in Lymphocyten
Dissertation
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Universität Konstanz
Fachbereich Biologie
vorgelegt von Robert Simpfendörfer
aus Osorno, Chile Konstanz im Juli 2008
Tag der mündlichen Prüfung: 9/Dezember/2008
1. Referent: Prof. Dr. H. Werner Hofer 2. Referent: Prof. Dr. Martin Scheffner
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS)
URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-74172 URL: http://kops.ub.uni-konstanz.de/volltexte/2009/7417/
Fachbereich Biologie
Studiendekan: Prof. Alasdair Cook, Ph.D.
Ich erkläre: die vorgelegte Dissertation habe ich selbständig, ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt.
Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten Schriften entnommen wurden, sind als solche gekennzeichnet. Bei den von mir durchgeführten und in der Disser- tation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis eingehalten.
1. Referent: Prof. Dr. H. Werner Hofer 2. Referent: Prof. Dr. Martin Scheffner
Ecc. 7: 8
1. Einleitung . . . 9
1.1.Protein-Phosphorylierung als Regulationsmechanismus der Zellaktivität . . . 9
1.2. Serin/Threonin-spezifische Proteinphosphatasen . . . 10
1.3. Tyr-spezifische Proteinphosphatasen (PTPs) . . . 11
1.3.1. Doppelspezifische Phosphatasen (DSPs) . . . 12
1.3.2. Erstmalige Beschreibung der PTP-Enzymfamilie . . . 13
1.3.3. Grundsätzliche Eigenschaften in Struktur und Funktion der PTPs . . . 13
1.3.4. PTP1B . . . 16
1.3.5. Tc-PTP . . . 18
1.3.6. PTP1C . . . 19
1.3.7. PTP1D . . . 19
1.3.8. CD45 . . . 20
1.3.9. R-PTPα . . . 21
1.4. Tyr-Phosphorylierung während der Lymphocytenaktivierung . . . 22
1.5. Beteiligung von PTPs an der Aktivierung von T-Lymphocyten mittels TCR im Immunsystem . . . 24
1.6. Regulation der Genexpression der PTPs Tc- und 1B: ein Mechanismus zur Kontrolle der biologischen Funktion . . . 26
1.7. Einführende Zusammenfassung und Ziel der Arbeit . . . 27
2. Material und Methoden . . . 29
2.1. Chemikalien . . . 29
2.3. Grundsätzliche Methoden zur Sterilisierung von Materialien und Lösungen . . . 30
2.4. Mikrobiologische Verfahren . . . 30
2.4.1. Medien zur Bakterienkultur . . . 30
2.4.2. Lagerung von E. coli und Kulturbedingungen . . . 30
2.4.3. Herstellung von chemokompetenten Bakterien aus E. coli . . . .31
a) Herstellung chemokompetenter Bakterien . . . 31
b) Herstellung von elektrokompetenten Bakterien . . . 31
2.4.4. Transformation kompetenter Bakterien . . . 31
2.4.5. Bakterienwachstum in selektivem Medium . . . 32
2.5. Molekularbiologische Methoden . . . 32
2.5.1. Beschreibung des Plasmids pBluescript . . . 32
2.5.2. Vorbereitung von Plasmiden (“Mini-Präp.”) . . . 33
2.5.3. Restriktionsverdau . . . 34
2.5.4. Ligation von mit Restriktionsenzymen geschnittenen DNAs . . . 34
2.5.5. RNA-Extraktion . . . 35
2.5.6. Präparation der Gesamt-RNA mit einem kommerziellen Kit . . . 36
2.5.7. RNA/DNA-Quantifizierung . . . 37
RNA-Quantifikation . . . 37
Bestimmung der DNA-Konzentration: . . . 37
2.5.9. Klonierung von amplifizierten DNA-Sequenzen vom Hausschwein . . . 41
2.5.10. Reinigung amplifizierter DNA . . . 41
2.5.11. RNA-Elektrophorese in Formaldehyd-Agarose-Gelen . . . 42
2.5.12. Herstellung von RNA-DIG-Sonden . . . 43
2.5.13. RNA-Transfer (“Northern-Blotting”) . . . 44
2.5.14. Hybridisierung und Nachweis von mRNAs mit RNA-DIG-Sonden . . . 45
2.5.15. DNA- Elektrophorese in Agarose-Gelen . . . 47
2.6.1. Denaturierende Elektrophorese in Polyacrylamid-Gelen (“SDS-PAGE”) . . . 50
2.6.2. Anfärben von PAA-Gelen mit Coomassie- Blau . . . 51
2.6.3. Zweidimensionale Gel-Elektrophorese . . . 52
2.6.4. Versuche zur Extraktion von PTPs aus Lymphocyten . . . 53
2.6.5. „Western Blot“-Analyse der PTP-Expression auf Protein-Ebene . . . 55
2.6.6. „Strippen“ der Membranen nach dem Western Blotting. . . 56
2.6.7. Bestimmung der Proteinkonzentration . . . 57
2.7. Biologisches Material . . . 57
2.7.1. Entnahme von Schweinemilz zur Gewinnung von Lymphocyten . . . 57
2.7.2. Präparation von peripheren Lymphocyten und Granulocyten vom Schwein durch Zentrifugieren in Ficoll-Paque . . . 57
2.7.3. Gewinnung von Splenocyten aus der Milz des Hausschweins . . . 58
2.7.4. Reinigung von T-Splenocyten aus Gesamt-Splenocyten der Schweinemilz . . . 59
2.7.5. Primärkultur und Stimulierung von Immunzellen . . . 60
2.7.6. Auszählen und Bestimmen der Zellmortalität . . . 61
2.8. Verwendete Software . . . 61
3. Ergebnisse und Diskussion . . . 62
3.1. Amplifikation und Klonierung von Protein-Tyrosinphosphatasen des Hausschweins . . . 62
3.1.1. Isolierung der PTP-DNA-Sequenzen aus kultivierten Milz-Lymphocyten . . . 64
3.1.2. Klonierung von DNA Sequenzen des Schweins . . . 66
3.2. DNA-Sequenzierung von PTPs vom Schwein . . . 67
3.3. Untersuchungen zur Expression von PTPs in Zellen des Immunsystems des Schweins nach Primärkultur . . . 69
3.3.1. Standardisierung der Amplifikationsbedingungen für RT-PCR . . . 69
3.3.2. Studie zur Genexpression von PTPs in Splenocyten mittels RT-PCR . . . 72
3.4. Isolierung von T-Lymphocyten aus Splenocyten mittels Zentrifugierung in Percoll-Gradienten . . . 78
3.5. Northern-Blotting zur PTPs Tc- und 1B in isolierte T-Splenocyten . . . 83
3.6. Extraktionsbedingungen der PTPs aus Immunzellen des Schweins . . . 87
3.6.1. Vorläufige Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von PTPs in Lymphocyten . . . 87
3.6.2. Vergleichende Analyse des PTP-Gehaltes in Percoll-isolierten Lymphocyten aus Milz und Blut . . . 89
3.6.3. Untersuchungen zu den Extraktionsbedingungen von PTPs aus Splenocyten des Schweins . . . 90
3.7. Western-Blotting-Studien zur Expression von PTPs an isolierten T-Splenocyten. . . 97
3.7.1. Expression von PTPs auf Proteinebene nach pharmakologischer Behandlung . . . 97
3.7.2. Untersuchung zu molekulären Interaktionen von PTPs in T-Lymphocyten mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese . . . 101
3.8. Andere vorläufige Resultate . . . 103
3.8.1. Amplifizierung der Transkripte der PTPs Tc-, 1B und 1D mittels 3‘-RACE . . . 103
3.8.2. Northern-Blotting Analyse der PTPs 1C und 1D . . . 103
3.9. Zukünftige Untersuchungen zur Expression von PTPs . . . 104
Zusammenfassung . . . 105
Anhang . . . 107
Danksagung . . . 121
4. Literatur . . . 122
1 x (1) fach konzentriert A Absorption
AS Aminosäure
Abb. Abbildung
ACS Aminocapronsäure
Act Aktin
AK Antikörper
Amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat β-ME β-Mercaptoethanol
b Basen
Bcr-Abl Fusionsprotein Bcr + Abl
BisTris Bis(2-Hydroxyethyl)-Iminotris(hydroxymethyl)methan
bp Basenpaare
BPB Bromphenolblau BSA bovine serum-albumin bzw. beziehungsweise ca. circa
cDNA copy-DNA
CIAP calf intestine alcaline phosphatase ConA Concanavalin A
CT carboxy-terminal
CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte antigen–4
CsA Cyclosporin A
ddNTP didesoxy-Nukleosidtriphosphat DEAE diethylaminoethyl
DEPC Diethylpyrocarbonat
DIG Digoxigenin
DMF N, N-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxy-Nukleosidtriphosphat
ds double strand
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ERK extracellular regulated kinase FAK focal adhesion kinase
FCS fötales Kälberserum
g Erdbeschleunigung bzw. Gramm GAPDH Glyceraldehydphosphat Dehydrogenase GTC Guanidinium Isothiocyanate
h Stunde
H2ODEPC DEPC-behandeltes Wasser IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
Iono Ionomycin
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid IR Insulin Rezeptor
IRS-1 Insulin Rezeptor Substrat-1
ITAM immuno receptor tyrosine-based activation motif JAK Janus Kinase
JH- Jak Homologie-Domän JNK c-Jun N-terminal Kinase
LB Luria-Bertani LPS Lipopolysaccharid
MAPK mitogen-activated protein kinase MHC major histocompatibility complex min Minute
mRNA messenger-RNA
MW Molekulargewicht
NAC N-Acetylcystein
NT amino-terminal
nt Nukleotid
PAA Polyacrylamid
PAGE poly-acrylamide gel electrophoresis PBS phosphate buffered saline
PCR Polymerase-Kettenreaktion PI-3-K Phophatidylinositol-3‘-Kinase Pipes Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure) PKA Protein Kinase A
PKC Protein Kinase C PTK Protein-Tyrosinkinase PTP Protein-Tyrosinphosphatase
Rapa Rapamycin
RE Restriktions-Enzym RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro min R-PTP Rezeptor-PTP
rRNA ribosomal-RNA Rt Raumtemperatur RT Reverse Transkriptase
s. siehe
S. Seite
SDS Natriumdodecylsulfat sec Sekunde
SFK Src family kinases
SH2/SH3 Src Homologie-Domän 2 bzw. 3
ss single strand
SS Salycilsäure
STAT signal transducers and activators of transcription TAE Tris-Acetat-EDTA
TBE Tris-Borat-EDTA
Tc T-Zell
TEA Triethanolamin
TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin Tricine N-tris[Hydroxymethyl]methylglycin Tris Tris-[hydroxymethyl]-aminomethan Tx-100 Triton X-100
U Unit (Einheit)
üN über Nacht
v/v Volumen/Volumen
w/v Gewicht/Volumen
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-Galactopyranosid
1. Einleitung
1.1.Protein-Phosphorylierung als Regulationsmechanismus der Zellaktivität
Die post-traduktionale Modifikation von Proteinen durch kovalente reversible Phosphorylie- rung ist einer der am besten untersuchten Aspekte der biochemischen Zellregulierung. Die Studien zur Kontrolle der Zellaktivität durch Protein-Phosphorylierung anhand von Enzymen begann vor etwa vierzig Jahren. Die Phosphorylierung von Enzymen mittels Proteinkinasen ist ein bei höheren Organismen weit verbreiteter Mechanismus zur Zellregulation. Die Phosphorylierung der Proteine erfolgt vorwiegend an den Ser/Thr- und an Tyr-Resten, außerdem in geringerem Umfang an Asp- und His-Aminosäureresten. Neueste Analysen an 2000 Phosphoproteinen haben gezeigt, daß ca. 86% der Phosphorylierungen in Ser, 12% in Thr und weniger als 2% in Tyr erfolgen (Olsen et al., 2006).
