5. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
5.1 Charakterisierung der molekularen Struktur und Funktion der epithelialen P i - -Transporter in Niere, Darm und Speicheldrüse bei Schafen und Ziegen
Niere:
Die Besonderheit der Wiederkäuerniere liegt in ihrer hohen Pi-Resorptionskapazität (99 %).
Damit ist die renale Pi-Ausscheidung unter physiologischen Bedingungen sehr gering (40 - 220 mg/Tag, Scott & McLean 1981, Field 1981, Schöneseiffen 1993). Wurden die Plasma-Pi -Spiegel bei erwachsenen, nicht laktierenden Ziegen auf Werte bis um 7,2 mmol/l durch intravenöse Infusion von isotonischen Pi-Lösungen erhöht, stieg die renale Pi-Ausscheidung auf etwa das 100fache an, die Effizienz der TRP sank auf 75 % (Tab. 4). Der Einfluss der Zunahme des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens (EZFV) wurde durch gleichvolumige Zufuhr von physiologischer Kochsalzlösung in Kontrollversuchen ausgeschlossen.
Tabelle 4: Nieren-Clearancedaten erwachsener, nicht laktierender Ziegen unter NaCl- und Pi-Infusionsbedingungen. Dargestellt sind die glomeruläre Filtrationsrate (GFR), die Rate des glomerulär filtrierten Pi (GFP=GFR×Plasma-Pi), die renale Pi-Ausscheidung, die tubuläre Pi-Resorptionsrate (TRP) und die tubuläre Resorptionskapazität für Pi (TRP/GFP) in Abhängigkeit von der infundierten Flüssigkeits- und Pi-Menge (Widiyono et al. 1998).
Lösung NaCl 300 0 1,6±0,3 108,9±22,3 175,6±30,2 2,0±0,8 173,6±29,9 98,9±0,4 NaCl 450 0 1,6±0,3 120,5±17,5 184,8±31,5 1,8±0,6 183,0±31,5 99,0±0,3 Pi 300 0,5 4,6±1,1 104,0±26,4 458,6±79,9 20,0±14,9 438,6±92,1 95,2±4,3 Pi 450 0,8 7,2±1,7 112,0±29,8 775,7±106,0 185,4±5,2 590,3±120,6 75,5±7,4 x±SD, n= 5 Tiere. Jedes Tier wurde mit NaCl- und mit Pi sowohl mit einer hohen als auch mit einer niedrigen Flussrate infundiert. Jeder Versuch wurde doppelt durchgeführt und der Mittelwert beider Ergebnisse als Messwert für das Tier eingesetzt. Die GFR wurde über die Creatininclearance bestimmt.
Aus der nicht-linearen Beziehung der TRP zum Plasma-Pi-Spiegel konnte rein rechnerisch ermittelt werden, dass der Resorptionsprozess sättigbar ist bei einer geschätzten maximalen TRP von 1087,05±565,03 µmol/min bei unphysiologisch hohen Plasma-Pi-Spiegeln (nicht dargestellt). Zu Beginn der Sättigungsphase bei einer TRP von etwa 500 - 600 µmol Pi/min begann die renale Pi-Ausscheidung damit schon bei Plasma-Pi-Werten um 4,6 mmol/l. Aus
der Beziehung der renalen Pi-Ausscheidung zur Pi-Konzentration im Plasma konnte ein Plasma-Schwellenwert von 4,3±1,0 mmol/l (x±SE) für den Beginn der renalen Pi -Ausscheidung errechnet werden (Abb. 6). Hierzu wurde aus den Messwerten der Pi -Ausscheidungsrate (mmol/min) und der Plasma-Pi-Konzentration (mmol/l) die Plasmaschwelle für die renale Pi-Ausscheidung (xs) mit Hilfe einer nicht-linearen Regressionsanalyse mit folgender Gleichung errechnet:
b1x für x≤ Schwellenwert (xs) yx =
a + b2x für x≥ Schwellenwert (xs)
Durch Gleichsetzen der beiden Funktionsteile lässt sich die Plasmaschwelle nach folgender Formel berechnen:
Plasmaschwelle für die renale Ausscheidung (xs) = a/b1-b2 (mmol/l)
Dabei ist yx die renale Pi-Ausscheidungsrate (mmol/min) zur Plasma-Pi-Konzentration „x“; x die Plasma-Pi-Konzentration (mmol/l), b1 bzw. b2 die Zunahmekonstanten (Steigungen) der renalen Pi-Ausscheidungsraten unterhalb bzw. oberhalb des Schwellenwertes und a der zugehörige Ordinatenabschnitt.
