Aus dem Medizinischen Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. H.W. Seyberth
Jetzt: Prof. Dr. R.F. Maier
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg AG Molekulare und Experimentelle Pharmakologie
Leiter: Prof. Dr. R.M. Nüsing
mRNA Expression elektrolytregulierender
Proteine an der Maus
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt
von
Christoph Michael Ludewig aus Idstein
(geboren in Wiesbaden)
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 23.10.2007
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Dekan: Prof. Dr. Maisch
Referent: Prof. Dr. Nüsing
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I.
Einleitung... 3
I.1. Bartter-Syndrom ... 3
I.1.1. Einführung... 3
I.1.2. Einteilung des Bartter-Syndroms ... 4
I.1.2.1. Beschreibung der Symptomatik... 4
I.1.2.2. Pathogenese... 7
I.1.2.2.1. Funktion und Eigenschaften der IonenKanäle und -Transporter...10
I.1.3. Therapie und Prognose... 15
I.2. Arachidonsäurestoffwechsel: Bedeutung der Cyclooxygenase und von Prostaglandin-E2... 17
II.
Material und Methoden ...20
II.1. Material ... 20
II.1.1. (Bio-) Chemikalien... 20
II.1.2. Enzyme und Nucleinsäuren ... 20
II.1.3. Tiere, Tierfutter und Medikamente... 21
II.1.4. Instrumente und Apparaturen ... 21
II.1.5. Sonstige Materialien ... 22
II.1.6. Software ... 22
II.2. Methoden ... 23
II.2.1. Versuchsbedingungen und Präparation der Nieren... 23
II.2.2. Isolierung und Quantifizierung von RNA ... 24
II.2.3. DNAse-Verdau und Reverse Transkiption ... 26
II.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese ... 28
III.
Ergebnisse...33
III.1. Verdünnungen ... 33
III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen: Expression von Nierenproteinen ohne und mit Furosemidgabe... 37
Inhaltsverzeichnis
IV.
Diskussion...55
IV.1. Behandlung der Mäuse mit Furosemid: Modell für das antenatale Bartter-Syndrom zur Untersuchung der Veränderungen von Protein-expressionen in der Niere... 55
IV.2. C57Bl6-Mäuse ohne und mit Furosemidbehandlung im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen ... 55
V.
Zusammenfassung und Abstract...71
V.1. Zusammenfassung... 71
V.2. Abstract... 74
VI.
Literatur
VII.
Anhang
Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen
A Ampere
AMP Adenosin-Monophosphat ATP Adenosin-Triphosphat BS Bartter-Syndrom
BSND BS with sensoneurinal Deafness (mit sensorineuronaler Taubheit)
°C Grad Celsius
cAMP cyclic-AMP (cyclisches-AMP)
CaSR calcium-sensible receptor (Calcium-sensibler Rezeptor) CCD cortical collecting duct (kortikales Sammelrohr)
cDNA copy-DNA (kopierte-DNA)
Cl- Chlorid
ClC-K chloride-channel K (nierenspezifischer Chloridkanal K) CNT connecting tubule (Verbindungstubulus)
COX Cyclooxygenase
DCT distal convolut (distales Konvolut) DEPC Diethylpyrocarbonat DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ENaC epithelialel Na-channel (epithelialer Natriumkanal) EP E-Prostanoid
G Erdbeschleunigung
GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase HCl Salzsäure HPS Hyperprostaglandin-E2-Syndrom HS Henle Schleife JG juxtaglomerulär K+ Kalium KCC Kaliumchlorid Kotransporter M Mol (Einheit)
Verzeichnis der Abkürzungen
Mg2+ Magnesium
mRNA messenger-RNA (Boten-RNA)
MQ-H2O deionisiertes Wasser (Milli-Q mittels Reinstwasser)
Na+ Natrium
NaCl Natriumchlorid
NCCT thiazide-sensitive NaCl Cotransporter
(Thiazid-senitiver NaCl Kotransporter)
Nedd-4 neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4 (aus neuronalen Vorläuferzellen exprimiertes entwicklungs-
geschichtlich herrunterreguliertes Protein 4)
NKCC Na-K-2Cl Cotransporter (Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter) NSAR nichtsteroidales Antirheumatikum
OMCD outer medullary collecting duct (äußeres medulläres Sammelrohr) PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PGE2 Prostaglandin-E2
PGH2 Prostaglandin-H2
R2 lineare Regression
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System RNA Ribonucleinsäure
ROMK renal outer medullary K (renaler Kalium Kanal des äußeren Marks K) RT reverse Transkription
SGK Serum-Glucocorticoid regulierte Kinase SLT salt losing tubolopathie (Salzverlusttubulopathie) TAE Tris-Eisessig-EDTA
TAL thick ascending loop of Henle
(dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife) tAL thin ascending loop of Henle
(dünner aufsteigender Ast der Henle Schleife) TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Unit (Einheit)
UE Untereinheit UV ultra-violett V Volt
Einleitung 3
I.
Einleitung
Die Einleitung befasst sich mit dem Bartter-Syndrom und den verschiedenen Formen, dieser angeborenen Nierenerkrankung. Im Mittelpunkt stehen hierbei die Elektrolytveränderungen und somit die jeweilige Expression der dafür verant-wortlichen Ionen-Kanäle der Niere. Im Zusammenhang damit ist auch die Prostaglandinbildung und deren Enzym Cyclooxygenase von Bedeutung.
I.1. Bartter-Syndrom I.1.1. Einführung
Die erste Beschreibung des Hyperprostaglandin-E2-Syndroms stammt aus dem Jahr
1957, als die amerikanischen Pädiater Rosenbaum und Hughes einen 2 Monate alten Säugling beobachteten, der unter ausgeprägter Gedeihstörung, Dehydratation, sporadisch auftretender Diarrhoe, therapieresistenter hypokalämischer Alkalose, renalem Konzentraionsdefizit und Hyperkaliurie litt und mit 7 ½ Monaten in extremer Dystrophie verstarb (Rosenbaum, Hughes, 1957).
5 Jahre später wurden durch Bartter et al. zwei ähnliche Fälle veröffentlicht, bei denen zusätzlich eine hohe Aldosteron- und Reninaktivität nachgewiesen wurde, was Bartter zu der Vermutung veranlasste, es könne sich um eine Angiotensin-II-Resistenz mit kompensatorischer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems handeln, da zusätzlich der juxtaglomeruläre Apparat und die Macula densa der Niere hypertrophiert waren (Bartter et al. 1962). Seitdem wurde bei Krankheits-bildern mit hypokalämischer Alkalose und Hyperaldosteronismus kombiniert mit Normotension vom Bartter-Syndrom gesprochen. Weitere Fälle führten zu einer Differenzierung dieses Krankheitsbildes.
So hatten von Gitelman et al. im Jahr 1966 beschriebene Patienten eine erhöhte Krampfbereitschaft mit Hypomagnesiämie und Hypokalzurie (Gitelman et al. 1966). 1971 publizierten Fanconi et al. 2 umfassende Fälle, die zu dem bestehenden Symptomenkomplex noch Hyperkalziurie mit Nephrokalzinose und Osteopenie aufwiesen. Auffällig war bei diesen Kindern außerdem ein in der Schwangerschaft aufgetretenes Polyhydramnion (Fanconi et al. 1971).
Seyberth et al. beschrieben dieses Krankheitsbild mit Polyurie und einem lebensbedrohlichen Salzverlust, assoziiert mit vermehrter Prostaglandinbildung
Einleitung 4 In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, auf der Ebene von Kanalproteinen in der
Niere, die weiter unten beschriebenen pathogenetischen Modelle zu spezifizieren bzw. genauere Aussagen über deren Regulation zu machen. Daher wurde zunächst nach einem geeigneten Tiermodell gesucht. Takahashi et al. stellten 2000 ein Modell vor, mit dem es möglich ist, das antenatale Bartter-Syndrom bei Mäusen zu simulieren. Sie verglichen zu diesem Zweck Mäuse, bei denen durch homologe Rekombination das Gen des NKCC2-Kotransporters (Slc12a1) inaktiviert wurde, mit Mäusen, die das Schleifendiuretikum Furosemid erhielten, das den NKCC2-Kotransporter inaktiviert. Da die Neugeborenen NKCC2-/- Mäuse bereits vor der Entwöhnung verstarben, wurde der Versuch unternommen, sie mithilfe des COX-Hemmers Indomethacin am Leben zu erhalten. Da dies erfolgreich war, konnten nun die erwachsenen NKCC2-/- Mäuse mit den mit Furosemid behandelten, Wildtyp Mäusen verglichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nierenparameter beider Tiergruppen ähnlich waren, so dass das durch den Slc12a1-Gendefekt hervorgerufene antenatale Bartter-Syndrom durch die Behandlung von Mäusen mit Furosemid simuliert werden kann (Takahashi et al. 2000).
I.1.2. Einteilung des Bartter-Syndroms I.1.2.1. Beschreibung der Symptomatik
Da es sich beim Bartter-Syndrom nur um einen Überbegriff für die hereditären Salzverlust-Tubulopathien handelt, waren bald weitere Unterteilungen nötig. Die Nomenklatur erfolgte nach klinischen Symptomen, biochemischen Merkmalen sowie der vermuteten Pathogenese.
Klinisch ist die Unterteilung in das antenatale und das klassische Bartter-Syndrom, sowie das Gitelman-Syndrom sinnvoll (reviewed in Naesens et al. 2004).
Das antenatale Bartter-Syndrom (Bartter-Syndrom Typ I, II, IV, nach Hebert et al. 2003; auch Hyperprostaglandin-E2-Syndrom, nach Seyberth et al. 1985) ist durch ein
Polyhydramnion, Polyurie, sowie Polydypsie gekennzeichnet, wodurch es zu lebensbedrohlichen Dehydratationen kommen kann. Obwohl die Nierenfunktion oftmals gut erhalten ist, kommt es häufig zu Hyperkalziurie und Nephrokalzinose (reviewed in Naesens et al. 2004).
