Molekulare und funktionelle Entwicklung der epithelialen P i -Transporter während der Ontogenese bei Ziegen

Während der Ontogenese muss der P-Haushalt der Ziegen an den rasch steigenden P-Bedarf dieser Nestflüchter angepasst werden: Pi wird für eine adäquate Knochenmineralisation und für die postnatale Synthese ausreichender Mengen an energiereichen Phosphaten für die Mobilität, thermoregulatorische Leistungen und Wachstum gebraucht. Mit Einsetzen des endogenen Pi-Kreislaufes müssen entsprechende Pi-Mengen für die Sekretion mit dem Speichel zunächst resorbiert oder wieder aus dem Körper-P-Pool freigesetzt werden. Eine hohe resorptive Leistungsfähigkeit und postnatale Anpassungsfähigkeit des Darmes und der Niere sind hierfür Voraussetzung. Für die gerichtete Aufnahme von Nährstoffen über Epithelien müssen reife polarisierte Epithelzellen mit entwickelter BSM vorhanden sein (Buddington 1994, Traebert et al. 1999b). Während die Organreifung bei Nesthockern wie Ratten, Kaninchen u.a. erst im postnatalen Zeitraum abgeschlossen ist (Traebert et al. 1999b, Pacha 2000) ist die Reifung von Dünndarm und Niere bei kleinen Wiederkäuern pränatal schon nahezu beendet. Weitere intestinale Reifungsprozesse, die die Zellmigration entlang des Villus, die Zellerneuerungszeit und die Ausprägung der Krypten betrafen, verliefen bei Schaflämmern progressiv während der Saugphase schon vor der Umstellung auf festes Futter (Attaix & Meslin 1991). Die Reifung der Nierenstrukturen bei Schaflämmern war schon nach 18 - 90 % der intrauterinen Entwicklung abgeschlossen, nach 140 Tagen der Fetalentwicklung waren ausschließlich ausgereifte Glomeruli zu beobachten (Gimonet et al. 1998, Wintour et al. 1998, Moritz & Wintour 1999).

Zur Untersuchung der postnatalen Entwicklung des epithelialen Pi-Transportes bei Ziegen wurden die Pi-Transportprozesse und ihrer Charakteristika in Jejunum, Niere und Speicheldrüse erfasst. Die Phase der „nicht-ruminierenden“ Jungtiere umfasste den Zeitraum von Geburt an bis zum Absetzen (Tiere im Alter von 1 - 7 Tagen bis 4 - 5 Wochen, die

milchernährt waren und von 8 - 11 Wochen, die zur Milch erstes Rauhfutter aufnahmen). Der Übergang vom nicht-ruminierenden zum ruminierenden Wiederkäuer wurde anhand der Daten der 8-11 Wochen alten Tiere und 4-5 Monate alter, rauh- und kraftfuttergefütterter Tiere („ruminierende Ziegen“) erfasst.

Alle Ergebnisse sind in Abbildung 11 - 13 zusammengefasst. Die interindividuelle Streuung war in den gewählten Altersgruppen sehr hoch, was darauf hinwies, dass die individuelle Entwicklungsgeschwindigkeit sehr unterschiedlich sein dürfte.

Im Jejunum (Abb. 11) nicht-ruminierender Ziegen war ebenso ein Na⁺-abhängiger Pi -Transport festzustellen wie bei ruminierenden Ziegen, der strukturell ab der 4. - 5.

Lebenswoche hauptsächlich auf einem NaPi IIb beruhte (Korrelation von Vmax, NaPi IIb mRNA und Protein). Bei neugeborenen Lämmern war die Transportkapazität genauso hoch wie bei 4 - 5 Wochen und 4 - 5 Monate alten Ziegen, die Affinität dieses Transportsystems für Pi war aber signifikant geringer als bei den älteren Tieren. Da die Transportkapazität bei ruminierenden Ziegen mit der NaPi IIb-Proteinmenge korreliert war (Huber et al. 2002a), dürfte die bei den wenige Tage alten Ziegenlämmern exprimierte NaPi IIb-Menge nicht für die beobachtete Transportkapazität verantwortlich sein. Weiterhin entsprach ein Km-Wert von etwa 0,23 mmol/l nicht dem für den NaPi IIb charakteristischen Wert von etwa 0,05 mmol/l, so dass angenommen werden muss, dass bei neugeborenen Lämmern zunächst ein anderes Na⁺-abhängiges Transportsystem die hohe Pi-Transportkapazität aufrecht erhält, bis eine ausreichende Reifung des NaPi IIb-Systems stattgefunden hat.

