Western-Blotting-Studien zur Expression von PTPs an isolierten T-Splenocyten

T-Splenocyten wurden auf Percoll Gradienten gereinigt (nach 24 h Primärkultur der entnomme-nen Milz-Lymphocyten, in Gegenwart von 10% FCS). Schicht 4 (nach Kapitel 3.4) und die isolierten Zellen wurden in Gegenwart von 10% FCS unter Zugabe von verschiedenen Kombinationen und Do-sierungen von Calcium-Ionophoren und Immunsuppressoren für 20 h kultiviert. Nach dieser letzten Primärkultur wurden die Zellen zentrifugiert (1 x 10⁸ Zellen/Platte, je zu 5 ml) und im Verhältnis 1:10 (w/v) in Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 resuspendiert und homogenisiert. Von den extrahierten Proteinen wurden SDS-PAGE/Western-Blots angefertigt (5 Mini-Gele), um die relativen Protein-Konzentrationen in Bezug auf sich selbst (in jedem Blot, nicht zwischen Blots) der PTPs Tc-, 1B, 1C, 1D und CD45 zu ermitteln. Abb. 20 (A–F) zeigen die Analyse der mit monoklonalen Antikörpern für die entsprechenden PTPs dekorierten Nitrozellulose-Membranen.

Man kann erkennen, daß ansteigende Konzentrationen von Ionophoren (insbesondere Ionomycin) eine Abnahme der Tc-PTP in T-Splenocyten bewirkten, wenn diese 20 h in Gegenwart von 0,1, 1 und 5 µM Ionomycin kultiviert wurden, ebenso in geringerem Umfang, bei 0,1 µM A23187. Ebenso beein-flußte Ionomycin, wenn auch in geringerem Maße, die intrazellulären Konzentrationen der PTP1D und PTP1B (bzw. die 50 kDa-Monomere der PTP1B) in Bezug zur Menge jeder PTP in der entsprechenden Kontrollplatte. Auf der anderen Seite beeinflußte Ionomycin offenbar nicht die Konzentration der PT -P1C (oder nur gering; ca. 20 %) und von CD45 in den Milz T-Zellen. Der Ionophor A23187 induzierte ebenfalls eine Abnahme der zellulären Konzentration der Tc-PTP (im Verhältnis zur Menge der Tc-PTP in der Kontrolle), hauptsächlich bei Konzentrationen von 1 und 5 µM (sehr schwacher Nachweis der Tc-PTP bei 5 µM A23187). Allerdings war der Effekt dieser letzten Konzentration bei den anderen PTPs auch nur sehr schwach. Die Immunsuppressoren Cyclosporin A, FK-506 und Rapamycin (alle bei einer Konzentration von 1 µM) erzeugten (im Verhältnis zur Kontrolle; Abb. 20, A–F; Spur a) eine Zunahme der Tc-PTP, welche für alle drei Immunsuppressoren ungefähr gleich ausfiel. Gleichfalls konnte eine leichte Zunahme der PTP1D beobachtet werden (Abb. 20, D; Spuren h–j). Nicht beeinflußt wurden (im

Im Falle der 1B wurden verschiedene relative Mengen in den Banden niedrigerer Molekülgrö-ßen beobachtet (vermutlich proteolytische Produkte der PTP1B: 37 und 34 kDa Fragmente); in allen Fällen waren die größeren Molekülfragmente der PTP1B häufiger (37 kDa; Abb. 20, B), aber mit den Immunsuppressoren nahm die relative Menge der kleineren Proteolyse-Fragmente der 1B (34 kDA) zu (Abb. 20, B; h–j).

Bei der Kombination der Ionophoren Ionomycin und A23187 mit den Immunsuppressoren konnte man beobachten, daß letztere die Suppression der Expression der Tc-PTP nicht aufhoben, wobei eine stärkere Inhibition für eine Kombination von Ionomycin mit den drei Immunsuppressoren auftrat als bei A23187 plus Immunsuppressoren (Abb. 20, A; k–m, im Vergleich zu n–p). Eine ähnli-che Schlussfolgerung läßt sich bei PTP1D ziehen, obwohl hier in geringerem Umfang in Bezug auf die Tc-PTP. Die PTPs 1C, 1B, und CD45 wiesen keine deutliche (bzw. 1C/1B, sehr geringe)

Konzen-205

Abb. 20 (A-E) Expression der PTPs auf Protein-Ebene (Western-Blotting) in isolierten T-Splenocyten nach Percoll-Zentrifugiation . Splenocyten wurden präpariert und während 24 h kultiviert. Danach wurden die Splenocyten in Percoll-Gradienten zentrifugiert und getrennt. Isolierte T-Splenocyten (Schicht 4; s. Abb.

