mittels des Calcium sensing-Rezeptors (CaR) der Ne- benschilddrüsenzellen gemessen wird (BROWN et al. 1993). PTH, das glomerulär filtriert wird (BA et al. 2003), bindet an den membranständigen Parathormon- Rezeptor Typ 1 (PTHR1), der sowohl in der apikalen als auch basolateralen Zell- membran lokalisiert ist. Dabei handelt es sich um einen G-Protein gekoppelten Re- zeptor, der sieben Transmembrandomänen besitzt (Abb. 1-2) und neben PTH auch das Parathormon-related peptide (PTHrP) bindet (JUPPNER et al 1991; ABOU- SAMRA et al. 1992). Neben dem PTHR1 existiert ein zweiter Subtyp des Rezeptors, PTHR2, der nur durch PTH, aber nicht durch PTHrP aktiviert wird und dessen biolo- gische Bedeutung bislang nicht vollständig geklärt ist (USDIN et al. 1995). Beide Re- zeptoren zählen zur Familie B der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und aktivieren mehrere intrazelluläre Signalkaskaden. Dazu gehören die Modulation über die Ade- nylatzyklase mit einem Anstieg des intrazellulärem zyklischem Adenosinmo- nophosphat (cAMP) und der Phospholipase-C-Weg mit Bildung von Diacylglycerol (DAG), sowie Inositol-3-Phosphat (IP3) mit einem Anstieg des intrazellulären Ca

(23)

(SHORT u. TAYLOR 2000; PIERCE et al. 2002). Die Rezeptoraktivierung durch Bin- dung des Liganden ist in zwei Schritte unterteilt. Im ersten Schritt erfolgt eine spezifische Wechselwirkung des N-terminalen Rezeptoranteils mit dem Peptidhormon. An- schließend erfolgt die Interaktion dieses Komplexes mit Transmembrananteilen für die Signalübertragung (ROLZ et al. 1999; MANNSTADT et al. 1999). Zur Aktivierung des PTHR1 sind nur 34 Aminosäuren lange N-terminale PTH-Fragmente erforderlich (MANNSTADT et al. 1999).

Abbildung 1-2: Schematische Darstellung des PTHR1 der Ratte. Die Sekundär- struktur des Gesamtrezeptors ist mit der vermutlichen Topologie der Transmembranhelices dargestellt (UREÑA et al. 1993).

1.1.2 Regulation der P- und Ca-Homöostase

Sowohl Calcitriol als auch PTH sind an der Regulation der P- und Ca-Homöostase von monogastrischen Tieren und Wiederkäuern beteiligt. Beide Hormone regeln das Zusammenspiel von Knochen, Weichgewebe, Nieren und Gastrointestinaltrakt, um die P- und Ca-Konzentrationen im Blutplasma zu regulieren und so den Ablauf von intrazellulären Prozessen zu sichern.

Zwischen Phosphat (Pi) und Ca besteht eine enge Beziehung, da sie durch ein an- nährend konstantes Löslichkeitsprodukt (das Produkt der Konzentrationen von Ca und Pi, das gerade noch die volle Löslichkeit des Salzes im Plasma erlaubt) mitein- ander verbunden sind. Wird dieses Löslichkeitsprodukt überschritten, lagern sich Ca-

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Pi-Kristalle nicht nur im Knochen, sondern auch in Gelenken, Nieren oder anderen Organen ab (RITSKES-HOITINGA et al. 1989a, b; MATSUZAKI et al. 1997, 2001).

Beim Wiederkäuer werden neben den erwähnten Organen die Vorgänge im Vorma- gensystem maßgeblich über die Regulation der P- und Ca-Homöostase beeinflusst.

P wird über die Nahrung aufgenommen und gelangt mit dem Speichel in den Pan- sen. Im Pansen lebende Mikroorganismen sind für die mikrobielle Fermentation des Futters verantwortlich. Dabei entstehende Fettsäuren dienen als Energielieferant für das Wirtstier (BRYANT 1959). Über eine hohe Pi-Sekretion mit dem Speichel (KAY 1966; POTTHAST et al. 1976; CHALLA u. BRAITHWAITE 1988a) erfolgt die Puffe- rung der Fettsäuren im Pansen. Ferner wird Pi von den Pansenmikroorganismen für die Adenosintriphosphat (ATP)- und Phospholipidsynthese gebraucht (KOMISARC- ZUK et al. 1987). Pi gelangt mittels abgestorbener Mikroorganismen, in gelöster und/oder gebundener Form, in den Darm. Große Mengen an Pi werden im Darm resorbiert (BRUCE et al. 1966; BEN-GHEDALIA et al. 1975; WILSON u. FIELD 1983;

SKLAN u. HURWITZ 1985; WYLIE et al. 1985). Quantitativ wird beim erwachsenen Tier im Dünndarm in etwa die Menge an Pi absorbiert, die über die endogene Spei- chelsekretion in den Magen-Darm-Trakt gelangt (PFEFFER et al. 1970; BEN- GHEDALIA et al. 1975; GOFF 2000). In der Niere wird Pi fast vollständig glomerulär filtriert, aber auch nahezu komplett wieder in den proximalen Tubuli resorbiert. Auf dem Blutweg gelangt Pi in die Speicheldrüsen, wo aufgrund der hohen Konzentrier- fähigkeit der Drüsen der Speichel mit Pi angereichert wird. Die Konzentration an Pi im Speichel liegt deutlich über der Plasma-Pi-Konzentration. Bei dem beschriebenen Mechanismus handelt es sich um den endogen Pi-Kreislauf, der für Wiederkäuer charakteristisch ist.