Renale 600 Pi-Ausscheidung
(µmol/min)
12 10
8 6
4 2
0 400
200
Plasma-Pi -Konzentration
(mmol/l) 0
Abbildung 6: Beziehung der renalen Pi-Ausscheidung zur Plasma-Pi-Konzentration.
(Widiyono et al. 1998).
Die Plasmaschwelle für die renale Pi-Ausscheidung für Ziegen liegt somit um das 2 - 3fache höher als der Plasma-Pi-Spiegel, während bei monogastrischen Tieren wie z.B. dem Schwein diese etwa in Höhe des Plasma-Pi-Spiegels (2,0 mmol/l) liegt (McIntosh & Scott 1975). Aus der großen Resorptionskapazität und der hohen Plasma-Pi-Schwelle für die renale Ausscheidung wird klar, warum die Ziegen im Rahmen der physiologischen Schwankungen der Plasma-Pi-Konzentrationen den P-Haushalt nicht über die Niere regulieren können.
Auf welchen Pi-Transportprozessen beruht nun diese hohe Resorptionskapazität? Bei Ratten wurde für den Hauptanteil der Pi-Resorption im proximalen Tubulus der Niere ein Na+ -abhängiges Pi-Transportsystem strukturell und funktionell beschrieben. Dieses zu den NaPi Typ IIa-Kotransportern gehörende System stellt den regulierbaren Anteil des renalen Pi -Transportes bei monogastrischen Tieren dar, ist elektrogen und pH-sensitiv und weist eine Affinität (Km) für Pi von 0,1 - 0,2 mmol/l und für Na+ von 50 - 70 mmol/l auf (Murer et al.
2000).
Mittels Pi-Aufnahmestudien in isolierte renale BSMV von Schaf und Ziege wurde gezeigt, dass auch im proximalen Tubulus der Wiederkäuerniere ein Na+-abhängiges Transportsystem existierte, welches - berechnet nach einer Michaelis-Menten-Kinetik - eine ähnliche Affinität für Pi (Km 0,34±0,05, Ziege und 0,55±0,12 mmol/l, Schaf; x±SE, n=12 bzw. 3) und für Na+
(Km(Na) 95,9±4,7, Ziege und 81,1±5,8 mmol/l, Schaf; x±SE, n=12 bzw. 3; Schröder et al.