1, A) wurden kultiviert und für 20 h mit verschiedenen Substanzen inkubiert, wie gezeigt: Kontroll-Platte (Kulturmedium plus 10 % FCS), kein Zusatz; Ionomycin (Iono); Cyclosporin A (CsA); FK-506 (FK);

Rapamycin (Rapa). Nach dieser Inkubation wurden die Zellen (1:10, w/v) in Puffer A + 8 M Harnstoff/1

% Tx-100 homogenisiert; die Überstände wurden durch Zentrifugieren gewonnen und auf SDS-PAGE/

Western-Blotting analysiert (5 SDS-PAA-Minigele; 5 µg Protein/Spur).

Abb. 20 A) Western-Blotting zur Tc-PTP nach verschiedenen chemischen Stimuli, in kultivierten T-Splenocyten. Exposition des Films, 1,5 h.

Abb. 20 B) Western-Blotting zur PTP1B, in T-Splenocyten. Exposition, 1,5 min.

Abb. 20 C) Western-Blotting zur PTP1C, in T-Splenocyten. Exposition, 5 min.

Abb. 20 D) Western-Blotting zur PTP1D, in T-Splenocyten. Exposition, 10 min.

Abb. 20 E) Western-Blotting zur Rezeptor-PTP CD45, in T-Splenocyten. Exposition, 1 min.

kDa

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trationsänderungen in den T-Splenocyten nach Anwendung dieser Ionophoren-Immunsuppressoren-Kombinationen auf.

Man kann daraus schließen, daß die Tc-PTP größere Änderungen in der Zelle erfährt, wenn die-se Ionophoren und den Immunsuppressoren Cyclosporin A, FK-506 und Rapamycin ausgedie-setzt wer-den. Die Auswertung ergab für die Kombinationen aus Ionophoren und Immunsuppressoren (insbe-sondere Iono) einen vorherrschenden Effekt der Ca²⁺-Ionophoren vor der aktivierenden Wirkung der Immunsuppressoren bei der Expression/Halbwertszeit der Proteine der Tc-PTP in T-Splenocyten.

Mittels Western-Blotting wurden die relativen PTP-Mengen in T-Zellen aus der Schweinemilz, die kultiviert und während 20 Stunden mit verschiedenen Molekülen behandelt worden waren. Es wurden Substanzen und Pharmaka benutzt, die in der Literatur als Regulatoren beschrieben sind und eine Immunantwort entweder auslösen oder beeinflussen und die auf verschiedenen Ebenen regulie-rend in die Signaltransduktion von T-Zellen eingreifen - und zwar Ionophoren wie Ionomicyn und A23187, als auch Immunsuppressoren (Sigal & Dumont, 1992; Ullman et al., 1993). Der Effekt die-ser Moleküle auf Splenocyten wurde sowohl für die Substanzen im einzelnen als auch für simultane

A B

C

E

D

µ µ

µ µ

µ

Abb.20 (F) Densitometrische Analyse zu Abb. 20 (A-E).

Zellen manuell in Pufferlösung unter Zusatz von 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 homogenisiert, um die Gesamte PTPs vollständig zu extrahieren (Gesamtkonzentration jedes Enzyms in der Zelle).

Die Ionophoren (beide Typen auf ähnliche Art und Weise, wobei Iono in effektiverer Form als A23187 in niedrigen Konzentrationen vorlag), eine Abnahme der relativen Menge der Tc-PTP in T-Lymphocyten aus der Milz (im Verhältnis zur Kontrollgruppe ohne Pharmakazusatz) herbeiführten.

Die Immunsuppressoren hingegen erhöhten deutlich die Tc-PTP-Konzentrationen in der Zelle. Eine Auswertung des Interaktionseffekts zwischen Ionophoren und den drei Immunsuppressoren ergab jedoch, daß Letztere die Inhibierung der Expression der Tc-PTP, ausgelöst durch Iono oder A23187, nicht revertierten, was darauf hinweist daß Kalzium und Immunsuppressoren entweder auf vonein-ander unabhängige Signalwege zur Kontrolle der Expression dieser PTP einwirken, oder aber, daß Ca²⁺, im Verhältnis zu den Immunsuppressoren auf den Signalwegen “downstream” aktiv ist, die die intrazelluläre Konzentration der Tc-PTP (bzw. der PTPs 1B und 1D) kontrollieren.