Unter physiologischen Bedingungen erfolgt die Ausscheidung von überschüssigem Pi

beim Wiederkäuer im Gegensatz zum monogastrischen Tier nicht über die Nieren, sondern verstärkt über die Faeces (BREVES u. SCHRÖDER 1991; WIDIYONO 1995; WALTER 1999).

Die diätetische P-Versorgung hat einen entscheidenden Einfluss auf die P- Homöostase des Wiederkäuers (SCOTT et al. 1984b). So sind die Plasma-Pi-Spiegel sowohl bei einer diätetischen P-Zulage, als auch -Restriktion positiv mit der P-

(25)

Aufnahme korreliert (PRESTON u. PFANDER 1964; BREVES 1985; RODEHUTS- CORD et al. 1994). Ferner wurde festgestellt, dass sowohl in Fütterungs- als auch Infusionsversuchen die Speichel-Pi-Konzentration direkt von der Pi-Konzentration im Plasma abhängig war (BEAL et al. 1973; SCOTT u. BEASTALL 1978; MAÑAS- ALMENDROS et al. 1982; CHALLA u. BRAITHWAITE 1988b, c; WIDIYONO et al.

1998).

Erst wenn die Plasma-Pi-Konzentration bei Ziegen einen renalen Schwellenwert (4,3 mmol · l^-1 Pi) überschritten hatte (WIDIYONO 1995), erfolgte eine verstärkte Aus- scheidung von Pi über den Harn. Dieser Schwellenwert wurde dann überschritten, wenn die Konzentrierungsfähigkeit der Speicheldrüsen für Pi überschritten war (MA- ÑAS-ALMENDROS et al. 1982; CHALLA u. BRAITHWAITE 1988a, b, c; CHALLA et al. 1989).

Eine lang anhaltende diätetische P-Restriktion führte zu einem Absinken der Pi- Konzentration im Pansen. Wenn die Pi-Konzentration im Pansen unter 0,03 mmol · l^-1 sank, wurden die Pansenmikroorganismen mit Pi unterversorgt, sodass sich als Fol- ge die mikrobielle Proteinsynthese verringerte (BREVES u. HÖLLER 1987). Es erfolgte eine Reduktion des Pi-Flusses durch den Darm, was einen Anstieg der intestinalen Pi-Absorption nach sich zog (SCHRÖDER et al. 1995a) und die fäkale Pi- Ausscheidung absenkte (SCOTT et al. 1984a; BREVES et al. 1987; BREVES u.

HÖLLER 1987). Die renale Pi-Ausscheidung war ebenfalls reduziert, jedoch spielte diese Einschränkung quantitativ keine Rolle (TERNOUTH u. SEVILLA 1990; PFEF- FER et al. 1993, 1995). Zur Aufrechterhaltung bzw. Wiederherstellung der Plasma-Pi- Konzentration erfolgte die Mobilisation von Pi aus Knochen und Weichgewebe (SHUPE et al. 1988; BLAIR-WEST 1992; VITTI et al. 2000). So kam es bei einer lang anhaltenden diätetischen P-Restriktion bei Schafen und Rindern zu Gewichtsverlus- ten, geringeren Futteraufnahmen, schlechtem Haarkleid, verringerter Ossifikation der Knochen, Knochenbrüchen oder Verhaltensanomalien wie z. B. Fressen von Kno- chen (Allotriophagie) (PRESTON u. PFANDER 1964; CORLETT u. CARE 1988;

BREVES u. PROKOP 1990; BLAIR-WEST 1992; SCOTT et al. 1994).

Zur Aufrechterhaltung der P- und Ca-Homöostase laufen transepitheliale Pi- Transportprozesse ab. In den einzelnen Organen sind spezifische Pi-Transporter als

(26)

Modulatoren lokalisiert, von denen besonders die im Jejunum und in der Niere gut charakterisiert sind. Die Expression dieser Pi-Transporter wird beim monogastrischen Tier durch Calcitriol und PTH nach Binden an den jeweils spezifischen Rezeptor reguliert.

1.1.3 Pi-Transporter als Modulatoren der P- und Ca-Homöostase

Für monogastrische Tiere wie auch für Wiederkäuer ist das mittlere Jejunum die Hauptlokalisation der intestinalen Pi-Absorption (SCHARRER 1985; ROSOL u. CA- PEN 1996). Die Aufnahme von Pi aus der Nahrung erfolgte beim monogastrischen Tier an apikalen Membranen des Dünndarms mittels eines Natrium (Na⁺)- abhängigen Pi-Transporters Typ IIb (NaPi IIb, solute carrier family 34 (sodium phos- phate), member 2 (SLC34A2)) (HILFIKER et al. 1998a; KATAI et al. 1999; WERNER u. KINNE 2001). Dies stellt den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für den tran- sepithelialen Pi-Transport dar. Nach Aufnahme von Pi in die Zelle wurde angenommen, dass es entlang des Mikrotubuli-Systems zur basolateralen Membran gelangte (DANISI u. MURER 1991). Die basolaterale Ausschleusung von Pi erfolgte unter einem elektrochemischen Gradienten carriervermittelt ins Plasma, wobei das entspre- chende Transportsystem noch nicht charakterisiert ist (DANISI u. MURER 1991). Die Protein-Expression des intestinalen Pi-Transporters in der apikalen Membran wurde durch eine diätetische P-Restriktion und/oder Calcitriol stimuliert (DANISI et al. 1990;

YAGCI et al. 1992; HATTENHAUER et al. 1999; XU et al. 2002; SEGAWA et al.

