das extramitochondriale Phosphorylierungpotential [ATP]/[ADP][Pi]. Stiegen die Konzentrationen von ADP und Pi intrazellulär an, erhöhte sich der O2-Verbrauch in der perfundierten Leber für die ATP-Synthese über die oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien. Wurde der Perfusionslösung Fruktose und Pi zugesetzt, stieg der O2 -Verbrauch und der ATP-Gehalt ebenfalls an (Sestoft 1974, 1979). Die Korrelation zwischen Plasma-Pi und intrazellulärem ATP-Gehalt in Leber und Niere war hochsignifikant positiv (r2=0,98) (Morris et al. 1978). Ebenso war der intrazelluläre ATP-Gehalt in caninen Nierentubuluszellen direkt mit dem intrazellulären Pi-Spiegel innerhalb des physiologischen Bereiches korreliert (r2=0,91) (Chobanian et al. 1995).
3. Pi und der Crabtree-Effekt: Die zwei Hauptwege der ATP-Synthese sind die Glykolyse und die oxidative Phosphorylierung (Dennis 1996). ATP-erzeugende und ATP-verbrauchende Stoffwechselwege in der Zelle modulieren sich gegenseitig, wobei in Hepatozyten die ATP-erzeugenden Prozesse aber den stärkeren Einfluss auf die Rate der ATP-verbrauchenden Prozesse haben. Die mitochondriale Produktion von ATP führte zu einer Reduktion der Glykolyserate um 26 % (Pasteur-Effekt), während die Glykolyse nur zu 10 % hemmend auf die mitochondriale ATP-Produktion wirkte (Crabtree-Effekt) (Ainscow & Brand 1999).
Glykolyse und oxidative Phosphorylierung konkurrieren um das gleiche intrazelluläre Substrat, Pi, da die Inkorporation von Pi in glykolytische Intermediate dessen Verfügbarkeit
für die mitochondriale Oxidation reduziert. Bei Einschränkung des extrazellulären Pi -Angebotes in isolierten, perfundierten Tubuli aus der Kaninchenniere sank der intrazelluläre Pi-Gehalt, die Rate des oxidativen Metabolismus und der intrazelluläre ATP-Gehalt. Diese Reaktion war aber nur bei ungestörter Glukoseaufnahme und -verstoffwechslung zu beobachten (Brazy et al. 1982, Brazy et al. 1984, Brazy & Chobanian 1996). Die Na+ -abhängige Pi-Aufnahme über die apikale Membran war hierbei essentiell für den zellulären Stoffwechsel (Brazy et al. 1982, Dennis 1996). Dieses Phänomen entspricht dem auch in anderen Geweben beschriebenen Crabtree-Effekt und beschreibt die Hexose-induzierte Hemmung des oxidativen Metabolismus oder die Folge eines reduzierten zytosolischen Pi -Angebotes - und somit eines relativen Überschusses an Hexosen - auf die mitochondriale Atmung. Der Mechanismus des Crabtree-Effektes beruht auf folgenden Wechselwirkungen zwischen Glykolyse und oxidativem Metabolismus: Für eine verminderte cytosolische Verfügbarkeit des Pi ist einerseits verantwortlich, dass Pi ein Substrat der Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase (GAPDH) ist, die die Triosephosphate während der Glykolyse bildet.
Außerdem stimuliert Pi die Hexokinase, was zur Bildung von Zucker-Phosphat-Monoestern führt. Eine Fruktoseapplikation in perfundierten Lebern resultierte in einer Zunahme von Fruktose-1-P und einer Abnahme des Pi und ATP-Gehaltes (Morris et al. 1978, Sestoft 1974).
Andererseits wurde eine Hemmung der apikalen Pi-Aufnahme im proximalen Tubulus der Niere durch hohe Glukoseaufnahme (Konkurrenz in der Nutzung des chemischen Na+ -Gradienten über die apikale Membran für beide Transportsysteme) und eine gesteigerte basolaterale Pi-Ausschleusung (Veränderung des basolateralen Membranpotentials) für die Reduktion des zytosolischen Pi verantwortlich gemacht (Brazy & Chobanian 1996). Die Verbindung zum oxidativen Metabolismus findet sich in den mitochondrialen Transportprozessen: Pi, das in den Mitochondrien über einen H+-abhängigen Pi-Antiporter akkumuliert wird (Ferreira et al.1989), ist ein wichtiges Gegenion für mitochondriale Anionentransporte. Intermediate aus dem Zitronensäurezyklus als Substrate für die innere
Atmung gelangen über einen Pi-abhängigen Dicarboxylattransporter in die Mitochondrien (Brazy et al.1984). Ein limitiertes extrazelluläres Pi-Angebot reduzierte die Verfügbarkeit von Dicarboxylat-Anionen in den Mitochondrien und könnte damit an der Reduktion des oxidativen Metabolismus und der ATP-Synthese beteiligt sein (Brazy et al.1984).
4. Pi und der Creatinphosphat-Shuttle: Pi-Mangel führte zu eingeschränktem Schlagvolumen des Herzens und Skelettmuskelschwäche mit Creatinurie. Pathophysiologisch wurden aufgrund des intrazellulären Pi-Mangels eine Depolarisation des Ruhemembranpotentials, die auf einer energetisch bedingten Reduktion der Na+K+ ATPase-Aktivität beruhte, und reduzierte ATP- und Phospholipid-Synthesen festgestellt (Fuller et al.