Das klassische Bartter-Syndrom (Bartter-Syndrom Typ III) beginnt in den ersten zwei Lebensjahren, oftmals erfolgt die Diagnose allerdings wesentlich später. Die Patienten haben ebenfalls Polyurie und Polydypsie und tendieren daher zur
Einleitung 5 Dehydratation. Ohne Behandlung sind Entwicklungsstörungen häufig. Biochemisch
handelt es sich um eine hypokalämisch, hypochlorämische metabolische Alkalose, nahezu ohne Nephrokalzinose, da die Ausscheidung von Calcium im Urin nur unwesentlich erhöht ist (reviewed in Naesens et al. 2004). Hingegen ist die Hypokaliämie hier besonders stark ausgeprägt.
Beim antenatalen und klassischen Bartter-Syndrom sind zudem eine verminderte Ausschüttung von Vasopressoren, Hyperplasie des juxtaglomerulären Apparates, Thrombozytenaggregationsstörung und eine erhöhte Prostaglandin-E2 (PGE2)
Ausscheidung im Urin beobachtet worden (reviewed in Naesens et al. 2004). Interessanterweise findet sich allerdings keine Erhöhung von PGE2 im Blut, wohl
aber in anderen Geweben (Seyberth et al. 1994). Weiterhin ist bei diesen Patienten das Natrium intrazellulär erhöht, was durch eine erhöhte Membranpermeabilität erklärbar ist (reviewed in Naesens et al. 2004).
Das Gitelman-Syndrom ist die mildeste Form des Bartter-Syndroms und wird daher oft erst im Erwachsenenalter durch eine milde Hypokaliämie und Alkalose entdeckt. Allerdings sind auch Fälle von Muskelschwäche, über regelmäßige Muskelkrämpfe bis hin zur Tetanie aufgetreten. Weitere Symptome sind nächtlicher Harndrang, Polydipsie, Polyurie, Durst, Hypotonie, Schwindel, Salzmangel, nächtliches Ein-nässen. Ausserdem sind Gelenkschmerzen durch Chondrokalzinose bekannt. Bio-chemisch handelt es sich ebenfalls um eine hypokalämisch metabolische Alkalose, aber nicht verbunden mit einer Hyperkalziurie wie bei den anderen beiden Formen, sondern kombiniert mit einer Hypokalziurie (reviewed in Naesens et al. 2004). Zusätzlich kommt es zu einer hypermagnesiurischen Hypomagnesiämie, wodurch sich auch die Muskelbeschwerden erklären lassen.
Eine vierte Form mit sensorischer Taubheit ist ebenfalls beschrieben (Landau et al. 1995).
In diesem Zusammenhang ist auch der autosomal-rezessiv vererbte Pseudohypo-aldosteronismus Typ 1 zu nennen, bei dem es sich ebenfalls um eine Salzverlust-tubulopathie handelt. Diesem liegt der Defekt des epithelialen Natriumkanals (ENaC) zugrunde und die Symptome ähneln der Wirkung von Amilorid. Es kommt also biochemisch zu Hyponatriämie, Hyperkaliämie und hyperchlorämischer meta-bolischer Azidose.
Eine weitere Krankheit, bei der es sich ebenfalls um einen Defekt des ENaC-Kanals handelt, ist das Liddle Syndrom. 1963 von Liddle et al. das erste mal als autosomal
Einleitung 6 dominantes Syndrom beschrieben, ist es durch früh einsetzenden schweren
Hyper-tonus, Hypokaliämie, sowie metabolische Alkalose und supprimierte Plasma Renin Aktivität und Aldosteron Level gekennzeichnet (Liddle et al. 1963; Warnock, 1998). Neben dieser klinisch orientierten Einteilung ist es wichtig, die Pathogenese zu verstehen, die in Tabelle 1 dargestellt ist.
Tabelle 1 Klassifikation der hereditären Salzverlusttubulopathien mit hypokalämischer Alkalose
(modifiziert nach Naesens et al. 2004)
Klassifikation Gen/
Chromosom Transport-defekt Lokalisation Funktion Bartter-Syndrom Typ I (Furosemid-SLT) antenatales BS SLC12A1 15q15-21 NKCC2 TAL Na+-Cl- -Wiederaufnahme TAL K+ Versorgung (NKKC2) Bartter-Syndrom Typ II (Furosemid-SLT) antenatales BS KCNJ1 11q24-25 ROMK CCD renale Ausscheidung von K+ TAL Cl- - Wiederaufnahme distaler Tubulus Cl- - Wiederaufnahme Bartter-Syndrom Typ III
(Furosemid-Thiazid-SLT) klassisches BS CLCNKB 1p36 ClC-Kb CCD Cl- - Wiederaufnahme
tAL β-UE (ClC-Ka) TAL β-UE (ClC-Kb) BSND
1p31
Barttin
vaskuläre Stria β-UE (ClC-Ka/Kb)
Bartter-Syndrom Typ IV (Furosemid-SLT) antenatales BS Cl- - Wiederaufnahme CLCNKA CLCNKB 1p36 ClC-Ka ClC-Kb tAL TAL → CCD Cl- - Wiederaufnahme Bartter-Syndrom Typ V (Furosemid-SLT) antenatales BS CASR 3q13.3-q21
CaSR TAL Hemmung NKCC2,
ROMK und Na+-K+ -ATPase Gitelman-Syndrom (Thiazid-SLT) SLC12A3 16q13 NCCT distaler Tubulus Na+-Cl- -Wiederaufnahme
SLT = Salzverlusttubulopathie; NKCC2 = Na+-K+-2Cl--Kotransporter; ROMK = K+-Kanal; ClC =
Cl--Kanal; CaSR = Ca2+-sensibler Rezeptor; NCCT = Na+-Cl--Kotransporter; TAL = Dicker
aufsteigender Ast der Henle Schleife; tAL = Dünner aufsteigender Ast der Henle Schleife; CCD = Kortikales Sammelrohr; HS = Henle Schleife; UE = Untereinheit
Einleitung 7 I.1.2.2. Pathogenese
Um die Pathogenese zu verstehen, ist es erforderlich, sich das Zusammenspiel der verschiedenen Ionenkanäle in der Niere anzusehen (s. Abb. 1 und 2).
Abb. 1a: Ionenkanäle der Niere Abb. 1b: Ionenkanäle der Niere
(distaler Tubulus) (distaler Tubulus /Sammelrohr)
Zelle Interstitium Lumen 3 Na+ 2 K+ Na+-K+ -ATPase K+ Cl -KCC 1, 3, 4 Cl - ClC-K BS Typ III Barttin BS Typ IV K+ 2 Cl Na -+ NKCC 2 BS Typ I K+ ROMK-2 BS Typ II Ionenkanal Ionenkanal Interstitium Interstitium passiver Transport aktiver Transport aktiver Transport 3 Na+ 2 K+ NCCT Gitelman Syndrom Na+ Cl -Zelle Zelle Lumen Lumen ROMK K+ Na+ 3 Na+ 2 K+ Na+-K+ -ATPase Na+-K+ -ATPase ENaC α, β, γ NEDD-4 Cl - Chlorid-Kanal passiver Transport aktiver Transport
Abb. 2: Nephron (schematisch) Abb. 1c: Ionenkanäle der Niere (TAL)
Wie in Tabelle 1, sowie den Abbildungen 1c und 2 ersichtlich, ist der Gendefekt beim Bartter-Syndrom Typ I - IV vor allem im dicken aufsteigenden Ast der Henle-Schleife lokalisiert.
Einleitung 8 Da der Wirkstoff Furosemid ebenfalls in diesem Bereich ansetzt (Blockade des Na+
-K+-2Cl--Kotransporters (NKCC2)), werden diese Syndrome auch als Furosemid-ähnliche-Salzverlusttubulopathien bezeichnet. Bilanzierend lässt sich sagen, dass die in Abbildung 1c angeführten Kanäle für den Transport von Natriumchlorid aus dem Tubuluslumen ins Interstitium zuständig sind, der für die Harnkonzentrierung essentiell ist. Treibende Kraft ist hierbei die Na+-K+-ATPase, die unter Energie-aufwand Natrium aus der Zelle ins Interstitium transportiert. Somit entsteht ein Gradient, über den der Na+-K+-2Cl--Kotransporter Natrium zusammen mit Chlorid und Kalium aus dem Tubulus in die Zelle transportiert. Der Defekt des Gens SLC12A1 führt dazu, dass NKCC2 seine Funktion verliert (Bartter-Syndrom Typ I). Wichtig ist außerdem, dass dieser Gradient auch aufrechterhalten wird, dazu muss das Kalium wieder aus der Zelle gelangen, was über den luminalen K+-Kanal ROMK (renal outer-medullary K+) möglich ist. Kalium muss deshalb zurück ins Lumen, weil
es dort eine wesentlich niedrigere Konzentration als Natrium und Chlorid hat und deshalb der begrenzende Faktor für den Na+-K+-2Cl--Kotransporter ist. Dieses System bricht zusammen, wenn, wie beim Bartter-Syndrom Typ II, die Funktion von ROMK ausfällt (Defekt des Gens KCNJ1). Weiterhin wird Chlorid basolateral aus der Zelle ins Interstitium transportiert, was entweder über einen Kalium-Chlorid Kotransporter (KCC1-4) oder über einen Chlorid-Kanal (ClC-Kb), (Defekt des Gens CLCNKB beim Bartter Syndrom Typ III, typisches Bartter-Syndrom) abläuft. Barttin hingegen stimuliert den ClC-Ka und ClC-Kb Kanal, daraus erklären sich die Symptome des Bartter Syndroms Typ IV (Mutation des Barttin Gens BSND), das zusätzlich mit Taubheit verbunden ist (reviewed in Naesens et al. 2004). Ebenfalls mit Taubheit verbunden ist ein von Schlingmann et al. beschriebener Fall, bei dem ein Kind eine ähnliche Symptomatik zeigte, wie beim Bartter Syndrom Typ IV. Hierbei handelt es sich allerdings um einen kombinierten Defekt der Gene CLCNKA und CLCNKB und dementsprechend einen Ausfall der Kanäle ClC-Ka und ClC-Kb, ohne dass das Barttin-Gen BSND betroffen ist (Schlingmann et al. 2004). Chlorid führt durch seinen Gradienten über der Zellmembran dazu, dass Magnesium und Calcium passiv interzellulär vom Lumen ins Interstitium folgen. Außerdem ist Chlorid wichtig, um die Elektronenbilanz neutral zu halten, das heißt, wird es durch die Blockade von ClC-K nicht ins Interstitium transportiert, ist auch weniger Natrium-Resorption möglich.