2004).

In den proximalen Tubuli der Nieren wird das filtrierte Pi fast vollständig wieder resorbiert. Die renale Pi-Aufnahme erfolgte über einen in den apikalen Membranen lokali- sierten Na⁺-abhängigen Pi-Transporter Typ IIa (NaPi IIa, solute carrier family 34 (so- dium phosphate), member 1 (SLC34A1)) (MAGAGNIN et al. 1993; MURER et al.

2000). Dabei handelte es sich um einen elektrogenen Symporter mit einer Stöchio- metrie von 3 Na⁺ und 1 Pi. Zunächst bindet 1 Na⁺, 1 Pi folgt und anschließend die beiden verbleibenden Na⁺-Ionen. Die Konformationsänderungen des Transportprote- ins, nach Anlagerung des ersten Na⁺-Ions, sorgten für die Aufnahme des Pi in die Zelle (MURER et al. 2001, 2003). Die basolaterale Ausschleusung von Pi erfolgt ent-

(27)

lang eines elektrochemischen Gradienten. Über die möglichen Transportmechanis- men ist bislang wenig bekannt. Möglich wäre ein Na⁺-unabhängiger Anionentauscher oder ein anderes Na⁺-abhängiges Pi Transportsystem in der basolateralen Membran, anhand dessen Pi wieder ins Plasma gelangt (GRINSTEIN et al. 1980; SCHWAB et al. 1984; SCHWAB u. HAMMERMANN 1986; HAGENBUCH u. MURER 1986; MU- RER et al. 2000). Die hormonelle Regulation der renalen Pi-Resorption erfolgte beim Nichtwiederkäuer in den proximalen Nierentubuli durch eine PTH-induzierte Internali- sierung des NaPi IIa aus den apikalen Membranen (PFISTER et al. 1997, 1998b, 1999), was eine verstärkte Phosphaturie zur Folge hatte. Das Signal für die Internali- sierung wurde von aktivierten apikalen und basolateralen PTHR1 ausgelöst (RESH- KIN et al. 1991; LOTSCHER et al. 1997, 1999; PFISTER et al. 1997, 1998a, 1999;

KEUSCH et al. 1998; MURER et al. 1999; BIBER et al. 2000; TRAEBERT et al.

2000). Bei einer diätetischen P-Zulage nahm bei Ratten ohne oder mit Parathyroi- dektomie die renale NaPi IIa-Protein-Expression ab (LOTSCHER et al. 1996, 1997;

TAKAHASHI et al. 1998; RICCARDI et al. 2000). Demzufolge sorgte Pi direkt, genau wie PTH, für die Internalisierung des NaPi IIa aus der apikalen Membran. Hingegen bei einer diätetischen P-Restriktion wurde bei Ratten eine Zunahme der renalen NaPi IIa-mRNA- und -Protein-Expression beobachtet (WERNER et al. 1994; LOTSCHER et al. 1996).

In den Speicheldrüsen beim Mensch erfolgte die Pi-Aufnahme aus dem Plasma über basolateral lokalisierte NaPi IIb-Transporter. Die apikale Pi-Abgabe in den Speichel erfolgte hypothetisch mittels eines elektrochemischen Gradienten und noch nicht be- kannten Transportmechanismen (HOMANN et al. 2005).

Für den kleinen Wiederkäuer sind die beschriebenen spezifischen Na⁺-abhängigen Pi-Transportsysteme in Darm und Niere sowohl funktionell, als auch strukturell ebenfalls gut charakterisiert. Im Duodenum von Schafen und Ziegen wurde ein protonen- abhängiger Pi-Transporter (H⁺-Pi-Transporter) beschrieben, der durch eine diäteti- sche P-Restriktion beeinflusst wurde (SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991, 1996; HUBER et al. 2002). Die molekulare Struktur dieses Transportsystems ist bisher noch nicht charakterisiert. In Analogie zum monogastrischen Tier wurde bei der Ziege für die

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Modulation der jejunalen Pi-Aufnahme ein Na⁺-abhängiges Pi-Transportsystem Typ IIb nachgewiesen (SCHRÖDER et al. 1995a; SCHRÖDER u. BREVES 1996; HU- BER et al. 2000). Eine diätetische P-Restriktion und/oder Calcitriol stimulierten auf Protein-Ebene den intestinalen Pi-Transport über die apikale Membran (HUBER et al.

2002; SCHRÖDER u. BREVES 1996). Eine diätetische P-Zulage hingegen hatte keinen Einfluss auf den jejunalen Pi-Transport bei Ziegen (ROESLER 2002; HATTEN- DORF 2004).

