Nicht-ruminierende Ziegen

Aus den Untersuchungen zur Ontogenese des epithelialen Pi-Transportes ging hervor, dass junge Ziegen mit Beginn des Absetzens über weitgehend ausgereifte Transportsysteme in Darm, Niere und Speicheldrüse verfügen, die es ihnen ermöglichen, den hohen Bedarf an Pi

für mikrobielles Wachstum in den Vormägen und für ihr eigenes Wachstum zu decken. Um die Adaptationsfähigkeit des endogenen Pi-Kreislaufs in diesem Entwicklungsstadium zu charakterisieren, wurden 8 - 11 Wochen alte männliche Ziegenlämmer bei überwiegender Milch-Fütterung entweder mit doppelter Menge an P und/oder Ca („Zulage“-Versuch:

o(riginal)Ca/oP-1, oCa/d(oppelt)P, dCa/oP, dCa/dP) oder mit 30 % reduzierter P und/oder Ca-Menge („Restriktions“-Versuch: oCa/oP-2, oCa/r(estriktiv)P, rCa/oP, rCA/rP) versorgt (Tab.

3). Orientiert wurde die Verdopplung bzw. Restriktion des diätetischen P an den Originalgehalten von P und Ca im Sammelgemelk der Herde. Die Substitution der Milch erfolgte über die Zulage von NaH2PO4 und/oder Ca-Laktat. Die Tiere wurden zweimal täglich ad libitum gefüttert. Im Restriktionsversuch wurde Milch gefüttert, die zu 30 % mit einem selbsthergestellten Milchaustauscher, der weder P noch Ca enthielt, ersetzt worden war. Stroh stand den Tieren permanent zur Verfügung, die Aufnahme wurde quantitativ allerdings nicht erfasst. Wiederkauphasen waren bei diesen Tieren gelegentlich schon zu beobachten.

Morphologisch war die Pansenoberfläche noch wenig entwickelt mit kleinen Zotten geringer Dichte (Schlachtbefunde). Histologisch zeigte sich das Epithel differenziert mit dicht anliegender, geschlossener Keratinschicht, was darauf hinwies, dass die resorptive Tätigkeit des Epithel noch unterentwickelt war (Hofmann & Schnorr 1982). Die Wachstumsraten der Tiere im Restriktionsversuch waren geringfügig kleiner als im Zulageversuch. Diese Fütterung führte nur bei der oCa/dP-Gruppe zu einem signifikanten Anstieg und bei den

rP-Gruppen zu einem signifikanten Abfall der Plasma-Pi-Konzentrationen ohne Veränderung der Ca-Spiegel in der Weise, wie sie bei ruminierenden Wiederkäuern auftreten können (Schröder

& Breves 1996). Die dCa- und rCa-Fütterungen hatten keinen Einfluss auf die Plasma-Ca-Konzentrationen. Die Pi-Konzentrationen im Speichel lagen unbeeinträchtigt durch die Fütterung um 30 - 50 mmol/l, so dass anzunehmen ist, dass die Speicheldrüse schon in dieser Entwicklungsphase keine aktive Rolle für die Adaptation der P-Homöostase spielte, wie dies auch für ruminierende Wiederkäuer diskutiert wurde (Breves et al. 1987).

Im Folgenden soll nun die Beeinflussung der epithelialen Transportsysteme in Duodenum, Jejunum, Niere und Speicheldrüse nicht-ruminierender Ziegen durch die diätetische P- und Ca-Versorgung dargestellt werden.

Im Duodenum konnte über Pi-Aufnahmestudien in isolierte BSMV auch bei nicht-ruminierenden Tieren ein H⁺-abhängiges Pi-Transportsystem („H⁺/Pi-Transporter“) nachgewiesen werden, welches einen Km-Wert von 0,57±0,06 mmol/l (x±SE, n = 18) aufwies.