Während die kovalente Phosphorylierung von Proteinen an Ser/Thr-Resten vorwiegend der Regulierung enzymatischer Aktivitäten dient (Aktivität, Affinität/Spezifität von Substraten und/
oder subzelluläre Lokalisation) (Krebs & Beavo, 1979), ist die Phosphorylierung von Tyr-Resten ein regelmäßig wiedergefundener Mechanismus innerhalb von intrazellulären Signalketten (Hunter
& Cooper, 1985; Hunter, 1998). Tyrosinkinasen gehören einer Großfamilie von Proteinen an. Sie weisen typische Signaturmotive und eine charakteristische 3D-Struktur im Bereich der katalytischen Domäne auf.
Die Zelle besitzt verschiedene PTKs, die sich in Rezeptor-Tyrosinkinasen und Nicht-Rezeptor- Tyrosinkinasen aufteilen lassen. Die ”Non-Rezeptor”-PTKs sind im Cytoplasma lokalisiert: sie be- finden sich entweder auf der Innenseite der Zellmembran, assoziiert mit Transmembran-Rezeptoren, oder sie translocieren ins Cytosol. Die cytoplasmatischen PTKs haben relevante Funktionen u.a. bei der Signalübertragung mittels Cytokinrezeptoren und T-Zell-Rezeptoren (van Oers et al., 1996). Die cytoplasmatischen PTKs bilden eine breitgefächerte Familie mit einer großen Vielfalt von nicht-kata- lytischen Domänen, die sich in verschiedenen Repräsentanten dieser Familien wiederholen, wie z.B.
SH2- (Src, Fyn, ZAP-70, u.a.), SH3- (Lck, Lyn, Csk, u.a.) und JH-Domäne (Jak1/2, Tyk2, u.a.); zwar mit stark unterschiedlichen Molekülgrößen, aber mit katalytischen Domänen, welche Sequenzho- mologien mit erhöhtem Erhaltungsgrad besitzen (Taniguchi, 1995). Die Src-Familie ist unter diesen cytoplasmatischen PTKs die am besten untersuchte Gruppe (Src, Yes, Lyn, u.a.).
Die kovalente Phosphorylierung eines Proteins ist eine spezifische chemische Reaktion mit Proteinkinasen als Katalysatoren. Diese Enzyme besitzen die katalytischen Eigenschaften von Prote- in-Phosphotransferasen und reagieren hoch spezifisch mit den entsprechenden Protein-Substraten.
Die im jeweiligen Substratprotein vorliegende Phosphatgruppe stammt aus dem ATP, weshalb auch Enzyme, die Phosphatgruppen transferieren, als “Kinasen” bezeichnet werden. Die kovalente Bindung des Phosphats im Substratprotein erfolgt an einer OH-Gruppe auf der Seitenkette der Ami- nosäurereste. Das Produkt dieser Katalyse ist ein Phosphatester, der bei neutralen pH-Bereich zwei negative Ladungen aufweist.
Die Phosphatester-Bindungen der in den Proteinen Ser, Thr oder Tyr phosphorylierten Amino- säuren sind unter physiologischen Bedingungen in eukaryotischen Zellen sehr stabil. Die spontane Hydrolyserate dieser Phosphatgruppen ist äußerst niedrig. Für deren Dephosphorylierung benötigt
mehreren unterschiedlichen Proteinfamilien an und werden, ebenso wie die Proteinkinasen, in Ser/
Thr- und Tyr-spezifische Proteinphosphatasen eingeteilt (Charbonneau & Tonks, 1992).
Das erste im Zusammenhang mit der Zellregulierung durch Proteinphosphorylierung un- tersuchte Enzym war die Glykogen-Phosphorylase (GP) (Krebs et al., 1959). Eine der ersten Un- tersuchungen wurde schon um 1940 durchgeführt; Cori & Cori (1947) publizierten Hinweise zur molekulären Transformation von Phosphorylase a (aktive Form) zu Phosphorylase b, durch ein so- genanntes „PR“-Dephosphorylierungsenzym (”prosthetic group removing enzyme”). Die GP wird in unphosphorylierter Form als “Phosphorylase b” bezeichnet (inaktive Form). Die Phosphorylierung der Ser-14 durch Phosphorylase-Kinase (eine Ser/Thr-spezifische Proteinkinase), transformiert die GP in eine andere Form “Phosphorylase a” (aktiver Zustand). Die reversible Phosphorylierung dieses Enzyms, gemeinsam mit strukturellen Veränderungen, die von der Regulierung durch allosterische Effektormoleküle herrühren, produzieren eine glykolytische Feinregulierung an diesem molekularen Angriffspunkt. Sowohl die Phosphorylierung als auch die Dephosphorylierung der GP werden phy- siologisch von außerhalb der Zelle gesteuert. Ein anderes glykolytisches Enzym, bei dem ebenfalls früh eine Regulierung durch Phosphorylierung nachgewiesen werden konnte, ist die Phosphofrukto- kinase (PFK) (Hofer & Fürst, 1976). Dieses allosterische Enzym stellt, ähnlich wie GP, eine hormo- nelle Kontrolle der Glykolyse vor; die kovalente Phosphorylierung der PFK an Ser/Thr-Resten ist ein weit verbreiteter molekularer Regelmechanismus in eukaryotischen Organismen (Daum et al., 1986;
Biethinger et al., 1991; Schaloske et al., 1996; Simpfendörfer et al., 2006).
1.2. Serin/Threonin-spezifische Proteinphosphatasen
Das von Cori & Cori (1947) beschriebene “PR”-Enzym war eine Ser/Thr-Proteinphosphatase.
Diese Phosphatasen bilden in vivo Holoenzyme, die sich in mehrere katalytische und regulativen Untereinheiten aufteilen und die ein breites Spektrum an Signalübertragungswegen kontrollieren.
Physiologische Bedeutung erhalten die Ser/Thr-Phosphatasen durch ihre Sensibilität gegenüber ver- schiedenen Inhibitoren (Cohen, 2001), wie z.B. den Tumorpromotor Okadaische Säure (Shenolikar, 1994), die bei biomedizinischen Untersuchungen der durch Protein-Phosphorylierung geregelten Si- gnaltransduktion häufig eingesetzt wird.
Bei Säugern wurden bisher mindestens 4 Gruppen von Ser/Thr-Phosphatasen (PP) beschrieben und folgende Nomenklatur festgelegt: PP-1, -2A, -2B und -2C (Reviews: Cohen, 1989; Shenolikar, 1994). Die Phosphatasen PP-1, -2A und -2B haben sehr ähnliche DNA-Sequenzen in der katalyti- schen Domäne (Shenolikar & Nairn, 1991), unterscheiden sich aber in ihrer Substratspezifität und in ihren regulatorischen Mechanismen. PP-2B, auch als “Calcineurin” bezeichnet, besteht aus einer katalytischen (A) und einer regulatorischen (B) Untereinheit die strukturell mit dem Ca2+- bindenden Protein, Calmodulin, verwandt ist (Stewart et al., 1982). In der katalytischen Untereinheit von Cal- cineurin befindet sich eine Ca2+/Calmodulin-Bindungsstelle, die für die katalytische Aktivierung des Enzyms verantwortlich ist. Die Phosphatase Calcineurin spielt in der Medizin eine wichtige Rolle, da man annimmt, daß sie als Angriffspunkt für die immunsupprimierenden Wirkung von Cyclospo- rin A und FK-506 relevant ist (Transplantationsmedizin; Schreiber & Crabtree, 1992; Cohen, 2001).
Diese Immunsupressoren wurden ursprünglich eingesetzt, ohne daß ihr spezifischer Angriffspunkt bekannt war. Beide Moleküle binden an zwei Proteine (Liu et al., 1991), die als Cyclophilin und FK-506-Bindungsprotein bezeichnet werden und die als Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen wirken (Fischer, 1994).
Der immunsupprimierende Effekt von Cyclosporin A und FK-506 konnte teilweise so verstan- den werden, daß beide Moleküle durch sukzessive Vorgänge die Aktivität von Calcineurin hemmen.