In den proximalen Tubuli der Nieren bei Ziegen erfolgte die Pi-Resorption über ein Na⁺-abhängiges Pi-Transportsystem Typ IIa (NaPi IIa), das funktionell und strukturell mit dem renalen NaPi IIa des Nichtwiederkäuers verwandt ist (VACHON et al. 1991;

FORD et al. 1997; SCHRÖDER et al. 2000). Durch eine diätetische P-Restriktion bei unveränderten PTH- und Calcitriol-Spiegeln erfolgte jedoch keine Stimulation wie beim monogastrischen Tier, da die renale Pi-Resorption bereits bei einer adäquaten P-Versorgung nahezu maximal ist (WIDIYONO et al. 1998; SCHRÖDER et al. 2000).

Bei einer P-Zulage wurde dagegen beim Wiederkäuer erst bei sehr hohen Plasma-Pi- Konzentrationen, aufgrund der Überschreitung der Nierenschwelle, Pi vermehrt mit dem Harn ausgeschieden (ROESLER 2002; BOESER 2004).

So könnten beim Wiederkäuer die vollständige renale Pi-Resorption als auch die hohe Nierenschwelle für Pi Anpassungsprozesse im Rahmen der Evolution an den P- Bedarf der Mikroorganismen im Pansen sein und demzufolge an die Bereitstellung von Pi für den endogenen Pi-Kreislauf.

In caprinen Speicheldrüsen wurde ebenfalls ein Pi-Transportermolekül nachgewiesen, das deutliche Übereinstimmungen mit dem bovinen NaPi IIb-Transporter, wie auch mit dem renalen Na Pi IIa-Transporter beim Schaf besaß. Der Subtyp des NaPi II-Kotransporters der Ziege ist derzeit nicht bekannt (HUBER et al. 2003). In funktio- nellen Untersuchungen an basolateralen Membranen der Speicheldrüsen bei Scha- fen wurde gezeigt, dass ein vorhandenes Na⁺-abhängiges Pi-Transportsystem nicht durch eine diätetische P-Restriktion beeinflusst wurde (VAYRO et al. 1991; SHIRAZI- BEECHEY et al. 1991).

(29)

1.1.4 Hormonelle Regulationsprozesse der P- und Ca-Homöostase Die hormonellen Regulationsprozesse der P- und Ca-Homöostase sind für das monogastrische Tier in Abb. 1-3 für die primäre Absenkung und für den primären An- stieg des Plasma-Pi-Spiegels in einer Übersicht dargestellt.

(3b) vermindert/vermehrt

Pi-Exkretion

(7)

vermehrt/vermindert Calcitriol im Plasma

(6)

vermehrt/vermindert Pi/Ca-Mobilisation (8)

(5)

(3c) (4c)

(4b)

(4)

(3) (2)

(1)

vermehrt/vermindert Pi/Ca-Absorption

Knochen / Weichgewebe Niere

vermehrt/vermindert Plasma-Ca-Konzentration

Darm Normophosphatämie

Hypophosphatämie

Nebenschilddrüse vermindert/vermehrt

PTH im Plasma

Hyperphosphatämie

Abbildung 1-3: Mechanismus zur Erhaltung der P- und Ca-Homöostase bei Hy- pophosphatämie/Hyperphosphatämie ohne vorherige Änderun- gen der Plasma-Ca-Spiegel beim Nichtwiederkäuer. Die Zahlen (1) – (8) kennzeichnen die Reihenfolge der ablaufenden Regula- tionsprozesse: Niedrige/hohe Plasma-Pi-Spiegel (1) sorgen an der Niere (2) für eine vermehrte/verminderte Aktivierung von Calcitriol (3). Am Knochen und Weichgewebe sorgt Calcitriol für eine verstärkte/verminderte Mobilisation von Pi und Ca (3b). Im Darm (4) kommt es zu einer verstärkten/verminderten Pi- und Ca-Absorption (4b). Die Plasma-Ca-Konzentration steigt/sinkt (3c, 4c). In der Nebenschilddrüse (5) kommt es zu einer verminderten/verstärkten PTH-Synthese und -Sekretion (6), die für eine niedrigere/höhere renale Pi-Exkretion sorgt (7). Die Plasma-Pi- Spiegel steigen/sinken und eine Normophosphatämie stellt sich ein (8).

(30)

Beim monogastrischen Tier stimuliert PTH in der Niere durch Binden an den memb- ranständigen PTHR1 direkt die tubuläre Ca-Resorption und Pi-Exkretion. Es sorgt für die Aktivierung der Transkription der renalen 25-Hydroxyvitamin D-1α-Hydroxylase (1α-OHase) (BRENZA et al. 1998; MURAYAMA et al. 1998), die in den Mitochond- rien der proximalen Tubuluszellen der Niere lokalisiert ist. Das Enzym ist für eine ver- stärkte Calcitriol-Synthese verantwortlich. Außerdem hemmt PTH die renale 24- Hydroxylase (HENRY 1981), die für den verstärkten Calcitriol-Abbau sorgt.

Am Knochen bewirkt PTH eine Freisetzung von Ca und Pi (GARDELLA u. JUPPNER 2001). Konzentrationsabhängig kann es aber auch eine knochenaufbauende Wir- kung haben (DEMPSTER et al. 1993).

Calcitriol kontrolliert die eigene Produktion durch Hemmung der PTH-Synthese in der Nebenschilddrüse (DEMAY et al. 1992; MACKEY et al. 1996).