2000) aufwies. Die Stöchiometrie des Transportes - ermittelt aus der Relation der Pi -Aufnahme gegen die Na+-Konzentration im Puffer (sigmoidale Boltzman-Dosis/Wirkungsbeziehung) und der Umformung nach Hill (Hillkoeffizient) - lag bei 2 - 3 Na+ für jedes transportierte Pi-Ion, ebenfalls analog zu den Verhältnissen bei monogastrischen Tieren. Zur Erfassung der pH-Sensitivität wurde neben dem vesikel-einwärtsgerichteten Na+ -Gradienten ein H+-Gradient mit pHaussen 5,4 und pHinnen 7,4 für die Pi-Aufnahme in renale BSMV angelegt. Dies reduzierte die Pi-Aufnahme (die normalerweise einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt) von 2,7±0,9 nmol/mg Protein/sec (Vmax) auf kaum noch messbare
Werte, die linear mit der Pi-Konzentration bei einer Steigung von 0,15±0,006 zunahmen (x±SD, n=18).Da sich unter Zusatz von Valinomycin diese lineare Aufnahme nicht änderte, war ein über ein H+-Diffusionspotential getriebener Pi-Transport auszuschließen. Die Na+ -abhängige Pi-Aufnahme unter H+-Gradienteneinfluss lag aber deutlich über dem ohne Na+ -Gradient gemessenen diffusiblen (passiven) Transportanteil. Wurde der Na+-Gradient verstärkt (bis zu 500 mmol/l extravesikulär), stieg die Na+-abhängige Pi-Aufnahme langsam wieder an. Die Na+-Affinität des Systems schien deutlich reduziert, ein Km(Na)-Wert von 244 mmol/l konnte über die Boltzman-Dosis/Wirkungsbeziehung allerdings nur für ein Tier ermittelt werden. Wenn dies durch weitere Untersuchungen bestätigt werden könnte, wiese dies analog zu den Verhältnissen bei monogastrischen Tieren darauf hin, dass der pH-Effekt, zumindest teilweise, auf einer die Transporterfunktion beeinträchtigenden kompetitiven Hemmung der Na+-Bindung und damit der Pi-Ionen-Bindung durch die Protonen beruht, da sich die Pi-Transportkapazität durch hohe Konzentrationen an extravesikulärem Na+ wiederherstellen lies. Außerdem sind wahrscheinlich eine erhöhte Präferenz für divalentes Pi
und direkte Wirkungen auf den Transporter am pH-Effekt beteiligt (Hoffmann et al. 1976, Amstutz et al. 1985, Caverzasio et al. 1987). Aus elektrophysiologischen Studien am NaPi IIa, exprimiert in Xenopus laevis-Oozyten, wurde vermutet, dass die H+-Ionen nicht als Substrat transportiert werden. Ein abgeleitetes Modell für die Interaktion impliziert eine Wechselwirkung der H+ mit dem leeren Carrier (die Konformationsänderung des leeren Transporters zurück in die Ausgangsposition (backward transition) könnte beeinträchtigt sein) und mit der finalen Bindung der beiden letzten Na+-Ionen vor den Transportvorgang (Forster et al. 2000).
Diese Protonensensitivität des Na+/Pi-Transportes in der Niere könnte eine (patho)physiologische Bedeutung im Verlauf von Azidosen metabolischer oder respiratorischer Genese haben. Die mit chronischer metabolischer Azidose einhergehende Phosphaturie entfernt H2PO4--Ionen aus dem Körper zur Normalisierung des Blut-pH-Wertes.
Azidogen gefütterte Tiere (meist NH4Cl) zeigten unabhängig von P-Versorgung, PTH oder intraluminalem pH eine deutlich ausgeprägte Phosphaturie, die aber nur bei chronischer Azidose (mind. 3 Tage azidogene Fütterung) auftrat (Levine et al. 1983, Quamme 1985, Boross et al. 1986, Prasad et al. 1988). Akute (4 - 5 h) oder chronische (3 Tage) Belastungen durch HCl-Infusionen beim Schaf führten ebenfalls zur Absenkung des Blut- und Harn-pH-Wertes und bei chronischer Applikation zu einer verstärkten Phosphaturie (Williams &
Pickering 1980, Scott & Buchan 1981). Die Einschränkung der TRP bei azidogen gefütterten monogastrischen Tieren ist dabei aber auf Membranebene konserviert. Die Na+-abhängige Pi -Aufnahme in isolierte BSMV chronisch azidotischer Ratten ohne Einfluß eines pH-Gradienten war reduziert bei unveränderter Km (Levine et al. 1983). NaPi IIa mRNA als auch -Proteinmengen sanken zeitabhängig progressiv bei diätetisch azidotischen Ratten ab; eine Einschränkung der Na+/Pi-Cotransportfunktion war schon in einem Zeitraum von unter 6 h zu beobachten, die auf einer Internalisierung des Proteins beruhte (Ambühl et al. 1998). Die Chronizität als auch die Manifestation auf der Molekülebene lassen auf einen Prozess schließen, der einer transkriptionalen Regulation unterliegt und nicht einer akuten Regulation der Transporteraktivität. Ursächlich wird hierfür der bei metabolischer Azidose erhöhte Glukokortkoidspiegel verantwortlich gemacht. Dexamethason reduzierte sowohl NaPi IIa mRNA- als auch Proteinmenge (Jehle et al. 1999). Durch den bei metabolischer Azidose ebenfalls stimulierten apikalen NHE (H+-Akkumulation im Lumen) und die vermehrt unter der katabolen Wirkung der Glukokortikoide entstehenden und im Harn ausgeschiedenen Säuren könnte aber auch eine direkte Wirkung auf den NaPi IIa vorstellbar sein (Boross et al.