Einleitung 9 Beim Bartter-Syndrom Typ V (in der Abb. nicht gezeigt) handelt es sich um einen
Defekt des extrazellulären Calcium-Ionen sensitiven Rezeptor (CaSR). Dieser ist G-Protein gekoppelt und reagiert auf erhöhte extrazelluläre Konzentrationen von Calcium, indem er NKCC2, ROMK und die Na+-K+-ATPase hemmt. Der Kanal befindet sich auf der basolateralen Seite des dicken aufsteigenden Astes der Henle-Schleife (reviewed in Hebert, 2003).
Die verminderte Resorption von Natrium-Chlorid beim Bartter- sowie auch beim Gitelman-Syndrom (s.u.) erklärt auch die spätere Hypokaliämie, denn wenn Natrium in der Henle-Schleife und dem distalen Tubulus nicht ausreichend resorbiert wird, muss der Natrium-Verlust im Sammelrohr durch einen Natrium-Kalium Austausch ausgeglichen werden. Dies ist aber nicht im vollen Umfang möglich, da hier normalerweise nur noch die Feinregulation stattfindet.
Als weiteres Krankheitsbild ist das Gitelman-Syndrom bekannt. Hierbei ist der NCCT-Transporter (Na+-Cl--Kotransporter) defekt (s. Abb. 1a), was zu Symptomen
führt, die einer Behandlung mit Thiazid-Diuretika (daher auch Thiazid-ähnliche Salzverlusttubulopathie) ähneln, die ebenfalls an diesem Transporter ansetzen. Da der Mechanismus über NCCT nur für 7 % der Natrium-Ausscheidung über die Niere verantwortlich ist (Naesens et al. 2004), erklärt sich die relative milde Ausprägung der Bartter-Symptomatik. NCCT ist im distalen Tubulus des Nephrons lokalisiert und fördert die Resorption von Natrium und Chlorid vom Lumen des Tubulus ins Interstitium.
Die biochemischen Parameter des autosomal-rezessiv vererbten Pseudohypoaldo-steronismus Typ 1 erklären sich durch den Defekt des epithelialen Natriumkanals (ENaC) im Sammelrohr (s. Abb. 1b). Hier ist die Resorption von Natrium aus dem Lumen ins Interstitium nicht mehr möglich, und somit findet die Kaliumsekretion, die dem elektrochemischen Ausgleich dient, auch nicht mehr statt. Daraus folgt, dass im Gegensatz zum Bartter-Syndrom beim Pseudohypoaldosteronismus Typ 1 eine Hyperkaliämie vorliegt.
Genau umgekehrt verhält es sich beim Liddle Syndrom, bei dem der ENaC Kanal zwar ebenfalls mutiert, jedoch in diesem Fall vermehrt vorhanden ist (s. Abb. 1b). Es wird somit gesteigert Natrium rückresorbiert, und es kommt im Gegenzug zur ver-mehrten Kaliumsekretion. Durch die vermehrte Natriumwiederaufnahme wird auch Wasser aus dem Tubulus reabsorbiert und es kommt zum Hypertonus.
Einleitung 10 I.1.2.2.1. Funktion und Eigenschaften der Ionen-Kanäle und -Transporter
Na+-K+-ATPase:
Die Funktion der Na+-K+-ATPase in der Niere besteht darin, Natrium im Austausch mit Kalium aus der Zelle ins Interstitium zu transportieren. Dies ist im Bezug auf die Niere vor allem für die Natrium-Reabsorption essentiell.
Die Na+-K+-ATPase besteht aus verschiedenen Untereinheiten, bekannt sind die α,β,γ-Untereinheit (UE). Die minimale funktionale Einheit besteht aus einer α (1-4) und einer β (1-3) Einheit (reviewed in Blanco, Mercer 1998), wobei α die funktionale Einheit und β für die Struktur essentiell ist (Hasler et al. 1998). Die kleine γ UE ist in manchen Nierenabschnitten vorhanden und moduliert die Kinetik der Pumpe (Crambert, Geering 2003). α1 scheint die hauptsächliche oder einzige Untereinheit zu sein, die entlang des Nephrons exprimiert wird (Lucking et al. 1996). Aldosteron wirkt in der Niere am Aldosteron-sensitiven distalen Nephron, dem Verbindungs-Tubulus und dem Sammelrohr. Summa et al. wiesen nach, dass die Wirkung von Aldosteron auf die im Sammelrohr befindliche Na+-K+-ATPase, also vermehrte Expression, mit der α1-UE verknüpft ist. (Summa et al. 2003).
ClC-K:
Es gibt 2 ClC-K Chlorid Transporter, die in der Niere vorkommen, ClC-K1 (bei der Maus; entspricht dem menschlichen Ka) und ClC-K2 (bei der Maus; entspricht dem menschlichen Kb, Lokalisation auf Chromosom 1p36, Gen CLCNKB (Saito-Ohara et al. 1996)). Obwohl sich beide strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sie sich in ihrer Lokalisation innerhalb der Niere.
ClC-K1 wird im dünnen aufsteigenden Ast der Henle-Schleife exprimiert, findet sich aber auch in anderen Regionen des distalen Nephrons (Waldegger et al. 2002).
ClC-K2 befindet sich vor allem im distalen Nephron (dicker aufsteigender Ast der Henle-Schleife) an der basolateralen Membran (Yoshikawa et al. 1999
)
und spielt dort bei der Chlorid Resorption eine wichtige Rolle. Beim Defekt des ClC-K2 kommt es zum klassischen Bartter-Syndrom. Dieses ist weniger schwer ausgeprägt, als die antenatalen Formen. So führt das Bartter-Syndrom Typ IV (Defekt des BSND-Gens) zu einem wesentlich schwereren Krankheitsbild. Bei diesem Typ ist das Protein Barttin, ein Stimulator für ClC-K1 und K2, betroffen. Daraus lässt sich schließen, dass ClC-K1 einen zusätzlichen Effekt, im Vergleich zum reinen ClC-K2Einleitung 11 Ausfall beim klassischen Bartter-Syndrom, für die Ausprägung der Krankheit hat.
(Waldegger et al. 2002). Das gleiche gilt für den von Schlingmann et al. beschrie-benen Fall, bei dem die Gene von ClC-Ka und ClC-Kb unabhängig voneinander mutiert waren (Schlingmann et al. 2004).
ClC-K1 ist für die hohe Chlorid-Permeabilität im dünnen aufsteigenden Ast der Henle-Schleife verantwortlich und ist somit notwendig für die Urinkonzentrierung, ClC-K1-/- Mäuse weisen einen Defekt in der Fähigkeit auf den Urin zu konzentrieren (Uchida, 2000). Wolf et al. zeigten an Ratten, dass Furosemid die ClC-K1 mRNA Expression in der inneren Medulla der Niere um die Hälfte vermindert. Parallel dazu veränderte sich das Barttin. Dies weist auf den Versuch hin, über diesen Mecha-nismus die Wasser- und Salz-Homöostase zu erhalten (Wolf et al. 2003).
ROMK:
Die ROMK-Kanäle (renal outer-medullary K+) gehören zur Familie der ATP-regulierten-einwärtsgerichteten-niedrigspannungs K+-Kanäle, die vor allem für die Kalium Sekretion von Bedeutung sind (Giebisch, 1995). Beim Menschen sind fünf Formen des ROMK-Proteins bekannt, die durch Splicing des gleichen Gens entstehen (Shuck et al. 1994). Diese Kanäle sind vor allem im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife und im kortikalen Sammelrohr lokalisiert. In der Henle Schleife wird das Kalium auf der apikalen Seite durch ROMK aus der Zelle trans-portiert, um den elektrochemischen Gradienten für den Na+-K+-2Cl--Kotransporter aufrechtzuerhalten, zusätzlich fördert das entstehende lumenpositive Membranpoten-tial die Reabsorption von Magnesium und Calcium auf dem parazellulären Weg. Im Sammelrohr ist ROMK an der Kaliumsekretion aus der Zelle ins Lumen beteiligt (Frindt et al. 1989). Das entsprechende Gen ist KCNJ1 und liegt auf Chromosom 11q24-25 (Simon et al. 1996; Károlyi et al. 1997). Es ist beim Bartter-Syndrom Typ II geschädigt.
NKCC2:
Der bumetanide-sensitive Na+-K+-2Cl--Kotransporter (NKCC) gehört in die Familie der Kation-Cl--Kotransporter. In der NKCC Gruppe gibt es zwei Isoformen: NKCC1, ein weit verbreiteter Karrier, der auf der basolateralen Seite von polarisierten Zell-Typen exprimiert wird (Haas, Forbush III, 2000; Lytle et al. 1995; Mount et al. 1998)
Einleitung 12 und NKCC2, ein nierenspezifischer Karrier, der an der luminalen Membran des
dicken aufsteigenden Astes der Henle Schleife sowie in der Macula Densa vorkommt (Mount et al. 1999; Nielsen et al. 1998; Obermuller et al. 1996). Das entsprechende Gen ist das SLC12A1 auf Chromosom 15q15-21 (reviewed in Naesens et al. 2004) und ist beim Bartter Syndrom Typ I geschädigt. Der Ionentransport von NKCC beträgt, abgesehen vom Tintenfisch-Axon, immer 1 Natrium, 1 Kalium und 2 Chlorid. Im Zusammenspiel mit dem ROMK-Kanal, der das Kalium „recycled“, sowie der Na+-K+-ATPase, die den Gradienten für Natrium aufrechterhält und dem Chlorid-Kanal (ClC-K), über den Cl- die Zelle verlassen kann (Abb. 1c), ist NKCC2 für die Nettoresorption von Natriumchlorid aus dem Tubuluslumen der Niere nach basolateral verantwortlich. Somit ist er ein wichtiger Baustein für die Konzen-trierungsfähigkeit der Niere. PGE2 kann über den EP3-Rezeptor und ein
inhibitor-isches G-Protein die Adenylatcyclase hemmen, was zu einer erniedrigten Konzen-tration von cAMP führt und somit die NKCC2 Expression hemmt (reviewed in Shankar, Brater 2003). Schleifendiuretika, wie Furosemid, blockieren den NKCC2 Karrier und verhindern somit eine effektive Konzentrierung des Harns.
