III. Ergebnisse
III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2 -/- und EP4 -/- Mäusen: Expression
Ergebnisse 37
Ergebnisse 38
Abb. 16: GAPDH (Referenz) – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Abb. 17: GAPDH (Referenz) – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Abb. 18: GAPDH (Referenz) – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Der bumetanide-sensitive Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter (NKCC2) ist für die Netto-Resorption von Natrium und Chlorid, aus dem Tubulus ins Interstitium, im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife verantwortlich. Er wird durch das Schleifendiuretikum Furosemid gehemmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass Furosemid bei den C57Bl6-Mäusen langfristig zu einer Abnahme der NKCC2 mRNA-Konzentration in der Niere führt, in Zahlen ausge-drückt findet eine Reduktion von 100 % auf 59 % statt, was einer signifikanten Abnahme entspricht.
Dagegen findet sich bei den COX-2-/- sowie den EP4-/- Mäusen im Versuch mit Furosemid eine Zunahme der mRNA-Konzentration von 100 % auf 134 % bzw.
113 % gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen. Dies ist aber lediglich als Tendenz zu werten, da es sich in beiden Fällen um keine signifikanten Unter-schiede handelt.
Ergebnisse 39
Abb. 19: NKCC2 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 20: NKCC2 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 21: NKCC2 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Ergebnisse 40
Abb. 22: ROMK – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 23: ROMK – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 24: ROMK – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Der ROMK-Kanal (renal outer-medullary K+) ist in der Niere im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert, wo er in der apikalen Membran sitzt und den Gradienten für NKCC2 aufrechterhält. Außerdem befindet er sich im kortikalen Sammelrohr, in dem er an der Kaliumsekretion teilnimmt. Unter Furo-semidgabe an die C57Bl6-Mäuse ist ein signifikanter Abfall der mRNA-Konzen-tration von ROMK in der Niere von 100 % auf 68 % zu verzeichnen.
Ergebnisse 41 Dagegen kommt es im Versuchsaufbau mit den COX-2-/- Mäusen unter der
Furo-semidbehandlung zur Zunahme der ROMK mRNA-Konzentration von 100 % auf 170 %. Dies ist ein signifikanter Anstieg.
Bei den EP4-/- Mäusen ist die Tendenz eines Anstieges der renalen mRNA-Kon-zentration unter der Gabe des Schleifendiuretikums zu erkennen (100 % zu 118 %;
nicht signifikant).
Abb. 25: KCC1 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 26: KCC3 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 27: KCC4 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Ergebnisse 42
Abb. 28: KCC1 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 29: KCC3 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 30: KCC4 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Ergebnisse 43
Abb. 31: KCC1 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 32: KCC3 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 33: KCC4 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Die Kaliumchlorid-Kotransporter (KCC) werden im hypotonen Zustand aktiviert und dienen somit als Volumenregulatoren (Cossins, Gibson, 1997; Lauf et al. 1992). Die Expression der KCC1, 3 und 4 findet entlang des gesamten Nephrons statt (Liapis et al. 1998). Unter den Versuchsbedingungen ohne Furosemid, war für die C57Bl6-Mäuse, im Vergleich zu denen mit Furosemid, ein Abfall der mRNA in der Niere um
Ergebnisse 44 etwa die Hälfte erkennbar, für KCC1 von 100 % auf 45 %, für KCC3 von 100 % auf
54 % und für KCC4 von 100 % auf 42 % (signifikante Abfälle).
Dagegen zeigten die COX-2-/- Mäuse eine tendenzielle Zunahme der mRNA Kon-zentration bei allen drei Kanälen, wenn sie mit dem Schleifendiuretikum behandelt wurden, im Vergleich zu den Standardbedingungen; im einzelnen waren das: bei KCC1 von 100 % auf 156 %, bei KCC3 von 100 % auf 131 %, bei KCC4 von 100 % auf 108 % (alle nicht signifikant).
