Versuche zur Extraktion von PTPs aus Lymphocyten

a) Gewinnung der „löslichen“ und „unlöslichen“ Proteinfraktionen aus Lymphocyten:

Die Zellen wurden in einem manuellen Glas/Teflon – Homogenisator (Wheaton, 2 ml) im Eis-bad während 30-60 sec vollständig homogenisiert. Die spezifischen Protokolle für Homogenisierung und Proteinextraktion werden in den Abbildungen des Kapitels 3 gesondert beschrieben.

Alle abzentrifugierten Zell-Pellets wurden in Puffer A homogenisiert. Das homogenisierte Ma-teriel wurde bei 15.000 g und 4 °C, 15 min lang zentrifugiert. Der erhaltene Überstand enthält die lösliche Fraktion. In einigen Fällen wurde das in diesem Durchlauf erhaltene Pellet nochmals in verschiedenen Extraktionspuffern homogenisiert, teilweise bei hoher Ionenstärke, oder in Puffer A in Gegenwart von Detergentien, Heparin oder Harnstoff extrahiert.

A) Puffer niedriger Ionenstärke: - Puffer „A“ (pH 7,6):

- 20 mM TEA-HCl - 2 mM EDTA - 5 mM β-ME - 10 U/ml Aprotinin - 1 µM Pepstatin B) Puffer hoher Ionenstärke: - Puffer A;

+ 300 mM KCl + 300 mM MgCl₂ + 300 mM (NH₄)₂SO₄ C) Puffer mit Detergentien: - Puffer A;

+ 0,1 – 1 % Tx-100 + 0,1 % SDS D) Puffer mit organischen Substanzen: - Puffer A;

+ 0,25 – 1 M Aminocapronsäure + 1 – 100 µg/ml Heparin + 0,5 mg/ml Poly-Lysin E) Puffer plus Tx-100/Harnstoff: - Puffer A;

+ 1 % Tx-100/8 M Harnstoff

Nach Extraktion der „unlöslichen“ Protein-Fraktionen wurde wiederum zentrifugiert (20.000 g, 10 min, 4 °C). Die aus diesen Überständen erhaltenen Fraktionen wurden dann (zusammen mit den

„löslichen“ PTPs) elektrophoretisch getrennt (SDS-PAGE) und geblottet (Western Blot).

b) Western Blot - Analyse der Proteinexpression von PTPs nach Stimulierung

Proteinextrakt aus in kontinuierlichen Percoll-Gradienten gereinigten Schweine-Lymphocyten wurden nach einer Primärkultur und pharmakologischer Behandlung mit verschiedenen Chemikalien im Western-Blot-Verfahren untersucht. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 1.500 g, 10 min (Rt) gewonnen und die Pellets in verschiedenen Protein-Extraktionspuffern resuspendiert (vorwie-gend Puffer A + Tx-100/Harnstoff).

In Percoll-Gradienten gereinigte T-Splenocyten aus der Schweinemilz wurden kultiviert (1 x 10⁷ Zellen/Kulturplatte) und dann mit verschiedenen Chemikalien stimuliert, um die Expression der verschiedenen PTPs auf Proteinebene anzuregen, was dann im Western-Blot untersucht wurde.

Nach der pharmakologischen Stimulierung der Zellen wurden diese abzentrifugiert, die Pellets auf Eis in Puffer A unter Zusatz von 1 % Tx-100/8 M Harnstoff homogenisiert (Manueller Glas/

Teflon-Homogenisator). Der Proteinüberstand wurde zentrifugiert (20.000 g, 10 min, 4 °C) und auf Polyacrylamid-SDS-Gele aufgetragen, um die Proteinkonzentration der PTPs mit dem Western Blot

zu ermitteln.

c) Herstellung von subzellulären Fraktionen aus Splenocyten des Schweins

Durch Zentrifugieren in einem Percoll-Dichtegradienten wurden T-Splenocyten isoliert. Diese Zellen wurden aus dem Gradienten entnommen und zentrifugiert (1.000 g, 10 min, Rt) und die er-haltenen Zellpellets in flüssigen Stickstoff getaucht (nach Voges, 2002). Die Röhrchen wurden dann aus dem Stickstoff genommen und Extraktionspuffer niedriger Ionenstärke 1:5 (Puffer A) zugegeben.