NCCT:
Der Thiazide-sensitive Natriumchlorid-Kotransporter (NCCT) ist vom Gen SLC12A3 auf Chromosom 16q13 kodiert, das beim Gitelman-Syndrom geschädigt ist (Simon et al. 1996; Lemmink et al. 1998). Es sind verschiedene Mutationen dieses Gens bekannt (Lemmink et al. 1998). Dieser Kanal wird im distalen gewundenen Tu-bulus exprimiert (Plotkin et al. 1996) und ist dort an der Natriumchlorid-Resorption beteiligt (Abb. 1a). Durch eine basolaterale Na+-K+-ATPase wird die intrazelluläre Natriumkonzentration niedrig gehalten und bildet somit einen Gradienten für Na-trium vom Lumen in die Zelle, durch den der Na+-Cl--Kotransporter (NCCT) ange-trieben wird. Das Chlorid kann durch einen basolateralen Chloridtransporter wieder aus der Zelle entweichen, so dass eine Netto Natrium-chlorid-Resorption besteht. Beim NCCT handelt es sich somit um einen elektroneutralen Ionentransporter.
KCC:
Die Kaliumchlorid-Kotransporter (KCC) gehören zur Familie der anorganischen, elektroneutralen Kationen-chlorid Kotransporter, zu der auch der Na+-K+-2Cl-
Einleitung 13 1998). Es sind vier verschiedene KCC-Kanäle (KCC1-4) bekannt. KCC1 kommt in
vielen Geweben, auch in der Niere, vor (Gillen et al. 1996; Kumar et al. 1996), KCC2 ist neuronal exprimiert (Payne 1997; Payne et al. 1996). Das entsprechende Gen liegt auf Chromosom 16q22.1 (Gillen et al. 1996; Frengen et al, 1995). KCC3 liegt auf Chromosom 5p15.3 und ist ebenfalls weit verbreitet, vor allem aber in Herz und Niere. KCC4 hingegen, der in Muskel, Gehirn, Lunge, Herz und Niere exprimiert wird, liegt auf Chromosom 15q14 (Mount et al. 1999). KCCs werden nicht vom Mebranpotential beeinflusst, jedoch aktiviert, wenn die Zelle in einem hypotonen Zustand ist und fungieren somit als Volumenregulatoren, da sie durch Ionenausschleusung aus der Zelle auch das Volumen vermindern (Cossins, Gibson, 1997; Lauf et al. 1992). Außerdem sprechen sie auf die Diuretika Bumetanide und Furosemid an, allerdings mit einer niedrigeren Affinität als NKCC (Gillen et al. 1996; Payne, 1997). Die Expression der Kanäle KCC1, 3, 4 erfolgt entlang des gesamten Nephrons, einschließlich des Glomerulus (Liapis et al. 1998). Im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ist der Kaliumchlorid-Kotransport auf der basolateralen Seite lokalisiert und ist somit an der Natriumchloridresorption dieses Teils des Nephrons beteiligt (Greger, Schlatter, 1983).
ENaC, Nedd-4, SGK:
Der Amilorid-sensitive ephiteliale Natrium-Kanal (ENaC) reguliert viele physiolo-gische Funktionen im distalen Kolon, dem Lungenepithel, den Gangzellen der exo-krinen Drüsen und auch im distalen Nephron (reviewed in Garty, Palmer, 1997). Dort wird er in der zweiten Hälfte des distalen Konvoluts (DCT2), im Verbindungstubulus (CNT), im kortikalen Sammelrohr (CCD) und im medullären Sammelrohr (MCD) exprimiert, wobei es im distalen Konvolut eine Überschneidung mit dem thiazid-sensitiven Natriumchlorid-Kotransporter (NCC) gibt (Duc et al. 1994; Schmitt et al. 1999; Loffing et al. 2000). Diese relativ breite Überschneidung gilt aber nur für die Maus und die Ratte, beim Menschen ist ENaC nur in einem kleineren Stück im distalen Konvolut angesiedelt, die Überschneidung ist also geringer, beim Hasen kommt ENaC im DCT überhaupt nicht vor (Biner et al. 2002). ENaC nimmt an der Feinregulation der Natriumreabsorption teil, die u.a. durch die Hormone Vasopressin, das Mineralkortikoid Aldosteron, sowie Insulin und Proteasen vermittelt wird (Kemendy et al. 1992; Kleyman et al. 1994; Marunaka et al. 1992; Vallet et al. 1997). Außerdem wird die ENaC Aktivität von intrazellulären
Einleitung 14 Ionen, wie etwa Natrium, Calcium oder Wasserstoff gesteuert (Awayda, 1999;
Chalfant et al. 1999; Palmer, Frindt, 1987; Loffing et al. 2000). Es gibt drei homologe Untereinheiten: α-, β- und γ–ENaC, die zusammen den Kanal bilden, fehlt die α-Untereinheit, gibt es keinen Ionenfluss, fehlen β- oder γ– Untereinheit, ist der Fluss erniedrigt (Canessa et al. 1994). Die α-Untereinheit liegt beim Menschen auf Chromosom 12p13.3. Die β- und γ-Untereinheiten sind beide auf Chromosom 16p12-p13 lokalisiert (reviewed in Gormley et al. 2003). Letztere kommen in Vesikeln vor und werden dann in die apikale Zellmembran eingebaut. Die α-Untereinheit kommt nicht in Vesikeln vor, was für eine unabhängige Regulation der α-Untereinheit gegenüber den β- und γ-Untereinheiten spricht (Hager et al. 2001). Beim Typ I Pseudohypoaldosteronismus, einer Krankheit, die durch Volumen-verringerung und Hypotonie charakterisiert ist, wurde eine Mutation einer ENaC Untereinheit nachgewiesen (Chang et al. 1996), ebenso beim Liddle-Syndrom, das durch Volumenvergrößerung und Hypertonie gekennzeichnet ist (Hansson et al. 1995; Shimkets et al. 1994).
Ein erst vor kurzer Zeit entdeckter Regulationsmechanismus läuft über die Proteine Nedd4 und SGK 1 ab.
Nedd4 (neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4) ist ein Protein, das im embryonalen Mäusegehirn in hoher Konzentration vorliegt, während der Entwicklung jedoch herrunterreguliert wird. Exprimiert wird es, zusammen mit ENaC, in den Hauptzellen von kortikalem (CCD) und äußerem medullären Sammelrohr (OMCD) des distalen Nephrons, aber auch in den Atemwegen und in distalen Lungenepithelien (Staub et al. 1997).
Es gibt zwei Nedd4-Formen in der Maus, mNedd4-1 und mNedd4-2 (Kamynina et al. 2001), die humane Homologe haben hNedd4-1 (Chromosom 15q21.1) und hNedd4-2 (Chromosom 18q21), beide haben eine Hect-Domäne, die als ubiquitin-protein Ligase fungiert und vier WW-Domänen, die für die Verbindung mit dem PY-Muster von ENaC verantwortlich sind (reviewed in Gormley et al. 2003). Durch diese Verbindung kommt die Hect-Domäne in die Nähe des ENaC-Kanals und dieser kann dadurch mit Ubiquitin markiert (‚ubiquitiniert’), endozytiert und lyso-somal/proteosomal abgebaut werden (Malik et al. 2001). Nedd4-2 scheint allerdings funktionell wichtiger in der ENaC Regulierung in vivo zu sein (Kamynina et al. 2001). Beim Liddle Syndrom kommt es zu einer Deletion des PY-Musters, an dem
Einleitung 15 die WW Domäne des Nedd4 ansetzt. Es wird vermutet, dass der fehlende Abbau von
ENaC über Nedd4 der Grund für die erhöhte ENaC Dichte ist (Staub et al. 1996). Ein weiteres Protein, das in die Regulation des epithelialen Natriumkanals eingreift, ist die SGK (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase). Es sind drei Formen bekannt, SGK 1 liegt auf Chromosom 6q23, SGK 2 und SGK 3 auf Chromosom 20 und 18 (reviewed in Gormley et al.), wobei nur SGK 1 in der ENaC-Regulation eine Rolle zu spielen scheint, da sowohl mRNA als auch Protein innerhalb der ersten 30 min. nach Aldosteronbehandlung, durch vermehrte Genexpression, induziert werden (Chen et al. 1999; Naray-Fejes-Toth, Fejes-Toth, 2000). Es wird vermutet, dass SGK nicht nur direkt auf ENaC wirkt, sondern auch indirekt über ein PY-Muster mit hNedd4-2 interagiert, indem es dieses phosphoryliert und damit inaktiviert und somit den Abbau des ENaC Kanals reduziert (Snyder et al. 2002).
I.1.3. Therapie und Prognose
Da eine Heilung dieser Krankheiten nicht möglich ist, kann es bei der Therapie bisher nur darum gehen, die Symptomatik so gut wie möglich zu beherrschen.
Wichtig bei allen Formen des Bartter-Syndroms ist vor allem eine ausreichende Salz- und Flüssigkeitszufuhr, die gegebenenfalls auch parenteral erfolgen muss.
Da vor allem beim antenatalen Bartter-Syndrom das Hyperprosaglandin-E2 massiv
erhöht ist, ist die Therapie mit einem Cyclooxygenase(COX)-Hemmer angezeigt. Dieser kann die pathologisch erhöhte Diurese um bis zu 50 % erniedrigen (Seyberth et al. 1985; Köckerling et al. 1996; Nüsing et al. 2001; Reinalter et al. 2002). Besonders gut eignet sich hier Indomethacin, das weniger gastrointestinale Nebenwirkungen hat als die anderen nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAR) und das den Hyperprostaglandin-E2-Spiegel besser senkt als diese (Seyberth et al. 1994).
