Übersicht Projekte: Versuchsanordung in Abhängigkeit von der Fragestellung:

Charakterisierung der Pi-Transportsysteme im endogenen Pi-Kreislauf: In der Niere wurde die TRPmax und die Nierenschwelle für Pi ermittelt (Widiyono et al. 1998), der Na⁺ -abhängige Pi-Transport funktionell und strukturell charakterisiert (Schröder et al. 2000) und die pH-Sensitivität dieses Systems überprüft. Vier bis fünf Monate alte Ziegen wurden geschlachtet, die Nierencortices präpariert und in flüssigem N2 schockgefroren. Die Isolierung der BSMV erfolgte wie beschrieben (Schröder et al. 2000), die Pi-Aufnahmestudien wurden mittels schneller Filtrationstechnik wie folgt durchgeführt: Die konzentrationsabhängigen Pi -Aufnahmen wurden entweder bei einem extravesikulären pH von 7,4 oder 5,4 (intravesikulärer pH jeweils 7,4) in Anwesenheit eines vesikeleinwärts gerichteten Na⁺ -Gradienten gemessen. Das Inkubationsmedium enthielt 100 mmol/l Mannitol, 50 - 500 mmol/l NaCl und 20 mmol/l HEPES/Tris pH 7,4 bzw. MES/Tris pH 5,4. Intravesikulär war NaCl durch KCl (100 oder 500 mmol/l) ersetzt. Die Pi-Konzentrationen lagen zwischen 0,05 und 3 mmol/l. Zum Ausschluss eines über ein H⁺-Diffusionspotential getriebenen Pi -Transport wurde Valinomycin (10 µmol/l) eingesetzt.

Im Duodenum und Jejunum wurden zur funktionellen Charakterisierung des intestinalen Pi -Transportes Ussingkammer-Experimente und Pi-Aufnahmestudien in isolierte BSMV durchgeführt. Hierbei wurden vesikeleinwärts gerichtete Na⁺- als auch H⁺-Gradienten angelegt (Huber et al. 2002a). Zur funktionellen Expression des im Duodenum von Ziege und Schaf vorkommenden Pi-Transporters in Xenopus laevis Oozyten wurde poly(A)⁺RNA aus duodenaler Mukosa isoliert und 50 ng in isolierte Oozyten injiziert. Nach Inkubation der injizierten Oozyten für 3 Tag bei 14 ^oC in Kuloripuffer (90 mmol/l NaCl, 1 mmol/l KCl, 2 mmol/l CaCl2, 5 mmol/l HEPES, 2,5 mmol/l Pyruvat, 20 mg/l Penicillin, 25 mg/l Streptomycin) wurde die Pi-Aufnahme gemessen. Strukturell wurde der jejunale Pi -Transporter mittels RT-PCR, Klonierung, Northern und Western Analyse identifiziert und seine Lokalisation immunhistochemisch festgestellt (Huber et al. 2000, Huber et al. 2002a).

In der Speicheldrüse (Gl. parotis) wurde die strukturelle Charakterisierung des Pi -Transporters mittels RT-PCR und Northern Analyse durchgeführt. Nach Isolierung der poly(A)⁺RNA wurde mit der MMuLV (moloney mouse leucemia virus)- Reverse Transkriptase cDNA hergestellt, die als Matrize in der PCR eingesetzt wurde. Die verwendeten Primer wurden aus der NaPi IIb-Sequenz einer bovinen Nierenzelllinie (Acc.No.

X81699) abgeleitet. In einem Thermocycler (Mastercycler gradient, Eppendorf) wurde für die Amplifikation folgendes Programm verwendet: 34 Zyklen mit Denaturierungsphase bei 94 ^oC für 30 s, die Primer-Bindung bei 60 ^oC für 1 min und die Verlängerung der DNA-Fragmente durch die Aktivität der Taq Polymerase (Gibco) bei 72 ^oC für 2 min. Abschließend wurden 15 min bei 72 ^oC für das Fertigstellen der Produkte vorgegeben. Das PCR-Produkt wurde kloniert, sequenziert und als DNA-Sonde in der Northern Analyse eingesetzt (Huber et al.

2002b).

Ontogenese des endogenen Pi-Kreislaufs: Untersucht wurden saugende Ziegenlämmer in der ersten bis dritten Lebenswoche, Ziegenlämmer mit beginnender Raufutteraufnahme in der 7. - 10. Lebenswoche und 4 - 5 Monate alte ruminierende Ziegen mit Heu/

Konzentratfütterung (Tab. 3). Dünndarm, Niere und Speicheldrüsen wurden sofort nach der Schlachtung entnommen und in flüssigem N2 schockgefroren. Aus Dünndarm und Niere wurden BSMV isoliert und Pi-Aufnahmestudien zur Ermittlung der kinetischen Parameter durchgeführt. Aus allen entnommenen Geweben wurde poly(A)⁺RNA bzw. Gesamt-RNA gewonnen und die Genexpression in der semiquantitativen Northern Analyse ermittelt. Die Quantifizierung erfolgte durch den Bezug der Intensität der spezifischen Bande auf die Intensität der b-Aktin-Bande derselben Probe. Der Vergleich der Mittelwerte der Quotienten NaPi II/b-Aktin jeder Versuchsgruppe wurde zur Bestimmung quantitativer Unterschiede herangezogen. Im Jejunum wurde die Genexpression zusätzlich auf Proteinebene semiquantitativ bestimmt, da ein spezifischer Antikörper für den Pi-Transporter der Ziege zur