Die Komplexe Cyclosporin A/Cyclophilin und FK-506/FK-506-Bindungsprotein binden an Calcineu- rin und wirken hemmend auf dessen katalytische Phosphatase-Aktivität. Einer der ersten beschriebe- nen Effekte von Calcineurin in der Immunantwort ist die Inhibition der Transkription von Interleukin 2, die extrazellulär die Aktivität der Lymphocyten induziert. Hieraus konnte abgeleitet werden, daß Calcineurin eine relevante Funktion auf den Signalübertragungsweg hat, der zur Aktivierung der T- Lymphocyten führen (Gallo et al., 2006).
Die Molekulare Struktur der Ser/Thr-Proteinphosphatasen stellt sich in der Hauptsache als He- terodimer mit einer katalytischen und einer regulatorischen Untereinheiten dar, von denen die letztere spezifische Funktionen für die Aktivitätskontrolle und subzelluläre Lokalisierung dieser Enzyme auf- weist. PP-1 besitzt z.B. mehrere unterschiedliche regulatorische Untereinheiten die an unterschiedli- chen Stellen innerhalb der Zelle das Enzym verkoppeln (“targeting subunits”). Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur der katalytischen Untereinheit der PP-1 wurde duch von Goldberg et al.
im Jahre 1995 durchgeführt. Das Enzym besitzt im aktiven Zentrum zwei Metallionen (Mn2+), für die Funktionen bei der Katalyse und der Substratbindung angenommen werden.
Die Regulation der Ser/Thr-Proteinphosphatasen erfolgt auf drei unterschiedliche Mechanis- men. Durch die regulatorische Untereinheit können die Proteinphosphatasen gezielt an intrazellulä- re Lokalisationen ankoppeln; wo die Enzyme passende phosphorylierte Proteinsubstrate vorfinden (Alessi et al., 1992; Hubbard & Cohen, 1993). Ein anderer Mechanismus bei der funktionalen Kont- rolle ist die reversible Bindung der Ser/Thr-PP an spezifische Inhibitorproteine (Shenolikar & Nairn, 1991). Diese Interaktionen regulieren die Aktivität der Proteinphosphatase; die Inhibitorproteine ge- hen differenzierte Bindungen ein, je nachdem, ob sie sich in phosphoryliertem Zustand befinden oder nicht, d.h. die Inhibitorproteine selbst werden durch reversible Phosphorylierung gesteuert (Hubbard
& Cohen, 1993). Ein dritter Mechanismus ist die Phosphorylierung selbst. Ein Beispiel hierfür ist die PP-1, die am C-Terminus der Aminosäuresequenz des Proteins phosphoryliert wird. Die Phosphory- lierung erfolgt durch eine Cyclin-aktivierte Ser/Thr-Proteinkinase und hat eine aktivierende Wirkung auf PP-1 (Villa-Moruzzi, 1992).
Die katalytischen Aktivitäten der Proteinkinasen und Proteinphosphatasen bilden ein koordi- niertes Gleichgewicht ihrer biologischen Funktionen. Der Phosphorylierungsgrad der Aminosäuren Serin und Threonin wird durch das Gleichgewicht der katalytischen Aktivität zwischen den entspre- chenden Protein-Kinasen und den Phosphatasen bestimmt. Eines der am häufigsten untersuchten Beispiele für die interdependenz der Aktivität von Kinasen und Phosphatasen ist die oben erwähnte Kontrolle des Glykogenstoffwechsels im Skelettmuskel (Review: Cohen, 1992). Hier läßt sich die Regulation metabolische Reaktionen mittels verschiedener extrazellulärer Signale beobachten, die durch die sekundären cytoplasmatischen Botenstoffe cAMP und Ca2+ physiologisch unabhängig von- einander kontrolliert werden (Cohen, 1992).
1.3. Tyr-spezifische Proteinphosphatasen (PTPs)
Durch die Sequenzierung des Human-Genoms (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001) wur- de es möglich, die Gene der PTP-Superfamilie zu identifizieren und einzuordnen (Review: Tonks, 2006). PTPs bilden eine große Enzymfamilie von großer struktureller Vielfalt, welche die Dephos-
phorylierung von an Tyrosin phosporylierten Proteinen katalysieren. Durch ihren Wirkmechanismus können die PTPs sowohl Antagonisten als auch Amplifikatoren der durch Proteinphosphorylierung an Tyrosin regulierten Signaltransduktion sein und dadurch fundamentale Zellfunktionen wie Wach- stum, Proliferation, Migration und Apoptose kontrollieren (Neel & Tonks, 1997; Li & Dixon, 2000;
Tonks & Neel, 2001; Halle et al., 2007). Gene der PTP-Superfamilie kodieren Enzyme, die in “klas- sische” pTyr-Phosphatasen (“PTPs”) und “dualspezifische” Phosphatasen (“DSPs”) (Andersen et al., 2004) unterteilt werden.
Ursprünglich wurden die PTPs als “Housekeeping-Enzyme” angesehen. Im Laufe von etwa 15 Jahren haben entsprechende Untersuchungen gezeigt, daß diese Enzyme Schlüsselstellen bei der Regulation von Signaltransduktionsketten innehaben und auch neue therapeutische Angriffspunkte bieten (Tonks, 2003,b; Xie et al., 2003; Alonso et al., 2004).
Die Phosphorylierung von Proteinen an Tyrosinresten ist ein Schlüsselvorgang bei der intrazel- lulären Kommunikation, ausgelöst durch Reize aus dem Umfeld der Zelle die physiologische Zellvor- gänge wie Wachstum, Ausdifferenzierung, Proliferation, Tumorbildung, Apoptose oder den Energie- haushalt kontrollieren (Review: Blume-Jensen & Hunter, 2001). Die Phosphorylierung von Proteinen an Tyrosinresten unterliegt einer koordinierten Kontrolle durch PTKs und PTPs. Inzwischen weiß man, daß die Enzymfamilie ein breitgefächertes Struktur- und Funktionsspektrum aufweist, etwa 100 Gene umfaßt (im Vergleich hierzu: gibt es ca. 90 menschliche Gene, die für PTKs mit ähnlich komplexen Strukturen und Funktionen codieren). Diese, aufgrund der großen Zahl von Repräsen- tanten in dieser Proteinfamilie schon recht hohe Struktur- und Funktionskomplexität wird durch die Verwendung von alternativen Promotoren in den Genen der PTPs, alternatives splicing der mRNAs und durch post-traduktionale Modifikationen nochmals wesentlich erhöht. Diese Komplexität ist ein Indikator für die herausragende biologische Bedeutung der PTPs bei der Kontrolle der Zellkom- munikation (“cell-signaling”) (Alonso et al., 2004; Andersen et al., 2004). Eine Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen “normalen” PTK- und PTP-Aktivitäten hat anormale Phosphorylierungen an Tyrosinresten in manchen Proteinen zur Folge, was für die Ätiologie der verschiedensten Patho- logien wie Krebs (Wu et al., 2003; Tartaglia et al., 2004; Bentires-Alj & Neel, 2007; Julien et al., 2007), Stoffwechselstörungen (Elchebly et al., 1999; Kennedy & Ramachandran, 2000; Wimmer et al., 2004) und Affektionen des Immunsystems (Mustelin et al., 2005; Heinonen & Tremblay, 2006;
Simoncic et al., 2006) von großem Interesse ist.
1.3.1. Doppelspezifische Phosphatasen (DSPs)
Die Familie der PTPs kann in zwei große Kategorien unterteilt werden: in klassische, für pTyr Reste spezifische PTPs (z.B. PTP1B und CD45) und die Dualspezifischen-Phosphatasen, die sowohl Tyr- als auch Ser/Thr-Zielproteine dephosphorylieren (Tonks, 2003,a). Diese doppelspezifischen Phosphatasen besitzen einen Katalysemechanismus ähnlich wie die “konventionellen” PTPs, weisen aber strukturelle Unterschiede in ihrem aktiven Zentrum auf (Review: Tonks, 2006), wobei das “sig- nature motif” HC(x)5R dieses aktiven Sites unverändert bleibt. Die DSPs weisen untereinander eine größere strukturelle Differenzierung auf als die “klassischen” PTPs, dabei ist ihre katalytische Domä- ne weniger konserviert (Tonks, 2006). Ähnlich wie “klassische” PTPs, besitzen die DSPs ebenfalls aktive und inaktive katalytische Domänen (DSP-Pseudophosphatasen) (Wishart & Dixon, 1998). Die katalytisch nicht kompetenten Domänen wirken als Regulatoren, wie dies auch bei den “klassischen”
PTPs der Fall ist. Derzeit werden etwa 65 Gene beschrieben, die eine heterogene Gruppe von dop-
pelspezifischen Phosphatasen kodieren. Diese Enzyme haben eine geringere Sequenzähnlichkeit im Bereich des “signature motif” in dem sich die konservierte Cys des aktiven Zentrums befindet, und haben außerdem kleinere katalytische Domänen als die “klassischen” PTPs. Wenn auch die DSPs im Großen und Ganzen den gleichen Katalysemechanismus besitzen wie die “klassischen” PTPs, erlaubt ihnen doch die Struktur ihres aktiven Zentrum, sich an phosphorylierte Reste von pSer, pThr und pTyr ihrer Zielproteine zu binden. Zu den DSPs gehören auch Enzyme des Typs “VH1”, die mit dem VH1-DSP-Prototypen verwandt ist, einem Protein von 20 kDa das den virulenten Faktor des Vaccinia-Virus bildet (Guan et al., 1991).
DSPs wirken im Lebenszyklus der Zellen auf die Signalwege der MAP-Kinasen auf die cycli- nabhängigen Kinasen (“cyclin-dependent kinases”, CDKs) welche entscheidende Funktionen bei der Zellproliferation spielen (Poon & Hunter, 1995; Schumacher et al., 2002).