Nebenwirkungen dieser Therapie sind vorübergehender Haarausfall, aber vor allem das Maskieren von Infektionskrankheiten durch das ausbleibende Fieber (Seyberth et al. 1994). Zusätzlich muss der Kaliumspiegel im Plasma kontrolliert werden und bei Hypokaliämie entsprechend Kalium substituiert werden. Beim Gitelman-Syndrom ist es außerdem angebracht, die Hypomagnesiämie durch eine Therapie mit Magne-siumpräparaten wenigstens teilweise zu beheben (Köckerling et al. 1998).
Einleitung 16 (Köckerling et al. 1998). Einige beschriebene Fälle von psychomotorischer
Retard-ierung sind wahrscheinlich auf postpartale Entgleisungen des Wasser- und Salzhaus-haltes sowie auf allgemeine Probleme der Frühgeburtlichkeit zurückzuführen (Schwartz et al. 1996; Seidel et al. 1995; Seyberth et al. 1998). Bei früher und konsequenter Behandlung ist die Prognose allerdings recht gut. Dies gilt auch für die milderen Formen, also das klassische Bartter- und das Gitelman-Syndrom.
Umgekehrt ist die Therapie beim Pseudohypoaldosteronismus Typ 1. Neben einer adäquaten Natrium- und Flüssigkeitssubstitution, muss die Kaliumzufuhr reduziert werden, bei bedrohlichen Hyperkaliämien muss gegebenenfalls auf die Gabe von Ionenaustauschern zurückgegriffen werden (Köckerling et al. 1998). Allerdings ist auch hier der Einsatz von COX-Hemmern gerechtfertigt, da Prostaglandin-E2
sekundär erhöht ist (Bommen et al. 1982; Rampini et al. 1978). Die Prognose hängt maßgeblich von der Prävention neonataler Dehydratationszustände und Elektrolyt-entgleisungen und auch vom Ausmaß der Beteiligung anderer Organsysteme ab (Köckerling et al. 1998).
Einleitung 17 I.2. Arachidonsäurestoffwechsel: Bedeutung der Cyclooxygenase und von
Prostaglandin-E2
Um zu verstehen, welche Auswirkungen die Prostaglandine, vor allem Prostaglandin E2, auf die Nierenfunktion haben und wie darin eingegriffen wird, ist es wichtig,
deren Entstehung aus der Fettsäure Arachidonsäure zu kennen. Auch die möglichen Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle.
Abb. 3 Arachidonsäuremetabolismus ProstaglandinSynthase (Peroxidase und Cyclooxygenase) Hydro(pero)xy-Fettsäuren Leukotriene Prostaglandine z.B. ProstaglandinE2 Thromboxane Prostaglandin H2 Lipoxygenase Arachidonsäure Phospholipase A2 Phospholipid (in Zellmembranen) Prostacycline
Arachidonsäure ist eine essentielle Fettsäure, das heißt, sie muss dem Körper zugeführt, bzw. kann, nur aus dem Körper zugeführten Fettsäuren, synthetisiert werden. Sie wird vor allem für den Einbau in Phospholipide der Plasmamembranen gebraucht.
Durch das Enzym Phospholipase A2 wird sie wieder aus der Plasmamembran
freigesetzt und steht für die Bildung von Eicosanoiden zur Verfügung. Über ver-schiedene enzymatische Stoffwechselwege (Prostaglandinsynthase, Lipoxygenase) kann sie in Prostaglandine (PG), Prostacycline, Thromboxane und Leukotriene überführt werden.
Einleitung 18 Diese Stoffe werden auch als Gewebshormone bezeichnet und werden in allen
Organsystemen gebildet. Sie wirken im direkten Umfeld ihres Produktionsortes (auto- oder parakrine Wirkung) und regulieren vielfältige Zellfunktionen.
In der Niere ist vor allem das PGE2 von Bedeutung. Lokal in der Niere erhöhte
PGE2-Werte sind als Ursache für die hypokalämische Alkalose des antenatalen
Bartter-Syndroms bekannt (Gill et al. 1976). Der vermutete Pathomechanismus spielt sich im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ab. Es wird angenommen, dass PGE2, vermittelt über einen EP3-Rezeptor und ein inhibitorisches G-Protein, die
Adenylatcyclase hemmt. Dadurch wird ATP vermindert zu cAMP abgebaut, das den Chlorid-Kanal (ClC-K) (Köckerling et al. 1998), sowie den Na+-K+-2Cl— Kotrans-porter (NKCC2) (reviewed in Shankar, Brater, 2003) stimuliert und damit die Reab-sorption fördert. Fällt dieser Stimulus weg, können dem Chlorid kein Natrium, Magnesium und Calcium folgen bzw. kann Natriumchlorid nicht resorbiert werden und damit kommt es zu einer verminderten Konzentrierungsfähigkeit des Harns. Darüber hinaus sind in der Macula Densa, die den aufsteigenden Ast der Henle Schleife mit dem Glomerulus verbindet, der NKCC2 und der ROMK Transporter exprimiert. In der Macula Densa wird die Salzionenkonzentration gemessen und es kann per Feedbackmechanismus das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) aktiviert werden. Man vermutet, dass dieser Mechanismus über COX-2 und PGE2
reguliert wird. Wenn nun, wie es beim antenatalen Bartter-Syndrom/ Hyperprosta-glandin-E2 Syndrom der Fall ist, NKCC2 oder ROMK ausfallen, ist über den oben
beschriebenen Mechanismus auch die Chloridkonzentration erniedrigt. Dies führt zu einer erhöhten COX-2 Expression und somit auch zu erhöhter Produktion von PGE2.
In diesem Zusammenhang ist noch die Bedeutung des Prostaglandinrezeptors EP4 zu nennen, über dessen Vermittlung, in den juxtaglomerulären Zellen, vermutlich das RAAS durch eine erhöhte cAMP Konzentration stimuliert wird. (Nüsing et al. 2001; Nüsing et al. 2005). Laut Tang et al. führt die über EP4 erhöhte cAMP Konzentration zusätzlich zu einer Vasodilatation der afferenten Arteriole (Tang et al. 2000).
PGE2 entsteht aus PGH2. Dieses wird aus der Arachidonsäure durch die
Prostaglandinsynthase synthetisiert, die als membrangebundenes Haem- und Glykoprotein sowohl Peroxidase- als auch Cyclooxygenaseaktivität besitzt. Dies erklärt, dass bei Hemmung der Cyclooxygenase PGH2 und somit auch PGE2
Einleitung 19 Es gibt verschiedene Cyclooxygenasen (COX). In der Niere spielen besonders
COX-1 und COX-2 eine Rolle, die dort vermutlich eine antagonistische Rolle spielen. COX-2 Inhibition führt zu einer Verminderung des Blutflusses im Nierenmark, daraus resultierend wird der Urin-Fluss vermindert und damit der Druckeffekt von Angiotensin II erhöht (Qi et al. 2002).
COX-1 und 2 unterscheiden sich aber auch in der Expression in der Niere. Während beide im Glomerulus, den papillären interstitiellen Zellen und den renalen Gefäßen nachweisbar sind, ist COX-1 im Sammelrohr besonders ausgeprägt exprimiert, wo-hingegen COX-2 dort bisher nur bei Mäusen nachgewiesen wurde. In der Macula densa und dem dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ist COX-2 bei Versuchs-tieren nachweisbar, bei Primaten und Menschen ist es bisher nur gelungen, bei über 60 jährigen COX-2 in diesen Regionen zu detektieren, wobei dies mit dem erhöhten Renin Wert bei älteren Menschen in Verbindung gebracht wurde (reviewed in Khan et al. 2002). Das COX-2 auch bei Patienten mit antenatalem Bartter-Syndrom in der Macula densa vorkommt, wiesen Kömhoff et al. nach (Kömhoff et al. 2000).
Bei der Beobachtung der Wirkung von selektiven COX-2 Hemmern im Vergleich zu COX-1 und -2-Hemmern (NSAR) fiel auf, das die renale Wirkung der NSARs, akute Verschlechterung der Nierenfunktion, mit Natrium-Retention, Ödemen, Hypertens-ion und Hyperkaliämie, ebenfalls bei den selektiven COX-2 Hemmern auftreten. Dies gilt vor allem für die Situation des physiologischen Stresses, was sich daraus erklärt, dass in diesem Fall die Konzentration der Vasokonstriktoren im Blut erhöht ist, und als Gegengewicht die Prostaglandine, vor allem PGE2, vermehrt gebildet
werden, um eine ausreichende renale Durchblutung zu sichern. (Breyer et al. 2001). Diese Wirkung macht man sich bei hohem Salz- und Wasserverlust, wie dies beim antenatalen Bartter-Syndrom der Fall ist, zunutze.
Besonders mit dem nichtselektiven COX-Hemmer Indomethacin wurden hier gute Erfahrungen gemacht (Seyberth et al. 1994). In neueren Studien wurde eine ebenso gute Wirksamkeit, wie die von Indomethacin, bei den selektiven COX-2 Hemmern Nimesulide und Rofecoxib beobachtet, außerdem sind die Nebenwirkungen auf den Gastrointestinaltrakt geringer (Nüsing et al. 2001, Reinalter et al. 2002).
Material und Methoden 20
II.