1986). Unabhängig von der Problematik „metabolische Azidose“ erhöhte sich die Pi -Ausscheidung nach bilateraler Ligation der Speicheldrüsengänge. Dabei sank der Harn-pH innerhalb des ersten Tages nach Versuchsbeginn ab, die Pi-Auscheidung stieg im gleichen Zeitraum an (Sato 1975). Auch hier könnte aufgrund der schnellen Wirkung ein direkter
hemmender Effekt der H+-Ionen auf den NaPi IIa die TRP verringern, um die P-Homöostase aufrechtzuerhalten.
Aufgrund der hohen Übereinstimmung der funktionellen Charakteristika des renalen Na+/Pi -Cotransportmechanismus von Ziege und Schaf mit denen der monogastrischen Tiere lag nahe, dass auch bei diesen Spezies der Na+-abhängige Pi Transport zumindest teilweise über einen NaPi Typ IIa moduliert wird. Mit Hilfe der RT-PCR und NaPi IIa-spezifischen Primern (Ursprungssequenz NaPi IIa Ratte) konnte sowohl bei der Ziege als auch beim Schaf ein NaPi IIa spezifisches Fragment von 768 Basen (b) amplifiziert werden, welches in seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz etwa 90 % Homologie zur Sequenz des NaPi IIa der Ratte aufwies (Schröder et al. 2000, Abb. 7). Im Northern Blot ergab eine Hybridisierung von renaler mRNA mit diesem PCR-Produkt als radioaktiv markierte Sonde eine Bande mit eine Größe von etwa 2,4 kb. Zum Nachweis des entsprechenden Proteins in der apikalen Membran der proximalen Tubuli fehlt zur Zeit noch ein spezifischer Antikörper. Welchen Anteil an der Gesamt-Pi-Resorption dieser Transporter trägt, soll später noch diskutiert werden.
MMSYSERLGGPAVSPLPVRGRHMVHGAAFAYVPSPQVLHRIPGTTTYAISSLSPVALTEHSCPYGEVLECHDPLPAKLAQEEEQKPEPRL
Abbildung 7: Aus den cDNA-Sequenzen abgeleitete Aminosäuresequenzen von NaPi IIa (Ratte, Acc.No L13257),NaPi IIb (Maus Acc.No. AF081499) und NaPi IIb aus boviner Nierenzelllinie (Acc.No.X81699)(in grau dargestellt).
1) NaPi IIa-Fragment aus der Ziegenniere, die entsprechende Sequenz des NaPi IIa vom Schaf ist nicht dargestellt (98 % homolog zur Ziegensequenz)
2) NaPi IIb-Fragment aus dem Jejunum des Schafes 3) NaPi IIb-Fragment aus der Ohrspeicheldrüse der Ziege.
Darm:
Der Dünndarm als Hauptresorptionsort für Pi (Pfeffer et al. 1970, Breves & Schröder 1991) kann aufgrund der beteiligten Transportmechanismen in mindestens zwei Kompartimente unterteilt werden. Im Duodenum wurde mittels Ussingkammer-Experimenten und Pi -Aufnahmestudien in isolierte BSMV ein H+-abhängiges, Na+-sensitives Pi-Transportsystem nachgewiesen (Abb. 8).