1.3.2. Erstmalige Beschreibung der PTP-Enzymfamilie
Das erste beschriebene Mitglied de PTP-Familie war PTP1B (Tonks et al., 1988,a,b). Dieses Enzym wurde aus menschlichem Plazentagewebe als monomeres Polypeptids isoliert, das die kata- lytische Domäne des Enzyms umfasste (Tonks et al., 1988,a,b). Aufgrund der Aminosäurensequenz des gereinigten Proteins konnte eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit einem anderen Protein des Immunsystems – CD45 – festgestellt werden. Von diesem Lymphocyten-Marker, einem Transmemb- ran Protein, war bis dahin nur die Sequenz bekannt, nicht jedoch die Tatsache daß er auch eine PTP- katalytische Aktivität besitzt (Tonks et al., 1988,c; Thomas, 1989). Proteine aus der PTP-Familie konnten somit in sog. Rezeptor- und Non-Rezeptor-Formen unterteilt werden, wobei die Möglichkeit in Erwägung gezogen wurde, daß die R-PTPs in ihrer Aktivität auf physiologischem Wege durch extrazelluläre Liganden kontrolliert werden könnten.
Seit der Entdeckung der PTPs und der katalytischen Charakterisierung der PTP1B, wurden seine dreidimensionale Struktur, die strukturellen Grundlagen seiner katalytischen Funktion und der Vorgänge bei der physiologischen Regulation der Aktivität untersucht (Iversen et al., 2002; Tonks et al., 2003,b; Li et al., 2005). Auch als Angriffspunkte pharmazeutischer Therapiestrategien bei Stoff- wechselstörungen wie Diabetes und Übergewicht erlangten sie zumindest theoretische Bedeutung (Ukkola & Santaniemi, 2002; Dube & Tremblay, 2005). Einer der wichtigsten Fortschritte bei der Untersuchung von PTPs war die Entwicklung von Pharmaka welche die Aktivität der PTP1B regu- lieren (Cheon et al., 2004; Zhang, 2005; Zhang & Zhang, 2007). Mehrere der für PTP1B gefundenen Funktionsprinzipien, stellten sich als gültig für die PTPs heraus (Tonks, 2003,b).
1.3.3. Grundsätzliche Eigenschaften in Struktur und Funktion der PTPs
PTPs besitzen eine (bzw. zwei; R-PTPα und R-PTPε) katalytische Domäne und eine oder meh- rere regulierende Domänen auf einer einzigen Polypeptidkette. Dadurch verfügen sowohl intrazel- lulären als auch Transmembran-PTPs über eine Vielzahl von regulierenden Domänen, die in ihrer Primärstruktur Homologien mit charakteristischen Domänen anderer Proteinfamilien aufweisen.
Hierunter fallen z.B. (nach Tonks, 2006):
Domäne Non-Rezeptor PTPs * Transmembran-PTPs * PTP pseudo-phosphatase
Domäne
CD45 (RC); PTPµ (RM); κ (RK); λ (RU); δ (RD); γ (RG); LAR (RF);
PYPσ (RS); IA2 (RN)
Immunoglobulin-like PTPµ (RM); ρ (RT) ; δ (RD); LAR
(RF); PYPσ (RS)
Fibronectin type III-like CD45 (RC); PTPµ (RM); γ (RG); β
(RB); LAR (RF)
MAM (Meprin/A5/PTPµ) PTPµ (RM); κ (RK); ρ (RT); λ (RU)
Carbonic anhydrase-like PTPγ (RG); ζ (RZ1)
Cadherin-like PTPµ (RM); κ (RK)
RDGS-adhesion recognition motif (Arginin-Aspartat-
säure-Glycin-Serin-) IA2 (RN); IA2b (RN2)
KIM (Kinase-interaction
motif) HePTP (N7) PCPTP1 (RR); STEP (N5)
SH2 (Src-homology-2) PTP 1C (N6); 1D (N11) SEC14 (SEC14/cellular
retinaldehyde-binding protein-like) (Sec14 = phosphatidylinositol-transfer protein)
MEG2 (N9)
Prolin-rich BDP1 (N18); PTP-PEST
(N12); LYP (N22); HDP- TP (N23); PTPTYP (N20) FERM (Band 4.1, Ezrin,
Radixin, Moesin homology)- domain
PTPH1 (N3); MEG1 (N14); PTPD1 (N21);
PTPBAS (N13) PDZ (Akronym für synapse-
associated protein PSD-95/
SAP90, the septate junction protein Discs-large, und das tight junction protein ZO-1)- Domäne
PTPH1 (N3); MEG1 (N14); PTPBAS (N13)
Bro1 (ein Endosom-assozii- ertes Protein in Saccharomy-
ces cerevisiae) HDPTP (N23)
HD (Histidin Domäne) HDPTP (N23)
(*In Klammern und kursiv gesetzt: das Gensymbol jeder PTP nach Andersen et al., 2004)
Die intrazellulären oder Non-Rezeptor-PTPs besitzen sowohl eine katalytische als auch regu- lierende Domänen oder solche, die an subzellulären Strukturen andocken. Vierschiedene Studien zur Struktur, die im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Enzym-Kinetik der PTP-Aktivität durch-
geführt wurden, konnten die Funktion der Substraterkennung und der katalytischen Wirkung klären.
Die PTP-Katalyse läuft zweistufig ab. Der aktiven Zentrum der PTPs ist durch die Aminosäuren [I/V]
HCSxGxGR[S/T]G charakterisiert (Andersen et al., 2004). Dieses “signature motif” enthält einen unveränderlichen Cys-Rest (Cys215 bei der Human-PTP1B), der für die Katalyse relevant ist.
In der ersten Phase der Katalyse erfolgt eine nukleophile Bindung des Schwefelatoms aus dem Thiolat der Cys-Seitenkette an das proteingebundene Phosphat des Substrates. Dieser Vorgang ist mit der Protonierung der Tyrosylgruppe assoziiert, die im Substrat durch einen Teil der Seitenkette eines konservierten Säurerestes (Asp181 in Human-PTP1B) phosphoryliert wird. Diese Etappe fürt zur Bildung des Katalysemittlers Cysteinyl-Phosphat. In der zweiten Etappe koordiniert ein Glutaminrest (Gln262 in Human-PTP1B) ein Wassermolekül, während Asp181 (Human-PTP1B), zur Hydrolyse des Katalysemittlers führt, wodurch die Phosphatgruppe freigesetzt wird.
Die erste Ermittlung der dreidimensionalen Struktur einer PTP mittels Röntgenkristallographie gelang mit der katalytischen Domäne der PTP1B, mit einer Größe von 37 KDa (Barford et al., 1994).
Die Darstellung des Kristalls erfolgte unter Verwendung von Natriumwolframat als Analogstruktur des Phosphates. Die dreidimensionale Struktur zeigte eine einzige Domäne, bei der die Polypeptid- Kette in Form einer 8 α-Helix, 12 β−Strands und 10 stranded – mixed β−sheets organisiert war und deren globale Struktur in sich hochgradig spiralig verdreht war (Barford et al., 1994). Das Signa- turmotiv, welches den Phosphat-Erkennungssite auf dem Substratprotein bildet, ist direkt auf der
“cleft” des aktiven Zentrums positioniert. Die Seiten dieser Einbuchtung bestehen aus 3 Motiven:
der WPD-Loop enthält den unveränderlichen Asp-Rest (Asp181 in der Human-PTP1B, bei zwei Ka- talyse-Etappen beteiligt); der Q-Loop, welcher den Gln262-Rest enthält und der an der Hydrolyse des intermediären Cysteinyl-Phosphats beteiligt ist; der pTyr-Loop enthält einen Tyrosinrest (Tyr46 in der Human-PTP1B), welcher die Tiefe der Einbuchtung definiert und damit die Spezifität der PTP1B für die phosphorylierten Substrate bestimmt (in Ser/Thr-phosphorylierte Substrate reichen nicht an die Schlüsselstellen des Phosphat-sites im aktiven Zentrum der PTP1B heran; Barford et al., 1994).
Weiterführende Informationen wurden durch die Verwendung von inaktiven Mutanten erlangt, welche ihre Fähigkeit behalten, sich an Protein-Substrate anzulagern (Jia et al., 1995). Diese Expe- rimente benutzten u.a. ein Peptid, welches den Autophosphorylierungs-site des Epidermal Growth- Factor-Rezeptors repräsentiert. Dieses bildet einen stabilen Komplex mit einer katalytisch inaktiven Form der PTP1B, bei der das Cys215 mittels gezielter Mutagenese durch Ser ersetzt wurde (Cys215 bestimmt das Signaturmotiv des aktiven PTP-sites). Die inaktive Mutante der PTP1B behielt ihre Fä- higkeit zur Erkennung und spezifischen Bindung des Substrats ohne dieses zu dephosphorylieren (Jia et al., 1995). Die Bindung PTP mit einem Substrat eine umfangreiche Veränderung der dreidimensio- nalen Struktur impliziert, bei der sich der WPD-Loop dem phosphorylierten pTyr-Rest des Substrates annähert und sich um diesen herum räumlich annlagert.
Diese Strukturelle Änderung bewirkt, daß ein katalytischer Phe-Rest (Phe182 der Human-PTP1B) sich an die Phenyl-Seitenkette des phosphorylierten pTyr-Restes des Substrates anlagert, wodurch die
“Einbuchtung” des aktive Site physisch “geschlossen” wird. Es erfolgt dann eine räumliche Annäher- ung des invariablen Restes Asp181 (in der Human-PTP1B), der in der ersten katalytischen Etappe der Reaktion als Säure wirkt. So ist PTP1B ein Beispiel für ein Enzym des “Induced-Fit”-Typs, bei dem die Bindung eines Enzyms an das Substrat eine strukturelle Anpassung des aktiven Zentrums bewirkt
Eine “Substrate Trapping” Mutante des Enzyms wurde auch durch gezielte Mutagenese der in- varianten Reste Gln262 und/oder Asp181 (Humane-PTP1B) erzielt. Der Austausch von Gln262 gegen Ala (Q262A) ermöglichte die Untersuchung des Katalysemechanismus auf Kristallstrukturebene. Diese Studien ermöglichten die Identifizierung der katalytisch wirksamen Aminosäuren des aktiven Zen- trums der PTP1B und anderer PTPs und die Suche nach physiologischen Substrate von PTPs da diese Mutanten stabile Komplexe bilden, welche immunpräzipitierbar sind (Flint et al., 1997).