Es sorgt nach Bindung an den VDR im Dünndarm für eine verstärkte Ca- und Pi- Aufnahme aus der Nahrung in die Enterozyten (WASSERMAN u. FULLMER 1995).

In der Niere wird unter dem Einfluss von Calcitriol die renale Ca-Ausscheidung reduziert, indem verstärkt Ca renal absorbiert wird (HEALY et al. 2003). Am Knochen kommt es zu einer verstärkten Ca-Mobilisation unter der Wirkung von Calcitriol (TA- KEDA et al. 1999).

Beim Wiederkäuer sind die Mechanismen der hormonellen Regulation der P- und Ca-Homöostase wenig untersucht, wie auch die Wirkungen von PTH und Calcitriol an Gastrointestinaltrakt und Niere nicht ausreichend geklärt sind.

Die oft bei einer Hypophosphatämie beobachtete Hypercalcämie bei Nichtwieder- käuern trat auch bei Schafen und Ziegen auf, ein entsprechender Anstieg der Plas- ma-Calcitriol- und/oder PTH-Konzentrationen wurde jedoch nicht beobachtet (BRE- VES et al. 1985; MAUNDER et al. 1986; MÜSCHEN et al. 1988; SCHRÖDER et al.

1990; SCHRÖDER u. BREVES 1996).

In Versuchen an Schafen, die eine diätetische P-Restriktion erhielten, wurden sowohl reduzierte Plasma-Calcitriol-Konzentrationen, wie auch daraus resultierend eine Ab-

(31)

nahme der intestinalen Ca-Absorption beobachtet (YOUNG et al. 1966; ABDEL- HAFEEZ et al. 1982).

In Ca-Infusionsversuchen an Ziegen wurde gezeigt, dass die PTH-Sekretionsrate, wie beim monogastrischen Tier, reduziert war. Die Regulation der Freisetzung von PTH aus internen Speichern der Nebenschilddrüsen erfolgte beim Wiederkäuer auch anhand der Plasma-Ca-Konzentration (HOVE u. SAND 1981).

Die intravenöse Gabe von Pi bei Schafen hatte hingegen keinen Effekt auf die Plas- ma-PTH-Spiegel. Die Zunahme der Pi-Konzentration in Plasma und Speichel könnte auf einem „direkten“ Pi-Effekt beruht haben, da eine Applikation von PTH bei Schafen ohne oder mit Parathyroidektomie keinen direkten Einfluss auf die Pi-Sekretion mit dem Speichel hatte (SCOTT u. BEASTALL 1978; MAÑAS-ALMENDROS et al.

1982). Ein indirekt stimulierender Effekt des PTH auf die Pi-Sekretion mit dem Spei- chel durch eine PTH-abhängige Steigerung der Speicheldrüsendurchblutung wurde bei Schafen diskutiert (WRIGHT et al.1984). Bei jungen Kühen hingegen wurde angenommen, das nicht PTH, sondern Calcitriol die Speichel-Pi-Konzentration und -Sekretion modulierte. Bei intravenöser Pi-Gabe war die Plasma-Calcitriol- Konzentration bei unveränderten PTH-Spiegeln reduziert und die Speichel-Pi- Konzentration und -Sekretion waren angestiegen. Wurde die Plasma-Calcitriol- Konzentration durch Injektion erhöht, stellte sich wieder eine Hyperphosphatämie ein, jedoch sanken die Speichel-Pi-Konzentration und -Sekretion (RIAD et al. 1987).

Die intravenöse Gabe von PTH bei Schafen, ohne oder mit Parathyroidektomie, hatte keinen Einfluss auf die renale Ca-Resorption oder Pi-Exkretion und Speichel-Pi- Sekretion. Jedoch stiegen die Plasma-Flussrate und die Pi-Konzentration im Speichel an (CLARK et al. 1975; MAÑAS-ALMENDROS et al. 1982). Bei ungeborenen Läm- mern im Mutterleib und Kälbern hingegen wurde durch Infusion von PTH eine Phosphaturie, wie sie beim monogastrischen Tier vorkommt, induziert (HOVE et al.

1984; DAVICCO et al. 1992).

Ferner wurde bei Kühen beobachtet, dass bei einer Hypocalcämie eine intravenöse Gabe von PTH für eine verstärkte Calcitriol-Aktivierung in der Niere sorgte, wie das vom monogastrischen Tier bekannt ist (HORST u. REINHARDT 1983).

(32)

Anhand der Literatur konnte gezeigt werden, dass PTH bzw. Calcitriol auch beim Wiederkäuer an der Regulation der P- und Ca-Homöostase beteiligt sind. Jedoch unterschieden sich teilweise die Regulationsprozesse des Wiederkäuers von denen des monogastrischen Tieres.

Trotz der unveränderten Hormonkonzentrationen wurde bei P-restriktiv gefütterten Ziegen eine erhöhte intestinale Pi-Absorption gemessen (SCHRÖDER et al. 1995a).