Die Pi-Affinität des H⁺/Pi-Transportsystems bei milchernährten Ziegen war somit etwas geringer als bei ruminierenden Tieren (Huber et al. 2002a), während die Transportkapazität mit 1,93±0,24 nmol/mg Protein/10 s (x±SE, n = 18) gleich hoch war. Eine P und/oder Ca-Zulage hatte keinen Einfluss auf die kinetischen Parameter dieses Transportsystems. Der duodenale Pi-Transport der Tiere aus dem Restriktionsversuch wurde nicht untersucht. Beim Wiederkäuer führten im Gegensatz zum monogastrischen Tier nur Veränderungen in der diätetischen Ca-Zufuhr zu einem Effekt auf die Plasma-Calcitriol-Konzentrationen. Bei den nicht-ruminierenden Ziegen führte die Verdopplung der aufgenommenen Ca-Menge unabhängig von der Höhe der P-Zufuhr zu einer signifikanten Reduktion der Plasma-Calcitriol-Spiegel (oCa-Gruppen: 118,2±37,4 pmol/l; dCa-Gruppen: 54,0±29,8 pmol/l; x±SD, n = 6, p<0,01), so dass dieses H⁺-abhängige Pi-Transportsystem außerdem unabhängig vom Plasma-Calcitriol-Spiegel war. Dieses Hormon schien aber auch beim Wiederkäuer einen

stimulierenden Effekt auf den jejunalen Na⁺-abhängigen Pi-Transport ruminierender Ziegen zu haben (Schröder & Breves 1996).

In Jejunum, Niere und Speicheldrüse nicht-ruminierender Ziegen wurden die kinetischen Parameter des Na⁺-abhängigen Pi-Transportes (Jejunum, Niere) charakterisiert und die spezifischen NaPi II-mRNA- und jejunalen NaPi IIb-Proteinmengen semiquantitativ ermittelt.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 14 für den Zulageversuch und in Abbildung 15 für den Restriktionsversuch dargestellt.

Nur eine Verdopplung der diätetischen P-Versorgung von 0,9 auf 1,8 g P/kg Milch führte zu einer signifikanten Beeinflussung der epithelialen Transportsysteme in Jejunum und Niere.

Die Na⁺/Pi-Transportkapazität sank in beiden Organen, im Darm ohne Veränderung der Transporteraffinität: Im Darm war der reduzierende Effekt der P-Zulage nur statistisch zu sichern, wenn der Mittelwert beider oP-Gruppen gegen den beider dP-Gruppen verglichen wurde (oP: 0,23±0,05 nmol/mg Protein/10 sec, n = 7; dP: 0,12±0,10 nmol/mg Protein/10 sec, n = 8; x±SE, p<0,05 (t-Test)). Die Transportkapazität in der Niere bei alleiniger P-Zulage war dagegen hochsignifikant reduziert, während bei dCa/dP der reduzierende Einfluss ebenfalls nur über den Vergleich oP gegen dP zu sichern war (oP: 5,50±2,12 nmol/mg Protein/10 sec, n

= 9; dP: 2,02±2,03 nmol/mg Protein/10 sec, n = 8,x±SE, p<0,01 (t-Test)). Die Affinität des renalen Na⁺/Pi-Transportes war nur unter alleiniger P-Zulage signifikant erhöht (oCa/dP:

0,09±0,02 mmol/l, oCa/oP: 0,53±0,09 mmol/l; n = 4, x±SE, p<0,001). Da für beide Organe der Hauptanteil des Na⁺/Pi-Transportes über NaPi Typ II-Transporter vermittelt werden soll, überrascht nicht, dass unter oCa/dP- und dCa/dP-Bedingungen auch die entsprechende NaPi IIb-Proteinmenge in den jejunalen BSM (ohne Änderung der NaPi IIb-Transkriptmenge) und unter oCa/dP-Bedingungen in der Niere die NaPi IIa-mRNA-Menge signifikant abnahmen.

Die relativen Mengen der NaPi II-mRNA in der Speicheldrüse war in allen substituierten Gruppen tendenziell höher, ohne dass dies zur Zeit erklärt werden könnte.