Bei den EP4-/- Mäusen ist erneut eine signifikant reduzierte mRNA-Konzentration zu sehen, wenn die Mäuse das Medikament bekamen. Es handelt sich hierbei um fol-gende Abnahmen (gegenüber Standardbedingungen): Die KCC1 mRNA-Konzentrat-ion nimmt von 100 % auf 57 % ab, während die für KCC3 und KCC4 von 100 % auf 61 bzw. 63 % abnimmt.
Ergebnisse 45
Abb. 34: ClC-K1 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 35: ClC-K1 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 36: ClC-K1 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Der Chloridtransporter ClC-K1 ist für die hohe Chlorid-Permeabilität im dünnen aufsteigenden Ast der Henle-Schleife verantwortlich und ist somit notwendig für die Urinkonzentration. Die mRNA-Konzentration dieses Transporters wird in der Niere,
Ergebnisse 46 unter der Gabe von Furosemid an die C57Bl6-Mäuse, nahezu nicht verändert.
Gleiches gilt für die COX-2-/- Mäuse.
Bei den EP4-/- Mäusen kommt es jedoch zu einer deutlichen Abnahme der mRNA Konzentration von ClC-K1. Bei den Versuchen zeigte sich ein Abfall der ClC-K1 mRNA-Konzentration, unter der Verabreichung von Furosemid, von 100 % auf 49 %, gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen.
Abb. 37: NCCT – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 38: NCCT – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 39: NCCT – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Ergebnisse 47 Der Thiazide-sensitive Natriumchlorid-Kotransporter (NCCT) wird im distalen
Konvolut exprimiert. Dort ist er an der Natriumchlorid-Resorption beteiligt. Unter Furosemidbehandlung der C57Bl6-Mäuse zeigt sich auf der Ebene der mRNA der Niere, im Vergleich zum Versuch ohne Furosemid, eine signifikante Abnahme der Expression von 100 % auf 67 %.
Im Gegensatz dazu, kommt es bei den COX-2-/- Mäusen zu keiner signifikanten Veränderung der NCCT mRNA-Konzentration, unter der Behandlung mit dem Schleifendiuretikum. Es ist von der Tendenz her jedoch eine Zunahme zu erkennen;
von 100 % auf 123 %.
Für die EP4-/- Mäuse ändert sich die mRNA-Konzentration ebenfalls nicht signifikant.
Ergebnisse 48
Abb. 40: Na+-K+-ATPase – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 41: Na+-K+-ATPase – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 42: Na+-K+-ATPase – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Die Natrium-Kalium-ATPase (Na+-K+-ATPase) ist eine von Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) abhängige Ionenpumpe. In der Niere kommt sie vor allem an der basolateralen Seite der Tubuluszellen vor und ist dort für den Austausch von 3 Natrium gegen 2 Kalium zuständig, wobei das Natrium aus der Zelle ins Inter-stitium transportiert wird und das Kalium den umgekehrten Weg nimmt. Daher
Ergebnisse 49 nimmt die Na+-K+-ATPase an der Resorption von Natrium ins Interstitium und der
Sekretion von Kalium in den Tubulus teil.
Als Resultat des Versuches kann man festhalten, das die mRNA der Na+-K+-ATPase unter den Bedingungen des erhöhten Salz- und Wasserverlustes, wie dies unter Furo-semid der Fall ist, in der Niere hochreguliert wird. Effektiv findet eine signifikante Zunahme um 38 %, von 100 % auf 138 %, statt.
Das Ergebnis der COX-2-/- Mäuse unterscheidet sich von dem der C57Bl6-Mäuse.
Unter Furosemidbehandlung ergibt sich hier nahezu keine Veränderung der mRNA Konzentration in der Niere.
Ein ähnliches Ergebnis ist bei den EP4-/- Mäusen zu beobachten. Hier findet sich ebenfalls keine signifikante Veränderung.