Bei den anderen untersuchten PTPs war die Wirkung der Immunsuppressoren und deren Kom-binationen mit Ionophoren weniger stark ausgeprägt, wobei die qualitativen Resultate für PTP1D (und PTP1B) mit denen an der Tc-PTP beobachteten Ergebnisse übereinstimmten: mit den drei Immunsup-pressoren erfolgte ein leichter Anstieg der PTP1D-Menge; praktisch kein Effekt auf die Expression auf Proteinniveau der PTP1C und CD45 (Abb. 20, C; E). Bei PTP1B kann man zwischen den proteo-lytischen Fragmenten des Enzyms eine Änderung des relativen Abundanzmusters erkennen, wobei ein Unterschied zwischen der Behandlung mit Ionophoren und Immunsuppresoren sichtbar ist, wobei das qualitative Ergebnis denen der Tc-PTP entspricht: die Immunsuppression konnten nicht den Ef-fekt der Ionophoren bei der Expression der PTP1B aufheben, ebensowenig erfolgte eine Änderung in der Verteilung der Proteolysefragmente (Abb. 20, B). Bei diesem speziellen Experiment, konnte die Konstantmenge der CD45 (sowie die Intensität der unspezifischen Bande, die mit den anti-PTP1B-Antikörper detektiert wurde, Abb. 20, B) als Kontrolle für eine konstante Proteindosierung auf die SDS-PAGE-Gele dienen. Für die Transmembran PTP CD45 konnten auch keine Variationen in der Zusammensetzung der Isoformen des Proteins nach der Behandlung der T-Lymphocyten beobachtet werden (Abb. 20, E), wie dies bei den verschiedenen elektrophoretischen Profilen der in den Subpo-pulationen von Milzlymphocyten detektierten Isoformen der Fall war (Abb. 11, E).

Die Mechanismen mittels derer Ionophoren die Protein-Konzentration der Tc-PTP hemmen, waren weder zur Zeit der Versuchsdurchführung noch heute bekannt. Auch für die aktivierenden Effekte der Immunsuppressoren auf die Proteingehalt der Tc-PTP (in geringerem Grade auch der PTP1B und 1D) standen zu diesem Zeitpunkt noch keine Erklärunen der molekularen Vorgänge zur Verfügung. Mittlerweile ist die negative Rolle der Tc-PTP (aber auch der PTP1C) bei der Aktivierung von T-Lymphocyten bekannt (Mustelin et al., 2005). Ionophore aktivieren die Proliferation von ru-henden Lymphocyten über eine Steigerung der cytoplasmatischen Konzentration von Ca²⁺ (Winslow

& Crabtree, 2005; Feske, 2007). Diese Zunahme von Ca²⁺ im Cytosol der Lymphocyten könnte die Ser/Thr-Phosphatase Calcineurin aktivieren und dadurch Transkriptionsfaktoren induzieren (Hogan et al., 2003). Auch Immunsuppressoren hemmen die Proliferation/Aktivierung von Lymphocyten durch die Inhibition der Aktivierung von NFAT über die Hemmung des Calcineurin-Signalweges (Higham et al., 1986; Liu et al., 1991; Feske, 2007). Diese durch Ca²⁺ auselösten molekularen Vor-gänge stimulieren die Proliferation von T-Lymphocyten und die Transkription von Genen des Im-munsystems (Winslow & Crabtree, 2005). Darunter ist das IL-2-Gen, ein wichtiger Aktivator der Immunantwort soweit dabei T-Lymphocyten die Schlüsselrolle spielen (Feske, 2007). Parallel hierzu

würde die durch Ca²⁺ hervorgerufene Reduktion der Tc-PTP-Menge (Abb. 20, A; b-g) die Aktivie-rung der T-Lymphocyten begünstigen und zwar über eine Zunahme in der aktivierenden Phosphory-lierung von Transkriptionsfaktoren der STAT-Familie, welche Substrate der Tc-PTP darstellen (Aoki

& Matsuda, 2002; ten Hoeve et al., 2002; Wang et al., 2006,a).