Abbildung 8: A Pi-Nettofluxraten duodenaler Epithelien von Ziegen:
Einfluß der mukosalen H+- und Na+-Konzentrationen (serosal immer pH 7,4; Na+-frei). 5,4 bzw. 7,4/oNa = mukosal pH 5,4 bzw. 7,4; Na+-frei inkubiert; 5,4 bzw. 7,4/Na = mukosal pH 5,4 bzw. 7,4 und 100 mmol/l Na+. Dargestellt sind x±SE, n=4 Tiere. Der Effekt von pH-Wert, Na+-Konzentration und die Wechselwirkung zwischen beiden war hochsignifikant mit p<0,001(Varianzanalyse ANOVA, BMDP 92 Software Program).
B Pi-Akkumulation in isolierte BSMV des Ziegenduodenums:
Einfluß eines einwärtsgerichteten H+- und/oder Na+-Gradienten. pHa(aussen) 5,4/oNa bzw. Na
= einwärtsgerichteter H+-Gradient ohne oder mit Na+-Gradient; pHa7,4/oNa bzw. Na = Iso-pH-Bedingungen ohne bzw. mit einwärtsgerichtetem Na+-Gradient. Beispielhaft ist das Ergebnis eines Tieres gezeigt, jeder Messpunkt stellt den Mittelwert von 3 Einzelmessungen dar (Huber et al. 2002a).
Eine mukosal Na+-freie Inkubation der Epithelien resultierte bei pH 7,4 in einer sehr geringen Nettofluxrate für Pi, die durch Absenken des mukosalen pH-Wertes auf 5,4 um etwa das 5fache anstieg. Ein mukosales Na+-Angebot bei pH 5,4 stimulierte den Transport auf etwa das 4fache, während dieses bei Iso-pH-Bedingungen ausblieb. Die Pi-Aufnahme in isolierte duodenale BSMV zeigte analog zu den Ussingkammer-Ergebnissen nur dann eine Pi
-Akkumulation (Overshoot), wenn ein vesikel-einwärtsgerichteter H+-Gradient existierte. Ein gleichzeitiger Na+-Gradient vergrößerte den Overshoot, wobei der Effekt nicht so deutlich wie bei den transepithelialen Nettofluxraten auftrat (Abb. 8B). Diese H+-abhängige Pi -Aufnahme in Abhängigkeit von der extravesikulären Pi-Konzentration folgte einer Michaelis-Menten-Kinetik und ergab einen Vmax-Wert von 2,10±1,25 nmol/mg Protein/10 sec und einen Km-Wert von 0,45±0,37 mmol/l (x±SD, n=4). Die strukturelle Basis für diesen Transport ist noch unbekannt. Die Expression von duodenaler mRNA aus Ziegendarm in Xenopus laevis-Oozyten führte unter Na+-freier Inkubation der Oozyten bei einem pH von 5,4 zu einer Pi -Aufnahme in die Oozyten, die signifikant höher war als bei pH 7,4. Dieser H+-abhängige Pi -Transport wird nicht endogen von der Oozyte exprimiert. Daher wird zur Zeit versucht, die dem H+/Pi-Transport zugrundeliegende Nukleinsäure über das Anlegen einer cDNA-Genbank und einer funktionellen Expressionsklonierung in dem heterologen Expressionssystem Oozyte zu klonieren. Ein über Protonen stimuliertes Pi-Transportsystem in den vorderen Dünndarmabschnitten, wie es auch für das Schaf beschrieben wurde (Shirazy-Beechey et al.
1996), dürfte eine wichtige physiologische Bedeutung haben, da bei Wiederkäuern der pH-Wert im Darmlumen erst langsam von etwa 2 - 3 im Duodenum auf etwa 8 - 9 im terminalen Ileum ansteigt (Kay & Pfeffer 1969). Bei monogastrischen Tieren wurde ein solcher Transport bisher nicht beschrieben, die luminalen pH-Werte liegen hier schon im Duodenum deutlich höher.