Das nach dem Homogenisieren (Teflon/Glass-Potter Homogenisator) und Abzentrifugieren (400 g, 15 min, 4 °C) erhaltene Pellet wurde in Puffer A + 250 mM Saccharose re-homogenisiert, und zentrifu-giert. Der hier erhaltene zweite Überstand wurde verworfen. Das bei der zweiten Extraktion erhaltene Pellet („Kern“-Fraktion), wurde wiederum in Puffer A + 1 % Tx-100/8 M Harnstoff homogenisiert und zentrifugiert. Dieser letzte Überstand, der die gelösten Proteine der Kernfraktion enthält, wurde elektrophoresiert und mit Western-Blotting analysiert.

Der Überstand aus der ersten Zentrifugierung der „Kern“-Fraktion (400 g, 15 min in Puffer nied-riger Ionenstärke), wurde nochmals bei 40.000 g, 40 min, 4 °C, zentrifugiert. Der so erhaltene Über-stand entspricht der „löslichen“ Fraktion der Proteine aus Lymphocyten des Schweins. Das 40.000g - Pellet entspricht der mikrosomalen Fraktion. Es wurde in Puffer A + 1 % Tx-100 re-extrahiert und bei 20.000 g, 15 min, 4 °C auszentrifgiert. Der erhaltene Überstand entspricht der Detergens-löslichen membrangebundenen Proteinfraktion. Die 3 Fraktionen (Kern, Membrangebunden und „löslich“), wurden auf denaturierenden SDS-PAGE Elektrophoresen getrennt und geblottet.

2.6.5. Western-Blot -Analyse der PTP-Expression auf Protein-Ebene

In diesen Experimenten wurden aus Schweine-Splenocyten extrahierte Proteine in denaturier-ten Mini-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAGE) elektrophoretisch getrennt und auf Membranen aus Ni-trozellulose (Schleicher & Schuell) transferiert. Auf der Membran konnten dann mit monoklonalen Antikörpern die spezifischen Proteine nachgewiesen werden (AK α - PTPs Tc-, 1B, 1C, 1D, CD45, R-PTPα). Für den Proteintransfer („Western Blot“, Bollag et al., 1996) wurde das PAA-Gel mit einer Nitrozellulose-Membran in Kontakt gebracht, die auf die Größe des Mini-Gels zugeschnitten und in Transfer-Puffer getränkt war. Auf beiden Seiten der Gel-Membran wurden ein Whatman-Filtrierpa-pier und darüber ein Schwamm angebracht. Das Gel wurde mit der Kathodenseite zur Membran und mit der Anodenseite in die Transferkammer eingelegt. Der Transferpuffer war nach folgendem Ansatz hergestellt:

Transferpuffer (pH 8,3):

- 25 mM Tris-HCl - 190 mM Glycin - 20 % (v/v) Methanol - 0,02 % (w/v) SDS

Angelegte Spannung: 80-100 V, 90 min, 0,5-0,8 A. Die Transferkammer lag auf Eis. Nach dem Blotten wurden auf der Nitrozellulose-Membran die Molekülgewichtsstandards markiert. Um sicher-zustellen, daß die Proteine vollständig transferiert worden waren, wurde das Gel, von dem der Trans-fer erfolgte, mit Coomassie-Blau eingefärbt. Die Membran wurde 10 min mit Ponceaurot (Sigma) gefärbt, um die Molekülgrößenstandards zu markieren. Danach wurde die Membran unter fließendem