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Abbildung 14: Beeinflussung der Expression des epithelialen Pi-Transportes in Jejunum, Niere und Speicheldrüse durch die diätetische P und Ca-Versorgung bei nicht-ruminiernden Ziegen. Linke Seite: Kapazität des jejunalen Na⁺/Pi-Transportes (A), relative NaPi IIb-mRNA-(B) und -Proteinmenge (C)* (* bezogen auf die Mengen der oCa/oP-Gruppe als 100

%-Wert), rechte Seite: Kapazität des renalen Na⁺/Pi-Transportes (D) und relative NaPi IIa-mRNA-Menge (E), rechts unten: relative NaPi II-IIa-mRNA-Menge der Speicheldrüse (F).

Angegeben sind x±SE, die n = Anzahl der Tiere sind in den Säulen angegeben. Signifikante Unterschiede der Gruppen zur Kontrolle sind mit * p<0,05, ** p<0,01 und *** p<0,001 markiert (One-Way-ANOVA mit Tukey´s t-Test unter der Annahme normalverteilter Werte;

Graph.pad prism 3.0, www.graphpad.com).

Ob sich dies auf Proteinebene ebenso manifestierte, ist unbekannt. Gegen eine Zunahme des Transportproteins und der funktionellen Kapazität sprach, dass in den Speichel-Pi -Konzentrationen zwischen den Gruppen keine Unterschiede bestanden. Eine Zunahme des NaPi II-Proteins bei gleichbleibenden Speichel-Pi-Konzentrationen würde eine verstärkte Speichelsekretion voraussetzen, die bei diesen Tieren aber nicht quantitativ erfasst wurde.

Im Jejunum schien der adaptive Prozess unabhängig von der Höhe des Plasma-Calcitriols zu sein, weil unter alleiniger P-Zulage kein Effekt auf die Calcitriolkonzentration im Plasma auftrat, während unter Ca-Zulage mit oder ohne P-Zulage gleichermaßen die Calcitriolkonzentration niedriger war. Es ist aber nicht auszuschließen, dass der Reduktion des jejunalen Pi-Transportes verschiedene Mechanismen in oCa/dP und dCa/dP zugrunde liegen. Während der Effekt einer alleinigen P-Zufuhr noch nicht erklärt werden kann („Pi -Effekt“, siehe im Folgenden) könnte die Reduktion des Pi-Transportes bei dCa/dP auch eine Folge der verminderten Calcitriolwirkung in Kombination mit einem „Pi-Effekt“ sein. Für einen weiteren Regulationsmechanismus könnte auch die leicht reduzierte NaPi IIb-mRNA-Menge sprechen, die nur in dieser Gruppe auftrat, aber aufgrund der niedrigen n-Zahlen statistisch nicht zu sichern war. In der Niere schien die Adaptation an eine alleinige P-Zulage oder an eine P-Zulage verbunden mit einer Ca-Zulage deutlicher verschiedenen Mechanismen zu unterliegen. Die Veränderung der Affinität des renalen Na⁺/Pi-Transportsystems bei alleiniger P-Zulage könnte darauf hinweisen, dass hier ein zweites renales Pi-Transportsystem mit sehr niedriger Transportrate noch aktiv war, während der über den NaPi IIa vermittelte Anteil abgeschaltet war. Die Affinität entsprach der für den NaPi IIc beschriebenen Affinität (Km 0,07 mmol/l), welcher in dieser Entwicklungsphase bei Ratten als Wachstums-spezifisches Transportsystem beschrieben wurde (Segawa et al. 2002). Bei der dCa/dP-Zulage kam es nicht zu einer vollständigen Abschaltung des NaPi IIa-Transporters, sondern nur zu einer leichten Einschränkung der Transportrate, obwohl keine erhöhten Plasma-Pi-Werte vorlagen. Da das diätetische Ca in dieser Entwicklungsphase das limitierende Element für den