Material und Methoden
II.1. Material
II.1.1. (Bio-) Chemikalien
Bromophenol blue Roth, Karlsruhe
Chloroform Merck, Darmstadt
DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) Sigma, Steinheim
DTT (0,1M) Invitrogen, Karlsruhe
EDTA (25mM) (pH 8,0) Invitrogen, Karlsruhe EDTA (0,5M) (pH 8,0) Sigma, Steinheim
Eisessig Merck, Darmstadt
Ethanol (absolut) Riedel-de Haen®, Seelze
Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe
First Strand Buffer (5x) Invitrogen, Karlsruhe
H2O (RNAse frei) Ambion, Huntingdon,
Cambridgeshire (UK)
Isopropanol (2-Propanol) Merck, Darmstadt
PCR-Puffer (10x) Sigma, Steinheim
peq Gold RNA Pure™ peq lab Biotechnologie, Erlangen rRNasin® (Rnase Inhibitor) (40 U/μl) Promega, Madison Wi (USA) SeaKem® LE Agarose Cambrex Biosciences,
Rockland M.E. (USA)
Sucrose (w/v) Sigma, Steinheim
TRIS Base Roth, Karlsruhe
Xylene cyanol ff Sigma, Steinheim
II.1.2. Enzyme und Nucleinsäuren
100 Base-Pair-Ladder Amersham Biosciences,
Buckinghamshire (GB)
DNAse I (Amplification Grade) Invitrogen, Karlsruhe
dNTP (10mM) Amersham Biosciences,
Buckinghamshire (GB)
Material und Methoden 21
Primer Eurogentec, Köln
SuperScript™ II (RNAse H- RT) Invitrogen, Karlsruhe
Taq DNA Polymerase (5 U/μl) Sigma, Steinheim
II.1.3. Tiere, Tierfutter und Medikamente
Altromin Standard Diät 1320 (Ratten/Mäuse) Altromin Gesellschaft für
Tierernährung mbH, Lage
C57B16 Mäuse Charles River Lab. Inc. Wilmington,
MA, USA
COX-2-/- Mäuse Prof. Robert Langenbach, Research Triangle Park, North Carolina, USA EP4-Rezeptor-/- Mäuse Prof. Schuh Narumija, Kyoto
University, Japan
Forene (Isofluran) Abbot, Wiesbaden
Furosemide Sigma, Steinheim
Ketavet (Ketaminhydrochlorid) 100 mg/ml Pharmacia, Erlangen Rompun (Xylazinhydrochlorid) 2 %ig Bayer Vital, Leverkusen
II.1.4. Instrumente und Apparaturen
Elektrophoresebecken: Model B1 OWL Separation Systems, Porthsmouth HN (USA)
Gelbilddokumentationssystem Vilber Lourmat, Marne la Vallée
(France) Heizblock: Digi-Block® JR Laboratory Devices, Holliston MA
(USA) Heizblock: Dri-Block® DB-2D Techne Duxford, Cambridge (UK)
Heizblock: Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg PCR-Automat: T-Gradient Thermoblock Biometra, Göttingen
Photometer: Gene Quant II
(RNA/DNA Calc.) Pharmacia Biotech, Cambridge (UK) Polytron Typ PTA 10-35 Kinematica, Luzern (CH)
Präzisionsküvette
Material und Methoden 22 Spannungsgerät: Consort E321 (250/100) Consort nV, Turnhout (Belgien) Vortexer: VF2 Janke & Kunkel;
IKA®-Labortechnik, Staufen Waage: KB 600-2 Kern & Sohn, Balingen Zentrifuge: Biofuge fresco Heraeus Instruments, Hanau
Zentrifuge,Vortex: Combi Spin FVL-2400 BioSan Medical-Biological Research & Technologies, Riga (Latvia)
Zentrifuge: Sigma 110 Sigma Laborzentrifugen, Osterode am Harz
II.1.5. Sonstige Materialien
Epi-Cups (1,5ml) Eppendorf, Hamburg
Falcon® Tubes (14ml, sterile) Becton Dickinson Labware, Le Pont de Claix (France)
PCR Soft Tubes (0,2ml) Biozym scientific, Hess. Oldendorf
II.1.6. Software
Bio Capt MW Version 11.01 for Windows M8S Instruments Trading Inc.
ImageJ 1,32j Wayne Rasband,
National Institiutes of Health (USA) GraphPad Prism Version 4.02 for Windows GraphPad Software, San Diego
Material und Methoden 23 II.2. Methoden
II.2.1. Versuchsbedingungen und Präparation der Nieren
Versuchsbedingungen
Es wurden für die Versuche unterschiedliche Linien von Mäusen genutzt. Die Genehmigung der Tierversuche war durch das Regierungspräsidium Gießen ge-geben. Die Tiere wurden nach 21 Tagen von ihren Eltern getrennt und genotypisiert. Zu Beginn der Versuche waren die Tiere zwischen 8 und 12 Wochen alt. Die Versuchstiere wurden unter Standardbedingungen gehalten: das Licht war täglich von 6 Uhr morgens bis 18 Uhr abends an, und es herrschten konstant 23 °C in den Versuchsräumen, die Tiere bekamen Futter (Altromin Standard-Diät 1320) und Wasser ad libitum. Die Versuche dauerten jeweils 10 Tage. Es wurden pro Gruppe zwölf Referenz- sowie zwölf Versuchstiere eingesetzt. In der ersten Gruppe waren zwölf C57Bl6 Kontrolltiere, sowie zwölf Mäuse, deren Trinkwasser 1 mg/ml Furosemid enthielt. Diese Tiere hatten zusätzlich Zugang zu einem Salzstein, um die hohen Salzverluste ausgleichen zu können. In der zweiten Gruppe gab es den gleichen Versuchsaufbau, allerdings wurden hier COX-2-/- Mäuse verwendet und in der dritten Gruppe, wiederum unter gleichen Bedingungen, EP4-Rezeptor-/- Mäuse.
Präparation der Nieren
Zur Entnahme der Nieren wurden die Tiere narkotisiert. Narkose:
Nach einer Kurznarkose mit Isofluran bekam die Maus eine i. p. (intra peritoneale) Narkose mit Ketamin(Ketaminhydrochlorid 100 mg/ml)-Xylazin(Xylazinhydro-chlorid 2 %ig) 1:1 Æ 2 μl/g Maus. Die Spritze mit Narkotikum wurde von der rechte Leistenbeuge nach oben medial eingestochen, bis das Peritoneum durchstochen war, die Nadel nach oben medial ventral ausgerichtet und dann das Narkotikum eingespritzt.
Bei tiefer Narkose (die Maus reagiert nicht, wenn sie am Zehenansatz gezwickt wird), wurde die Maus mit Kanülen auf einer Styroporplatte fixiert (an der Achsel- und Leistenfalte).
Material und Methoden 24 Der so fixierten Maus wurde am Übergang von der Regio inguinalis zur Regio pubis die Haut mit der Schere durchtrennt, und der Schnitt nach distal zu den Hinterpfoten und nach oben bis zum Diaphragma verlängert.
Nun wurde die Bauchaorta der Maus freigelegt und mit einer Kanüle punktiert, das Blut wurde auf diese Weise so weit wie möglich aus dem Blutkreislauf der Maus entfernt (etwa 0,5 ml). Nachdem man die Nieren freigelegt hatte, konnte man diese mit der Schere heraustrennen. Die so entnommenen Nieren wurden in flüssigem Stickstoff gekühlt, bis sie, bei – 80 °C eingefroren wurden, um dann weiterver-arbeitet zu werden.
II.2.2. Isolierung und Quantifizierung von RNA
Die Isolierung der RNA aus den gefrorenen Nieren erfolgte nun in 4 Schritten:
1. Homogenisierung
Jeweils eine halbe Niere wurde im gefrorenen Zustand in ein Rundröhrchen, in das zuvor 1 ml peq Gold RNA Pure™ gegeben wurde, überführt, anschließend wurde die Probe für einige Sekunden im Polytron homogenisiert und für 5 Minuten auf Eis gestellt.
2. RNA-Extraktion
In eine Probe wurden 150 μl Chloroform gegeben und diese 15 Sekunden kräftig vermischt. Nachdem die Probe erneut für 15 Minuten auf Eis gestanden hatte, wurde 1 ml der Gewebelösung in ein 1,5 ml Epi-Cup überführt und anschließend für 20 Minuten zentrifugiert (13000 g, 4°C). Dadurch bildeten sich 2 Phasen: eine untere gelbliche Phenol-Chloroform-Phase, die DNA und Proteine enthielt, und eine obere wässrige, in der die RNA enthalten war.
3. RNA-Präzipitation
Die wässrige Phase wurde nun in ein neues Cup überführt, und das entsprechende Volumen an Isopropanol zugefügt. Nach erneutem Vermischen und Kühlen bei –80 °C für 30 Minuten wurde die Probe nochmals 30 Minuten zentrifugiert (13000 G, 4°C).
4. Waschen der RNA
Der wässrige Überstand wurde abgenommen und das RNA-Präzipitat mit 1 ml 70%igen Ethanol durch Vortexen und anschließendes Zentrifugieren (10 Minuten,
Material und Methoden 25 13000 G, 4°C) gewaschen. Dieser Waschschritt wurde wiederholt und der wässrige Überstand soweit wie möglich abgenommen. Anschließend wurde die Probe für 10 Minuten an der Luft trocknen gelassen. Zuletzt wurde das Präzipitat in 50 μl RNAse freiem TE (pH = 8) gelöst, die Probe 10 Minuten bei 70°C erwärmt und anschließend wieder auf Eis gestellt.
Quantifizierung der isolierten RNA
Die Konzentration der RNA in den Proben wurde mit Hilfe eines Spektralphotometers bestimmt. Dafür wurden die Proben 1:100 verdünnt. Das Gerät maß RNA-Proben in UV-Zellen gleichzeitig bei Wellenlängen von 230 nm, 260 nm und 280 nm. Dabei dienten 260 nm und 280 nm der Quantifizierung und Berechnung zur Reinheitsprüfung, während 230 nm zur Hintergrundskompensation (Proteine) gebraucht wurde. Die Nucleinsäureprobe galt als ausreichend rein, d.h. frei von Proteinen, wenn galt: 2 > A260/A280 ≥ 1,7 und A230 < A260 > A280. Nur
dementsprechende Proben wurden zur reversen Transkription weiterverwendet. Die RNA-Proben wurden auf 1 μg/ 7,5 μl eingestellt und bei –80°C gelagert.
T(RIS)E(DTA) (RNAse frei) (pH =8):
TRIS (1 M, pH 8,0) 1 ml
EDTA (0,5 M (pH 8,0) 200 μl ad 100 ml mit MQ H2O
Æ autoklavieren
Diethyl-Pyrocarbonate-H2O:
Reinst H2O wird mit 0,1% DEPC versetzt, über Nacht stehen gelassen und dann
Material und Methoden 26 II.2.3. DNAse-Verdau und Reverse Transkiption
DNAse-Verdau
Um zu gewährleisten, dass bei der später folgenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) keine DNA mehr vorhanden ist, die das Ergebnis verfälschen könnte, wurde vor der reversen Transkiption ein DNAse Verdau vorgenommen. Dies erfolgte nach folgendem Protokoll:
• 7,5 μl der RNA (= 1μg RNA) wurden in ein 1,5 ml Eppi-Cup pipettiert. • Zu jeder Probe wurden nun 2,5 μl des DNAse-Mastermixes (2 μl 5 X Puffer, 0,5 μl DNAse I) zugefügt und das Gemisch 15 Minuten bei 37°C inkubiert. • Anschließend wurde zu jeder Probe 1 μl EDTA (25 mM) gegeben und die
Proben kurz durchmischt und abzentrifugiert.