Abb. 43: ENaC β – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 44: ENaC γ – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Ergebnisse 50
Abb. 45: ENaC β – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 46: ENaC γ – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 47: ENaC β – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 48: ENaC γ – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Ergebnisse 51 Der Amilorid-sensitive ephiteliale Natrium-Kanal (ENaC) wird in der Niere im
distalen Nephron exprimiert und nimmt dort an der Feinregulation der Natrium-reabsorption teil. Er besteht aus drei homologen Untereinheiten. Neben der nicht untersuchten α-Untereinheit gibt es noch β- und γ-ENaC, die in Vesikeln vorkommen und aus diesen in die apikale Zellmembran eingebaut werden. Die mRNA-Konzentration in der Niere dieser beiden Einheiten der C57Bl6-Mäuse, ist unter der Behandlung mit Furosemid (β-ENaC: 146 %; γ-ENaC: 137 %) signifikant erhöht, im Vergleich zu Standardbedingungen (100 %).
Eine ähnliche Beobachtung lässt sich unter der Gabe von Furosemid an die COX-2 -/-Mäuse machen. Hier findet sich zwar keine signifikante Änderung der mRNA Expression der β- und γ-ENaC Untereinheiten im Vergleich zu Normalbedingungen, allerdings ist eine tendenzielle Zunahme unter der Diuretikagabe zu erkennen.
Bei den EP4-/- Mäusen lässt sich dagegen keine einheitliche Aussage machen. Die mRNA-Konzentration der β-Untereinheit zeigt eine deutliche Abnahme um 54 %, von 100 % auf 46 % unter der Behandlung mit dem Schleifendiuretikum. Dies ist signifikant. Bei der γ- Untereinheit ändert sich die mRNA-Konzentration jedoch nicht (100 % zu 100 %).
Ergebnisse 52
Abb. 49: Nedd 4 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 50: Nedd 4 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 51: Nedd 4 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Nedd-4 ist ein Protein, das beim Abbau von ENaC eine Rolle spielt, ENaC wird markiert (‚ubiquitiniert’), endozytiert und lysosomal/proteosomal abgebaut (Malik et al. 2001).
Unter den Versuchsbedingungen zeigt sich, dass die in der Niere vorkommende mRNA unter Furosemidbehandlung, im Vergleich mit den Standardbedingungen,
Ergebnisse 53 tendenziell erniedrigt wird und zwar um 16 %, dieser Wert ist jedoch nicht
signifikant.
Die Behandlung mit dem Schleifendiuretikum führt auch bei den COX-2-/- Mäusen eher zu einer Abnahme der Nedd-4 mRNA-Konzentration in der Niere. Auch hier handelt es sich aber um keinen signifikanten Unterschied.
Demgegenüber zeigen die EP4-/- Mäuse, die mit Furosemid behandelt wurden, gegenüber denen die keines erhielten, einen kleinen Anstieg der Nedd-4 mRNA-Konzentration, der jedoch ebenfalls nicht signifikant ausfällt.
Abb. 52: SGK 1 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 53: SGK 1 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 54: SGK 1 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
Ergebnisse 54 Die SGK 1 (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase 1) wirkt vermutlich auf der
einen Seite direkt stimulierend auf ENaC, andererseits aber auch indirekt durch die Inaktivierung von Nedd-4. In der Niere findet unter den Versuchsbedingungen bei den C57Bl6-Mäusen mit Furosemidbehandlung, gegenüber dem Versuch ohne Furo-semid, eine Abnahme der SGK 1 mRNA-Konzentration von 100 % auf 57 % statt (signifikanter Unterschied).
Bei den COX-2-/- Mäusen ist zwar eine Zunahme der mRNA-Konzentration von 100 % auf 120 % bei Furosemidgabe gegenüber Standardbedingungen zu beobach-ten, dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant.
Beim EP4-/- kommt es, wie auch schon bei den C57Bl6-Mäusen, zu einem signi-fikanten Abfall der SGK 1 mRNA-Konzentration unter der Gabe des Diuretikums. In diesem Fall war eine Abnahme von 100 % auf 72 % zu sehen.
Diskussion 55