Durch “Substrate-Trapping” PTP-Mutanten (D/A oder C/S; unter anderen Methoden) nachge- wiesene potentielle PTP-Substrate:
Enzym Potentielles PTP-Substrat Referenz
PTP1B
EGFR Flint et al., 1997; Xie et al., 2002 PDGFR Haj et al., 2002; 2003
IR Wälchli et al., 2000
IRS-1/2 Elchebly et al., 1999; Goldstein et al., 2000 JAK2 Cheng et al., 2002; Gu et al., 2003
TYK2 Myers et al., 2001
p62DOK Dube et al., 2004
p21Bcr-Abl LaMontagne et al., 1998 STAT5a/b Aoki & Matsuda, 2000
p130cas Bjorge et al., 2000,b; Cheng et al., 2001
Tc-PTP
EGFR Tiganis et al., 1998
IR Wälchli et al., 2000; Galic et al., 2003 p52Shc Tiganis et al., 1998
PDGFR Persson et al., 2004 JAK1/JAK3 Simoncic et al., 2002
STAT5a/b Aoki & Matsuda, 2002
STAT1/STAT3 ten Hoeve et al., 2002; Yamamoto et al., 2002
Die Bindung an verschiedene intrazelluläre Lokalisierungen ist ein weiterer Kontrollmechanis- mus von PTPs. Darüber hinaus besitzen eine große Zahl von PTPs auch noch Splicing-Varianten ihrer mRNAs, die wiederum die Struktur der regulatorischen Domänen und die Intrazellulären Ankerpunk- te modifizieren, was die Vielseitigkeit der Funktionskontrolle nochmals erweitert. Beispiele hierfür sind Tc-PTP, CD45 und andere (Champion-Arnaud et al., 1991; Lorenzen et al., 1995; Trowbridge &
Thomas, 1994). Splicing-Varianten wurden bei der PTP1B ebenfalls beschrieben; die relative Häu- figkeit ihres Vorkommens wird durch Wachsumsfaktoren und/oder Insulin bestimmt (Shifrin & Neel, 1993; Sell & Reese, 1999).
1.3.4. PTP1B
PTP1B (Gen-Symbol: PTPN1) ist der Prototyp einer Hauptfamilie der cytoplasmatischen PTPs (Chernoff et al., 1990). PTP1B besteht aus 435 Aminosäuren, mit einem nativen Molekulargewicht von 50 kDa (Human-PTP1B). Das Enzym besitzt eine katalytische Domäne am N-Terminus, dem
zwei Prolin-rich Motive in Tandemposition folgen (Human-PTP1B), die eine Interaktion mit Protei- nen ermöglichen, welche eine SH3-Domäne aufweisen (Pawson, 2004; Zhou, 2006). Es handelt sich um eine PTP, die von höheren Organismen in großem Umfange exprimiert wird.
Von der PTP1B wurde ursprünglich als katalytische Domäne von 37 kDa gereinigt; nachträg- lich stellte sich heraus, daß dem Peptid, entsprechend der Nukleotidsequenz der cDNA, am CT-Ende 114 Aminosäuren fehlen. Diese fehlenden AS gehören zur Domäne, die das Protein an intrazellulären Membranen verschiedener Organellen spezifisch verankert (Brown-Shimer et al., 1990; Guan et al., 1990). Die 35 terminalen AS-Reste der humanen-PTP1B sind überwiegend hydrophob und verankern das Enzym auf der cytoplasmatische Seite der Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER) (Frangioni et al., 1992). Dieses Strukturmotiv wurde als “zip-code” der PTP bezeichnet (Mauro &
Dixon, 1994). Nicht nur durch “Targeting” ihres CT-Endes wird die biologische Aktivität von PTP1B kontrolliert: dieses Segment der Polypeptid-Kette reguliert auch seine katalytischen Eigenschaften.
Es gibt Hinweise, daß die katalytische Wirkung der PTP1B durch Proteolyse in CT kontrolliert wird (Frangioni et al., 1993).
In einem Protease-abhängigen Vorgang werden 75 Aminosäuren des CT-Endes der humanen PTP1B (worin auch das Motiv der ER-Bindung enthalten ist) abgeschnitten (Frangioni et al., 1993).
Diese Proteolyse geht mit einer Erhöhung der katalytischen Kapazität des PTP1B einher, was na- helegt daß das CT-Ende Katalyse-repressive Eigenschaften besitzt (Frangioni et al., 1993; Gulati et al., 2004). Gegenwärtige Untersuchungen beschäftigen sich auch mit der Frage, ob Anomalien der proteolytischen Kontrolle der PTP1B bei der Ätiologie pathophysiologischer Vorgänge beteiligt sein könnten (Kuchay et al., 2007).
PTP1B war eine der ersten PTPs, bei denen die Regulation mittels Phosporylierung in vivo beschrieben wurde. Das Enzym weist verschiedene durch Ser/Thr-Kinasen phosphorylierbare Sites an seinem regulierenden CT-Ende auf, wie z.B. Ser378 , das durch PKC phosphoryliert wird und die Reste Ser352 und Ser386 (menschliches Enzym), deren Phosphorylierbarkeit vom Reproduktionszyklus der Zelle abhängt (Flint et al., 1993). Diese PTP1B-Phosphorylierungen werden mit Änderungen der Enzymaktivität in Verbindung gebracht, wenn auch die physiologischen Funktionen dieser Regulati- on durch Phosphorylierung noch nicht umfassend verstanden werden (Flint et al., 1993; Ravichand- ran et al., 2001; Tao et al., 2001).
Die Phosphorylierung durch Ser/Thr-Kinasen wurde als Regulationsmechanismus der Aktivität verschiedener PTPs beschrieben (sowohl stimulierend wie inhibierend). Dies würde bedeuten, daß hier eine Art biochemischer “cross-talk” stattfindet, wenn man davon ausgeht, daß die Aktivierung der PTP-phosphorylierenden Ser/Thr-Kinasen mittels einer Aktivitätskontrolle verschiedener PTPs ein Regelmechanismus für den Grad der Phosphorylierung von Tyr-Resten auf den Zielproteinen verschiedener Signalwege ist.
Auch die Phosphorylierung von Tyr in verschiedenen PTPs wie PTP1B konnte nachgewiesen werden, wobei allerdings die physiologische Bedeutung noch unklar ist. Insulin stimuliert die Phos- phorylierung der PTP1B an den Tyr66-, Tyr152- und Tyr153-Resten (Bandyopadhyay et al., 1997), was deren katalytische Phosphatase-Aktivität erhöht (Dadke et al., 2001). Dieser Vorgang müßte ein negatives feedback auf den Insulin-Signalweg (down-regulation) haben.
PTP1B ist ein wichtiger Faktor bei der Regulierung des Insulin-Rezeptors (IR) und ein physiologi- scher Regulator der Glucose-Homöostase (Elchebly et al., 1999; Goldstein, 2002; Johnson et al., 2002;
Dube & Tremblay, 2005). Antisense Oligonukleotide welche die Expression von PTP1B bei männlichen und weiblichen Ratten supprimieren, können die Insulinsensibilität erhöhen und die Plasma-Glucosewerte senken (Rondinone et al., 2002; Zinker et al., 2002; Gum et al., 2003). Obwohl die Dephosphorylierung von IR (und möglicherweise IRS-1; Goldstein et al., 2000; Johnson et al., 2002) durch PTP1B evident ist, sind die genauen Mechanismen dieses Prozesses und die hierbei aktivierten Signalwege sowie die mögliche Teilnahme weiterer PTPs bisher noch nicht vollständig abgeklärt (Dube & Tremblay, 2005).
1.3.5. Tc-PTP
Ursprünglich wurde Tc-PTP (Gen-Symbol: PTPN2) aus einer cDNA-Library von peripheren Hu- man-T-Zellen kloniert (Cool et al., 1989; 1990; Ibarra-Sanchez et al., 2000). Tc-PTP ist eine ubiquitäre Tyr-spezifische, “lösliche” Protein-Phosphatase, bei der die katalytische Domäne sowohl in ihrer Primär- struktur (72 % Identität; AS-Reste 43 – 288 der Tc-PTP-Humansequenz), als auch in seiner Tertiärstruktur der PTP1B ähnelt (Andersen et al., 2001; Iversen et al., 2002). Tc-PTP kann als eine Splicing-Variante von 48 kDa auftreten, die intrazellulär mittels eines hydrophoben Endes seiner CT an die ER-Membran gebun- den ist; außerdem existiert eine 45 kDa-Form (Tc45) ohne dieses hydrophobe Segment, die sich mittels eines zweiteiligen nukleären Lokalisationssignals (nuclear localization signal, NLS) reversibel im Zellkern ablagern kann (Champion-Arnaud et al., 1991; Tillmann et al., 1994; Lorenzen et al., 1995). Die auf ihrer Regulierenden Domäne liegende NLS ermöglicht der Tc45, die Kern-Membran zu passieren und sich so, je nach den physioligischen Erfordernissen, sowohl innerhalb als auch außerhalb des Nucleus aufzuhalten (Tiganis et al., 1997); dies wird durch spezifische Stimuli gesteuert. Auf diesem Wege hat Tc45 sowohl Zugang zu cytoplasmatischen wie nukleären Substraten (Tiganis et al., 1998; Ibarra-Sanchez et al., 2000;
Lam et al., 2001).
Andere Beobachtungen zeigen eine extranukleäre Beteiligung der Tc45 bei der Signaltransduktion.