• Dann blieben die Proben 10 Minuten bei 65°C stehen, kamen kurz auf Eis, und wurden dann erneut abzentrifugiert.
Reverse Transkiption
Um die RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese zu detektieren und quantifizieren, musste die mRNA zuvor in copyDNA (cDNA) um-geschrieben werden. Die Synthese der cDNA mittels einer reversen Transkiptase (einer RNase-H--Mutante der Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Reversen-Transkript-ase, SuperScript™ II der Firma Invitrogen), sowie entweder oligo(dt) als Primer (um die komplette RNA umzuschreiben) oder einem Gemisch aus spezifischen Primern für folgende Proteine: SGK, KCC1, KCC3, KCC4. Für diese Proteine wurde eine spezifische Transkription gewählt, um die Selektivität zu erhöhen und das Signal zu verbessern. Die reverse Transkription erfolgte unter folgenden Bedingungen:
• Zu den 11 μl (enthielten die RNA) aus dem oben beschriebenen DNAse- Verdau wurde entweder 1 μl oligo(dt) oder 1 μl des spezifischen Primer- Gemisches (10μM) hinzugegeben. Wichtig war, dass auf Eis pipettiert und
mit der Pipette gemixt wurde.
• Nachdem die Proben 10 Minuten bei 70°C inkubiert wurden, kamen sie für eine Minute auf Eis und wurden anschließend zentrifugiert.
Material und Methoden 27 (250 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) + 1 μl d NTP
(10 mM) + 2 μl DTT (0,1 M) + 1 μl DEPC-H2O + 1 μl SuperScript™ II + 1 μl
rRNasin® (Rnase Inhibitor) (40 U/μl) wurde kurz durchmischt und zentrifu- giert, danach wurden 8 μl des Mastermixes zu den bestehenden 12 μl gegeben und die so entstandene Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. • Nun erfolgte eine Inkubation von 50 Minuten bei 42°C und eine weitere für 5 Minuten bei 95°C.
• Dann kam die Probe erneut auf Eis und wurde noch einmal abzentrifugiert.
Die so gewonnene cDNA diente als Vorlage für die PCR und wurde zwischenzeitlich bei –20°C gelagert. Zur Vermeidung von Kontamination bzw. Reaktion der RNA-Proben mit Ribonucleasen wurde stets mit Einmalhandschuhen und autoklavierten Plastikartikeln auf Eis bzw. bei 4°C gearbeitet.
Primer für die reverse Transkription:
SGK 5’-CGA GAC TGC CAA GCT TCC-3’ KCC1 5’-CGG ATC CAT TTC CAC TGC-3’ KCC3 5’-AGC TGG CAC CTG TCA ACC-3’ KCC4 5’-GGC CTG GCT TTT CTC TCC-3’
Material und Methoden 28 II.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese
Die PCR erlaubt es, gezielt Abschnitte, die von zwei bekannten DNA-Sequenzen eingerahmt werden, zu amplifizieren. Die Stränge der Ziel-DNA werden durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt. Danach wird die Reaktion abgekühlt, um die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen. Von diesen ausgehend synthetisiert die DNA-Polymerase in Gegenwart von allen vier dNTPs neue komplementäre DNA-Stränge. Dieser Zyklus wird mit derselben Reaktionsmischung 20-40 mal wiederholt, so dass es zu einem exponentiellen Anstieg der Produkte kommt, die zwischen diesen Sequenzen liegen. Hierzu wurde in dieser Arbeit folgender Ansatz und folgendes Programm benutzt.
PCR-Ansatz: DEPC-H2O 12,5 μl cDNA (1 :10 verdünnt) 2 μl 10 X Taq-Puffer 2 μl dNTP (2mM) 1 μl Vorwärts-Primer (10 μM) 1 μl Rückwärts-Primer (10 μM) 1 μl Taq-Polymerase (5 U/μl) 0,5 μl PCR-Programm
Schritt 1: Denaturierung 95°C 5 min
Beginn Schleife
Schritt 2: Denaturierung 95°C 45 sec Schritt 3: Anlagerung der Primer 65°C 60 sec Schritt 4: Verlängerung der Primer 72°C 60 sec
Material und Methoden 29 Primer für die PCR (in Klammern: Accessionsnumber der Gendatenbank):
GAPDH vorwärts 5’-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC TGC-3’ (M32599) rückwärts 5’-GCT GTT GAA GTC GCA GGA GAC AAC-3’ (Chan et al. 2002) 340 Basenpaare
ROMK vorwärts 5’-TGG TCT CCA AAG ATG GAA GG-3’ (AF012834) rückwärts 5’-AAG CAG AAA AAT GGC AGT GG-3’
356 Basenpaare
NCCT vorwärts 5’-TTT TCT GGA CCA CCA TCT CC-3’ (U61085) rückwärts 5’-GTT CTT GCC ATA GCC TTT GC-3’
371 Basenpaare
ClC-K1 vorwärts 5’-CAG CCC TCT TTC TAC GAT GG-3’ (NM_024412) rückwärts 5’-CTC TCT GGT CTC CAC CAA GG-3’
213 Basenpaare
Na+-K+- vorwärts 5’-TGT GAT TCT GGC TGA GAA CG-3’ ATPase α1 rückwärts 5’-TCT TGC AGA TGA CCA AGT CG-3’ (BC010319) 206 Basenpaare
NKCC2 vorwärts 5’-GGA TCC AAC CAA TGA CAT CC-3’ (U20973) rückwärts 5’-CCA GCA AGA ATC CCA GTA GC-3’
306 Basenpaare
ENaC β vorwärts 5’-CCC CAC CCA GCA ACT AGT GAA CTC AAA-3’ (NM_011325) rückwärts 5’-AAA GCA CGT GTT CCC CTT TCA AGA CTT-3’ (Chan et al. 2002) 420 Basenpaare
ENaC γ vorwärts 5’-GAC TCT CTT CCT GAC ACA AAT GGT CCT-3’ (NM_011326) rückwärts 5’-ACA CAC ATT CTC ACA CAT ACA CAT ACT-3’ (Chan et al. 2002) 749 Basenpaare
Material und Methoden 30
NEDD-4 vorwärts 5’-GCG ATT TGT GAA CCG TAT CC-3’ (U96635) rückwärts 5’-GCT CTT GGC AGC TTA TCA GG-3’
375 Basenpaare
SGK vorwärts 5’-GAA CAC GGC TGA GAT GTA CG-3’ (NM_011361) rückwärts 5’-ATA GGA GAA GCC GAG GAA GG-3’
370 Basenpaare
KCC1 vorwärts 5’-GGC TGT GGA CTT TCT TCT GC-3’ (AF121118) rückwärts 5’-GGT AAC AAT GGC CAG AAT GG-3’
374 Basenpaare
KCC3 vorwärts 5’-ACA CTT CCC GGT CTG TAT GC-3’ (AF211854) rückwärts 5’-GAC CGA GGG AAA GAA GAT CC-3’
379 Basenpaare
KCC4 vorwärts 5’-CTG GTA CTA CGC CCT TTT CG-3’ (AF087436) rückwärts 5’-GTG CCC TCT AGC ACA GAT CC-3’
300 Basenpaare
Für den PCR-Ansatz wurden je ein genspezifisches Primerpaar für GAPDH, ROMK, NCCT, ClC-K1, Na+-K+-ATPase α1, NKCC2, ENaC β, ENaC γ, NEDD-4, SGK, KCC1, KCC3 oder KCC4 verwendet.
Die PCR-Produkte wurden mit 6x-Probenpuffer (4 μl pro Ansatz) versetzt, je 10 μl davon auf ein 1,6 %iges Agarosegel aufgetragen, dem 0,75 μl Ethidiumbromid bei-gegeben waren und elektrophoretisch in 1x TAE-Puffer aufgetrennt (35 Minuten, 120 V/100 mA). Als Längenstandard diente eine 100-Basenpaare-Leiter. Die Banden konnten nun unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation erfolgte mit einer Dokumentationseinrichtung der Firma Vilber Lourmat, sowie des Pro-gramms Bio Capt MW Version 11.01 for Windows.
Material und Methoden 31 6x Probenpuffer: Bromphenol blue 0,25 % Xylene cyanol ff 0,25 % Sucrose (w/v) 40 % in MQ-H2O 50x TAE-Puffer: TRIS Base (2 M) 242 g Eisessig (100 %) 57,1 ml EDTA (0,5 M, pH 8) 100 ml ad 1 l mit MQ-H2O Agarosegel 1,6 %ig: 1,2 g Agarose 75 ml 1x TAE 0,75 μl Ethidiumbromid
Die Methode, welche reverse Transkription und PCR kombiniert, wird RT-PCR genannt. Sie ist sehr sensitiv, selbst geringe RNA-Mengen können detektiert werden (Wang et. al 1989). Dies liegt daran, dass die cDNA exponentiell vervielfältigt wird. Die Schwierigkeit liegt nun darin, eine quantitative Aussage zu treffen, da Unter-schiede in der Effizienz bei der RNA-Isolierung, der reversen Transkription und der Amplifikation auftreten können (Chelly et. al 1988). Deshalb wurde die endogene GAPDH-Sequenz als interner Standard gewählt. Da es sich bei GAPDH um ein konstitutiv exprimiertes Protein handelt, konnte man davon ausgehen, dass die Konzentration an GAPDH-RNA in den zu vergleichenden Proben immer gleich hoch war. Wichtig war nun, das sich GAPDH während der PCR noch im linearen Bereich befand, da man zwar theoretisch davon ausgehen kann, dass sich die Ziel-DNA wie in der folgenden Formel verhält: N = N0 * 2 n (N = Anzahl der Amplifikate, N0 =
Anzahl der Kopien der ursprünglichen DNA-Matritze, n = Anzahl der Vermehr-ungszyklen), unter experimentellen Bedingungen sich die zu vervielfältigenden Sequenzen jedoch nicht beliebig lange exponentiell vermehren. Es kommt im Laufe späterer Zyklen irgendwann zu einem Plateau- oder Sättigungseffekt, da sich die Produktionsrate vermindert. Daher wurde GAPDH in einer Verdünnungsreihe getestet, wobei man bei einer Verdünnung von 1:500, der aus der mRNA result-ierenden cDNA, im linearen Bereich arbeitete. Auch für die cDNA der anderen
Material und Methoden 32 untersuchten Proteine wurden entsprechende Verdünnungsreihen durchgeführt, und es wurde mit den in Tab. 2 (s. Ergebnisteil) aufgeführten Verdünnungen gearbeitet. Die cDNA-Konzentration der anderen Kanalproteine wurde ins Verhältnis zur GAPDH-cDNA gesetzt, womit man das relative Expressionsniveau der Kanäle berechnen und sie damit vergleichen konnte.