Einige PTPs werden spezifisch durch die Calcium-abhängige Protease Calpain modifiziert (Rock et al., 1997; Falet et al., 1998; Gil-Henn et al., 2001; Cortesio et al., 2008) was eine Änderungen ihrer subzellulären Lokalisierung auslöst und möglicherweise eine Rolle bei der funktionellen Kontrolle von PTP1B und R-PTPα spielt (Schoenwaelder & Burridge, 1999; Gil-Henn et al., 2001; Gulati et al., 2004; Kuchay et al., 2007). Möglicherweise ist die durch Ionophoren hervorgerufenen Abnahme in PTP-Konzentrationen (Gulati et al., 2004), wie sie auch in der vorliegenden Arbeit gefunden wur-den (Tc-PTP, PTP1B, PTP1D), auf eine Aktivierung von Calpain zurückzuführen. Auch in Neuronen wird die Aktivierung von Calpain durch Immunsuppressoren (CsA) gehemmt wird (Ferrand-Drake et al., 2003). Diese Ergebnisse stimmen mit der beobachteten Zunahme der PTPs in T-Zellen (Tc-, 1B und 1D) nach Exposition mit Immunsuppressoren überein. Ähnlich wie PTP1B (Rock et al, 1997;

Gulati et al., 2004; Kuchay et al., 2007) könnten auch andere PTPs Substrate von Calpain sein und die durch Immunsuppressoren ausgelöste Konzentrationserhöhung bestimmter PTPs in T-Lymphocy-ten könnte über die von Immunosuppressoren ausgelöste Calpain-Inhibierung erfolgen. Parallel dazu scheinen Immunsuppressoren (CsA) die Genexpression einiger Calpain-Formen hemmen (Miyabara et al., 2005).

3.7.2. Untersuchung zu molekulären Interaktionen von PTPs in T-Lymphocyten mittels zweidimen-sionaler Gelelektrophorese

Es wurde auch versucht, die post-transduktionalen Modifikationen und molekulare Assoziati-onen der PTPs nach mitogenen Stimulierung der Splenocyten in Primärkultur zu ermitteln. Hierzu wurden Splenocyten präpariert und während 15 h sowohl ohne als auch mit ConA 20 µg/ml kultiviert.

Nach dieser Primärkultur wurden lösliche Extrakte (in Puffer A extrahierbare Proteine) der Kontroll-gruppe der Splenocyten (ohne ConA) und der Kulturplatte, die dem Mitogen ConA ausgesetzt war, verglichen. Die Proben wurden hierzu homogenisiert und zentrifugiert. Im Überstand befinden sich die löslichen Proteine niedriger Ionenstärke der Splenocyten. Diese wurden auf zwei Spuren eines großformatigen nativen PAA-Gels aufgetragen und in Gegenwart von Coomassie-Blau elektrophore-tisch getrennt (BN-PAGE) (3 Stunden bei 120 V; 10 – 12 °C). Die erhaltenen Gelstreifen wurden mit dem Skalpell ausgeschnitten und jede für sich horizontal in SDS-PAA-Gele montiert, um eine dena-turierende Elektrophorese in einer zweiten Richtung zu erstellen und die entstehenden Mini-Gele auf Western-Blot-Nitrozellulosemembranen zu transferieren. Die Reste des nativen Gels wurden fixiert und mit Coomassie-Blau angefärbt, um die nativen Standards für die Molekülgrößen sichtbar zu machen. Die geblotteten Membranen wurden mit kommerziellen α-PTP 1D-Antikörpern dekoriert (PTP1D wies die höchsten Extraktionslevels in Puffer A auf).

Die der Migration im nativen Gel (erste Dimension; Abb. 21, A, B) zugehörigen 2 Molekülgrö-ßen für die PTP1D - spezifisch erkannte Dots liegen bei 160 und 170 kDa. Die der zweiten Dimension (SDS-PAGE) migrieren bei 69 und 73 kDa. Wenn die Zellen ConA ausgesetzt waren (20 µg/ml, 15 h), erkennt man in der zweidimensionalen Elektrophorese daß sich die Lage der PTP1D ändert: während die Kontrollzellen drei verschiedene „Molekülformen“ aufweisen, erkennt man bei den mit ConA

in der ersten Dimension ermittelte native Form liegt bei 160 kDa, in der zweiten Dimension (SDS-PAGE) bei 73 kDa. Die unter nativen Elektrophoresebedingungen erhaltenen größeren Moleküle der PTP1D in der ersten Dimension könnten auf molekulare Wechselwirkungen dieses Enzyms mit anderen Proteinen des Splenocyten-Cytosols zurückzuführen sein.