0

Relative NaPi IIb mRNA-Menge (%) NaPi IIb mRNA/b-Aktin

0

Relative NaPi IIb Protein-Menge (%) NaPi IIb Protein/b-Aktin

0.0

Vmax (nmol/mg Protein/10sec) Km (mmol/l)

% NaPi IIb Protein NaPi IIb/b-Aktin

% NaPi IIb mRNA NaPi IIb/b-Aktin

Abbildung 11: Entwicklung des intestinalen Pi-Transportes bei Ziegen. A) NaPi IIb-mRNA-Expression im Jejunum, B) NaPi IIb-Protein-IIb-mRNA-Expression im Jejunum und C) Transportkapazität (Vmax, linke y-Achse) und Transporteraffinität (Km, rechte y-Achse) des Na⁺-abhängigen Pi-Transportes im Jejunum in Abhängigkeit vom Lebensalter (Huber et al.

2002b).

Die Werte sind als x±SD angegeben, die zugrundeliegenden Tierzahlen (n) sind jeweils in den Säulen angegeben. Für die semiquantitativ bestimmten mRNA- und Proteinmengen ist sowohl das Verhältnis NaPi II/b-Aktin (absolute Werte, rechte y-Achse) als auch die prozentuale Menge bezogen auf den Wert der 1 - 7 Tage alten Tiere als 100 % Basis (relative Werte, linke y-Achse) dargestellt. Der Effekt des Entwicklungsstatus auf die NaPi-Transportparameter wird im Text unter Berücksichtigung von Tabelle 5 näher erläutert.

0

Vmax (nmol/mg Protein/10sec) Km (mmol/l)

1-7 Tg 4-5 Wo 8-11 Wo 4-5 Mo

Abbildung 12: Entwicklung des renalen Pi-Transportes bei Ziegen. D) NaPi IIa-mRNA in der Niere und E) Transportkapazität (Vmax, linke y-Achse) und Transporteraffinität (Km, rechte y-Achse) des Na⁺-abhängigen Pi-Transportes in der Niere in Abhängigkeit vom Lebensalter (Huber et al. 2002b).

Die Werte sind als x±SD angegeben, die zugrundeliegenden Tierzahlen (n) sind jeweils in den Säulen angegeben. Für die semiquantitativ bestimmten mRNA-Mengen ist sowohl das Verhältnis NaPi II/b-Aktin (absolute Werte, rechte y-Achse) als auch die prozentuale Menge bezogen auf den Wert der 1 - 7 Tage alten Tiere als 100 % Basis (relative Werte, linke y-Achse) dargestellt. Der Effekt des Entwicklungsstatus auf die NaPi-Transportparameter wird im Text unter Berücksichtigung von Tabelle 5 näher erläutert.

Auch in Niere und Speicheldrüse konnten NaPi II-Transportsysteme nachgewiesen werden: In der Niere (Abb. 12) war NaPi IIa-mRNA ab dem ersten Lebenstag nachweisbar, so dass angenommen werden kann, dass dieses Transportsystem wie bei ruminierenden Tieren einen Anteil an der renalen Pi-Resorption hat. In der Gl. parotis (Abb. 13) konnte im Northern Blot erst ab der vierten Lebenswoche NaPi II-mRNA nachgewiesen werden. Die Expression korrelierte mit der zunehmenden Konzentrierung von Pi im Speichel bei nicht-ruminierenden Ziegen, so dass auch hier davon ausgegangen werden kann, dass im Speicheldrüsenepithel ein NaPi II für die Sekretion des Pi in den Speichel eine Rolle spielt.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Speichel Pi (mmol· l-1 ) NaPi II mRNA/b-actin

Tage

Abbildung 13: Entwicklung des Pi-Transportes in der Speicheldrüse bei Ziegen. F) NaPi II-mRNA in der Speicheldrüse und G) NaPi II-mRNA (Dreiecke) korreliert mit den Pi -Konzentrationen im Speichel (Kreise) in Abhängigkeit vom Lebensalter (Huber et al. 2002b).