Mit dem Programm Imagej konnten die verschiedenen Banden aufgrund ihrer Grau-stufen quantitativ verglichen werden. Jede PCR-Reaktion wurde im Doppel durchge-führt. Nach Auswertung wurde der Mittelwert hieraus ermittelt.
Anschließend wurden die Ergebnisse mithilfe des t-Tests auf signifikante Unter-schiede getestet. Das Konfidenzintervall betrug p < 0,05 das heißt bei einem p ≤ 0,05 wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Probereihen festgestellt. In den Abbildungen wurden Signifikanzen mit einem * gekennzeichnet.
Ergebnisse 33
III. Ergebnisse
III.1. Verdünnungen
Wie schon unter Material und Methoden beschrieben bleibt die Amplifikation der c-DNA bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), nicht beliebig lange im expo-nentiellen Bereich, sondern es kommt im Laufe der Zeit zu einem Sättigungs- oder Plateaueffekt. Daher ist es vor Durchführung der Versuche wichtig, festzustellen, bei welchen Verdünnungen die Amplifikation noch im linearen Bereich liegt. Aus diesem Grund wurde eine Verdünnungsreihe der c-DNA mit den Primern aller verwendeten Proteine durchgeführt. Diese sind sowohl in den Abbildungen 3-15 als Ergebnis der Gelelektrophorese als auch graphisch dargestellt.
Abb. 3b: GAPDH Verdünnung - Grafik R2 = 0,9295 0 2000 4000 6000 8000 10000 1:1 1:5 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 4b: NKCC2 Verdünnung - Grafik R2 = 0,9206 0 2000 4000 6000 8000 1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 5b: ROMK Verdünnung - Grafik Abb. 3.a: GAPDH Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 1:5 1:1
Abb. 4a: NKCC2 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:500 1:100
Abb. 5a: ROMK Verdünnungsreihe
Verd. 1:100 1:10 1:1 R2 = 0,8545 0 2000 4000 6000 8000 1:1 1:10 1:100 1:1000 Verdünnung rel. Ein he it
Ergebnisse 34
Abb. 6b: KCC1 Verdünnung - Grafik
Abb. 7b: KCC3 Verdünnung - Grafik R2 = 0,9916 0 2000 4000 6000 8000 1:1 1:10 1:100 1:1000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 8b: KCC4 Verdünnung - Grafik R2 = 0,8552 0 2000 4000 6000 8000 1:1 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 9b: ClC-K1 Verdünnung - Grafik
Abb. 6a: KCC1 Verdünnungsreihe
Verd. 1:1000 1:100 1:10 1:1
Abb. 7a: KCC3 Verdünnungsreihe
Verd. 1:1000 1:100 1:10 1:1
Abb. 8a: KCC4 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 1:1
Abb. 9a: ClC-K1 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10 R2 = 0,9899 0 2000 4000 6000 8000 10000 1:1 1:10 1:100 1:1000 Verdünnung rel. Ein h eit R2 = 0,9516 0 2000 4000 6000 8000 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Ergebnisse 35
Abb. 10b: NCCT Verdünnung - Grafik R2 = 0,8903 0 2000 4000 6000 8000 10000 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 11b: Na+-K+-ATPase Verd. - Grafik
R2 = 0,8389 0 2000 4000 6000 8000 10000 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 12b: ENaC-β Verdünnung - Grafik
R2 = 0,893 0 2000 4000 6000 8000 1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 13b: ENaC-γ Verdünnung - Grafik
Abb. 10a: NCCT Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
Abb. 12a: ENaC-β Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:500 1:100
Abb. 13a: ENaC-γ Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10 Abb. 11a: Na+-K+-ATPase Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10 R2 = 0,9704 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Ergebnisse 36
Abb. 14b: Nedd-4 Verdünnung - Grafik R2 = 0,965 0 2000 4000 6000 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Abb. 15b: SGK Verdünnung - Grafik Abb. 14a: Nedd-4 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
Abb. 15a: SGK Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 R2 = 0,7397 0 2000 4000 6000 8000 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Verdünnung rel. Ein he it
Aus der Auswertung der Abbildungen ergaben sich für die c-DNA der Proteine folgende Verdünnungen, die bei allen weiteren PCRs verwendet wurden.
Kanalprotein bzw. Protein Verdünnung der c-DNA Größe der Fragmente GAPDH (Chan et al. 2002) 1 : 500 340 Basenpaare
NKCC 2 1 : 2000 306 Basenpaare ROMK-2 1 : 20 356 Basenpaare KCC1 1 : 50 374 Basenpaare KCC3 1 : 50 379 Basenpaare KCC4 1 : 500 300 Basenpaare ClC-K1 1 : 500 213 Basenpaare NCCT 1 : 600 371 Basenpaare Na+-K+-ATPase α1 1 : 1200 206 Basenpaare ENaC β (Chan et al. 2002) 1 : 2000 420 Basenpaare ENaC γ (Chan et al. 2002) 1 : 500 749 Basenpaare
NEDD-4 1 : 500 375 Basenpaare
SGK 1 : 2000 370 Basenpaare
Ergebnisse 37 III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen: Expression
von Nierenproteinen ohne und mit Furosemidgabe
Einer Gruppe von jeweils zwölf C57Bl6-, COX-2-/-- sowie EP4-/--Mäusen wurde zehn Tage lang mit dem Trinkwasser Furosemid zugeführt, während eine ent-sprechende Kontrollgruppe von ebenfalls je zwölf Mäusen unter Standardbeding-ungen gehalten wurde. Danach wurden die Tiere getötet. Die Nieren wurden ent-nommen, bei – 80°C tiefgefroren und anschließend die RNA aufbereitet und in cDNA umgeschrieben. In den aus den Vorversuchen gewonnenen Verdünnungen wurde die cDNA zusammen mit den jeweiligen Primern in der PCR vervielfältigt. Nachdem die Ergebnisse der Proben unter Zuhilfenahme der Gelelektrophorese dargestellt und mittels eines Videodokumentationssystems gespeichert wurden, konnten sie aufgrund der unterschiedlichen Graustufen mithilfe des Programms ImageJ miteinander verglichen werden. Als Bezugsgröße diente GAPDH, ein konstituiv exprimiertes Protein (Haushaltsfunktion), zu dem alle Ergebnisse in Relation gesetzt wurden und so vergleichbar sind.
In den Abbildungen (Abb. 19-54) sind die PCR-Ergebnisse der Furosemid-behandelten Gruppen sowie der Kontrollgruppen im Original dargestellt (n=12). Rechts dargestellt ist die Mittlung der jeweiligen Graustufenauswertung, die die relative Expression zu GAPDH (Abb. 16-18) darstellt. Diese Weise der semi-quantitativen Analyse erlaubt den relativen Vergleich zwischen den jeweiligen Verum- und Plazebogruppen.
Ergebnisse 38
Abb. 16: GAPDH (Referenz) – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Abb. 17: GAPDH (Referenz) – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Abb. 18: GAPDH (Referenz) – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Der bumetanide-sensitive Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter (NKCC2) ist für die Netto-Resorption von Natrium und Chlorid, aus dem Tubulus ins Interstitium, im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife verantwortlich. Er wird durch das Schleifendiuretikum Furosemid gehemmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass Furosemid bei den C57Bl6-Mäusen langfristig zu einer Abnahme der NKCC2 mRNA-Konzentration in der Niere führt, in Zahlen ausge-drückt findet eine Reduktion von 100 % auf 59 % statt, was einer signifikanten Abnahme entspricht.
Dagegen findet sich bei den COX-2-/- sowie den EP4-/- Mäusen im Versuch mit Furosemid eine Zunahme der mRNA-Konzentration von 100 % auf 134 % bzw. 113 % gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen. Dies ist aber lediglich als Tendenz zu werten, da es sich in beiden Fällen um keine signifikanten Unter-schiede handelt.
Ergebnisse 39
Abb. 19: NKCC2 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 20: NKCC2 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 21: NKCC2 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
Ergebnisse 40
Abb. 22: ROMK – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 23: ROMK – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 24: ROMK – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Der ROMK-Kanal (renal outer-medullary K+) ist in der Niere im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert, wo er in der apikalen Membran sitzt und den Gradienten für NKCC2 aufrechterhält. Außerdem befindet er sich im kortikalen Sammelrohr, in dem er an der Kaliumsekretion teilnimmt. Unter Furo-semidgabe an die C57Bl6-Mäuse ist ein signifikanter Abfall der mRNA-Konzen-tration von ROMK in der Niere von 100 % auf 68 % zu verzeichnen.
Ergebnisse 41 Dagegen kommt es im Versuchsaufbau mit den COX-2-/- Mäusen unter der
Furo-semidbehandlung zur Zunahme der ROMK mRNA-Konzentration von 100 % auf 170 %. Dies ist ein signifikanter Anstieg.
Bei den EP4-/- Mäusen ist die Tendenz eines Anstieges der renalen mRNA-Kon-zentration unter der Gabe des Schleifendiuretikums zu erkennen (100 % zu 118 %; nicht signifikant). Abb. 25: KCC1 – C57Bl6-Mäuse ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 26: KCC3 – C57Bl6-Mäuse ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 27: KCC4 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