Diese Analyse wurde auch für andere PTPs versucht, aber die „löslichen“ Mengen dieser PTPs waren niedriger (PTP1C und R-PTPα) und die in Puffer A gelöste Fraktion der PTPs Tc-, CD45 und 1B migrierten als diffuser Streifen im nativen Gel ohne Auftrennung von der Gel-Front des BN-PA-GE-Gels (ausgehend nach unten, obwohl dieses 0,5 M ε-Aminocapronsäure enthielt). Unter diesen Bedingungen war eine zweidimensionale Elektrophorese für andere PTPs (Tc-PTP, PTP1B, CD45) nicht möglich. Die PTP1C (eine kleine, in Puffer A gelöste Fraktion) migrierte in nativen BN-PAGE-Gelen als eine einzige Bande, bei einer ungefähren Größe von ~67 kDa, genau wie in der zweiten Dimension nach dem SDS-PAGE (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die drei Banden der PTP1D nach zweidimensionaler Elektrophorese (BN-PAGE → SDS-PAGE) könnten einerseits durch einen kombinierten Interaktionsmechanismus Protein-Protein (im nativen Zustand; erste Dimension), andererseits auch durch eine Proteinphosphorylierung (Tailor et al., 1996) (was die zwei Banden für PTP1D in den denaturierenden Gelen in Gegenwart von SDS, s.

Abb. 11, D) erklärt werden. Eine Interaktion zwischen PTP1D und Proteinen von 90-110 kDa Mo-lekulargewicht wurde schon in der Literatur beschrieben (Frearson et al., 1996; Tailor et al., 1996;

Gadina et al., 1999).

Bei einer Behandlung der Zellen in Primärkultur während 16 Stunden mit ConA (20

µg/Mil-116

Abb. 21 (A-B) Zweidimensionale-Elektrophorese und Western-Blotting auf PTP1D (in Puffer A-lösliche Fraktion von T-Splenocyten), nach 15 h Stimulierung mit 20 µg/ml ConA (Abb. 21, B) im Vergleich mit unstimulierten kultivierten Splenocyten (Kontrolle; Abb. 21, A). Abgebildet sind die nativen Molekulargewichts-Marker für BN-PAGE (Gradienten-Gel, 6 → 16 % PAA; in kDa) und SDS-PAGE (10

% PAA; in kDa). Exposition der Filme 15 min.

liliter), wurde für die PTP1D nur eine Bande mit einer Größe von 160 kDa im BN-Page (73 kDa in der zweiten denaturierenden Dimension, SDS-Page) beobachtet. Dieses Ergebnis ist ein Hinweis auf eine mögliche post-traduktionelle multiple Kontrolle, als Reaktion auf mitogene Stimuli, wobei die 1D ihre Intrazelluläre molekuläre Darstellung ändert; man kann auch vermuten, daß dieser (reversi-blen?) funktionalen molekularen Assoziation eine physiologische Aktivität zugeordnet werden kann und daß sie die Kontrolle der biologischen Aktivität der PTP1D in T-Lymphocyten gegenüber extra-zellulären Stimuli beeinflusst. In der Literatur ist die Isolierung eines Komplexes zwischen PTP1D und Gab2 (“p97”, ein adaptor-Protein) in hämatopoietischen Zellen (Sattler et al., 2002; Wheadon et al., 2002) beschrieben, der eine sehr ähnliche Größe wie die in dieser Arbeit gefundener PTP1D-Komplex hat (Krejci et al., 2007), und wie dies auch für PTP1D in Tumorzellen des Immunsystems festgestellt wurde (Brockdorff et al., 2001). PTP1D wird eine relevante Funktion bei der Tumor-genese zugeschrieben (Mohi & Neel, 2007), weshalb die vorliegenden biochemischen Studien der molekularen Wechselwirkungen sehr zum Verständnis der Regulierung seiner biologischen Funktion mittels reversibler Interaktionen von Molekülen - sowohl im Immunsystem als auch in anderen Zell-systemen - unter physiologischen und physiopathologischen Konditionen beitragen könnten.