Die Werte sind als x±SD angegeben, die zugrundeliegenden Tierzahlen (n) sind jeweils in den Säulen angegeben. Für die semiquantitativ bestimmten mRNA-Mengen ist das Verhältnis NaPi II/b-Aktin (absolute Werte, rechte y-Achse) dargestellt. Der Effekt des Entwicklungsstatus auf die NaPi-Transportparameter wird im Text unter Berücksichtigung von Tabelle 5 näher erläutert.

Zur Abschätzung der Signifikanz des Effektes des Alters bzw. des Wiederkäuerstatus (nicht-ruminierend, ruminierend) auf die Transportparameter wurde eine Korrelation mittels linearer Regression mit der Gleichung y = a + b · x durchgeführt. Über die Signifikanz und das Vorzeichen der Steigung der Geraden und das Bestimmtheitsmaß r² wurde positive oder negative Korrelationen der Daten erfasst (Tab. 5).

Während der nichtruminierenden Phase stiegen im Jejunum sowohl NaPi IIbmRNA und -Proteinmengen als auch Kapazität und Affinität des Na⁺-abhängigen Pi-Transportes kontinuierlich an. In der Niere stieg bei gleichbleibender NaPi IIa-mRNA-Menge die Transportkapazität, während die Affinität sank. Parallel dazu stiegen ab der 4. - 5. Woche messbar die Speichel-Pi-Konzentrationen (von 2,7 mmol/l (in der dritten Woche gepoolte Speichelprobe) auf 39,9±6,1 mmol/l in der 8. - 11. Lebenswoche) und die NaPi II-mRNA-Mengen in der Gl. parotis. Im Plasma stiegen die Pi-Konzentrationen von 2,2±0,5 mmol/l (1 - 7 Tg) auf 3,2±0,2 mmol/l (4 - 5 Wo, 8 - 11 Wo). Anhand der zunehmenden NaPi II-mRNA-Expression in der Speicheldrüse und der steigenden Pi-Konzentrierungsfähigkeit im Speichel in einer Entwicklungsphase, in der die Bedeutung des Pansens für die Verdauung noch sehr gering ist, scheint hier ein zum Teil offensichtlich genetisch programmierter Prozess abzulaufen, obwohl die physiologische Organreifung noch nicht abgeschlossen ist (Kay 1960b). Dies gewährleistet neben der zunehmenden mechanischen Stimulation des Speichelflusses durch die Aufnahme von festem Futter v.a. in der 8. - 11. Woche das Einsetzen des endogenen Pi-Kreislaufes auf einem relativ hohen Niveau zum Zeitpunkt des Absetzens.

Dieser zunehmende Abfluss von Pi in den Speichel beeinträchtigte den Plasma-Pi-Pool in dieser Entwicklungsphase nicht. Kompensiert wurde dieser erhöhte Bedarf über den Anstieg der intestinalen als auch der renalen Pi-Transportkapazität, wie dies auch für Schaflämmer gezeigt wurde (Shirazy-Beechey et al. 1989). Mechanistisch könnte der Anstieg des Pi -Transportes im Jejunum auf verschiedenen Prozessen beruhen: Der parallele Anstieg der NaPi IIb-Transkripte und der NaPi IIb-Proteinmenge deutete direkt auf eine verstärkte Genexpression hin. Zusätzlich kann diese Verstärkung der Genexpression durch die verringerte Erneuerungsrate der jejunalen Enterozyten und geringere Migrationsgeschwindigkeit entlang der Zotte in dieser Entwicklungsphase unterstützt werden,

da dies die Lebensdauer der einzelnen Zelle verlängert und mehr reife Enterozyten vorhanden sind (Attaix & Meslin 1991).