Verfügung stand (Huber et al. 2002a). Da für die Speicheldrüse keine Messungen zur Kinetik des Pi-Transportes und der Lokalisation und Expression des spezifischen Transportproteines durchgeführt werden konnten, wurde die Konzentrierungsfähigkeit der Speicheldrüse für Pi

als indirekter funktioneller Parameter hinzugezogen.

Beeinflussung der endogenen Pi-Kreislaufes durch die diätetische P-Versorgung:

a) Nicht-ruminierende Tiere

Untersucht wurden 7 - 10 Wochen alte ad libitum gefütterte, milchernährte Ziegenlämmer, die zusätzlich geringe Mengen an Stroh aufnahmen (Tab. 3). Die P- und /oder Ca-Zufuhr war entweder doppelt so hoch wie in der Muttermilch Zulage) oder um 30 % reduziert (P-Restriktion). Die Reduktion wurde durch den Ersatz von Muttermilch durch 30 % eines selbsthergestellten Milchaustauschers erreicht. Diese Fütterung einschließlich der Haltung der Lämmer bis zur Schlachtung wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für Tierernährung der Universität Bonn dort durchgeführt. Erfasst wurden Plasma- und Speichel-Pi -Konzentrationen, die kinetischen Parameter des Pi-Transportes in Duodenum, Jejunum und Niere (Roesler 2002) und die spezifische Expression der Pi-Transporter in Jejunum, Niere und Speicheldrüse (über semiquantitative Northern bzw. Western Analysen). Außerdem wurden die Plasma-Calcitriolspiegel bei den P-Zulagetieren gemessen.

b) ruminierende Tiere

Die molekulare als auch die funktionelle Genexpression der spezifischen renalen und intestinalen Pi-Transporter von Ca- oder P-restriktiv gefütterten ruminierenden Ziegen und Schafen (nur P-Mangel) wurde untersucht. Die Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen wurden semiquantitativ auf mRNA und Proteinebene erfasst, die kinetischen Parameter wurden mittels Pi-Aufnahmestudien in isolierte BSMV von Nierencortex, duodenaler und jejunaler Mukosa ermittelt. Der P-Status der Tiere wurde über die Plasma-Ca- und Pi -Konzentrationen determiniert (Schröder et al. 2000, Huber et al. 2002a).

Auswirkungen des Pi auf den Intermediärstoffwechsel a) Gaswechselmessungen

Der Gaswechsel von Schafen unter diätetischer P-Restriktion wurde in Respirationskammern für Großtiere in Zusammenarbeit mit dem Institut für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig gemessen. Der O2-Verbrauch und die CO2- bzw. CH4-Abgabe wurden im offenen System durch die jeweiligen Differenzen zwischen Abluft und angesaugter Frischluft erfasst. Die O2-Messung erfolgte in einem Sauerstoffanalysator der Firma Maihak (Oxygor 6 N), die CO2 und CH4-Messung mittels Infrarotabsorptionsverfahren (CO2-Analysator Uras 2T, Hartmann und Braun). Die Luftmenge wurde mit Hilfe eines Membrankörper-Messwerkes der Firma Hartmann und Braun unter Korrektur auf Normalbedingungen bestimmt. Aus den mit Hilfe der indirekten Kalorimetrie ermittelten Daten und den ebenfalls erfassten Bilanzdaten der Tiere konnte nach der Brouwerschen Formel (Brouwer 1965) der Protein- und Fettansatz und der Energie-Umsatz der Tiere berechnet werden (Kottke 2000) .

b) Bestimmung der Enzymaktivitäten

Die Aktivitäten zentraler Enzyme aus der Glykolyse: Pyruvatkinase (PK, E.C.2.7.1.40), Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase (GAPDH, E.C.1.2.1.12) und cytosolische Glycerat-3-P-Dehydrogenase (cGPDH, E.C.1.1.1.8), aus der Glukoneogenese: Fruktose-1,6-Diphosphatase (FDPase, E.C.3.1.3.11) und aus dem Aminosäurekatabolismus: Glutamat-Dehydrogenase (GlDH, E.C.1.4.1.3), Aspartat-Transferase (ASAT, E.C.2.6.1.1), Alanin-Transferase (ALAT, E.C.2.6.1.2) und Arginase für die Bestimmung der Harnstoffproduktion wurden mittels photometrischer Assays modifiziert nach Bergmeyer (1974) in Gewebshomogenaten bestimmt (Huber & Breves 1999, Kottke 2000).

c) Statistische Verfahren

Die jeweils auf die Daten angewandten statistischen Verfahren, n-Zahlen und Signifikanzniveaus werden bei den entsprechenden Ergebnissen angegeben.