Es wurde angenommen, dass bei unveränderten Hormonkonzentrationen die Eigen- schaften der spezifischen Hormonrezeptoren unter Einfluss einer diätetischen P- Restriktion verändert sein könnten. Aus diesem Grund wurde bei laktierenden Ziegen die Bindungskapazität und -affinität des duodenalen VDR unter Einfluss einer P- Restriktion untersucht. Die Bindungskapazität des VDR im Duodenum bei laktierenden Ziegen, die eine diätetische P-Restriktion erhielten, war unverändert. Die Disso- ziationskonstante, die Auskunft über die Affinität des Rezeptors für Calcitriol gibt, war hingegen signifikant reduziert und somit die Affinität des Rezeptors erhöht (SCHRÖ- DER et al 1990). Bei männlichen wachsenden Ziegen wurde durch eine diätetische P-Restriktion im Duodenum, Jejunum und proximalen Kolon eine Reduktion der Bin- dungskapazität bei gleichzeitig unveränderten Dissoziationskonstanten des VDR gemessen (SCHRÖDER et al 1995b). Anhand der unklaren Ergebnisse konnte in diesen Untersuchungen die Beteiligung des intestinalen VDR an der aktiven intestinalen Pi-Absorption nicht nachgewiesen (SCHRÖDER et al 1990, 1995b).

Die P-Homöostase beim Wiederkäuer wird demzufolge nicht im gleichen Maß über die Konzentrationen an PTH und/oder Calcitriol bei einer diätetischen P-Störung reguliert wie beim monogastrischen Tier. Dies führte zu der dieser Dissertation zugrun- de liegenden Arbeitshypothese, dass bei Ziegen trotz gleicher Hormonspiegel bei einer diätetischen P-Störung die Expressionshöhe der spezifischen Rezeptoren für PTH und Calcitriol verändert sein könnte.

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1.2 Zielsetzung

Nach Störung der P- und Ca-Homöostase durch eine unterschiedliche diätetische P- Versorgung bei Ziegen sollte die Expressionshöhe der jejunalen und renalen PTH- und Calcitriol-Rezeptoren auf mRNA- und Protein-Ebene untersucht werden.

Außerdem sollte die Expressionshöhe der Zielstrukturen der PTH- und Calcitriol- Wirkung, der jejunale und renale Pi-Transporter, auf mRNA-, Protein- und funktionel- ler Ebene bestimmt werden.

Hierzu mussten folgende methodischen Voraussetzungen etabliert werden:

• Die Entwicklung von spezifischen DNA-Sonden zum Nachweis von PTH- und Calcitriol-Rezeptoren in Jejunum und Niere.

• Die simultane Präparation von apikalen und basolateralen Membranen aus den Epithelien des Jejunums und den proximalen Tubuli der Nierenrinde.

• Die Präparation von Kernextrakten aus den Epithelien des Jejunums und den proximalen Tubuli der Nierenrinde.

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2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere und Haltung

Die Untersuchungen wurden an 24 Ziegenlämmern der Rasse „Weiße Deutsche Edelziege“ aus dem Bestand des Institutes für Tierernährung der Friedrich-Wilhelms- Universität zu Bonn durchgeführt. Im Rahmen eines gemeinsamen DFG-Projekts sind die hier beschriebenen Tiere noch unter anderen Fragestellungen untersucht worden. Alle Tiere wurden 1 – 2 Tage nach der Geburt von ihren Müttern getrennt.

Die 14 Tiere des P-Zulage-Versuchs (BOESER 2004; HATTENDORF 2004) wurden in zwei Gruppen eingeteilt und ab dem zweiten Lebenstag einzeln in Stoffwechselkä- figen eingestallt. Die restlichen 10 Tiere gehörten zum P-Restriktion-Versuch (LOOFF 2005) und wurden ebenfalls in zwei Gruppen geteilt. Zunächst wurden diese Ziegen zu zweit in stroheingestreuten Boxen gehalten. Ab Versuchsbeginn wurden diese Tiere einzeln in strohlosen Boxen gehalten, gefüttert und bilanziert. Eine Über- sicht über die in den zwei Versuchen verwendeten Tiere zeigt die Tabelle 2-1:

Tabelle 2-1: Gruppeneinteilung der Versuchstiere.

Versuch P-Zulage P-Restriktion

2 weibliche Ziegen

2 weibliche Ziegen 3 männliche

Ziegen 8 oP

3 Zwitter

5 P⁺ 3 männliche Ziegen

1 weibliche Ziege

3 weibliche Ziegen Anzahl der Tiere und Geschlecht 14

6 dP

5 männliche Ziegen

10

5 P^–

2 männliche Ziegen mittleres Alter bei Versuchsbeginn 2 Tage 3 Monate

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2.1.1 Fütterung

Versuch P-Zulage

Beide Gruppen des Versuchs P-Zulage erhielten Milch aus dem Sammelgemelk der Herde. Die Milch der Kontrolltiere hatte einen „original“ (o) P-Gehalt, während bei den Tieren der P-Zulage-Gruppe (doppelt (d) P) der Milch P in Form von Natriumdi- hydrogenphosphat (NaH2PO4) hinzugefügt wurde. Die Menge der Salze wurde so gewählt, dass es zu einer Verdopplung der Mineralstoffgehalte im Vergleich zur Milch kam (Tab. 2-2). Den Tieren wurde von Versuchsbeginn an Kraftfutter und Heu im Verhältnis 4:1 ad libitum angeboten, wobei die tatsächliche Aufnahme an Milch, Kraftfutter und Heu wöchentlich erfasst wurde.

Tabelle 2-2: Rohnährstoff-, Ca- und P-Gehalte des Kraftfutters der oP- und dP- Gruppe (Institut für Tierernährung, Universität Bonn).