Tabelle 5: Die Korrelation der Na⁺/Pi -Transportdaten mit dem Alter über lineare Regressionsanalysen (y = a + b·x) unter Berücksichtigung des Wiederkäuerstatus (Nicht-ruminierende Ziegen = 1 - 7 Tg bis 8 - 11 Wo; Ruminierende Ziegen = 8 - 11 Wo bis 4 – 5 Mo) (Huber et al. 2002b).

Daten ^r2 a b p -Wert

Jejunum

Nicht-ruminierend mRNA Blot 0.67 0.16±0.16 0.016±0.004 <0.001 Protein Blot 0.67 0.11±0.08 0.008±0.002 <0.01 Vmax 0.57 0.08±0.02 0.002±0.001 <0.01 Km 0.55 0.10±0.02 -0.0016±0.0005 <0.05 Ruminierend mRNA % 0.52 679±158 -3.912±1.424 <0.05

Protein % n.s.

Vmax 0.69 0.30±0.05 -0.0012±0.0004 <0.01 Km 0.82 -0.01±0.01 0.0004±0.0001 <0.01 Niere

Nicht-ruminierend mRNA Blot n.s.

Vmax 0.29 3.26±0.58 0.038±0.016 <0.05 Km 0.28 0.24±0.06 0.004±0.002 <0.05 Ruminierend mRNA % 0.50 116±15.8 -0.396±0.132 <0.05

Vmax 0.70 8.44±1.06 -0.037±0.009 <0.01

Km n.s.

Speicheldrüse

Nicht-ruminierend mRNA Blot 0.88 -0.08±0.06 0.011±0.001 <0.001 Ruminierend mRNA Blot 0.76 -0.56±0.62 0.019±0.005 <0.05 Die Werte sind als x±SE angegeben für n Ziegen; die n-Zahlen sind in Abbildung 11 - 13 enthalten. mRNA, Protein Blot = NaPi II/ b-Aktin-Verhältnis, Daten aus einem Blot (weiße Balken in Abb. 11 - 13) ; mRNA, Protein % = NaPi II/ b-Aktin-Verhältnis als relativer Wert bezogen auf die Werte der 1 - 7 Tg alten Tiere als 100% (schwarze Balken in Abb.11-13), Daten aus allen Blots; n.s. nicht signifikant, p = Signifikanz der Steigung der Regressionsgraden.

Auch ein Wechsel der Affinität des Pi-Transportsystems könnte ursächlich an der Erhöhung der Transportkapazität beteiligt sein. Hier ist dies aber eher auszuschließen, da der Anstieg der Affinität von der ersten zur 4. - 5. Lebenswoche keine Änderung der Vmax zur Folge hatte, während ohne weitere Änderung der Affinität die Transportkapazität zur 8. - 11.

Lebenswoche deutlich anstieg.

Der renale Pi-Transport zeigte keine so deutliche Entwicklung, was aufgrund der weit fortgeschrittenen Organreife zum Zeitpunkt der Geburt erklärbar ist. Die Transportkapazität stieg in der nicht-ruminierenden Phase an, während der Veränderungen in der NaPi

mRNA-Menge nicht feststellbar waren. Die Entwicklung der Expression des NaPi IIa-Proteins ist unklar. Bei Ratten wurde ein posttranskriptionaler Regulationsmechanismus für die ontogenetischen Veränderungen des NaPi IIa postuliert (Taufiq et al. 1997), welcher auch für die Ziegen angenommen werden könnte. Eine adaptive Steigerung des NaPi IIa aufgrund veränderter Plasma-Pi-Spiegel wie beim erwachsenen Tier lag hier ursächlich nicht vor. Über die Expression von mit NaPi IIa anti-sense Nukleotiden hybridisierter und somit subtrahierter cRNA aus der Rattenniere konnte aber in Xenopus laevis Oozyten bei jungen Tieren noch eine Na⁺-abhängige Pi-Aufnahme festgestellt werden, die bei den erwachsenen Tieren nicht mehr vorhanden war. Dies und die Tatsache, das Npt2 (-/-) knock out Mäuse (NaPi IIa knock out) noch eine hohe Pi-Resorptionskapazität in der Niere aufwiesen, führten zu der Annahme, dass ein weiteres renales wachstums-spezifisches Na⁺/Pi-Transportsystem existiert (Silverstein et al. 1996, Spitzer & Barac-Nieto 2001). Ein hochaffines (Km 0,07 mmol/l), elektroneutral transportierendes Pi-Transportsystem (NaPi IIc) mit etwa 36 – 38 % Homologie der Aminosäuresequenzen zu NaPi IIa und IIb konnte aus der Rattenniere kloniert werden, welches nahezu ausschließlich bei Tieren in der Absetzphase hochexprimiert auftrat (Segawa et al. 2002). Auch für Ziegen in dieser Phase könnte ein solches zusätzliches Pi -Transportsystem für die erforderliche Adaptation verantwortlich sein.