Der spezifische Proteinnachweis erfolgte durch Inkubation der Membranen mit spezifischen monoklonalen Antikörpern. Hierzu wurde die Membran dreimal in PBS (1 x) gewaschen und dann mindestens 90 min lang bei 4 °C mit Blocking-Puffer behandelt. Danach wurde mit den für das erste PTP spezifischen Antikörper (nach Herstelleranweisung 500 x - 10.000 x in Blocking-Puffer verdünnt) inkubiert (2-4 h, 4 °C), die Antikörperlösung zur Wiederverwendung entnommen und die Membrane 2 Mal mit PBS 1x gewaschen. Dann wurde zum zweiten Antikörper (gekoppelt an alkali-sche Phosphatase) übergegangen: Verdünnung 10.000 x in Blocking-Puffer, Inkubation 30-60 min bei Rt, Waschen der Membran in PBS 1 x (+ 0,1 % Tween 20) unter dreimaligem Austausch des Puffers.

Dann konnte die Nachweisreaktion für AP oder POX in situ mittels Chemoluminiszenz realisiert werden. Um den zweiten, an die Peroxidase gekoppelten Antikörper sichtbar zu machen, wurde die Membran 10 min in 5 ml der folgenden Lösung inkubiert:

Chemiluminiszenz-Lösung (pH 10):

- 0,1 M Diethanolamin - 0,24 mM CSPD - 1 mM MgCl₂

Nach der Inkubation wurde überschüssige Lösung verworfen, die Membran blasenfrei zwi-schen zwei Folien eingeschweißt und auf FUJI-Röntgenfilm dokumentiert.

Für den Nachweis der AP-Reaktion (unter Verwendung des 2. an die AP gekoppelten Antikör-pers) wurde die Membran in Gegenwart des Enzyms AP inkubiert (BCIP in alkalischem Medium), welches nach der Dephosphorylierung mit NBT reagiert, was ein unlösliches Präzipitat auf der Mem-bran erzeugt. Die so erhaltenen MemMem-branen wurden dunkel aufbewahrt und so bald wie möglich fotografisch dokumentiert, da dieser Niederschlag lichtempfindlich ist.

AP-Reaktionslösung:

- 100 mM Glycin (pH 9,6) - 1 mM MgCl₂

- 1 mM ZnCl₂

- 50 µg/ml BCIP (aus frischer Stammlösung angesetzt)

- 100 µg/ml NBT (frisch aus konzentrierter Stammlösung angesetzt)

Diese AP-„Entwicklungslösung“ wurde auf die Nitrozellulosemembranen aufgebracht und bei Dunkelheit inkubiert (Rt, 5-60 min) bis die Banden sichtbar werden. Dann wurde die Entwicklung mit Wasser gestoppt und die Membran im Dunkeln aufbewahrt.

2.6.6. „Strippen“ der Membranen nach dem Western Blotting

Beim Proteinnachweis mittels Western Blot wurde eine einzelne Nitrozellulose-Membran mit mehr als einem spezifischen Antikörper inkubiert. Daher mußte die Membran zwischen den einzelnen Versuchen „gestrippt“ werden, um die erste Antikörper-Verbindung zu lösen, und die Membran einer weiteren „Immundekoration“ zuführen zu können. Der Blot wurde hierzu mit folgendem „Stripping-Puffer“ behandelt:

„Stripping“ Puffer (pH 6,8):

- 62,5 mM Tris-HCl - 2 % SDS

- 100 mM β-ME

Die Membran wurde in diesem Puffer inkubiert (30 min, 56 °C), danach 5 x 10 min in jeweils frischem PBS (1 x) gewaschen. Nach dem fünften Waschen wurde die Membran dann in Magermilch als "Blocking-Puffer" (0,5 %) gesättigt. Die Stripping-Lösung hatte nicht die vollständige in situ-Re-aktion mit den an AP gekoppelten Antikörpern entfernt, weshalb im zweiten Immunnachweis Reste der ersten Banden sichtbar waren, was allerdings als „Referenz-Reaktion“ für die Molekülgrößen und die relative Menge der PTPs von Nutzen war. Im zweiten Immunnachweis wurden nur an Peroxidase gekoppelte sekundäre Antikörper verwendet (ECL-Methode).