P-Ansatz war (Ergebnisse aus dem Institut für Tierernährung Bonn, mündliche Mitteilung), könnte durch den höheren P-Ansatz erklärt werden, dass zum einen keine Anflutung in den Plasma-Pi-Pool stattfand und zum anderen eine noch relativ hohe renale Pi-Resorption trotz Verdopplung der P-Zufuhr aufrecht erhalten wurde. Warum die NaPi IIa-mRNA-Mengen in dieser Gruppe hochreguliert waren und inwieweit dies auf Proteinebene reflektiert wurde, ist noch unklar. Bei nicht-ruminierenden Schaflämmern stieg die fäkale P-Ausscheidung mit steigender Ca-Aufnahme, während die renale Exkretion sank (Hodge 1973). Die P-Versorgung dieser Tiere entsprach etwa der der dP-P-Versorgung der Ziegen, so dass die beobachteten Veränderungen in der Expression der epithelialen Pi-Transporter der oCa/dP- und dCa/dP-Gruppen diesen Bilanzdaten entsprachen. Eine Verringerung der intestinalen Transportkapazität resultiert in höherer P-Ausscheidung; eine sinkende P-Exkretion in der Niere unter steigender Ca-Zufuhr wies darauf hin, dass die Pi-Transportkapazität höher sein muss als unter oCa/dP-Bedingungen. Der reduzierenden Wirkung der P-Zulage auf den renalen Pi-Transport steht offensichtlich ein zweiter gegenläufiger Effekt über die Ca-Zulage entgegen. Dieser könnte eventuell über das PTH moduliert werden. Eine Reduktion des PTH-Spiegels führt zu erhöhter renaler Ca-Exkretion bei gleichzeitiger Verringerung der Pi -Ausscheidung, d.h. zu einer höheren Pi-Resorption. Dies könnte auch ursächlich für die verstärkte Expression der NaPi IIa-mRNA verantwortlich sein.

Der Mechanismus des Effektes der P-Zulage ist bisher noch nicht zu erklären. Möglich wäre ein regulatorische Anpassung der Hormonrezeptorendichte in Darm und Niere, so dass Zielorgan-spezifische Adaptationsprozesse stattfinden können. Auch ein P-sensing-Mechanismus („Pi-Effekt“), wie er über die hormonelle Regulation hinaus für die Pi-Wirkung auf den NaPi IIa der Rattenniere postuliert wurde (Murer et al. 2000), ist möglich. Ein solcher sensing-Mechanismus wurde bisher für das Ca in der bovinen Nebenschilddrüse (Brown et al.

1993) und der murinen (Riccardi et al. 1995) und humanen Niere (Aida et al. 1995) beschrieben. Eventuell könnte der für diesen Mechanismus verantwortliche

Ca-sensing-Rezeptor auch für Pi eine Bedeutung haben, da sein Auftreten mit einer durch die diätetische P-Versorgung oder durch PTH erzeugten Veränderung der NaPi IIa-Expressionshöhe positiv korreliert war (Riccardi et al. 2000).