In der ruminierenden Phase stieg nur noch die NaPi II-mRNA-Expression in der Speicheldrüse, während alle anderen Parameter absanken (NaPi IIb-mRNA und Transportkapazität und -affinität im Jejunum, NaPi IIa-mRNA und Transportkapazität in der Niere) oder gleich blieben (Speichel-Pi-Konzentration, NaPi IIb-Protein im Jejunum, Affinität des renalen Pi-Transportes). Da die Speichel-Pi-Konzentrationen schon während des Absetzens ein Maximum erreicht hatten, kann die erhöhte Expression des NaPi II - falls sie sich auf Proteinebene widerspiegelt - darauf zurückgeführt werden, dass die Pi-Transportrate aufgrund des gesteigerten Speichelflusses zur Aufrechterhaltung der gleichen Pi -Konzentration bei voll ruminierenden Tieren erhöht sein muss. Dies erforderte eine höhere

Transporterexpression. Unter diesem erhöhten Abfluss von Pi über den Speichel war der Plasma-Pi-Spiegel signifikant auf 1,5±0,2 mmol/l bei den 4 - 5 Monate alten Tieren reduziert.

Ob der gesteigerte Pi-Abfluss allerdings die Ursache für die Reduktion des Plasma-Pi-Pool ist, ist unklar. Diskutiert wurde ein hormonell bedingter Abfall des Plasma-Pi durch Androgene und Östrogene beim geschlechtsreifen Tier (Rind), beim Jungtier wurde ursächlich die Einwirkung des Somatotropen Hormons für ein hohe Pi-Retention auch im Plasma-Pool verantwortlich gemacht (Unselm & Flock 1967). Ebenso sollte das Niveau des Energiestoffwechsels (sinkender Energieumsatz bei steigendem Alter) zu einer Anpassung der Plasma-Pi-Konzentrationen führen, da der Stoffwechselbedarf für Pi sinkt (Sestoft 1979).

Auch die geringere Bioverfügbarkeit des Futter-P gegenüber der Pi-Verfügbarkeit in der Milch (fast 100 %) könnte über eine geringere intestinale Absorption den Plasma-Pi-Spiegel reduzieren (Boencke et al. 1976, Haramati & Mulroney 1993). Das Absinken der intestinalen Pi-Transportkapazität - teilweise bedingt durch die geringere Affinität des System für Pi bei 4 - 5 Monate alten Ziegen - könnte genetisch festgelegt oder auch indirekt als Ziel einer Hormonwirkung ursächlich zu einer Reduktion des Plasma-Pi-Spiegels beigetragen haben.

Die Diskrepanz zwischen NaPi IIb-mRNA- und NaPi IIb-Protein-Mengen könnten auf eine posttranskriptionale Regulation der Expression hinweisen.

Niedrigere Plasma-Pi-Spiegel bedingen reduzierte Mengen an Pi im Ultrafiltrat der Niere und könnten somit zusammen mit entwicklungsbedingten hormonellen Veränderungen für die Reduktion der NaPi IIa-mRNA-Expression und für die Verminderung der renalen Pi -Transportkapazität verantwortlich sein. Die insgesamt hohe tubuläre Pi-Resorptionskapazität von etwa 99 % dürfte trotzdem unbeeinflusst sein.