1976, 1978, O´Connor et al. 1977). Neben der reduzierten ATP-Synthese verminderten sich auch der Creatinphosphatspiegel (CrP) signifikant sowohl mit sinkendem intrazellulärem Pi
(r2=0,7) als auch mit fallendem Plasma-Pi-Spiegel (r2=0,8) und die Aktivität der mitochondrial und myofibrillär lokalisierten Creatinkinasen (Brautbar et al. 1982). ATP, CrP und die Creatinkinasen sind in den Energietransfer von den Mitochondrien zu den Myofibrillen in Herz- und Skelettmuskel involviert. In diesem als Creatinphosphat-Shuttle bezeichneten Prozess wird die Energie aus dem in der oxidativen Phosphorylierung entstandenen ATP an der äusseren Mitochondrienmembran durch die Creatinkinase auf Creatin transferiert, in dieser Form zu den Myofibrillen transportiert und dort durch eine Creatinkinase wieder auf das am Myosinkopf lokalisierte ADP transferiert. Störungen dieser Muskelbioenergetik im P-Mangel könnten mitverantwortlich für die beobachtete Muskelschwäche sein (Saks et al. 1980, Bessmann & Geiger 1981, Brautbar et al. 1982, Thompson & Kemp 1995, Radda 1996). Für die Eigenversorgung der Muskelzelle wurde ein Na+-abhängiges Pi-Transportsystem beschrieben, welches eine Pi-Konzentration von 2 - 4 mmol/l im Ruhezustand aufrecht erhielt (Kemp et al. 1992). Für die Leistungsschwäche im Herz-Kreislaufsystem könnte neben diesen bioenergetischen Störungen im P-Mangel außerdem eine verringerte Glykogenspeicherung im Herzmuskel verantwortlich sein (Hörl et
al. 1981), im Gefäßsystem konnte eine Angiotensin-Resistenz als auch eine verminderte Ansprechbarkeit auf Catecholamine festgestellt werden (Kreusser et al. 1982).
3. ZIELSETZUNG
Aus den bisherigen Kenntnissen über die an der P-Homöostase des Wiederkäuers beteiligten Organe und Gewebe ergeben sich die in Abbildung 4 dargestellten Zusammenhänge:
Niere
Abbildung 4: Phosphorhomöostase beim ausgewachsenen Wiederkäuer
Exogener P und endogenes Pi stehen den Mikroorganismen im Pansen für Stoffwechsel-leistung und Wachstum zur Verfügung. Pi, mikrobiell gebundener P und Futter-P gelangen in den Dünndarm und werden dort teilweise absorbiert. Die P-Bilanz ist bei ausgewachsenen, nicht laktierenden Wiederkäuern ausgeglichen. Die Höhe der intestinalen Aufnahme entspricht der im Speichel sezernierten Pi-Menge, da die renale Pi-Exkretion quantitativ unbedeutend ist. Die im Plasma befindlichen Pi-Mengen stehen im Fließgleichgewicht mit dem Pi-Pool im Weichgewebe und im Knochen, welcher als Pi-Speicher im Bedarfsfall mobilisiert werden kann. Der intermediäre Stoffwechsel beeinflusst die Verfügbarkeit dieses Speicher-P, ebenso kann eine Veränderung des Plasma-Pi-Pools den intermediären Metabolismus beeinträchtigen. Der Pi-Pool im Plasma ist nicht eng reguliert und zeigt eine breite physiologische Schwankung. Die Rezyklierung des Pi über die Sekretion mit dem
Speichel wird als endogener Pi-Kreislauf bezeichnet, welcher einen wichtigen Faktor zur Regulation der P-Homöostase darstellt. Die Adaptationsfähigkeit der beteiligten Organe in Kombination mit der möglichen Mobilisation der P-Speicher und dem intermediären Stoffwechsel garantieren eine dem Status des Tieres angepasste Regulation des P-Haushaltes.
Die zellphysiologischen Grundlagen dieses komplexen homöostatischen Systems sind für den kleinen Wiederkäuer bisher nicht untersucht worden. Daher ist es Ziel dieser Arbeit, diese auf molekularer Ebene und auf der Ebene des Intermediärstoffwechsels zu erfassen.
Þ Charakterisierung der molekularen Struktur und Funktion der epithelialen Pi -Transporter in Darm, Niere und Speicheldrüse bei Schafen und Ziegen
Þ Molekulare und funktionelle Entwicklung der epithelialen Pi-Transporter während der Ontogenese bei Ziegen; Charakteristika des endogenen Pi -Kreislaufs in der nicht-ruminierenden und der ruminierenden Phase wachsender Ziegen
Þ Beeinflussung der Genexpression der Pi-Transporter und ihrer funktionellen Parameter durch die diätetische P- und/oder Ca-Versorgung bei nicht-ruminierenden und nicht-ruminierenden Ziegen
Þ Auswirkungen einer diätetischen P-Restriktion auf den Intermediär- und den Energiestoffwechsel bei Schafen; Wechselwirkungen zwischen dem N- und P-Haushalt