Durch die Verwendung einer “wild-type” und der inaktiven Mutante (D182A) von Tc45 wurde beobachtet, daß die Tc45-PTP hemmend bei der durch EGF/Integrin Aktivierung von Phosphatidylinositol-3-Kinase/
Akt-Weg, wirkt - einem Signalweg, über den Prozesse der Zellproliferation, Migration und der allgemeinen Zellvitalität laufen (Tiganis et al., 1999). Außerdem wurde festgestellt, daß Tc45 durch Insulin-Rezeptor ak- tivierte Signalwege auf der Zelloberfläche inhibiert (Lam et al., 2001). Bei der Cytoplasma-Kern Transloka- tion der Tc45 (nuclear import) (Tiganis et al., 1997) nimmt man die Beteiligung von Importin-1, gemeinsam mit einem noch nicht identifizierten Protein von 116 kDa an (Tiganis et al., 1997). Der Mechanismus des Austritts aus dem Kern ist noch unbekannt.
Mit Hilfe der ”substrate trapping” Mutante D182A der humanen Tc-PTP; Tiganis et al., 1998) wur- de ein stabiler Komplex zwischen Tc45 und dem phosphorylierten EGF-Rezeptor gefunden. Ebenso wie PTP1B erkennt auch Tc-PTP den IR als Substrat, und die “downstream”-Signalwege sind in Zellen mit Tc-PTP-Mangel aktiviert (Galic et al., 2003). Auf Insulin antwortete die “substrate-trapping” Mutante D182A der Human-Tc-PTP mit der Bildung eines stabilen Komplexes mit an Tyr-phosphoryliertem IR; in Tc-PTP–/– Fibroblasten von Ratten-Embryos waren sowohl die Tyr-Phosphorylierung an IR als auch der Signalweg über PI-3-K/Akt erhöht (Tiganis et al., 1999). Diese Studien zeigen, daß Tc-PTP eine zentrale Rolle bei der in vivo – Regulierung des IR belegt, wenn auch weiterhin noch Unklarheit bezüglich der kombinierten Beteiligung der PTPs 1B und Tc- (u.a. PTPs) bei der Kontrolle der durch Insulin angeregten Signalwege besteht (Galic et al., 2003).
Es wurde beobachtet, daß die Tc-PTP in Abhängikeit zum Zellzyklus an Ser-304 phosphory- liert wird (Bukczynska et al., 2004). Diese Phosphorylierung beeinfluß aber nicht die katalytische Aktivität, die Stabilität des Proteins oder dessen subzelluläre Lokalisierung, allerdings besteht die Möglichkeit, daß die Tc-PTP nur kurzzeitig Kontrollereignissen ausgesetzt ist, die gemeinsam mit anderen externen Stimuli ausgelöst werden.
1.3.6. PTP1C
PTP1C (auch: SHP1, HCP, Hcph, SH-PTP1; Gen-Symbol: PTPN6) ist eine für hämatopoetische Gewebe spezifische intrazelluläre Phosphatase, deren Struktur durch das Vorliegen von zwei SH2- Domänen in Tandemposition charaktisiert ist, welche N-terminal zur katalytischen Domäne gelegen sind (Neel, 1997). Die Bedeutung der PTP1C bei der Regulierung der Signalwege in T-Lymphocyten wurde mit Hilfe des “Motheaten” Defekts in Ratten aufgeklärt, denen PTP1C Aktivität gänzlich fehlt (Shultz et al., 1993). Nach einem cross-linking der TCR in Gegenwart von IL-2 (Lorenz et al., 1996) trat bei diesen Versuchstieren eine Hyperproliferation von Thymocyten auf. Eine der biochemischen Charakteristika der Thymocyten in Ratten mit PTP1C- Defizienz ist das Auftreten zahlreicher an Tyr phosphorylierter Proteine, wie z.B. TCR ζ, CD3 ε, ZAP-70, LAT und Vav (Shultz et al., 1993).
Diese Hyperphosphorylierung ist eine Folge der konstitutiven Aktivierung der Familien von Src- und Syk-Kinasen - letztlich ein direktes Resultat der Abwesenheit von PTP1C; welche die in diesen Ki- nasen vorhandenen regulierenden Tyr-Reste dephosphoryliert (Pani et al., 1996; Lorenz et al., 1996;
Brockdorff et al., 1999). Dabei assoziiert die SH2-PTP sowohl mit dem TCR-Komplex als auch mit PTK ZAP-70 (Pani et al., 1996; Plas et al., 1996). Es ist ferner zu vermuten, daß PTP1C die Aktivität dieser Kinasen mittels einer strukturellen Assoziierung mit hemmenden Rezeptoren beeinflußt (Veil- lette et al., 2002). Obwohl die ITAMs des TCR bei PTP1C-defizienten Ratten hyperphosphoryliert sind, finden sich in der Literatur verschiedene Hinweise darauf, daß PTP1C die ITAMs der TCR oder auch der BCR nicht auf direktem Wege dephosphoryliert (Brockdorff et al., 1999; Guntermann &
Alexander, 2002).
Einige Literaturstellen weisen auch darauf hin, daß PTP1C mit der PTK Bcr-Abl einen Kom- plex eingeht (Tauchi et al., 1997; Liedtke et al., 1998). PTP1C ist ein Enzym, das als “negativer Re- gulator” auf verschiedene hämatopoietische Signalwege wirkt (Tonks & Neel, 1996; Neel & Tonks, 1997), Wege, die durch Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, Cytokine und Antigene induziert werden.
So wurde auch eine Einwirkung der PTP1C auf die Pathogenese der chronischen myelogenen Leukä- mie (CML) beim Menschen, nachgewiesen (Delibrias et al., 1997; Douziech et al., 1999; Uesugi et al., 1999).
1.3.7. PTP1D
Wie PTP1C, so enthält auch die PTP1D (auch: SHP2, Syp, PTP2C, SH-PTP2; Gen-Symbol:
PTPN11) in ihrer Struktur zwei SH2-Domänen in Tandem-Position N-terminal vom katalytischen Zentrum. PTP1D gewann kürzlich großes Interesse als das erste Proto-Onkogen, das eine Tyrosin Phosphatase kodiert (Chan & Feng, 2007), nachdem somatische Mutationen des Typs “gain-of-func- tion” im Human-PTPN11-Gen bei verschiedenen Leukämietypen entdeckt worden waren: Dies löst eine “anormale” Hyperaktivierung des Ras-ERK- Signalweges aus (Bentires-Alj et al., 2004; Chan
& Feng, 2007).
Die Vorkommen von PTP1D ist ubiquitär; das Protein weist in seiner Nukleotidsequenz Homo- logien mit PTP1C auf. Im Gegensatz zu dieser wird jedoch PTP1D als ein kritischer positiver Regu- lator von Signalwegen angesehen, die durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren aktiviert werden (Huyer
& Alexander, 1999).
PTP1D ist eine Phosphatase, die als positiver Effektor bei Funktionen des Integrins beschrie- ben wurde. Es wurde hierbei eine PTP1D–Anreicherung in der Plasmamembran beobachtet, wo es an die phosphorylierten Proteine SHPS-1/SIRP-1 ankoppelt (Tsuda et al., 1998). Dies bedeutet, daß Tyr-Phosphorylierungs-Vorgänge auch “upstream” an den durch PTP1D regulierten Punkten des Integrin-Signalweges erfolgten. Parallele Hinweise in dieser Richtung sind Beobachtungen an
“loss-of-function”-Mutationen für PTP1D in Embryonalzellen, oder embryonale Mutanten mit einer dominant negativen PTP1D, welche außer einer Abnahme in der durch Integrin induzierten MAPK- Aktivierung auch noch veränderte chemotaktische Antworten aufweisen (Tsuda et al., 1998; Yu et al., 1998; Mañes et al., 1999; Oh et al., 1999). Es wurden aber auch Studien veröffentlicht, die zeigen, daß PTP1D-mutierte Zellen ihre Zelladhäsion mittels verschiedener Komponenten der ECM erhöhen (Inagaki et al., 2000).
Bisher besteht noch keine Klarheit darüber, wie PTP1D die Funktion des Integrins reguliert.
Einige Untersuchungen lassen vermuten, daß PTP1D über den Integrin-Signalweg den Grad der Phosphorylierung von FAK reguliert. Zellen mit katalytisch defizienter PTP1D zeigen sowohl eine Hyperphosphorylierung des Proteins FAK (Yu et al., 1998; Mañes et al., 1999), als auch eine Zu- nahme von Aktin-Fibrillenbündeln (stress-fibers) und von fokalen Kontakten (Yu et al., 1998; Inagaki et al., 2000; Saxton et al., 2000). Neben PTP1C, wurde auch die Fähigkeit von PTP1D zur Dephos- phorylierung von TCR ζ beschrieben (Lee et al., 1998). Bei der Kontrolle der Immunantwort von Lymphocyten ist die Anwesenheit von PTP1D für die durch IL-2 induzierte Aktivierung der MAP- Kinasen erforderlich, außerdem bei der ”early gene activation” nach der Interaktion von Cytokinen mit Cytokin-Rezeptoren (Gu et al., 1998).