Im Vergleich mit monogastrischen Tieren lag die Transportkapazität beim Wiederkäuer über dem gesamten Entwicklungszeitraum immer höher. Unter vergleichbaren Bedingungen erfasste Kapazitäten des renalen Na⁺/Pi-Transportes bei der Ratte in den gleichen Entwicklungsphasen zeigten eine ähnliche Entwicklung während der Ontogenese (Tab. 6;

Taufiq et al. 1997). Diese Parallelität der Entwicklung dürfte bei dieser Nesthockerspezies unter anderem auch auf der zunehmenden Reifung des funktionellen Nierengewebes beruhen, welches wie auch beim Schwein erst postpartal abgeschlossen ist (Moritz & Wintour 1999).

Tabelle 6: Vergleich der kinetischen Parameter des renalen Na⁺/Pi -Transportes (Vmax in nmol/mg Protein/10 s; Km in mmol/l) monogastrischer Spezies (Ratten (Taufiq et al. 1997);

Schweine (Schröder et al. 2000) und Wiederkäuern (Huber et al. 2002b).

Entwicklungsphasen Ratten

(Ziegen = 4 - 5 Mo) 1,44±0,19 0,14±0,03 2,73±0,19 0,49±0,06 0,95±0,07 0,11±0,002

Adultphase 0,78±0,15 0,12±0,03

Dargestellt sind x±SE, n = 3 (Ratten), n = 4 - 7 (Ziegen), n = 3 (Schweine)

Aus dem Vergleich der Transportkapazitäten von Ratten, Ziegen und Schweinen in der Jugendphase (d.h. abgesetzte, noch wachsende Tiere) (Tab. 6) wird deutlich, dass die hohe renale Pi-Transportkapazität bei diesem Wiederkäuer schon von Geburt an entwickelt ist. Dies unterstreicht die Bedeutung dieses Organs für die Etablierung des endogenen Pi-Kreislaufs und den gesamten P-Haushalt bei Ziegen. Die intestinale Reifung und die Entwicklung der Pi -Konzentrierungsfähigkeit der Speicheldrüse verlaufen progressiv während der nicht-ruminierenden Phase, so dass bei Einsetzen einer fütterungsbedingt vermehrten Speichelflussrate die aus dem Körper-Pi-Pool über den Speichel abfließende Pi-Menge effizient im Rahmen des endogenen Pi-Kreislaufs rezykliert werden kann. Die Reduktion der Pi-Transportleistung in Niere und Darm bei älteren Ziegen dürfte adaptiv den nachlassenden Stoffwechselleistungen mit fortscheitendem Alter angepasst sein.

Einschränkend ist in dieser Diskussion zu sagen, dass auch die Gesamtmasse der Organe ebenso wie die eventuelle Verschiebung von Transporterlokalisationen eine entscheidende Rolle für die Pi-Aufnahme spielt. Ebenso ist der parazelluläre Transport, die

Membranzusammensetzung und -fluidität als auch die Größe der Epitheloberfläche entscheidend für entwicklungsbedingte Veränderungen in Nährstofftransporten. Externe (Futterkomponenten, biologisch aktive Peptide) und intrinsische (genetisch programmierte Abläufe, hormonell gesteuerte Abläufe) Signale sind mitverantwortlich für die postnatale Differenzierung der Organfunktionen (Buddington 1992, Pacha 2000). Die hormon- oder wachstumsfaktor-gesteuerte Regulation der Transportexpression während der Ontogenese beruht z.B. auf der hemmenden Wirkung des EGF (epidermal growth factor) auf den renalen und intestinalen Na⁺/Pi-Transport (Arar et al. 1999, Xu et al. 2001) oder der stimulierenden Wirkung der Schilddrüsenhormone auf den renalen (Euzet et al. 1995, Alcalde et al. 1999) und des Calcitriols auf den intestinalen Pi-Transport (Armbrecht et al. 1981, Armbrecht 1986, Ghishan 1992).

5.3 Beeinflussung der P-Homöostase und des endogenen Pi-Kreislaufs über die diätetische