Die Restriktion der diätetischen P und/oder Ca-Zufuhr beeinflusste die Parameter des Na⁺/Pi -Transportes in Jejunum, Niere und Speicheldrüse nicht (Abb. 15). Dies könnte darauf beruhen, dass eine 30 %ige Reduktion der P und/oder Ca-Zufuhr nicht zu einer Mangelsituation bei diesen nicht-ruminierenden Wiederkäuern führte. Die verfütterte Ziegenmilch enthielt etwa 0,9 g P/kg und 1,2 g Ca/kg Milch mit einer nahezu 100 %igen Bioverfügbarkeit der Elektrolyte (Ergebnisse aus dem Institut für Tierernährung, mündliche Mitteilung). Die Lebendmassezunahmen und die Futteraufnahmen der restriktiv und adäquat P gefütterten Tiere unterschieden sich nicht über den gesamten Versuchzeitraum. Da die Reduktionen der täglichen Gewichtszunahme und der Futteraufnahme die ersten Symptome eines P-Mangels sind (Preston & Pfander 1964, Blair-West et al. 1992), könnte dies auf eine noch nicht defiziente Versorgung der in diesem Versuch eingesetzten Tiere hinweisen. Die Plasma-Pi-Konzentrationen waren trotzdem in den beiden rP-Gruppen signifikant verringert (oP: 3,07±0,17 mmol/l, n = 8, rP: 2,67±0,22 mmol/l, n = 9; x±SD, p<0,001 (t-Test)). Dies hatte aber keinen Anstieg der Plasma-Ca-Konzentrationen zur Folge, was ein weiteres Charakteristikum für eine P-Mangelsituation gewesen wäre (Schröder et al. 1995). Bei abgesetzten Schaflämmern unter adäquaten, reduzierten und defizienten P-Versorgungsbedingungen wurde über die signifikante Korrelation der täglichen Gewichtszunahme und der täglichen P-Aufnahme folgende Gleichung zur Berechnung des täglichen P-Bedarfes erstellt: P = 0,0194W(1+0,0171G), wobei P = täglicher P-Bedarf in g, W

= Körpergewicht in kg, G = tägliche Zunahme in g ist (Preston & Pfander 1964). Setzt man das mittlere Körpergewicht (Versuchsende) der Ziegenlämmer (14,5 kg = W) und deren tägliche Zunahme (G = 160 g/Tg, Mittel über Versuchzeitraum) in diese Formel ein, resultiert daraus ein Bedarf von etwa 1,05 g P/Tg, der aber nur eine annähernde Schätzung darstellt.

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Abbildung 15: Beeinflussung der Expression des epithelialen Pi-Transportes in Jejunum, Niere und Speicheldrüse durch die diätetische P und Ca-Versorgung bei nicht-ruminiernden Ziegen. Linke Seite: Kapazität des jejunalen Na⁺/Pi-Transportes (A), relative NaPi IIb-mRNA-(B) und -Proteinmenge (C), rechte Seite: Kapazität des renalen Na⁺/Pi-Transportes (D) und relative NaPi IIa-mRNA-Menge (E), rechts unten: relative NaPi II mRNA-Menge in der Speicheldrüse (F). Angegeben sind x±SE, die n = Anzahl der Tiere sind in den Säulen angegeben. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Fütterungsgruppen.

Dieser Wert wurde über die Milchfütterung in keiner Gruppe unterschritten. Die reine Milchversorgung in diesem Alter könnte also eine diätetische Überversorgung mit Pi

bedeuten, sodass eine 30 %ige Reduktion der Zufuhr keine Auswirkungen auf die P-Homöostase hatte. Für den Erhalt eines „normalen“ Plasma-Pi-Spiegels bei den Schaflämmern wurde ein Bedarf für die P-Aufnahme von etwa 70 mg P/kg W/Tg ermittelt.

Bei den Ziegenlämmern lag die P-Aufnahme aber selbst bei den rP-Gruppen mit etwa 90 mg/kg/Tg darüber. Das beobachtete Absinken der Plasma-Pi-Spiegel könnte aber darauf hinweisen, dass der P-Bedarf bei milchernährten Ziegenlämmern doch höher ist als bei abgesetzten Schaflämmern. Da bei den rP-Gruppen die Wachstumsraten nicht beeinträchtigt waren, dürfte die Reduktion der Plasma-Pi-Konzentrationen die Verschiebung des Pi in den Körper-Pool und in den Speichel reflektieren, ohne dass dieses für die epithelialen Transportsysteme ein ausreichendes Signal für adaptive Prozesse war. Dass das Anpassungsvermögen der Homöostase bei milchernährten Lämmern an eine defiziente Versorgung nicht ausreichend ist oder die Sensitivität der Systeme zur Erfassung von P-Defizienzen nicht hoch genug ist, ist unwahrscheinlich, da ein rasch wachsendes Jungtier mit hohem P-Bedarf schneller in eine Mangelsituation kommt als ein ausgewachsener Wiederkäuer.