1.3.8. CD45
Bei CD45 (Gen-Symbol: PTPRC) handelt es sich um eine Transmembran-PTP mit 2 intrazellulären PTPase- Domänen. CD45 wurde als erste ”Rezeptor-Phosphatase” beschrieben, weshalb man sie als deren Prototyp betrachtet. Untersuchungen an mutierten Zelllinien, wie sie z.B. bei Menschen mit CD45-Defi- zienz vorliegen, zeigten von Anfang an die große Bedeutung dieser Transmembran-PTP für die Signaltrans- duktion des Antigenrezeptors bei der Entwicklung und Reifung von Lymphocyten (Pingel & Thomas, 1989;
Uemura et al., 1996; Trowbridge & Thomas, 1994). Man weiß heute, daß CD45 auch Signale moduliert, die von Integrin- und Cytokinrezeptoren ausgehen (Yamada et al., 2002). Das Protein wird sowohl in seiner Genexpression als auch beim alternativen Splicing durch unterschiedliche Signaltransduktionswege regu- liert, was einerseits mit der Gegenwart verschiedener Isoformen des Proteins, andererseits mit einer Regu- lierung der Phosphatase-Aktivität, erklärt werden kann (Huntington & Tarlinton, 2004). Seine katalytische Aktivität wird teilweise durch extrazelluläre Dimerisation kontrolliert, was zu einer Inhibierung der PTP- Aktivität führt (Weiss & Schlessinger, 1998). Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden Funktionsmodelle für CD45 vorgeschlagen, bei denen das Enzym die Zellantworten auf externe Stimuli beeinflußt. Änderungen dieser Funktion könnten zu Autoimmunreaktionen, Immundefizienz und damit zu pathologischen Situatio- nen führen. Aus diesem Grunde wurde auch vorgeschlagen, die Modulation von CD45 für therapeutische Ansätze in der Humanmedizin zu erwägen (Hamaguchi et al., 2001; Penninger et al., 2001).
CD45 ist eines der häufigsten Glykoproteine auf der Oberfläche von Zellen des Immunsystems und kann bis zu 10% der Fläche der Plasmamembran abdecken (Thomas, 1989; Trowbridge & Tho- mas, 1994). Der cytoplasmatische Teil des Proteins zeigt bei den untersuchten Spezies eine Homologie von etwa 95%, der extrazelluläre Teil kommt immerhin noch auf 35% Homologie (Thomas, 1989).
Aufgrund eines alternativen Splicings von 3 Exonen (A, B, C) auf der extrazellulären Domäne, liegt CD45 in multiplen Isoformen vor. Die größte dieser drei Formen ist das RABC (alle drei Exone sind vorhanden), die kleinste RO (3 fehlende Exone). Die drei Exone dieses Proteins kodieren verschie- dene sites der O-gekoppelten Glykosylierung und zeigen verschiedene Grade von Modifikationen durch Sialylsäure. So ergeben sich verschiedene Isoformen, mit Molekülgrößen von 180 kDa (RO) bis 240 kDa (RABC), mit deutlichen Variationen in Größe, Form und Negativladung (extrazellulär).
Der Rest der extrazellulären Domäne ist hochgradig N-glykosyliert und enthält eine Region, in der sich Cys, gefolgt von 3 Fibronectin Typ III-repeats angereichert ist (Okumura et al., 1996).
CD45 besitzt eine einzige Transmembran-Domäne sowie einen großen cytoplasmatischen Ab- schnitt, in dem zwei homolog duplizierte Domänen für PTPase - D1 und D2 - in Tandemstellung angeordnet sind. Nur das der Plasmamembran nächstliegende Fragment (D1) ist katalytisch aktiv; es wird für die Erschließung des Signalweges via TCR auf einer CD45-defizienten Zelllinie benötigt (De- sai et al., 1994). Die Funktion der Domäne D2 ist nicht geklärt. D2 könnte die CD45-Aktivität mittels eines Inserts von 19 Aminosäuren regulieren, in denen Ser- und saure Aminosäurereste angereichert sind. D2 weist einen sehr hohen Konservierungsgrad in humaner, Ratten- und Maus-CD45 auf. Die Domäne ist physisch assoziiert mit (und wird phosphoryliert durch) Casein Kinase II (CK2) (Wang et al., 1999; Greer et al., 2001). Außerdem weisen Molekülmodelle darauf hin, daß die Juxtamembran- Region eine keilförmige Struktur mit der D1- Domäne bildet. Der Glykosylierungsmuster der CD45 wird also nicht nur durch den differenzierten Einsatz von alternativen Exonen bestimmt, sondern auch noch vom Zelltyp, seinem Entwicklungsstadium und der Zellaktivierung, was eine funktionelle Relevanz nahelegt (Thomas, 1989). Ein Beispiel hierfür ist die α-2,6-Sialylsäure die in T-Zell-CD45 N-verlinkt vorliegt und mit CD22 (einem Lektin der an Sialylsäure bindet, und das in B-Zellen vor- kommt) interagiert und so zu Vorgängen der T-B Zellbindung beiträgt (Powell et al., 1993). CD45 weist auch Affinitäten zu spezifischen Isoformen des Lektins Glucosidase II des endoplasmatischen Retikulums auf (Baldwin et al., 2000). Diese Assoziierung wird durch den Grad der Zellentwicklung reguliert und kann die in CD45 enthaltenen Kohlenhydrate modifizieren, was wiederum potentiellen Einfluß auf die Entwicklung von Thymocyten haben könnte (Baldwin & Ostergaard, 2001).
1.3.9. R-PTPα
Bei der R-PTPα (Gen-Symbol: PTPRA) handelt es sich um eine Transmembran-PTP mit einer kurzen extrazellulären Domäne, die an N- und O-Stellen hoch glykosyliert ist, und zwei PTPase- Domänen in Tandemposition (D1 und D2) besitzt, wie es für die Mehrzahl der receptor-like PTPs charakteristisch ist (Matthews et al., 1990; Sap et al., 1990; Daum et al., 1994). Auf der extrazellulä- ren Domäne liegen Splicing-Varianten von 123 oder 132 AS-Resten vor. Die Expression von R-PTPα ist bei Säugern in großem Umfang gegeben (Harder et al., 1998); es sind verschiedene potentiell physiologische Substrate bekannt. Auch wurde beschrieben, daß die Expression von R-PTPα den Signalweg des Insulin-Rezeptors (IR) beeinflußt (Moller et al., 1995). Andere Untersuchungen haben gezeigt, daß R-PTPα mit der Insulin-induzierten Genexpression von Prolactin und mit der Transloka- tion von GLUT4 in Richtung der Plasmamembran interferiert (Cong et al., 1999). Es wurde gezeigt,
daß R-PTPα direkt den IR dephosphoryliert, was die insulinaktivierten Signalwege mediieren würde (Buist et al., 2000).
R-PTPα aktiviert Kinasen der Src-Familie (SFKs; Harder et al., 1998; Ponniah et al., 1999; Su et al., 1999). Dies fördert die Integrin-stimulierte early-Autophosphorylierung der Focal Adhesion- Kinase (FAK). Es wurde berichtet, daß die Stimulierung durch Integrin eine Phosphorylierung der R-PTPα in Tyr auslöst. Es wurde beobachtet, daß R-PTPα dephosphoryliert wird, wenn in vitro- Fibroblasten vom Substrat abgelöst werden; eine Tyr-Rephosphorylierung von R-PTPα tritt auf, wenn die Zellen auf Fibronectin-beschichtete Platten transferiert werden (Fibronectin ist ein Inte- grin- Ligand). Die Phosphorylierung von R-PTPα ereignet sich am Tyr789 und erfordert sowohl die Gegenwart von SFKs (Src oder Fyn/Yes), FAK als auch ein intaktes Cytoskelett (Chen et al., 2006).
Dies weist darauf hin, daß R-PTPα SFKs aktiviert und daß der resultierende Komplex (aktivierte SFK/FAK Tyr-Kinase) seinerseits R-PTPα phosphoryliert. Diese Studien wurden mit der Produktion von nicht R-PTPα-phosphorylierbaren Mutanten verifiziert (Y789F) (Chen et al., 2006). Daraufhin wurde vorgeschlagen, R-PTPα auf Integrin-Signalwegen (die durch SFKs und FAK mediiert werden) sowohl upstream von FAK (Zeng et al., 2003) als auch “spätere” Events auf dem Signalweg (down- stream) zu beobachten (Formation von focal adhesion-Punkten des Cytoskeletts) (Chen et al., 2006).
Bei der Beobachtung dieser Ereignisse zeigte sich, daß die Phosphorylierung der R-PTPα en Tyr789 ein essentieller Prozeß ist (Zheng & Shalloway, 2001).
Andere Studien legen nahe, die Rolle der R-PTPα bei der Entstehung von onkologischen Abläufen in Betracht zu ziehen (Ardini et al., 2000; Bjorge et al., 2000,a; Zheng et al., 2000). Man hat festgestellt, daß sich R-PTPα mittels eines Phosphorylierungs-sites in Tyr an seinem C-Terminal an das Adaptor-Protein Grb2, einen Ras-Regulator, anlagert (Su et al., 1996). Bei Patienten mit fort- geschrittenen Colon-Carcinom wurde eine erhöhte R-PTPα − Expression beobachtet (Tabiti et al., 1995). R-PTPε (eng mit R-PTPα verwandt) ist bei der Pathogenese des Mamma-Carcinoms in Rat- ten beteiligt (Elson, 1999). Zudem ist R-PTPα ein wichtiger Aktivitätsregulator von SFK, indem es die Dephosphorylierung des negativ regulierenden Sites Y530 am äußeren Ende des CT von c-Src kontrolliert (Bjorge et al., 2000,a; Mustelin & Hunter, 2002). Zellen mit einem Mangel an R-PTPα weisen eine reduzierte Fyn- und c-Scr-Kinasen-Aktivität auf, außerdem manifestieren sie funktionale Defekte, ähnlich denen bei Zellen mit c-Src-Mangel (Ponniah et al., 1999). Gleichzeitig erzeugt eine erhöhte R-PTPα Expression eine Zunahme der c-Src-Aktivität (Zheng et al., 2000). Die Aktivierung dieser Kinase kann regelmäßig in Tumorgewebe von Mamma- und Coloncarcinomen beobachtet wer- den (Cartwright et al., 1990; Bjorge et al., 2000,a), was ein möglicher Hinweis auf die Potenzierung des signaling über die ErbB-Familie ist (Tice et al., 1999). Daher wurde vermutet, daß R-PTPα ein Promotor für die Transformation oder Progression von gesunden Zellen zu Neoplasien sein könnte (Bjorge et al., 2000,a; Mustelin & Hunter, 2002).