Im Jejunum existiert ein Na+-abhängiges Pi-Transportsystem mit einer Affinität für Pi von etwa 0,03 mmol/l, einer Stöchiometrie von 2 - 3:1 Na+:Pi und einer Na+-Affinität von etwa 6 mmol/l (Schröder & Breves 1996). Dieses wies eine ausgeprägte H+-Sensitivität auf (Huber et al. 2002a). Pi-Aufnahmestudien in isolierte jejunale BSMV der Ziege zeigten, dass bei Anlegen eines vesikeleinwärts gerichteten H+-Gradienten (pHa 5,4; pHi 7,4) die Kapazität des Na+-abhängigen Pi-Transportes signifikant gesteigert wurde (7,4/7,4: 0,132±0,015; 5,4/7,4:
0,343±0,037 nmol/mg Protein/10 sec; x±SE, n=8/Gruppe; p<0,001). Dieser Effekt könnte
eventuell auf einer Veränderung der Na+-Affinität beruhen, während die Transporteraffinität für Pi unter Einfluß des H+-Gradienten (p<0,05) sank. Die physiologischen Konsequenzen dieser funktionellen Anpassungsmöglichkeit sind noch unklar. Strukturell beruhte dieses Pi -Transportsystem auf einem NaPi-Kotransporter vom Typ IIb (Huber et al. 2000, 2002a).
Dieser war in der apikalen Membran der Enterozyten lokalisiert (Abb. 9), das spezifische Protein wies eine Größe von etwa 90 kDa auf und die mRNA von 4,0 kb. Ein etwa 1/3 des Transporters umfassendes Fragment wurde in der RT-PCR mit Primern amplifiziert, die aus der cDNA-Sequenz des murinen NaPi IIb (Hilfiker et al. 1998) abgeleitet wurden, kloniert und sequenziert (Huber et al. 2000a, Abb. 7). Dass dieser NaPi IIb einen Teil des intestinalen Pi-Transportes beim Wiederkäuer vermittelt, wurde durch die hohe Korrelation der Transportrate mit der relativen Menge an spezifischem Transporterprotein belegt (Abb. 10).
Beim murinen NaPi IIb ist die Na+-Affinität wesentlich geringer mit einer Km(Na) von etwa 33 mmol/l (Murer et al. 2000). Die höhere Na+-Affinität könnte mit zu der insgesamt höheren intestinalen Pi-Absorptionskapazität der Wiederkäuer beitragen.
NaPi IIb/
b-Aktin
0.
0.4 0.3
0.2 0.1
0.0 0.7
r2= 0.63
0.5
0.2
0.0
Vmax (nmol Pi/mg Protein/10 sec)
Abbildung 10: Positive Korrelation der Transportkapazitäten (Vmax) mit der relativen Menge an NaPi IIb-Protein im Jejunum von Ziegen:
Abbildung 9: Lokalisation des NaPi IIb Quadrate= P-adäquat, Dreiecke = P-
Proteins in der apikalen Membran der je- restriktiv versorgte Tiere (s. 5.3.2).
junalen Enterozyten (Huber et al. 2002a). (Huber et al. 2002a).
Speicheldrüse:
Für alle Untersuchungen wurde nur Gewebe der Gl. parotis verwendet (im Folgenden als
„Speicheldrüse“ bezeichnet), da diese als kontinuierlich sezernierende Drüse den mengenmäßig größten Anteil des Speichels mit dem höchsten Pi-Gehalt produziert (Kay 1960a). Mittels RT-PCR und Primern, die aus der NaPi IIb-Sequenz einer bovinen Nierenzelllinie abgeleitet waren, konnte ein NaPi IIb-spezifisches Fragment amplifiziert werden (Abb. 7, Huber et al. 2002b). Unter Verwendung dieses PCR-Produktes als radioaktiv markierte Sonde im Northern Blot mit mRNA aus der Speicheldrüse konnte ein etwa 2,0 kb großes Transkript detektiert werden. Für die Western Analyse und immunhistochemische Untersuchungen steht noch kein geeigneter Antikörper zur Verfügung, der für den NaPi IIb im Darm spezifische Antikörper erwies sich in ersten Versuchen als nicht geeignet.
5.2 Molekulare und funktionelle Entwicklung der epithelialen Pi-Transporter während