Gehalte (g/kg T) Inhaltsstoffe oP dP

Rohprotein 184 178 Rohfaser 64 60,2

Rohfett 21,7 24,7

Rohasche 85,2 102

Ca 5,6 5,6

P 4,1 8,7

Versuch P-Restriktion

Die Ziegen wurden vor Versuchsbeginn zweimal täglich mit dem Sammelgemelk aus der Muttertierherde gefüttert. Nach Erreichen von im Mittel 19 kg Körpergewicht er- hielt die adäquat P (P⁺)-Gruppe durchschnittlich 0,63 g P pro Megajoule (MJ) Um- setzbare Energie (ME) und die restriktiv P (P^–)-Gruppe 0,15 g P/MJ ME. Die Futter- zusammensetzung war nahezu identisch (Tab. 2-3). Alle Tiere erhielten 600 g Kraft-

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futter pro Tag, auf drei Mahlzeiten verteilt. Als Raufutter wurde Stroh bis zu 300 g pro Tier und Tag gefüttert.

Tabelle 2-3: Zusammensetzung des Kraftfutters der P^–- und P⁺-Gruppen.

P^P^–-Gruppe P^P⁺-Gruppe Inhaltsstoffe

% der Futtermenge

Maisstärke 72,1 69,8

Saccharose 6,5 6,3

Sojaextraktionsschrot 13,8 13,4

Harnstoff 2,3 2,2

CaCO3 2,0 1,9

MgO 0,4 0,4

K2SO4 2,1 2,0

NaCl 0,5 0,5

Spurenelemente 0,2 0,2

Vitamine 0,03 0,02

NaH2PO4 -- 3,2

2.2 Probenentnahme

Die Tiere wurden vor der Geschlechtsreife getötet, sodass die Geschlechtsunter- schiede keine Rolle spielen dürften. Mittels Bolzenschuss wurden die Ziegen betäubt und durch Eröffnung der Arteriae carotides communes entblutet. Die Bauchhöhle wurde eröffnet und die Nieren entnommen. Die Kortizes wurden präpariert und in flüssigem Stickstoff (N2) eingefroren. Gleichzeitig erfolgte die Entnahme des mittleren Jejunums, das mit eiskalter 0,9%iger Kochsalz-Lösung (Natriumchlorid, NaCl) ge- spült und der Länge nach aufgeschnitten wurde. Von dem Darmsegment wurden 10 cm abgeschnitten, unter Zuhilfenahme eines Objektträgers der lumenseitige Anteil der Darmwand vom Rest separiert und umgehend in flüssigem N2 eingefroren. Der

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restliche Darmabschnitt wurde komplett in flüssigem N2 eingefroren. Bis zur Verarbei- tung wurden die Proben bei –80 °C gelagert.

2.3 Chemikalien, Lösungen, Puffer und Medien

Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien, Lösungen, Puffer und Medien sind im Anhang aufgeführt.

2.4 Enzyme und Antikörper

Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme und Antikörper sind im Anhang aufgeführt.

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Mittels des Fließschemas (Abb. 2-1) soll der chronologische Ablauf der durchgeführ- ten Präparationen und Analysen dargestellt werden. Mittels spezifischer Nachweis- verfahren erfolgte die Detektion von Transportern und Rezeptoren auf RNA-, Protein- und teilweise auf Funktionsebene in den isolierten Fraktionen.

Gewebe (Kap. 2.2)

Nachweis von Rezeptor- und Transporter-mRNA mittels

Northern Analysen (Kap. 2.6)

Erzeugung von DNA-Sonden

(Kap. 2.5)

Isolierung von Zellkern- extrakten

Isolierung von jejunalen und renalen Membranen

(Kap. 2.8 & 2.9)

mRNA- Isolie-

rung

Biochemisch-analytische Methoden

(Kap. 2.10)

Nachweis von Rezeptor- und Transporter-Protein mittels

Western Analysen (Kap. 2.11)

Funktionelle Studien (Kap. 2.12)

Abbildung 2-1: Übersichtsschema der angewandten Methoden.

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2.5 Erzeugung von spezifischen DNA-Fragmenten zur Verwen- dung als Sonde in den Northern Analysen

In der Northern Analyse soll mit einem spezifischen DNA-Fragment die PTHR1- und VDR-mRNA detektiert werden. An renaler und jejunaler mRNA werden nach Um- schreibung in cDNA PTHR1- und VDR-spezifische DNA-Fragmente amplifiziert. Für die Amplifikation werden spezifische Primerpaare gesucht, die sich komplementär am Anfang bzw. am Ende der Zielsequenz an der cDNA anlagern. Es handelt sich hierbei um synthetisch erzeugte Oligonukleotide.

Für den Nachweis des renalen NaPi IIa (SCHRÖDER et al. 2000) und des jejunalen NaPi IIb (HILFIKER et al. 1998a) bei der Ziege stehen etablierte Primerpaare zur Verfügung, wie auch für den Nachweis von ß-Aktin-mRNA.