1.4. Tyr-Phosphorylierung während der Lymphocytenaktivierung
Nach Bindung von Antigenen an Immunzellen (z.B. T-Lymphocyten; Sefton & Campbell, 1991) werden an der Innenseite der Zellmembran Signalwege aktiviert, die auf den Zellkern einwirken. Die Phosphorylierung in Tyr ist ein Schlüsselprozeß bei diesen Signaltransduktionsereignissen.
Die Aktivierung von T-Lymphocyten wird durch den T-Zell Antigen-Rezeptor (TCR) kontrol- liert, und zwar in Kombination mit zusätzlichen Signalen, die von Helfermolekülen, welche ihrerseits
auf den APC-Zellen (antigen presenting cells) sitzen, ausgelöst werden. Bei frühzeitigen Events der Aktivierung von Lymphocyten hat man definiert, daß Proteine verschiedener molekulärer Größe in Tyr Phosphoryliert werden (Weiss & Littman, 1994), welche auf der cytoplasmatischen Seite der Zell- membran von T-Zellen auf den Interzellulären Verbindungszonen mit den APC-Zellen liegen (Arroyo et al., 1994). Ebenso wurde festgelegt, daß die Aktivierung des Transmembran-Enzyms CD45 durch gegen seine extrazellulären Domains gerichtete Antikörper Phosphorylierungen in Tyr revertiert (Ar- royo et al., 1994), indem sie, als einen von mehreren Signaling-Events in der Immunantwort, die Integrin-induzierte zelluläre Adhäsion inhibiert.
PTKs des cytoplasmatischen Typs (aus der Familie der Src, die in T-Zellen ausgedrückt wer- den, wie Lck und Fyn) wirken als Auslöser der Initiierung einer Signaltransduktion über TCR. Lck spielt eine wichtige Rolle bei der Phosphorylierung in Tyr der TCR-ζ-Kette (Qian et al., 1997). Die Kinase Fyn phosphoryliert in Tyr die FAK-PTK Pyk2 in frühzeitigen Events nach Aktivierung der TCR. Mutierte T-Zell Linien, bei denen inaktive Varianten von Lck vorliegen, antworten mit einer begrenzten Phosphorylierung von Proteinen in Tyr nach einer TCR-Stimulation, wobei sie allerdings nur eine sehr niedrige Mobilisierung der intrazellulären Ca2+ und eine reduzierte Zellproliferation erzeugen (Straus & Weiss, 1992). Lck phosphoryliert auch die für das TCR-Signaling entscheiden- de Kinase ZAP-70 (PTK der Syk-Familie; Wange & Samelson, 1996). Die Kinasen Lck und Fyn phosphorylieren in frühen Events der Anbindung an TCR die in den ζ-Ketten und den CD3 ε, δ und γ-Untereinheiten des in TCR enthaltenen ITAM-motifs (Billadeau & Leibson, 2002). Die in Tyr phos- phorylierten ITAMs binden und aktivieren ZAP-70, ein Vorgang, der zusammen mit der Aktivierung der Src-Kinasen zu einer Aktivierung von PTKs der Tec, Itk und Txk-Familien führt. Diese suk- zessive Aktivitätszunahme mehrerer Tyr-Proteinkinasen führt zu einer Phosphorylierung in Tyr der unterschiedlichsten Adapterproteine und Signaltransduktionsenzyme (z.B. PI-3-K). Diese wiederum kanalisieren downstream Signale zur Lymphocytenaktivierung, Gentranskription, Reorganisation des Cytoskeletts, Cytokinproduktion und Zellproliferation - charakteristische Vorgänge während einer Immunantwort (Kane et al., 2000).
Es konnte bereits frühzeitig festgelegt werden, daß in all diesen Events eine aktive Beteiligung der Proteinphosphorylierung in Tyr als Mechanismus einer posttraduktionalen Modifizierung vor- liegt, die sowohl positiv als auch negativ durch verschiedene PTPs kontrolliert wird (Mustelin et al., 2005). Die Bindung der verschiedenen Cytokine an jeweils passende Cytokinrezeptoren des Typs I und II (Leonard, 1996) erzeugt ein breites Spektrum von Effekten bei der Aktivierung von Immun- zellen.
Cytokinrezeptoren selbst besitzen keine eigene katalytische Aktivität (O’Shea, 1997), im Ge- gensatz zu Transmembranrezeptoren, die Ser/Thr- bzw. Tyr-Kinasen sind. Cytokinrezeptoren sind funktionell mit Kinasen der Jak-Familie assoziiert. Diese PTKs zeichnen sich durch ein erhöhtes Molekulargewicht und strukturelle Einzigartigkeit aus (O’Shea, 1997); sie triggern den Signalweg der Jak/STATs (Review: Shuai & Liu, 2003). Die Cytokin-Rezeptorbindung induziert sowohl eine Homo- als auch Heterodimerisierung der Rezeptoren, was zu einer Assoziierung der Jaks mit intra- zellulären Domänen der Rezeptoren führt, ein Vorgang, der die an Tyr-Transphosphorylierung der Jaks untereinander aktiviert. Wie auch bei anderen Tyr-Kinasen, sind die Phosphorylierungen in den aktivierenden Loops der katalytischen Kinase-Domains auslösende Ereignisse für ihre Aktivierung.
Die aktivierten Jaks phosphorylieren die Cytokin-Rezeptoren in Domains, die sich dadurch in “do-
STAT-Familie der Fall ist (O’Shea et al., 2002). Diese Bindung der STATs an Cytokinrezeptoren führt zu einer Phosphorylierung in Tyr dieser STATs (am C-Terminal), ein Site, der so auch von der SH2-Domain eines zweiten STAT-Moleküls erkannt wird, wodurch STATs dimerisieren. Diese durch Phosphorylierung in Tyr aktivierten Transkriptionsfaktoren, nachdem sie selbst Homo- und Hetero- dimere gebildet haben, translocieren nun zum Zellkern und koppeln sich gezielt an DNA-Sequenzen, wodurch die Expression bestimmter Gene kontrolliert wird (O’Shea et al., 2002). Außer als Tran- skriptionsfaktoren funktionieren STATs noch als Adaptermoleküle bei der Koppelung von Rezepto- ren an andere Signaltransduktionswege (Shuai & Liu, 2003). STATs haben neben ihrer SH2-Domäne auch noch SH3-Domänen.
Frühzeitige Phosphorylierungs-Events in Tyr lösen eine aktivierende Signaltransduktion in T- Zellen aus (Hardwick & Sefton, 1995). Eine Stimulierung von Immunzellen über einen längeren Zeit- raum, kann zu malignen Proliferationen führen. Deshalb erfolgt eine “Feinregulierung” der Homöos- tase der Phosphorylierung in Tyr durch verschiedene Mitglieder der PTP-Familie in T-Lymphocyten und so eine generelle Regulierung des durch die PTKs ausgelösten Signalings (June et al., 1990).
Frühzeitig wurde festgelegt, daß die Behandlung von T-Lymphocyten mit H2O2 ähnliche intrazellu- läre Effekte hervorruft wie die Verbindung extrazellulärer Liganden mit ihren entsprechenden Trans- membran-Rezeptoren. Eine H2O2-Exposition von T-Lymphocyten erzeugt schnell (schon Sekunden nach der Behandlung) eine massive Phosphorylierung in Tyr bei den intrazellulären Proteinen. Man hat festgestellt, daß einige spezifische Tyr-Kinasen der Lymphocyten, wie z.B. p56lck durch H2O2 als Resultat einer Autophosphorylierung katalytisch aktiviert werden (durch die Phosphorylierung ihrer Tyr-394 in Human-Lck; Hardwick & Sefton, 1995).
1.5. Beteiligung von PTPs an der Aktivierung von T-Lymphocyten mittels TCR im Immunsystem Der T-Zell-Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen des Immunsystems gehört zu einem Komplex von Multi-Untereinheiten, bestehend aus αβ Untereinheiten (ligand-binding) in nicht-kovalenter Asso- ziierung mit den intrazellulären Signalkomponenten ΤCR ζ, CD3 γ, δ, ε (Ashwell & Klausner, 1990).
Das Struktur-Funktionsmodell der TCR in der Plasmamembran entspricht dem Komplex (αβγεδεζζ)
(Review: Call & Wucherpfennig, 2005). Das Heterodimer αβ erkennt speziell kleine Peptide, die in das Molekül des MHC eingebetten sind, welcher in einigen Zelltypen des Immunsystems vorliegt (Kaufman et al., 1984; Henrickson & von Andrian, 2007). Der TCR-Komplex hat die bemerkenswerte Eigenschaft, zwischen sehr geringen Aminosäure-Variationen im Antigen-Peptid differenzieren zu können, was zu außerordentlich vielfältigen Zellantworten führen kann (Jameson & Bevan, 1995). Diese Fähigkeit des TCR, Variationen des immunogenen Peptidkomplexes/MHC unterscheiden zu können, äußert sich in verschiedenen intrazellulären Signalen mittels der Untereinheiten TCR ζ und CD3 γ, δ und ε. Alle diese Untereinheiten bestehen aus kurzen extrazellulären Sequenzen, einer Transmembran-Region und cyto- plasmatischen Domänen, bei denen eine oder mehrere Kopien eines Signalmotivs erhalten ist, das als ITAM bezeichnet wird (Reth, 1989). Diese ITAM-Motive sind durch zwei Tyr-Reste charakterisiert, die selektiv in einem bestimmten Abstand angeordnet sind; jeder der Reste ist von konservierten Aminosäu- ren umgeben; voneinander sind sie durch 6-8 Aminosäuren getrennt (Weiss, 1993). Die Funktion dieser ITAM bei der Immunantwort wird mittels der Phosphorylierung der beiden Tyr-Reste durch PTKs der Src-Familie ausgelöst (Review: Mustelin et al., 2004). Die ITAM sind nicht TCR-exklusiv, sondern liegen außerdem in anderen Zellstrukturen des Immunsystems vor, wie z.B. im B-Zell-Rezeptor (BCR) und in den Zell-Rezeptoren einiger Unterpopulationen Natural-Killerzellen (NK) (Weiss, 1993).