2.5.1 Primersuche

Für den VDR sind in der Literatur (SCHRÖDER et al. 2001) Primersequenzen im Je- junum beim Schaf beschrieben, die eine große Homologie zu dem des humanen VDR (Gene Bank Accession Nummer: J03258) besitzen. Da sowohl die zu untersu- chenden Ziegen als auch Schafe zu den kleinen Wiederkäuern zählen, wird eine Art- verwandtschaft angenommen, sodass die beschriebenen Primer (Tab. 2-4) für die Ziege ebenfalls spezifisch sein könnten. Die Suche nach spezifischen PTHR1- Primern erfolgte anhand verfügbarer Sequenzdaten für Mensch (Gene Bank Acces- sion Nummer: NM_000316), Schwein (Gene Bank Accession Nummer: U18315), Maus (Gene Bank Accession Nummer: NM_011199) und Ratte (Gene Bank Acces- sion Nummer: NM_020073) im National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Die DNA-Sequenzen wurden manuell untereinander verglichen und die Lokalisation von PTHR1-Primern der Ratte aus der Literatur (LARGO et al. 1999) gekennzeich- net. Da es für diese Primer Sequenzunterschiede zwischen den verschiedenen Spe- zies gab, wurden so genannte Wobbles in die Primer eingebaut (Tab. 2-4). So ent- stehen Primer-Gemische (Carl Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe), wo an bestimmten Stellen jeweils unterschiedliche Basen eingebaut sind (Tab. 2-4). Die

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Spezifität der Sequenzen, die für diese Primer herausgesucht wurden, sind mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) überprüft worden.

Tabelle 2-4: Sequenzen der PCR-Primer, spezifische Annealing-Temperaturen und Größe der Amplifikate.

Gen sense Primer antisense Primer

5’–ATGATGATATTGCTGCGCTC–3’

Sequenzposition: +91 – +110

5’–AGTGATCTCTTTCTGCATCC–3’

ß-Aktin

Annealing-Temperatur: 60 °C Amplifikat-Größe: 949 bp

5’–AGSTGGTKCCYGGGCACAA–3’

5’–CARCTCYTCCTCRGTGAGGC–3’

PTHR1

Annealing-Temperatur: 61,2 °C Amplifikat-Größe: 320 bp

5’–TTGACCGGAACGTGCCCCGGATC–3’

5’–GAGCGCAACATGATGACCTCAAT–3’

VDR

5’–ATGGTCTCCTCTGGCTTGTTG–3’

5’–CGGAGTGATGGCTGAGGTGA–3’

NaPi IIa

5’–TGCAGGAGCCACTGTTCATG–3’

5’–GCAGAGGTGAACACAGAGCT–3’

NaPi IIb

Annealing-Temperatur: 60 °C Amplifikat-Größe: 612 bp Abkürzungen für Wobbles:

K = G, T R = A, G S = G, C Y = C, T

2.5.2 Isolierung von Gesamt-RNA

Die Isolierung der renalen und jejunalen RNA erfolgte mit dem RNeasy^® Mini-Kit (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden). Die Durchführung erfolgte laut Protokoll des Her-

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stellers. Mit einem DNase-Verdau (RNase-Free DNase Set, Qiagen GmbH, D-40724 Hilden) wurden Reste genomischer DNA aus der RNA-Probe entfernt. Gelagert wurde die Gesamt-RNA bei –80 °C.

2.5.3 Reverse Transkription

Die reverse Transkription erfolgt mit einer modifizierten Reverse Transkriptase aus dem Moloney murine leukemia virus (MMLV). Für die Initiation der cDNA-Synthese werden Oligo(dT)-Primer eingesetzt, die mit dem 3’-Ende der Poly (A)⁺-RNA hybridi- sieren.

Für die Erststrang-Synthese wurde zu 1 µg Gesamt-RNA 1 µl Oligo(dT)-Primer (500 pmol · ml^-1) und 1 µl dNTP-Mix (je 10 mmol · l^-1) pipettiert. Der Ansatz wurde mit Aq. bidest. auf ein Gesamtvolumen von 13 µl aufgefüllt, für 5 min bei 65 °C denatu- riert und danach für 2 min auf Eis inkubiert, um Reassoziationen zu vermeiden. An- schließend wurden 4 µl 5x konzentrierter Erststrang-Synthesepuffer und 2 µl Dithi- othreitol (DTT; 0,1 mol · l^-1) hinzupipettiert und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Danach wurden 1 µl Reverse Transkriptase (200 U · µl^-1) hinzugegeben und der Ansatz bei 42 °C für 50 min inkubiert. Anschließend wurde das Enzym für 15 min bei 70 °C inak- tiviert. Die synthetisierte cDNA wurde bei –20 °C gelagert. Die Überprüfung der cDNA-Qualität erfolgte mittels PCR, ß-Aktin-Primern (Tab. 2-4) und einer sich an- schließenden Gel-Elektrophorese.

2.5.4 Präparative Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient der selektiven Vervielfältigung eines DNA-Segments, vorausgesetzt, die Sequenzen an den Enden sind bekannt. In einer Serie zyklischer Reaktionen werden zwei gegenläufige Oligonukleotide mit den be- kannten Sequenzen als Primer eingesetzt. Sie begrenzen den Abschnitt, der amplifiziert werden soll, wobei die optimale Bindung an den komplementären DNA- Einzelstrang temperaturabhängig (Annealing-Temperatur) ist. Während der Elongation werden die Primer durch den Einbau von komplementären dNTPs am 3’- Ende verlängert. Die DNA-Synthese selbst wird von dem thermostabilen Enzym DNA-Polymerase I des Bakteriums Thermus aquaticus katalysiert (MULLIS et al.